CN101610762A - 脑功能改善用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种像食品成分或天然提取物等这样的安全的材料，而且具有更强的脑功能改善效果(改善脑内神经传递物质单胺的代谢，而且改善由于乙酰胆碱能神经的功能降低而导致的记忆、学习能力的下降的效果)的物质。本发明提供了脑功能改善用组合物，其特征在于含有源自醋酸菌的碱性稳定脂质、N－酰基二氢鞘氨醇或N－2′－羟棕榈酰－二氢鞘氨醇作为有效成分。

Description

脑功能改善用组合物

技术领域

本发明涉及通过经口摄取具有脑功能改善效果的功能性组合物。更具体的是，本发明涉及以源自醋酸菌的碱性稳定脂质(alkali-stable lipid)、N-酰基二氢鞘氨醇(N-acylsphinganine)或N-2′-羟基棕榈酰基-二氢鞘氨醇作为有效成分的通过改善神经传递机制的异常而具有记忆、学习能力的改善功能的脑功能改善用组合物。

背景技术

近年来，随着人口的老龄化等，神经、精神疾病对社会带来越来越大的负担，例如，多发于老人的痴呆症导致的学习、记忆障碍成为严重的问题。日本的痴呆症患者已经超过100万人，据称在20年后会增加至近300万人。

现已清楚痴呆症之一的阿耳茨海默氏病(Alzheimer′s disease，以下也称为AD)是脑中的神经传递机制中发生异常。即，发现了在AD中，前脑基底部的Mynert核中发生胆碱能神经的变性和脱落，随之，作为乙酰胆碱合成酶的乙酰胆碱转移酶活性的降低和去甲肾上腺素以及血清素(serotonin)等单胺类化合物的浓度减少，NGF等神经营养因子的浓度减少等状况(例如，参照非专利文献1)。

还有，胆碱能神经的功能降低不仅是AD而且也是老龄脑中共通的现象(例如，参照非专利文献1)。此外，各种事实显示单胺类障碍与综合失调症等各种神经、精神疾病强烈相关(例如，参照非专利文献2)。

对于这些AD等重度脑疾病，已经进行了作为脑机能改善剂的各种合成药物的开发，例如预期对活化胆碱能神经起改善效果的乙酰胆碱脂酶抑制剂现在已经被批准为阿耳茨海默氏病治疗药物。

但是，该乙酰胆碱脂酶抑制剂的问题在于，有报道指出其有肝损害，心律不齐，以及消化性溃疡等加剧恶化等副作用，作为合成药物存在不利。

还有，有报道指出神经营养因子通过在脑内直接给药产生脑功能改善作用(例如，参照非专利文献1)，但由于神经营养因子本身是高分子，因此在经口摄取时无法通过脑血屏障，因此存在无法预期其作用等问题。

另一方面，希望不常用合成药物，而是通过作为日常饮食等摄取来预防和改善神经、精神疾病，人们提出了各种食品成分和天然提取物。

例如，人们着眼于脑神经中，存在作为特异的脂质成分(或称“脂类成分”)的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸等磷脂、或二十二碳六烯酸和花生四烯酸等脂肪酸，神经节苷脂，神经鞘髓磷脂等，具有与神经营养因子同样的生理作用等，提出了以磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸，二十二碳六烯酸等作为有效成分的脑功能改善组合物(例如，参照专利文献1)。

但是，有报道指出上述磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸等的脑功能改善效果不改善单胺的代谢等，并不怎么强(例如，参照非专利文献3和4)。

根据这种背景，希望开发具有更强的脑功能改善效果而且安全的物质。

非专利文献1：老人性痴呆症和治疗药，CMC出版，p.37-44，p.108-125，1988年

非专利文献2：日独医报，33卷，p319-330，1988年

非专利文献3：Medicina，20卷，p2132-2133，1983年

非专利文献4：Acta psychiatrica Scandinavica，81卷，p.265-270，1990年

专利文献1：特开平7-17855号公报

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于解决上述问题，提供所谓的非合成药物而是像食品成分或天然提取物等这样的安全材料并且具有更强的脑功能改善效果的物质。

用于解决问题的手段

本发明人鉴于上述问题，进行了积极的研究，结果着眼于一直作为酿造制醋菌使用的认识到高安全性的醋酸菌。

还有，还已知欧洲的传统食品：里海酸奶(caspian sea yogurt)中含醋酸菌，醋酸菌自身有历史长期的食用经验，安全性高。

本发明人对这种安全性高有食用历史的醋酸菌的脑功能改善功能进行了研究，结果发现源自醋酸菌的碱性稳定脂质、N-酰基二氢鞘氨醇和N-2′-羟基棕榈酰基-二氢鞘氨醇改善神经传递机制的功能降低，而且具有改善记忆、学习能力的强作用，从而完成本发明。

在由于痴呆症和年龄增长导致的脑功能降低中，发现伴随记忆和学习能力的降低，乙酰胆碱转移酶活性的降低，去甲肾上腺素和血清素等单胺类化合物的浓度减少，NGF等神经营养因子的浓度减少等神经传递机制的功能降低。

为了研究这种脑功能降低的改善功能的试验方法中，作为使用大鼠或小鼠等动物的方法，可以例举通过Morris水迷宫试验等行为学试验直接验证记忆和学习能力的改善的方法或定量脑内神经传递物质的含量等生化学试验，验证神经传递机制的改善的方法。

还有，由于在使用动物的试验中需要大量的给药试样，因此作为少量的试样中研究脑功能改善功能的方法，有使用神经细胞的模式细胞株或脑组织的初代培养细胞的方法。即，通过观察对神经细胞的神经突起的伸长作用或神经细胞死亡的抑制作用等神经营养因子样作用，可以验证神经传递机制的改善。

