CN101618218A

CN101618218A - 聚乙二醇修饰的降钙素

Info

Publication number: CN101618218A
Application number: CN200810122797A
Authority: CN
Inventors: 冯军; 张喜全; 薛春佳; 朱裕辉; 张来芳; 赵伟; 胡博新
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Jiangsu Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2008-06-30
Publication date: 2010-01-06

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇修饰的降钙素及其制备方法，其中降钙素上的氨基通过亚甲基或羰基与聚乙二醇衍生物长链共价连接。本发明还包括其在调节钙-磷代谢及治疗各种骨相关疾病的用途。

Description

聚乙二醇修饰的降钙素

技术领域

本发明涉及一种化学修饰的降钙素及其制备方法和用途，具体地说涉及一种聚乙二醇修饰的降钙素及其制备方法，还包括其在调节钙-磷代谢及治疗各种骨相关疾病的用途。

背景技术

降钙素(calcitonin，CT)是甲状腺内的滤泡旁细胞(C细胞)分泌的一种32肽的激素，由Hirsh首次发现并证明它具有调节钙-磷代谢的功能。目前，降钙素在治疗骨质疏松症、佩吉特病(Paget’s disease)、高血钙、甲状旁腺机能亢进、变形性骨炎及骨骼愈合等方面都显示了良好的疗效。此外CN101035556公开了降钙素在骨生长中的用途；CN1856321公开了降钙素在治疗和/或预防骨关节炎中的用途；CN101180070公开了降钙素在治疗炎性疾病或炎性状况疾病中的应用；CN101171029公开了降钙素在治疗和/或预防神经性疼痛中的用途；CN1905894公开了降钙素在治疗需要合成代谢剂治疗的疾病，尤其是动脉粥样硬化中的用途；WO/2006/088765公开了降钙素用于治疗和/或预防多发性硬化症的用途；WO/2007/051641公开了降钙素用于治疗和/或预防风湿性关节炎及其相关疾病中的用途；CN1411386公开了降钙素用于增加个体的骨矿质密度方面的用途。

但是，在降钙素的使用过程中也发现该药物具有蛋白质和多肽药物所共有的缺点，如具有免疫原性，半衰期短等。已有临床报道降钙素会引起过敏反应，参见：胡淑兰，鲑鱼降钙素致严重过敏反应1例，药物流行病学杂志，2004，13(2)252；叶顺萍，鲑鱼降钙素注射液致过敏反应1例，海峡药学，2006，18(2)190。另外，由于降钙素在人体内的半衰期在70～90min，代谢较快，需要每日或隔日给药，这样也给病人带来治疗上的困难和痛苦。

针对降钙素在临床应用上出现的问题，WO/2008/038296公开了白细胞间素2融和的降钙素；WO/2004/043347、WO/2005/004792、CN1538851公开了与低分子量聚合物结合的降钙素；CN1721446公开了藻蓝蛋白β亚基基因融合的降钙素；WO/1994/008622公开聚乙二醇甘油脂结合的降钙素；WO/1989/009786公开了糖基和多元醇修饰的降钙素；EP511903公开了聚乙二醇修饰的降钙素。对降钙素进行结构修饰部分地解决了降钙素本身所有的缺陷，但是有些又带来了新的问题。例如EP0511903公开了一种聚乙二醇修饰降钙素的方法，该专利使用聚乙二醇修饰剂，分别修饰降钙素的羧基和氨基，得到的修饰产物活性较低，且修饰产物在体内不稳定，易水解，水解后留在蛋白质上的琥珀酸尾巴作为半抗原反而提高了蛋白质和多肽的免疫原性(参见Roberts MJ，Bentley MD，Harris JM.Chemistry for peptide and protein PEGylation.Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54：459-476)。

为了使降钙素更好地在临床中使用，客观上需要一种低免疫原性，半衰期延长的修饰的降钙素药物，同时该药物又不低于原有降钙素的活性，此外修饰物在代谢前后也不带来新的毒性等副作用。

发明内容

本发明提供一种聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于：降钙素的氨基上通过共价键连接有聚乙二醇衍生物长链，且与降钙素的氨基直接连接的基团是亚甲基或羰基。

