CN101594874B - 6‑烷氧基烷基雌二醇衍生物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有如下结构的化合物：其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7和R9独立地为氢，C1‑C6烷基或取代的烷基，卤素，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷部分；符号表示单键或双键，并且当符号为双键且构成3或17位上的酮基时，R7或R6分别不存在；符号‑‑‑表示在10位上存在或不存在键；且～～～符号表示与立体化学无关的任意类型的键。本发明还包括所述化合物的对映体，其它立体化学异构体，水合物，溶剂合物，互变体和药学上可接受的盐。

Description

6-烷氧基烷基雌二醇衍生物及用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2006年11月30日提交的美国临时申请号US60/867,980的利益。本申请还是2006年10月2日提交的目前悬而未决的美国申请号US11/541,987的部分继续申请，该申请要求2005年9月30日提交的美国临时中请号US60/722,204的优先权利益。将所有这类申请的教导完整地引入本文。
技术领域
本发明涉及通式(I)的6-烷氧基烷基雌二醇化合物且特别是化合物(R或S)6-羟甲基-或(R或S)6-甲氧基甲基-(8R或S，9S，13R或S，14S，17R或S)-13-甲基-7，8，9，11，12，14，15，16，17-十氢环戊[a]菲-3，17-二醇及其药学上可接受的盐或其前体药物的组合物及其制备方法。本发明还涉及包含这类化合物的体外和体内用于诊断应用和治疗增殖性疾患诸如癌症的药物组合物。
式(I)
背景技术
增殖性细胞病症，诸如肿瘤和原发性恶性肿瘤{本文的癌症}尤其成为问题，使得它们产生侵害周围组织并且迁移到体内远离器官的倾向。迄今为止，最频繁使用的治疗瘤形成的方法、尤其是治疗瘤形成的实体瘤形式的方法包括外科手术，放疗，药物疗法和上述方法的组合。
由于每年经诊断的癌症病例超过1百万，并且在美国每年有超过50万声称的癌症，所以对这类疾患的新治疗方式的需求增加。前列腺癌，肺癌和结肠直肠癌仍然是男性中最常见的癌症；而乳腺癌，结肠直肠癌和肺癌是女性中最常见的癌症。
近年来，在控制这些疾患中取得了显著进展。在癌症临床管理中的成功实例中的至少一个是早期的诊断和治疗选择目前正用于原发性乳腺癌。已经证实引入阻断雌激素作用的有效和无毒性的抗雌激素药是有效的。
他莫昔芬是主要的首选雌激素受体调节剂之一，它们已经成为用于乳腺癌激素治疗的一线疗法，既是辅助治疗，又可治疗转移性疾病。他莫昔芬为结合雌激素受体的雌二醇的竞争性抑制剂，所述的雌激素受体抑制其雌激素结合DNA上的雌激素结合元件。此外，对芳香酶抑制剂在特异性阻断雌激素局部产生中的应用的关注已经增加，所述的雌激素的局部产生主要促成激素应答性疾病，诸如乳腺癌。
将芳香酶(CYP19)描述为将绝经前和绝经后女性中的雄激素转化成雌激素的主要酶。将雌激素通过芳香酶抑制剂的消耗描述为具有激素依赖性乳腺癌的某些绝经患者的有效和选择性疗法。依西美坦(作为阿诺新销售，在化学上描述为6-亚甲基雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮)并且作为不可逆的甾体芳香酶失活剂起作用。它被认为作为芳香酶的假底物起作用并且被加工成不可逆结合该酶的活性位点的中间体，从而使其失活。美国专利US4,808,616和US4,904,650中披露了6-亚烷基雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮衍生物，诸如依西美坦以及其制备方法，将该文献教导的内容完整地引入本文。美国专利US4,876,045中披露了制备雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮类的6-亚甲基衍生物的方法。美国专利US4,990,635中披露了制备雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮类的6-亚甲 基衍生物的方法。