本发明人使用上述验证方法，通过口服从醋酸菌中提取、分离的源自醋酸菌的碱性稳定脂质，确认了其改善脑内神经传递物质的单胺代谢而且改善由乙酰胆碱能神经的功能降低导致的记忆、学习能力降低。此外，还确认了源自醋酸菌的碱性稳定脂质中的成分N-酰基二氢鞘氨醇，以及作为N-酰基二氢鞘氨醇中的成分的N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇通过神经营养因子样作用改善神经传递机制的功能降低。

还有，还确认了本发明的该碱性稳定脂质中不合有以前报道有脑功能改善效果的磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，二十二碳六烯酸等，而且还确认了N-酰基二氢鞘氨醇和N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇与上述已报道有脑功能改善效果的物质不同。

即，权利要求1中涉及的本发明是关于脑功能改善用组合物，其特征在于含有源自醋酸菌的碱性稳定脂质作为有效成分。

还有，权利要求2中涉及的本发明是关于脑功能改善用组合物，其特征在于含有N-酰基二氢鞘氨醇作为有效成分。

权利要求3中涉及的本发明是关于脑功能改善用组合物，其特征在于含有N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇作为有效成分。

权利要求4中涉及的本发明是关于权利要求1～3中任一项中记载的脑功能改善用组合物，其特征在于，其为饮品和食品。

权利要求5涉及的本发明是关于权利要求4所述的脑功能改善用组合物，其特征在于，其为食醋。

发明的效果

本发明的脑功能改善用组合物通过直接经口摄取源自醋酸菌的碱性稳定脂质，尤其是N-酰基二氢鞘氨醇或N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇，具有改善由于乙酰胆碱能神经的变性、脱落而导致的记忆、学习能力的降低的功能，改善脑内神经传递物质单胺的代谢，从而改善神经传递机制的功能降低的功能，通过神经营养因子样作用改善神经传递机制的功能降低的功能。

还有，本发明的脑功能改善用组合物是在食用历史的醋酸菌中所含之物，安全性优异。

附图说明

图1：是表示本发明的源自醋酸菌的碱性稳定脂质的制备方法的概略的图。

图2：是表示实施例2中使用的Morris水迷宫试验装置的概要的图。

图3：是表示实施例2中平台到达时间的图。

图4：是表示实施例2的探针试验中第四象限的滞留时间的图。

图5：是表示实施例2的探针试验中平台位置通过次数的图。

图6：是表示实施例3中测定的前脑皮质中去甲肾上腺素(NE)含量和血清素代谢物的5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)的图。

图7：是表示实施例3中测定的海马中去甲肾上腺素(NE)含量和血清素代谢物的5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细的说明。

权利要求1涉及的本发明为脑功能改善用组合物，其特征在于含有源自醋酸菌的碱性稳定脂质作为有效成分。

还有，权利要求2涉及的本发明为脑功能改善用组合物，其特征在于含有N-酰基二氢鞘氨醇作为有效成分。

此外，权利要求3涉及的本发明为脑功能改善用组合物，其特征在于含有N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇作为有效成分。

作为本发明中使用的醋酸菌，可以使用属于葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)，葡糖杆菌属(Gluconobacter)，醋杆菌属(Acetobacter)，Asaia属，Asidomonas属等的任一种的醋酸菌，没有特别限制。

详细的是，作为葡糖酸醋杆菌属的醋酸菌，可以例举汉氏葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter hansenii)，重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)，Gluconacetobacterintermedius，Gluconacetobacter sacchari，木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)，欧洲葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter europaeus)，服从葡萄酸醋杆菌(Gluconacetobacter oboediens)等。

还有，作为葡糖杆菌属(Gluconobacter)的醋酸菌，可以例举弗氏葡萄杆菌(Gluconobacter frateurii)，蜡状葡糖杆菌(Gluconobactercerinus)等。

此外，作为醋杆菌属(Acetobacter)的醋酸菌，可以例举Acetobacter tropicalis，Acetobacter indonesiensis，Acetobactersyzygii，Acetobacter cibinongensis，Acetobacter orientalis，巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，Acetobacterorleanensis，Acetobacter lovaniensis，醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)，果实醋杆菌(Acetobacter pomorum)等。

此外，作为Asaia属的醋酸菌，可以例举Asaia bogorensis，Asaiasiamensis等。

还有，作为Asidomonas属的醋酸菌，可以例举Asidomonasmethanolica等。

此外，作为醋酸菌，除上述外，还可以适当使用可以在食醋制造或酸奶等发酵食品中使用的醋酸菌，从自然界分离的并且已经在微生物保藏机构中保藏的可以发放的保藏菌株等。

源自醋酸菌的碱性稳定脂质可以通过以下方式制备：使用乙醇，丙酮，己烷，氯仿，甲醇，乙酸乙酯等1种或2种以上构成的有机溶剂，从醋酸菌中提取脂质类，对提取的脂质成分，实施弱碱性分离处理除去磷脂。如果考虑食品用途中的安全性理想的是低极性溶剂，作为提取溶剂合适的是己烷或丙酮等。

还有，N-酰基二氢鞘氨醇或N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇可以通过以下方式制备：将上述源自醋酸菌的碱性稳定脂质提供给硅胶柱层析，用己烷，氯仿，甲醇等2种以上构成的有机溶剂洗脱，进行分级。

还有，N-酰基二氢鞘氨醇或N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇可以是化学合成来源的，其安全性由醋酸菌的食用历史所支持，理想的是化学合成时按不含作为副产物的具有副作用的化合物类那样进行制备。