本文所用的术语“降钙素”可以是天然降钙素，如人降钙素、鲑鱼降钙素、猪降钙素、鳗鱼降钙素、大鼠降钙素或鲨鱼降钙素等；也可以是人工合成或者重组的降钙素。人工合成或者重组的降钙素，其中可以发生一个或多个氨基酸被置换，而保留了降钙素的部分或全部活性。在描述类似物时，用置换位置上标注置换氨基酸，继之以降钙素的说明。例如，“Pro²降钙素，人”意味着通常见于人降钙素2位的甘氨酸已被脯氨酸置换。人工合成或者重组的降钙素的例子可见于WO/2005/035566；WO/1996/024616；WO/1996/024618；WO/1996/029343；WO/1993/015106；WO/1994/015962；WO/1992/021700；WO/1991/015511；WO/1991/007433；WO/1990/012809；WO/1986/001226；WO/2002/083734；WO/2003/038034；WO/1995/018152；WO/1984/003279；WO/1984/003280；CN1333262；CN1276379；CN1313301；CN1167114；CN1235980等。

降钙素优选使用天然降钙素，更优选使用鲑鱼降钙素或人降钙素，最优选使用鲑鱼降钙素，鲑鱼降钙素的氨基酸组成序列为：H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-【Lys】-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-【Lys】-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-【Pro】-NH₂(其中两个Cys可以形成二硫键)；分子式为：C₁₄₅H₂₄₀N₄₄O₄₈S₂；分子量为3432。

所述的降钙素的氨基，具体而言就是指降钙素氨基酸组成序列中N-末端的α-氨基和赖氨酸的ε-氨基，例如对于鲑鱼降钙素来说可能的修饰位点为3个(见上述序列中的【】中的氨基酸)。

每个降钙素分子上可以连接一条至多条(不超过降钙素的氨基的数目)聚乙二醇的长链，优选每个降钙素分子上连接一条聚乙二醇长链。

所述的聚乙二醇长链可以为直链聚乙二醇或支链聚乙二醇，优选直链聚乙二醇；聚乙二醇长链的分子量通常在2000～200000之间，优选的分子量在3000～60000之间。

所述的聚乙二醇修饰的降钙素可以使用本领域技术人员公知的方法制备，包括：将聚乙二醇的衍生物与降钙素进行反应，然后将聚乙二醇修饰的降钙素从反应混合物中分离，得到药用纯度的聚乙二醇修饰的降钙素。所述的聚乙二醇衍生物可以是聚乙二醇醛类衍生物，包括但不限于：聚乙二醇甲醛、聚乙二醇乙醛、聚乙二醇丙醛、聚乙二醇丁醛、聚乙二醇戊醛、聚乙二醇己醛、聚乙二醇庚醛；也可以是聚乙二醇醛类衍生物通过酸水解形成的缩醛水合物(报道于US5990237；Adv.Drug Delivery Rev.2002，54，477)；还可以是聚乙二醇的琥珀酸活性酯，包括但不限于：甲酸聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、戊酸聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、己酸聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、庚酸聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。

上述的聚乙二醇衍生物除在聚乙二醇的一端引入如上所述的活性基团以保证聚乙二醇长链与降钙素分子连接之外，如本领域所知的还可以在聚乙二醇的其它端引入一个或多个下列的基团：(a)惰性基团，以保证每条聚乙二醇长链仅连接一个降钙素分子，如C₁～C₄的低级烷氧基；(b)亲脂性长链，如C₅～C₁₀的烷基；(c)糖基，如葡萄糖及其类似物；(d)氨基酸，如赖氨酸及其类似物。上述的这些基团可以直接通过共价键连接在聚乙二醇的非活性端上，也可以彼此通过共价键相连，再通过共价连接于聚乙二醇的非活性端上。

本发明优选的聚乙二醇修饰的降钙素可以表示如下：

(m-PEG-(CH₂)_q-T-NH)_p-R

其中m代表羟基或C₁～C₄的低级烷氧基，优选甲氧基；

其中PEG代表聚乙二醇长链，其形式可以是如-(CH₂-CH₂-O)_n-的直链聚乙二醇长链，也可以是带有支链的聚乙二醇长链，该长链的分子量通常在2000～200000之间，优选的分子量在3000～60000之间；