可用于制备依西美坦的中间体的制备披露在美国专利US3,274,176中。在德国专利DD 258820中，由雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮通过1，3-二吡咯烷并雄甾-3，5-二烯-17-酮制备6-羟甲基-雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮。
2005年1月14提交的共同悬而未决的国际申请PCT/US2005/001248(PCT公开号WO2005/070951)中也描述了用于制备依西美坦的中间体的制备方法，将该申请完整地引入本文作为参考。依西美坦的结构如下所示。
Schneider等在″Course of the reaction of steroidal 3，5-dienamines withformaldehyde″，Helvetica Chimica Acta(1973)，56(7)，2396-2404中披露了下述化合物：
其中 符号表示双键，它意旨酮基并且R6不存在；且其中 符号表示单键，R6为氢(即醇基)。不同于本发明的化合物，Schneider的化合物不包括雌二醇，睾酮或二氢睾酮的变化形式。
雌烷类的三羟基取代的衍生物披露在Tadanier等的美国专利 US3,377,363中，但未披露本发明化合物的芳族环上的3羟基取代基。
De Funari等的美国专利US5,914,324中披露了用于高血压和心力衰竭的6羟基和氧基雄甾烷衍生物。Gobbini等的美国专利US6,384,250中披露了制备(E，Z)3-(2-氨基乙氧基亚氨基)-雄甾烷-6，17-二酮中6位上的羟基和酮取代基。这些化合物涉及治疗心力衰竭。未披露6位上烷基羟基取代的作用。
Tanenbaum等在“Crystallographic comparison of thee strogenandprogestone receptor′sligand binding domains″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Biochemistry，Vol.95，pp 5998-6003中披露了ER受体的机制并且注意到含带有3-羟基取代基的芳族环的雌二醇充分结合ER配体结合区。其中披露了不含19甲基取代基的平伏芳族基团是有利的。如上所述，鉴定用于治疗癌症的新的和有效的活性剂的需求仍然存在。
发明内容
根据上述描述，本发明涉及化疗化合物，组合物及其使用和制备方法，由此克服了包括如上所述的现有技术中的各种缺陷和缺点。
本发明的一个方面涉及式I和II的化合物。
式(I) 式(II)
其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7和R9独立地为氢，C1-C6烷基或取代的烷基，卤素，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷部分；且 符号表示单键或双键，并且当 符号为双键且构成3或17位上的酮基时，R7或R6相应地不存在；符号---表示在10位上存在或不存在键；且 符号表示与立体化学无关的任意类型的键。这些化合物还包括对映体， 其它立体化学异构体，水合物，溶剂合物，互变体及其药学上可接受的盐。
本发明涉及以治疗方式治疗哺乳动物受试者(例如人体患者)癌症的方法。在本发明的该方面中，提供了抑制哺乳动物受试者中肿瘤或癌细胞生长的方法。在这类方法中，使细胞暴露于或接触式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的对映体，其它立体化学异构体，水合物，溶剂合物、互变异构体、或盐。在本发明方法的具体的非限制性实施方案中，式(I)或(II)的化合物用于以治疗方式治疗如本文所述鉴定的癌症状态。在本发明方法的另一个具体的非限制性实施方案中，包含式(I)或(II)的化合物的组合物用于以治疗方式治疗如本文所述鉴定的癌症状态。
本发明的化合物可以用于治疗直接或间接受到激素和/或雌激素相关活性影响的任意肿瘤，包括，但不限于涉及乳腺，胰腺，肺，结肠，前列腺，卵巢癌和脑，肝，脾，肾，淋巴结，小肠，血细胞，骨，胃，子宫内膜，睾丸，卵巢，中枢神经系统，皮肤，头和颈，食道或骨髓癌以及血癌的实体瘤，所述的血癌诸如白血病，急性前髓细胞性白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，脊髓发育不良，骨髓增生性疾病或顽固性贫血。