源自醋酸菌的碱性稳定脂质包括藿烷类(Hopanoids；萜类：terpenoids)化合物，神经鞘脂类，氨基脂质，脂肪酸等。这些化合物一般作为醋酸菌的膜脂质所含有，例如，“带大研报”，23卷，p917-925(1978年)，《岩手大学大学院连合农学研究科博士论文》，后藤英嗣著，p11-41(2001年)如所示，包括以下所示的化合物。

即，作为藿烷类(萜类化合物)化合物，包括例如四羟基细菌藿烷(Tetrahydroxybacteriohopane)(C35-萜烯醇)，高泛烷-22-醇，hop-22(29)-烯等。

还有，作为神经鞘脂类，包括例如N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-棕榈酰-二氢鞘氨醇，O-1-葡糖苷酸基-N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-顺式-vaccenoyl-二氢鞘氨醇，O-1-葡糖苷酸基-N-棕榈酰-二氢鞘氨醇等N-酰基二氢鞘氨醇和游离的二氢鞘氨醇等。

此外，作为氨基脂质，包括例如鸟氨酰牛磺酸脂质3-(棕榈酰)-羟棕榈酰-鸟氨酰-牛磺酸，鸟氨酸脂质3-(棕榈酰)-羟棕榈酰-鸟氨酸，溶血(lyso)-鸟氨酸脂质3-羟棕榈酰-鸟氨酸等。

还有，作为脂肪酸，包括例如顺式-11-十八碳烯酸等。

N-酰基二氢鞘氨醇是指包含于碱性稳定脂质中的二氢鞘氨醇脂质的一部分，是在作为鞘氨醇(sphingoid)碱基的二氢鞘氨醇上结合了脂肪酸的一般被称为神经酰胺的化合物，一般用以下化学式(1)表示。还有，式(1)中-CO-R表示酰基。式(1)中，已知构成酰基的脂肪酸是羟基脂肪酸或普通脂肪酸，饱和烃或不饱和烃，直链状或分支状的，碳原子数为2-30以下的脂肪酸。

还有，作为源自醋酸菌的N-酰基二氢鞘氨醇，确认的是构成酰基的作为脂肪酸的肉豆蔻酸，软脂酸，硬脂酸，棕榈油酸，油酸，11-十八碳烯酸，亚油酸，2-羟基肉豆蔻酸，2-羟基软脂酸等，尤其是N-2′-羟基棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-顺式-vaccenoyl-二氢鞘氨醇占其组成比的多数。

[化1]

以上化合物根据醋酸菌的种类而其含量比不同，在醋酸菌所属的革兰氏阴性菌中只作为膜脂质的主要构成成分存在，不作为革兰氏阳性菌和真核生物等其它生物的脂质成分存在，或者为极微量的化合物类。

作为这种脑功能改善用组合物，基本含有对于用上述有机溶剂从醋酸菌中提取脂质类而获得的脂质级分通过实施弱碱性分解处理除去磷脂而制备的源自醋酸菌的碱性稳定脂质，或者通过纯化该碱性稳定脂质而获得的N-酰基二氢鞘氨醇以及N-酰基二氢鞘氨醇中的N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇作为有效成分，但根据需要也可以直接含有该提取工序中不经过弱碱性分离处理而制备的脂质级分。

还有，该碱性稳定脂质，N-酰基二氢鞘氨醇或者N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇由于存在于醋酸菌的细胞膜中，因此可以不经过提取工序而直接含有醋酸菌本身作为有效成分，此时考虑体内的吸收，也可以含有通过高压均化器细胞破碎的产物。

这样一来，即使含有源自醋酸菌的碱性稳定脂质，N-酰基二氢鞘氨醇或者N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇的醋酸菌的细胞破坏物和通过有机溶剂提取的脂质级分作为有效成分，也可以获得同样的脑功能改善效果。

权利要求1，权利要求2或权利要求3涉及的本发明的脑功能改善用组合物的形态可以采用片剂，胶囊剂，粉末或液体等。

其次，权利要求4涉及的本发明是特征在于为饮品和食品的权利要求1-3中任一项记载的脑功能改善用组合物。

其中，作为饮品和食品的形态，具体可以例举糖果，口香糖，果冻，冰淇淋，小甜饼等点心；主食面包，米饭等主食；酒精饮料；牛奶，酸奶等乳制品；食醋饮料，运动饮料等各种饮料；以及酱油，日本大酱(miso)，食醋等调味料等。

这其中合适的是如权利要求5中记载那样的食醋，可以预期提供整合了食醋所具有的其它健康功能的优异的功能性食品。

还有，可以预期通过混合上述形态的源自醋酸菌的碱性稳定脂质，N-酰基二氢鞘氨醇或者N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇和其它天然物来源的脑功能改善剂，野菜或果实等天然物来源的抗氧化物质等，在脑功能改善方面有协同效果。

本发明中，脑功能改善用组合物中源自醋酸菌的碱性稳定脂质的含有比例为0.0001～5重量％，优选为0.001～1重量％。

还有，脑功能改善用组合物中的N-酰基二氢鞘氨醇或者N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇的含有比例分别为0.00001～0.5重量％，优选为0.0001～0.1重量％。

脑功能改善用组合物中的源自醋酸菌的碱性稳定脂质的含有量不到0.0001重量％，难以发现改善神经传递机制的异常，改善记忆、学习能力的效果，另一方面，如果超过5重量％，随着该组合物制造时的分散效率的恶化，不适于经口摄取，因此无论是不到0.0001重量％还是超过5重量％都不优选。