q为0至6之间的整数，优选q为2或3；

T为或CH₂；

R为少了p个氨基(NH₂)的降钙素分子；

p为降钙素上通过共价键连接的聚乙二醇长链的数目，p为1到降钙素分子的氨基数之间的整数，优选为1。

本发明还提供聚乙二醇修饰降钙素的制备方法，包括如下步骤：

在降钙素水溶液中，加入磷酸盐缓冲液调节pH值，然后再加入活化的聚乙二醇衍生物，反应温度为4～60℃，优选20～37℃；当T为

时，反应时间为5～120分钟，反应pH值6.0～8.0，当T为CH₂时，反应时间为0.5到48小时，反应pH值4.0～7.0；反应中活化的聚乙二醇衍生物与降钙素的摩尔比为0.1～100，优选2～15，将反应混合液采用本领域所公知的离子交换层析技术和反相层析进行分离纯化。离子交换层析采用阳离子交换层析，流动相为含NaCl的醋酸盐缓冲液。反相层析的流动相为乙醇-醋酸盐水溶液。

制备反应按下式进行：

p(m-PEG-(CH₂)_q-D)+R-(NH₂)_p→(m-PEG-(CH₂)_q-T-NH)_p-R

其中m代表羟基或C₁～C₄的低级烷氧基，优选甲氧基；

D为

或

其中R-(NH₂)_P为降钙素，其参与反应的氨基有p个；

q为0至6之间的整数，优选q为2或3；

当D为

时，T为

；当D为

时，T为CH₂；

R为少了p个氨基(NH₂)的降钙素分子；

p为降钙素上通过共价键连接聚乙二醇长链的数目，p在1到降钙素分子的氨基数之间的整数，优选为1。

离子交换层析采用阳离子交换层析进行分离，所使用阳离子交换层析介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如S Sepharose系列、CM Sepharose系列、CM Sephacel系列、SP Sephadex系列、CM Sephadex系列、SOURCE S系列等，其中优选使用SOURCE 30S作为层析介质进行分离；阳离子层析的柱体积为1～600ml，流速为0.5～50ml/min；用起始缓冲液平衡2～8倍柱体积；上样量为2～200ml；先用1～5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，1.0mol/L NaCl缓冲液(B)，B的体积百分含量从0～100％，洗脱20倍柱体积。起始缓冲液可使用醋酸-醋酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥-盐酸缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液等，这些缓冲液的pH可为3.0～7.0，其中最优地使用pH为3.5～5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液。收集各洗脱组份，用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析，合并聚乙二醇修饰的降钙素。

所使用的反相层析介质为本领域所公知的各种层析介质，有以高纯度硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团，如C₁₈、C₈、C₄和C₆H₅等反相硅胶介质；还有以聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物或聚甲基丙烯酸酯等聚合物为基质的反相层析介质，如美国ROHM HAAS公司的AMBERCHROM^TM CG系列和AMBERCHROM^TM XT系列；其中优选使用C₁₈反相硅胶介质作为层析介质进行分离；反相层析的柱体积为1～300ml，流速为0.5～20ml/min；先用1～5倍柱体积的流动相E洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为流动相E和流动相F，F的体积百分含量从0～100％，洗脱20～30倍柱体积。流动相E通常可为0.05～5％的醋酸或三氟乙酸水溶液，其中最优地使用0.5％的醋酸水溶液；流动相F为0.05～5％的醋酸乙醇溶液或三氟乙酸乙腈溶液，其中优选地使用0.5％的醋酸乙醇溶液。收集各洗脱组份，用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析，合并聚乙二醇修饰的降钙素。

本发明还提供了一种药物组合物，该组合物含有聚乙二醇修饰的降钙素和药用辅料，该组合物的制剂形式可以是注射剂，如注射液、注射用无菌粉针；鼻用制剂，如鼻用喷雾剂；肺吸入剂，如气雾剂、粉雾剂或喷雾剂。

本发明还提供了聚乙二醇修饰的降钙素在制备药物中的用途，所述的药物可以用于治疗和/或预防：需要增加个体的骨矿质密度的疾病，如骨质疏松症，促进骨折愈合；佩吉特病(Paget’s disease)；高血钙；甲状旁腺机能亢进；炎性疾病或炎性状况疾病，如骨关节炎、强直性脊椎炎、风湿性关节炎及其相关疾病；神经性疼痛；需要合成代谢剂治疗的疾病，如动脉粥样硬化，多发性硬化症。