本发明的化合物还可以用于哺乳动物中基于组合的治疗癌症的疗法。这类方法可以包括给予式(I)或(II)的化合物并组合其它辅助癌症疗法，诸如化疗，放疗，基因疗法，激素疗法和其它本领域公知的癌症疗法。
关注本发明的任意化合物用于以药物，前体药物乃至活性代谢物的形式对哺乳动物受试者给药。在本发明的治疗方法中，术语″给药″应包括使用具体披露的化合物或未具体披露的化合物治疗所述的各种疾患，所述未具体披露的化合物在对患者给药后在体内转化成特定的化合物并且表现出治疗活性。
本发明的另一个方面涉及抑制癌细胞生长的方法，包括给患者提供式(III)的前体药物，其中R5为甲基或氢；
式(III)
并且形成式(IV)，(V)，(VI)，(VII)和(VIII)的代谢物，其中其式II对应物的R3，R4，R5，R7，R8中任意一个可以为甲基或氢。这类代谢物可以包括例如如下所示的结构：
(IV)A-NDC-1088 (IV)B-NDC-1099
(V)A-NDC-1033 (V)B-NDC-1022
(VI)A-NDC-1110 (VI)B-NDC-1044
(VII)A-NDC-1066 (VII)B-NDC-1055
式(VIII)-A 式(VIII)-B
本发明的其它目的，特征，有益性和优点从本概述和如下描述的某些实施方案中显而易见，并且对具有各种化疗化合物，操作方法和/或方式的知识的本领域技术人员而言显而易见。
附图说明
图1-表示雌二醇生物合成路线。
图2-表示对本发明化合物预测的代谢途径。
图3-表示根据荧光素酶表达(RLU＝相对光单位)测定的NDC-1011，NDC-1022，NDC-1033，NDC-1044，NDC-1055和NDC-1066对雌激素受体β(ER-β)活性的作用。使用两种质粒构建体，即报道构建体ERE-tk-荧光素酶和CMV-ER-β构建体转染CV-1细胞。转染的对照组(Ctrl)CV-1细胞不接受处理，而雌二醇处理的细胞(E2)接受单独添加的10-9M(1nM)雌二醇。在NDC化合物的情况中，分别单独以10-8 M(10nM)(每种测试化合物示于左侧柱形图)或以10-8M+10-9M雌二醇(E2)(每种测试化合物示于右侧柱形图)添加每种化合物。
图4表示根据荧光素酶表达(RLU＝相对光单位)确定的NDC-1011，NDC-1033，NDC-1055和NDC-1066对雌激素受体α(ER-α)活性的作用。使用两种质粒构建体，即报道构建体ERE-tk-荧光素酶和CMV-ER-α构建体转染CV-1细胞。转染的对照组(Ctrl)CV-1细胞不接受处理，而雌二醇处理的细胞(E2)接受单独添加的10-9M(1nM)雌二醇。在NDC化合物的情况中，分别单独以10-8M(10nM)(每种测试化合物示于左侧柱形图)或以10-8M+10-9M雌二醇(E2)(每种测试化合物示于右侧柱形图)添加每种化合物。
图5表示如对细胞系HT-29，SK-OV-3，NCI-H23，MCF-7，MDA-MB-231，OVCAR-3，CAPAN-1，CAPAN-2，SH-SY5Y，A-549和PC-3各自测定的NDC-1022(左侧柱形图)，NDC-1033(中间柱形图)和NDC-1044(右侧柱形图)的IC50生长抑制数据(以μM计)。
图6表示如对细胞系HT-29，SK-OV-3，NCI-H23，MCF-7，MDA-MB-231，OVCAR-3，CAPAN-1，CAPAN-2，SH-SY5Y，A-549和PC-3各自测定的NDC-1022，NDC-1033和NDC-1044的IC50生长抑制数据(以μM计)。
具体实施方式
除非另作陈述，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义并且应理解为具有下述含义。将本文涉及的所有公开文献和专利完整地引入本文作为参考。除非另作陈述，否则涉及的具体化合物包括所有这类化合物的异构体形式，包括其外消旋和其它混合物。除非另作陈述，否则涉及的具体化合物还包括例如本文所述的其离子，盐，溶剂合物(例如水合物)，被保护形式，前体药物和其它立体异构体。