还有，N-酰基二氢鞘氨醇或者N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇的脑功能改善用组合物中的含量在分别不到0.00001重量％时难以发现改善神经传递机制的异常，改善记忆、学习能力的效果，另一方面，如果超过0.5重量％，随着该组合物制造时的分散效率的恶化，不适于经口摄取，因此无论是不到0.00001重量％还是超过0.5重量％都不优选。

作为本发明的脑功能改善用组合物的源自醋酸菌的碱性稳定脂质的给药量为成人每天0.001mg～100g，优选0.1mg～10g。按成人每天0.1mg的给药量，神经传递机制的异常的改善效果，记忆、学习能力的改善效果小，另一方面，成人每天的给药量如果超过10g则存在无法消化吸收的担心。

还有，N-酰基二氢鞘氨醇或者N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇的给药量为成人每天0.0001mg～10g，优选0.01mg～1g。N-酰基二氢鞘氨醇或者N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇的给药量按成人每天都不到0.01mg，神经传递机制的异常的改善效果，记忆、学习能力的改善效果小，另一方面，成人每天的给药量如果超过1g则存在无法消化吸收的担心。

本发明的脑功能改善用组合物含有源自醋酸菌的碱性稳定脂质，N-酰基二氢鞘氨醇或者N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇作为有效成分，在与其它的各种原料混合均匀后，还可以根据需要混合表面活化剂等，来谋求稳定化。作为这些表面活性剂，可以使用山梨聚糖脂肪酸酯，甘油脂肪酸酯，丙二醇脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯和卵磷脂等。

实施例

接下来，通过实施例等更详细地说明本发明，本发明的范围不受这些实施例的任何限制。

实施例1(源自醋酸菌的碱性稳定脂质的制备)

作为醋酸菌株的木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinusNBRC15237)株。该醋酸菌株保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术本部生物遗传资源部门(千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，是可以发放的醋酸菌。

源自醋酸菌的碱性稳定脂质按以下方法制备。

即，用氯仿-甲醇系溶剂(氯仿∶甲醇∶水＝1∶2∶0.8)从该醋酸菌株的2000g干燥菌体中提取，然后，进行2层分离，作为全脂质级分回收下层。然后，用0.4N NaOH对全脂质级分进行弱碱性分解除去磷脂，按照Folch的组成(氯仿∶甲醇∶水＝8∶4∶3)进行再提取，浓缩干燥，获得源自醋酸菌的碱性稳定脂质。以上提取方法的概要示于图1。

通过使用硅胶平板的薄层层析确认获得的源自醋酸菌的碱性稳定脂质中所含的脂质成分。作为该薄层层析中的展开溶剂，涉及脂肪酸，藿烷类化合物，神经鞘脂类使用氯仿∶甲醇＝96∶4，并且，涉及二氢鞘氨醇和氨基脂的使用氯仿∶甲醇∶水＝65∶16∶2。

作为对照，以从被确认含有藿烷类化合物，N-酰基二氢鞘氨醇，氨基脂质等的醋酸菌提取的纯化品(例如，参照前述的“带大研报”，23卷，p.917-925(1978年)，“岩手大学大学院连合农学研究科博士论文”，后藤英嗣著，p.11-41(2001年)和市售的二氢鞘氨醇(SIGMA社制))作为指标。薄层层析的结果发现在碱性稳定脂质中存在作为对照的化合物。

还有，通过高效液相色谱确认碱性稳定脂质中的主要成分的含量。在无水吡啶和氯化苯酰存在下于70℃使碱性稳定脂质反应10分钟，纯化含有藿烷类化合物和神经鞘脂类的苯酰衍生物。该苯酰衍生物提供给高效液相色谱，检测紫外吸光230nm的波长。

根据采用上述各化合物的市售标准品或确认了结构的醋酸菌中提取的纯化品的标准曲线，计算碱性稳定脂质所含的含量。使用己烷∶异丙醇＝100∶1的溶剂作为高效液相色谱的移动相，流速为1m l/分钟。

这样分析的源自醋酸菌的碱性稳定脂质中的主要成分示于下述表1。还有，可以确认氨基脂质的存在(组合比未确认)，没有发现存在磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰丙三醇等磷脂类。

表1

源自醋酸菌的碱性稳定脂质的主要成分	组合比(重量/重量％)
		藿烷类化合物	11.511
N-酰基二氢鞘氨醇	5.446
		二氢鞘氨醇	3.173

实施例2(采用记忆障碍模式小鼠，通过源自醋酸菌的碱性稳定脂质给药在Morris水迷宫试验中产生的改善效果)

在AD患者的脑和老龄脑中的前脑基底部的Meynert核中发现胆碱能神经的变性、脱落，通过正常大鼠的脑中给药鹅膏蕈氨酸(ibotenicacid)可以使大鼠发生同样的现象。于是，按照常规方法，在7周大的Crj：Wister系的雄性大鼠的前脑基底部Meynert核中注入5μg的神经毒素鹅膏蕈氨酸，制备胆碱能神经脱落的记忆障碍模式大鼠。

据报道批准为AD治疗药的乙酰胆碱酯酶抑制剂，在该记忆障碍模式大鼠中通过经口给药在行为学试验中显示出学习能力的改善。

该记忆障碍大鼠中从鹅膏蕈氨酸注入之日起14天时间，经口给药实施例1制备的醋酸菌碱性稳定脂质，在通过Morris水迷宫路进行的行为学试验中确认改善胆碱能神经的脱落导致的记忆、学习能力的降低的效果。