相对于未修饰的降钙素，本发明的聚乙二醇修饰的降钙素由于克服了降钙素原有的缺陷，因此其拥有更低的免疫原性；更长的半衰期。

相比于其它的修饰的降钙素，首先，用于修饰的聚乙二醇是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，也是经美国药品食品监督管理局(FDA)批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。用聚乙二醇修饰过的降钙素在代谢前后均不会带来明显的不良反应和副作用；其次，更令人惊奇的是与未修饰的降钙素相比，本发明的聚乙二醇修饰的降钙素活性更高，其拥有不低于未修饰的降钙素的活性，优选其活性高于未修饰的降钙素的5％，更优选其活性高于未修饰的降钙素的10％。

此外，本发明用于修饰的聚乙二醇衍生物多属于工业产品，在修饰过程中的反应和纯化步骤简单易行，更符合工业化生产的要求，有利于低成本，高效率地大规模生产。

附图说明

图1聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素的HPLC分析图谱

图2聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素的MALDI-TOF-MS分析图谱

具体实施方式

实施例1

丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)修饰鲑鱼降钙素的合成

反应温度的选择：取1.0mg/ml的鲑鱼降钙素溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.0，再加入mPEG-SPA-5000固体15mg，溶解，混匀，各取0.8ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4℃、10℃、25℃和37℃反应30min后，加入5mg甘氨酸，终止反应。比较单聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素(一个鲑鱼降钙素分子上连接1分子聚乙二醇链，以下称聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素)的修饰率，确定修饰条件。结果表明：在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，其中25℃的修饰率最高，具体数据见表一。

表一：不同温度对鲑鱼降钙素修饰率的影响

反应时间的选择：取1.0mg/ml的鲑鱼降钙素溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.0，再加入mPEG-SPA-5000固体15mg，溶解，混匀，各取0.7ml置于4支带塞试管中，然后于25℃分别反应5、15、30、60、120min后，加入5mg甘氨酸终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明：在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，其中30min后的修饰率没有明显提高，具体数据见表二。

表二：不同时间对鲑鱼降钙素修饰率的影响

mPEG-SPA-5000同鲑鱼降钙素的摩尔比的选择：取1.0mg/ml的鲑鱼降钙素溶液8ml，加8ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.0，各取3.0ml置于5支带塞试管中，然后分别加入2.2、4.4、6.6、11.0和22.0mg mPEG-SPA-5000(相当于鲑鱼降钙素同mPEG-SPA-5000的摩尔比分别为1∶1，1∶2，1∶3，1∶5，1∶10)，溶解，混匀，反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明：在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，当mPEG-SPA-5000同鲑鱼降钙素的摩尔比(简称摩尔比)为3时修饰率已达到最高，具体数据见表三。

表三：不同摩尔比对降钙素修饰率的影响

实施例2

聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素的分离纯化与鉴定

取1.0mg/ml的鲑鱼降钙素溶液10ml，加10ml的磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.0，再加入mPEG-SPA-5000固体44mg，溶解，混匀，于25℃反应30min，加入25mg甘氨酸终止反应。

取上述反应液，用截流分子量为1000的超滤膜，对0.01mol/L，pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液置换并浓缩至5ml，上柱分离。色谱条件如下：

层析介质：SOURCE 30S

柱体积：5ml

流速：3.0ml/min

柱平衡：用0.01mol/L，pH4.0的醋酸-醋酸钠(起始缓冲液)平衡5倍柱体积

上样量：5ml

洗脱：先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液，1.0mol/L NaCl缓冲液，1.0mol/L NaCl缓冲液体积百分比从0～100％，洗脱20倍柱体积。

收集：3.0ml/管

用RP-HPLC进行跟踪分析，合并聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，待进行下一步反相柱层析纯化。

反相柱层析的色谱条件如下：

层析介质：反相硅胶(C₁₈，40μm)

柱体积：10ml

流速：3.0ml/min

柱平衡：用0.5％的醋酸溶液平衡10倍柱体积

上样量：10ml

洗脱：先用5倍柱体积的0.5％的醋酸溶液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为0.5％的醋酸溶液和0.5％的醋酸乙醇溶液，0.5％的醋酸乙醇溶液从0～100％，洗脱30倍柱体积。

收集：3.0ml/管

用RP-HPLC进行跟踪分析，合并聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素

RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素的纯度在98％以上，见附图1，具有较高的纯度。聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素经MALDI-TOF-MS分析，测得其分子量为8187.31，见附图2。鲑鱼降钙素的分子量为3432，二者分子量相差约5000，同时在8187.31(M+1峰)附近有一系列峰，具有聚乙二醇的典型结构特征，证实实施例2得到的聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素为单修饰产物。