(1)向记忆障碍模式大鼠给药源自醋酸菌的碱性稳定脂质

设定使用没有记忆障碍的正常大鼠的鹅膏蕈氨酸无处置区，以及记忆障碍模式大鼠的无给药对照区，源自醋酸菌的碱性稳定脂质低用量给药区(以下有时也称为ASL低用量区)，源自醋酸菌的碱性稳定脂质用量给药区(以下有时也称为ASL高用量区)，给药了乙酰胆碱酯酶抑制剂的阳性对照区(以下有时也称为乙酰胆碱酯酶抑制剂给药区)的总计5组，每10只作为1组。

还有，每一组中使大鼠自由摄取作为固形饲料的CRF-1(Oriental酵母工业社制)。还有，源自醋酸菌的碱性稳定脂质给药区，使源自醋酸菌的碱性稳定脂质分散于3％单肉豆蔻酸溶液中，1天每1kg体重大鼠经口给药低用量165mg，高用量1650mg的该碱性稳定脂质。

在鹅膏蕈氨酸无处理区和无给药对照区中，按与源自醋酸菌的碱性稳定脂质给药区同容量只给药3％单肉豆蔻酸溶液。

作为阳性对照区，作为可以获得充分药效的剂量，每天给平均1kg体重的大鼠经口给药1mg的乙酰胆碱酯酶抑制剂9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶氯化氢(9-Amino-1，2，3，4-tetrahydroacridine hydrochloride，SIGMA社制)。在14天的整个给药期间，没有观察到由给药试样产生的大鼠的体重、一般状态的异常。

(2)Morris水迷宫试验

给药开始10天后至13天后，进行Morris水迷宫试验的学习试验，确认了学习的程度。每天的午前和午后1只进行2次试验，在总计4天内进行8次试验。此外，Morris水迷宫装置的概要示于图1。使用视觉上不可识别的透明的丙烯酸制的平台(直径：约12cm，高度：约30cm)和按平台没于水中那样覆盖了高度为约32cm的水的灰色氯乙烯制的圆形小池(直径：约148cm，高度约44cm)。

还有，将小池分成4个象限，在其中的第四象限中央(离小池中央约36cm)设置平台，在小池的周围作为空间的指引设置灯泡。从A～E的各1个地点将大鼠的头朝圆形小池的壁投入，测定到达平台上的时间(秒)(测定时间最大为90秒)。

最大测定时间90秒内挣扎地走到平台上，在平台上停留30秒时，判断识别平台的位置，结束测定。还有，在90秒时从池中救出没有走完的大鼠。

8次试验的投入地点按C地点，E地点，A地点，D地点，B地点，E地点，C地点，A地点。

学习试验结束后，给药开始后至14天后进行探针(probe)试验。

即，卸下平台，观察有多少在其附近停留，确认大鼠的空间认知记忆和地点学习的学习程度。从C地点按大鼠的头朝向圆形小池的壁的方向投入，在0～30秒，30～60秒和60～90秒的观察时间内测定大鼠在第四象限(学习试验时设置平台的象限)停留的时间(第四象限的游泳时间：秒)和通过平台所处位置的次数(通过第四象限内的平台所处地点的次数)。

学习试验，探针试验的结果示于图3～5。此外，所有结果都用各组10只的平均值来表示。

(3)碱性稳定脂质对学习试验的影响

图3中表示对无鹅膏蕈氨酸处理区，无给药对照区，ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区进行8次学习试验，在各区的学习试验中的到达时间的测定结果。还有，图3中的细长条纹表示标准偏差。

其结果是，无鹅膏蕈氨酸处理区中，实验次数每次增加，获得学习效果，到达时间就缩短。还有，在无给药对照区通过试验没有获得学习效果，到达时间没有缩短。

于是，相对于无给药对照区，在ASL低用量区，ASL高用量区，在阳性对照区域发现到达时间缩短，尤其是在ASL高用量区，3，5，6次试验目的到达时间比阳性对照区缩短，在ASL高用量区确认了阳性对照区以上的学习效果。

此外，在试验7次，在无给药对照区和ASL低用量区之间在Steel检验时危险率p＜0.05存在显著差异，与之现对，在无给药对照区和阳性对照区之间没有危险率p＜0.05的显著差异，在ASL低用量区中也确认了阳性对照区以上的学习效果。

(4)碱性稳定脂质给药对探针试验的影响

图4中表示鹅膏蕈氨酸无处理区，无给药对照区，ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区中探针试验时的第四象限的停留时间。还有，细长条纹表示标准偏差。

其结果是，在无给药对照区中，与鹅膏蕈氨酸无处理区相反，第四象限的停留时间延长。第四象限的停留时间在阳性对照区中没有发现延长倾向，与之相对，在ASL低用量区，高用量区，延长至接近于鹅膏蕈氨酸无处理区的水平，由此确认阳性对照区以上的空间认知记忆和地点学习的学习功能的改善效果。

其结果是，图5中表示鹅膏蕈氨酸无处理区，无给药对照区，ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区中探针试验时的平台位置通过次数。还有，细长条纹表示标准偏差。

其结果是，在无给药对照区中，相对于鹅膏蕈氨酸无处理区，平台位置的通过次数显著减少。与之相对，ASL低用量区，ASL高用量区以及阳性对照区的任意一组中均发现通过次数的显著增加。尤其是，ASL高用量区中通过次数高于阳性对照区，由此确认了与阳性对照区同等以上的空间认知记忆和地点学习的学习功能的改善效果。

还有，相对于未给要对照区，在ASL低用量区，ASL高用量区以及阳性对照区这3组之间，在Steel检验中发现有危险率p＜0.05的显著差异。

(5)考察

以上结果，学习试验中的平台到达时间(图3)，没有记忆障碍的鹅膏蕈氨酸无处理区中每次重复进行试验可获得学习效果，到达时间缩短。

与之相对，在ASL低用量区，ASL高用量区中的学习试验中获得了与阳性对照区同等水平以上的学习效果。即，在ASL高用量区中，第3，5，6次试验的到达时间比阳性对照区缩短，还有，在第7次试验时在ASL低用量区中，与无给药对照区相反，发现了显著的到达时间的缩短，在阳性对照区中没有发现显著缩短。

由此表明源自醋酸菌的碱性稳定脂质给药产生了学习能力的改善效果。

此外，探针试验中的结果(图4和图5)中也确认了同样的改善效果。即，进行了鹅膏蕈氨酸处理的无给药对照区中，与无鹅膏蕈氨酸处理的区域相对，第四象限的停留时间延长，平台位置的通过次数显著减少，空间认知记忆和地点学习的功能降低。

与之相对，ASL低用量区，ASL高用量区中第四象限的停留时间延长至接近无记忆障碍大鼠的水平。第四象限的停留时间，在阳性对照区中没有发现改善倾向。此外，还确认了平台位置的通过次数相对于无给药对照区显著增加，在ASL高用量给药区比阳性对照区有所增加。

由此确认通过源自醋酸菌的碱性稳定脂质的给药产生的改善空间认知记忆和地点学习的功能的优异效果。

根据如上的学习试验、探针试验的结果，在行为学试验中确认了醋酸菌碱性稳定脂质通过经口摄取发挥了改善在AD患者的脑和老龄脑等中发现的前脑基底部Meynert核中的胆碱能神经的脱落导致的学习、记忆障碍的优异效果。

实施例3(采用记忆障碍模式大鼠的由源自醋酸菌的碱性稳定脂质的给药产生的脑内单胺含量的改善效果)

伴随AD患者的脑和老龄脑等中发现的前脑基底部Meynert核中的胆碱能神经的脱落，前脑皮质和海马中去甲肾上腺素和血清素等单胺类化合物的浓度降低。清楚了单胺类化合物的代谢异常与各种神经，精神疾病的关连性。

于是，对实施例2的各组大鼠，测定它们的脑内物质的消长。

即，摘出实施例2制备的记忆障碍的模型大鼠的脑，测定前脑皮质和海马的单胺的含量。

(1)记忆障碍模型大鼠脑中单胺含量的测定方法

对实施例2中鹅膏蕈氨酸无处理区，无给药对照区，ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区的5组每组各5只大鼠，用断头器将给药14天后的大鼠断头，取出脑，将脑浸入冰冷的生理盐水(株式会社大塚制药工场)。然后，取出脑，从分割的脑中取出前脑皮质、海马，测定单胺和其代谢物含量。测定方法示于以下(a)～(c)。

(a)HPLC-ECD系统

泵系统EP-300(EICOM公司制)

脱气装置DG-300(EICOM公司制)

柱恒温槽ATC-300(EICOM公司制)

电化学检测器ECD-300(EICOM公司制)

石墨电极WE-3G(EICOM公司制)

垫圈GS-25(EICOM公司制)

参照电极RE-100(EICOM公司制)

自动取样器231XL(M&S机器社制)

注射泵402(M&S机器社制)

冷却器832(M&S机器社制)

数据处理装置EPC-300(EICOM公司制)

均化器PRO 260(PRO Scientific Inc.社制)

冷却离心机5417R(Eppendorf Yatron)

(b)试样的前处理

脑试样容器中加入0.2N高氯酸溶液后，添加内部标准液，用均化器均化，冰冷60分钟以上后，用冷却离心机离心分离(约4℃，13800rpm，5分钟)，将上清作为测定试样。

(c)HPLC条件

·分离柱：Eicompak SC-5ODS(3.0φ×150mm)(EICOM公司制)

·预备柱：PC-04(已填充AC-ODS剂)(EICOM公司制)

·移动相：0.1mol/L醋酸-柠檬酸缓冲液(pH 3.5)/甲醇/100mg/ml，1-辛烷磺酸钠溶液/5mg/mlEDTA·2·Na溶液的混合液(830/170/1.85/1)

流速：0.5ml/分钟

柱温：25℃

冷却器温度：4℃

注入量：20μl

加电压：+750mV

(2)碱性温度脂质给药对前脑皮质和海马单胺含量的影响

通过以上的测定方法，鹅膏蕈氨酸无处理区，无给药对照区，ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区的前脑皮质中去甲肾上腺素(NE)含量和血清素代谢物5-羟基吲哚乙酸(5-HI AA)含量的结果示于图6。图6中的细长条纹表示标准偏差。

其结果是，相对于无给药对照区，ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区的NE含量、5-HIAA显示出增加倾向。

在鹅膏蕈氨酸无处理区和无给药对照区之间的Student的t检验中，NE含量中发现危险率p＜0.01，5-HIAA含量中发现危险率p＜0.01，存在显著差异。与之相对，鹅膏蕈氨酸无处理区和ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区之间没有发现危险物为p＜0.05的显著差异，均发现恢复到接近鹅膏蕈氨酸无处理区的水平。此外，在NE含量中，在ASL高用量区中比阳性对象区增加，由此确认了与阳性对象区同等以上的改善效果。

同样，鹅膏蕈氨酸无处理区，无给药对照区，ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区的海马的NE含量和5-HIAA含量的测定结果示于图7。图7中的细长条纹表示标准偏差。

其结果是，相对于无给药对照区，ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区的NE含量、5-HIAA都显示出增加倾向。