实施例3

鲑鱼降钙素和聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素(由实施例2的方法制备得到)降低大鼠血钙的试验比较

参照中国药典2005年二部附录XII O中降钙素的效价测定方法，取健康合格，体重在200±15g的Wistar雌性大鼠90只，试验前禁食16小时，自由饮用蒸馏水，随机分成3组，空白、鲑鱼降钙素和聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素组各30只。腹部皮下注射给药，空白组注射生理盐水，鲑鱼降钙素和聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素给药剂量均为0.05μg/kg(聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素中以鲑鱼降钙素的量计算)，给药体积为0.4ml/100g。分别在给药前和给药后的1、2、4、8、12小时，每组取动物5只，自眼静脉丛取血，用邻甲酚酞络合剂测定样品中的血钙值。用各时间点空白组的平均血钙值减去给药组的平均血钙值，用二者的差比上空白组的平均血钙值，即得降低血钙的水平。测定表明：聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素不但效价没有降低，而且还显著升高，同等剂量下降低血钙的水平提高了1倍，同时作用时间也显著延长，由修饰前的4个小时延长到8个小时，具体结果见表四。

表四鲑鱼降钙素和聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素降低大鼠血钙的试验比较结果

实施例4

聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素(由实施例2的方法制备得到)对实验动物免疫原性的研究

以家兔作为制备抗血清的实验动物，采用福氏佐剂免疫法，并分别以甲醛处理过的鲑鱼降钙素和聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素作为抗原，剂量均为0.5mg/kg/次，每周1次，共5次。

分别以鲑鱼降钙素和聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素作为抗原，用双向免疫扩散法测定它们各自抗血清的效价，测定结果为：鲑鱼降钙素组抗血清的效价为1∶32；聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素组抗血清的效价测不出。

分别以鲑鱼降钙素和聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素作为抗原，然后用鲑鱼降钙素组的抗血清作为第一抗体，再以辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为第二抗体，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定它们各自的免疫原性，测定结果为：鲑鱼降钙素组为阳性，聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素组为阴性。

以上结果表明：同鲑鱼降钙素比较，聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素的免疫原性显著降低，这样更有利于作为治疗药物使用。

实施例5

用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SPA-20000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SPA-30000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯60000(mPEG-SPA-60000)代替实施例1中的mPEG-SPA-5000，使用实施例1和2的方法得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，并进行如实施例3和4的实验，获得相似的结果。

实施例6

用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SBA-5000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SBA-20000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SBA-30000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯60000(mPEG-SBA-60000)代替实施例1中的mPEG-SPA-5000，使用实施例1和2的方法得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，并进行如实施例3和4的实验，获得相似的结果。

实施例7

甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)修饰的鲑鱼降钙素

反应温度的选择：取1.0mg/ml的鲑鱼降钙素溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为5.0，再加入mPEG-ALD-5000固体30mg，溶解，混匀，再加0.029ml的1mol/L氰硼氢化钠，各取0.8ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4℃、25℃、37℃和50℃反应16h后，加5mg甘氨酸终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明：在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，其中37℃的修饰率最高，具体数据见表五。

表五：不同温度mPEG-ALD-5000对鲑鱼降钙素修饰率的影响

反应时间的选择：取1.0mg/ml的鲑鱼降钙素溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为5.0，再加入mPEG-ALD-5000固体30mg，溶解，混匀，再加0.029ml的1mol/L氰硼氢化钠，各取0.7ml置于5支带塞试管中，然后于37℃分别反应0.5、1.0、8.0、16.0、24.0h后，加5mg甘氨酸终止反应，比较修饰率，确定修饰条件。结果表明：在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，其中16h后的修饰率没有明显提高，具体数据见表六。

表六：不同时间mPEG-ALD-5000对鲑鱼降钙素修饰率的影响

mPEG-ALD-5000同鲑鱼降钙素的摩尔比的选择：取1.0mg/ml的鲑鱼降钙素溶液8ml，加8ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为5.0，各取3ml置于5支带塞试管中，然后分别加入2.2、6.6、11.0、22.0和33.0mg的mPEG-ALD-5000(相当于降钙素同mPEG-ALD-5000的摩尔比在1∶1～1∶15)，溶解，混匀，再分别加0.022ml的1mol/L氰硼氢化钠反应16.0h后，加5mg甘氨酸终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明：在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，当mPEG-ALD-5000同降钙素的摩尔比在10时修饰率已达到最高，进一步增加mPEG-ALD-5000的量修饰率也没有明显地增加，具体数据见表七。