在鹅膏蕈氨酸无处理区和无给药对照区之间的Student的t检验中，NE含量中发现危险率p＜0.05，存在显著差异。与之相对，鹅膏蕈氨酸无处理区和ASL低用量区，ASL高用量区，阳性对照区之间没有发现危险物为p＜0.05的显著差异，均发现恢复到接近鹅膏蕈氨酸无处理区的水平。此外，在NE含量中，在ASL高用量区中比阳性对象区增加，由此确认了与阳性对象区同等以上的改善效果。

还有，这些结果都是用5只的平均值来表示。

(3)考察

以上结果，在前脑皮质中，有记忆障碍的无给药区中NE含量和5-HIAA含量相对于无记忆障碍的鹅膏蕈氨酸无处理区显著降低。与之相对，在ASL低用量区和ASL高用量区中NE含量，5-HIAA含量相比无给药区均有增加、改善倾向。还有，在海马中，相对于有记忆障碍的无给药区，ASL低用量区，ASL高用量区中NE含量，5-HIAA含量均有增加、改善倾向。ASL高用量区中，前脑皮质、海马中NE含量均比阳性对照区增加。

如上所述，确认了由源自醋酸菌的碱性稳定脂质给药产生的单胺类化合物的代谢。还有，根据通过源自醋酸菌的碱性稳定脂质的经口摄取产生的单胺类化合物的代谢改善效果，可以期待AD和老龄脑中记忆，学习能力的改善和改善与神经传递机制的异常相关的各种神经、精神疾病的效果。

实施例4(源自醋酸菌的碱性稳定脂质的分级)

实施例1中制备的源自醋酸菌的碱性稳定脂质再用层析根据极性的强度进行分级，确认其脂质结构。

即，将10g碱性稳定脂质提供给用氯仿平衡过的硅胶柱，用按氯仿∶醋酸＝100∶1的容量比混合的溶剂洗涤后，将通过用氯仿∶醋酸＝97∶3的溶剂洗脱获得的级分进行干燥，获得了约0.5g的级分1。

然后，将通过用氯仿∶甲醇＝96∶4，95∶5的溶剂洗脱获得的级分进行干燥，获得了约0.5g的级分2。将通过用氯仿∶甲醇＝2∶1的溶剂洗脱残余脂质获得的级分进行干燥，获得了约0.5g的级分3。

对获得的级分1，通过采用硅胶板的薄层层析确认构成脂质。作为该薄层层析中展开溶剂，采用氯仿∶甲醇＝96∶4。其结果是，级分1的构成脂质是与实施例1中使用的确认了N-酰基二氢鞘氨醇的醋酸菌中获得的纯化品同一移动度的单一的点。此外，按照常规方法，用含水甲醇性盐酸分解级分1，通过薄层层析分离成鞘氨醇类碱基(sphingoidbase)和脂肪酸，并进行纯化。

对于这些鞘氨醇类碱基和脂肪酸，按照常规方法，进行三甲基甲硅烷基化反应，通过气相色谱-质谱分析进行结构分析，结果发现含有作为N-酰基二氢鞘氨醇的N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-顺式-vaccenoyl-二氢鞘氨醇。

根据以上结果，确认了级分1的通过薄层层析检测到的单一的点是N-酰基二氢鞘氨醇。

此外，通过薄层层析确认了级分2，级分3的构成脂质。作为薄层层析中的展开溶剂，级分2使用氯仿∶甲醇＝96∶4的溶剂，级分3使用氯仿∶甲醇∶水＝65∶16∶2的溶剂。作为对照，使用确认了实施例1中使用的藿烷类化合物，氨基脂质的结构的从醋酸菌中获得的纯化品以及市售的二氢鞘氨醇(SIGMA公司制)。

薄层层析的结果是，级分2的点与藿烷类化合物的对照一致，级分3的点与氨基脂质的对照一致。

根据以上结果，分别确认了级分2中检测到的薄层层析的点含有藿烷类化合物，级分3中检测到的薄层层析的点含有氨基脂质。

实施例5(神经突起伸长作用的确认)

对实施例4中纯化的级分1(包括N-酰基二氢鞘氨醇)，级分2(包括藿烷类化合物)和级分3(包括二氢鞘氨醇、氨基脂质)的3种级分，用神经模式细胞PC-12细胞，确认作为神经营养因子样作用的神经突起伸长分化的作用的有无。

还有，与实施例4一样，将10g碱性稳定脂质提供给经氯仿平衡过的硅胶柱，用按氯仿∶醋酸＝100∶1的容量比混合的溶剂洗涤后，通过用氯仿∶甲醇＝2∶1的溶剂洗脱，制成含有所有级分1、级分2和级分3的构成脂质的级分，以该级分作为不含脂肪酸的碱性稳定脂质级分，同样确认神经突起伸长分化的作用的有无。

PC-12细胞用从RIKEN Cell Bank购买的产品(RCB0009)，用胶原V涂覆盘在Dulbecco′s培养基(DMEM)，5％牛血清(FBS)，10％马血清(HS)，100μg/ml链霉素，100单位/ml青霉素的培养基中，于37℃，5％CO2的条件下培养。培养交换通过每2～3天1次，传代用胰蛋白酶处理每7天进行1次。

对约70％融合的PC12细胞进行胰蛋白酶处理，离心，再悬浮，在35mm直径的胶原V涂覆盘中以5×10⁴细胞/ml的浓度播种。进行数小时培养，使细胞粘着于盘表面后，按1％的浓度添加在DMSO中以各添加浓度的100倍的浓度溶解的级分1，级分2，级分3和碱性稳定脂质级分。