表七：不同摩尔比的mPEG-ALD-5000对鲑鱼降钙素修饰率的影响

实施例8

聚乙二醇修饰鲑鱼降钙素(醛修饰)的分离纯化与鉴定

取1.0mg/ml的鲑鱼降钙素溶液10ml，加10ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为5.0，再加入mPEG-ALD-5000固体150mg，溶解，混匀，再加0.145ml的1mol/L氰硼氢化钠，37℃反应反应16h后，加入50mg甘氨酸固体终止反应。然后按照实施例2中的方法进行聚乙二醇修饰降钙素的分离纯化与鉴定。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素的纯度在98％以上，具有较高的纯度。MALDI-TOF-MS分析表明其分子量为8124.21，为单修饰聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素。

实施例9

聚乙二醇修饰鲑鱼降钙素(醛修饰)的特性研究

按照实施例3～4中的方法进行mPEG-ALD-5000修饰鲑鱼降钙素降低大鼠血钙的试验和免疫原性的研究，结果不但效价没有降低，而且还显著升高，作用时间也显著延长，免疫原性降低。

实施例10

用甲氧基聚乙二醇丙醛2000(mPEG-ALD-2000)、甲氧基聚乙二醇氧基聚乙二醇丙醛10000(mPEG-ALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丙醛20000(mPEG-ALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丙醛30000(mPEG-ALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丙醛60000(mPEG-ALD-60000)代替实施例7中的mPEG-ALD-5000，使用实施例7和8的方法得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，并进行如实施例9的实验，获得相似的结果。

实施例11

用甲氧基聚乙二醇丁醛2000(mPEG-ButyrALD-2000)、甲氧基聚乙二醇丁醛5000(mPEG-ButyrALD-5000)、甲氧基聚乙二醇聚乙二醇丁醛10000(mPEG-ButyrALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丁醛20000(mPEG-ButyrALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丁醛30000(mPEG-ButyrALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丁醛60000(mPEG-ButyrALD-60000)代替实施例7中的mPEG-ALD-5000，使用实施例7和8的方法得到聚乙二醇修饰的鲑鱼降钙素，并进行如实施例9的实验，获得相似的结果。

Claims

1.一种聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于：降钙素的氨基上通过共价键连接有聚乙二醇衍生物长链，且与降钙素的氨基直接连接的基团是亚甲基或羰基。

2.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于：降钙素为鲑鱼降钙素或人降钙素。

3.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于，具有如下的结构：

(m-PEG-(CH₂)_q-T-NH)_p-R

其中m代表羟基或C₁～C₄的低级烷氧基；

其中PEG代表聚乙二醇长链，该长链的分子量在2000～200000之间；

q为0至6之间的整数；

T为

或CH₂；

R为少了p个氨基(NH₂)的降钙素分子；

p为降钙素上通过共价键连接的聚乙二醇长链的数目，p为1到降钙素分子的氨基数之间的整数。

4.权利要求3所述的聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于：其中m代表甲氧基。

5.权利要求3或4所述的聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于：其中q为2或3。

6.权利要求3、4或5所述的聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于：p为1。

7.权利要求3-6所述的聚乙二醇修饰的降钙素的制备方法：在降钙素水溶液中，加入磷酸盐缓冲液调节pH值，然后再加入活化的聚乙二醇衍生物，反应温度为4～60℃；当T为

时，反应时间为5～120分钟，反应pH值6.0～8.0，当T为CH₂时，反应时间为0.5到48小时，反应pH值4.0～7.0；反应中活化的聚乙二醇衍生物与降钙素的摩尔比为0.1～100，最后，将反应混合液采用本领域所公知的离子交换层析技术和反相层析进行分离纯化。

8.一种药物组合物，该组合物含有权利要求1-6所述聚乙二醇修饰的降钙素和药用辅料。

9.权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：组合物的制剂形式可以是注射剂；鼻用制剂或肺吸入剂。

10.权利要求1-6所述的聚乙二醇修饰的降钙素在制备药物中的用途，所述的药物可以用于治疗和/或预防：需要增加个体的骨矿质密度的疾病；佩吉特病(Paget’s disease)；高血钙；甲状旁腺机能亢进；炎性疾病或炎性状况疾病；神经性疼痛；需要合成代谢剂治疗的疾病。