然后，于37℃，5％CO₂的条件下培养48小时后，用相位差显微镜观察细胞的形态、突起。突起的长度被看作是分化到细胞直径以上的细胞，对每个视野的总细胞数和分化的细胞数计数。按每个框中约100个细胞那样随机拍摄显微镜像，对10张照片计数，计算出平均数，分化的细胞数相对于总细胞数的比例为分化细胞率。

分别添加无添加和级分1，级分2，级分3和碱性稳定脂质级分后48小时时的PC12细胞的分化细胞率示于表2。

根据表2，在添加碱性稳定脂质时，与无添加相比，分化细胞率大幅上升。还有，发现通过按浓度10μg/ml添加级分1，与无添加相比，分化细胞率的大幅上升。

根据以上结果，确认了作为碱性稳定脂质中的脂质成分，含有级分1，即N-酰基二氢鞘氨醇的级分的神经营养因子样的作用。即，表明通过摄取N-酰基二氢鞘氨醇，改善神经变性疾病和伴随年龄增长的神经传递机制的功能降低。

表2

实施例6(N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇的神经突起伸长作用的确认)

对于N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇，通过与实施例5相同的方法，确认了对PC-12细胞的神经营养因子样作用。

即，N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇的化学合成品(纯度99％以上，Matreya社)按各添加浓度的100倍浓度溶解于DMSO，再使用，并且，实施例5中实施的级分1(含N-酰基二氢鞘氨醇)和碱性稳定脂质级分，以1％的浓度添加，其它与实施例5同样方式实施。

各成分添加后48小时时的PC12细胞的分化细胞率示于表3。

根据表3，通过按5～25μg/ml的浓度添加N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇，与添加碱性稳定脂质级分和级分1时一样，与无添加时相比，分化细胞率大幅上升。

根据以上结果，确认了N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇的神经营养因子样作用，表明通过摄取N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇，改善神经变性疾病和伴随年龄增长的神经传递机制的功能降低。

表3

实施例7(片剂的制备)

用高速离心机器(8000rpm，20分钟)对醋酸发酵液10千升的收集菌体，获得了湿菌体10kg。用蒸馏水洗涤获得的10kg湿菌体，用大型冷冻干燥机冷冻干燥，获得了1.8kg干燥菌体。

将获得的干燥菌体1Kg与10升乙醇一起装入索氏(Soxhlet)提取器中，进行20小时加热环流。对获得的提取液进行减压干燥，溶解于5升的丙酮。通过过滤除去沉淀物，用转缸式蒸发机对过滤液进行蒸发干燥，获得了淡黄褐色的醋酸菌脂溶性有机溶剂提取物约300g。

加入获得的脂质级分1g(0.7重量％)，结晶纤维素35g(26.9重量％)，干燥玉米淀粉67g(51.5重量％)，乳糖22g(16.9重量％)，硬脂酸钙2g(1.5重量％)和作为结合剂的聚乙烯吡咯烷酮3g(2.3重量％)，混合粉末化后，填充于硬明胶胶囊中。

可以期待这样制备的片剂，作为脑功能改善用组合物可以有效地经口摄取。

实施例8(果冻的制造)

用高速离心机器(8000rpm，20分钟)对醋酸发酵液10千升的收集菌体，获得了湿菌体10kg。使获得的湿菌体10kg分散于等量的蒸馏水。在通过使分散的20kg的醋酸菌分散液3次通过高压均化器(20000psi)实施细胞破坏处理后，用大型冷冻干燥机冷冻减压干燥，获得了1.5kg的干燥菌体粉末。

均匀混合获得的干燥菌体粉末8g(0.8重量％)，砂糖250g(25重量％)，角叉菜胶1.6g(0.16重量％)，刺槐豆胶(Locust beangum)0.8g(0.08重量％)，黄原胶(xanthan gum)0.8g(0.08重量％)，获得粉状混合物。在锅中计量300g的水，溶解黑糖30g(3.0重量％)，再混合还原糖浆(hydrogenated syrup)150g(15重量％)，加入先前获得的粉状混合物，一边搅拌，再混合。将它们搅拌均匀，加入余下的水258.8g，加温。溶液温度在85℃加热10分钟溶解后，用流水冷却，获得了含醋酸菌体的果冻食品。

可以期待，这样制备的果冻可以作为脑功能改善用组合物有效经口摄取。

实施例9(食醋的制造)

用高速离心机器(8000rpm，20分钟)对醋酸发酵液10千升收集菌体，获得了湿菌体10kg。使获得的湿菌体10kg分散于100L食醋中。使分散的醋酸菌分散液3次通过高压均化器(20000psi)实施细胞破坏处理。将该溶液分注于容积为500ml的瓶中，通过加温至75℃进行杀菌，获得了含醋酸菌体的食醋。

可以期待，这样制备的食醋可以作为脑功能改善用组合物有效经口摄取。

产业上利用的可能性

本发明可以提供所谓的非合成药物而是像食品成分或天然提取物等这样的安全材料并且具有更强的脑功能改善效果的物质。因此，本发明涉及的脑功能改善用组合物通过作为日常饮食等方式摄取，可以预期预防和改善神经、精神疾病的效果。

Claims (5)

1、脑功能改善用组合物，其特征在于含有源自醋酸菌的碱性稳定脂质作为有效成分。

2、脑功能改善用组合物，其特征在于含有N-酰基二氢鞘氨醇作为有效成分。

3、脑功能改善用组合物，其特征在于含有N-2′-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇作为有效成分。

4、权利要求1-3任一项中记载的脑功能改善用组合物，其特征在于，其为饮品和食品。

5、权利要求4中记载的脑功能改善用组合物，其特征在于，其为食醋。

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