便利或理想的是制备，纯化和/或处理活性化合物的相应盐，例如药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例描述在Berge等的1977，″Pharmaceutically AcceptableSalts，″J.Pharm.Sci.，Vol.66，pp.1-19中并且在本文中讨论。
本发明的抗增殖性化合物具有治疗癌症的应用，且由此本发明进一步提供了抗癌药。本文所用的术语″抗癌药″涉及治疗癌症的化合物(即用于治疗癌症的化合物)。抗癌作用可以通过一种或多种机制产生，包括，但不限于调节细胞增殖，抑制血管发生(形成新血管)，抑制转移(肿瘤从其起点扩散)，抑制侵入(肿瘤细胞扩散入相邻的正常结构)或促进细胞凋亡(程序性细胞死亡)。
本发明进一步提供了通过治疗用于治疗人或动物体的方法中的活性化合物。这类方法可以包括对这类受试者给予治疗有效量的活性化合物，优选如本文进一步讨论的药物组合物形式。
本文所用的术语″治疗″或″疗法″在治疗疾患的上下文中一般治疗哺乳动物受试者和对其实施疗法，无论是人还是非人的动物(例如在兽医应用中)，其中实现某些期望的治疗作用，例如抑制疾患发展，并且包括减缓进展速率，使进展速率停止，改善疾患和/或治愈疾患。还包括作为预防性措施的治疗。治疗包括组合的治疗和疗法，其中合并有两种或两种以上治疗或疗法，例如依次或同时进行。治疗和疗法的实例包括，但不限于化疗(给予活性剂，包括，例如药物，抗体(例如作为在免疫疗法中)，前体药物(例如使用保护基，包括在适当位置，诸如3或17位上的磷酸衍生物和次磷酸酯，用于光动力疗法，GDEPT，ADEPT的化合物等)；手术；放疗；和基因疗法。
本文所用的术语″立体化学异构体″意旨彼此仅以原子空间定向上不同的异构体。在本发明中具有特别重要性的两种立体异构体为对映体和非对映体，这取决于两种异构体彼此是否为镜像。在优选的实施方案中，请求保护的制剂包含分离，拆分的这样的化合物且″基本上不含其它异构体″。
本文所用的术语″治疗有效量″涉及以相当于合理的收益/风险比有效产生某些期望的治疗作用的活性化合物或材料、包含活性化合物的组合物或剂型的用量。
术语″患者″意旨动物，包括哺乳动物，优选人。
术语″患者区域″意旨患有增殖性病症，癌症或肿瘤的患者的特定 区域或部分，并且在某些情况中意旨整个患者体内的区域。典型的这类区域为肺部区域，胃肠区域，乳腺区域，肾区域和其它身体区域，组织，淋巴细胞，受体，器官等，包括脉管系统和循环系统和癌性组织。″患者区域″包括，例如用披露的化合物和组合物治疗的区域。″患者区域″优选体内，不过可以为体外。
术语″组织″一般意旨可以执行特定功能的专用细胞。术语″组织″可以指单个细胞或多个细胞或细胞聚集物，例如膜，血液或器官。术语″组织″还包括涉及的异常细胞或多个异常细胞。典型的组织包括乳腺组织，包括乳腺细胞，膜组织，包括内皮和上皮，层，结缔组织，包括间质组织和肿瘤。
化合物
本发明涉及式(I)-(II)的化疗化合物：
式(I) 式(II)
其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9独立地为氢，C1-C6烷基或取代的烷基，卤素，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷部分；且 符号表示单键或双键，并且在 符号为双键且构成3或17位上的酮基时，R7或R6相应地不存在；符号---表示在10位上存在或不存在键；且 符号表示与立体化学无关的任意类型的键。这些化合物还包括对映体，其它立体化学异构体，水合物，溶剂合物，互变体及其药学上可接受的盐。
在式I的一个实施方案中，R5，R6，R7，R9为氢原子，甲基或Cl；R1，R2为氢或甲基；R3，R4为C1-约C6烷基或取代的烷基，卤素，且 为相当于醇基的单键。在另一个实施方案中，C-6碳上的立体化学包括S或R型对映体或非对映体。
本发明实施方案的化合物可以用于药物组合物。这类组合物可以包含一种或多种选自上述的、如下例证的、或否则就是本文推断的那些化合物及它们的组合。在某些实施方案中，这类组合物可以包含药学上可接受的载体成分。由于不受限制，所以这类组合物可以包含化合物的外消旋混合物。在某些实施方案中，这类混合物可以作为S和R型对映体存在，优选基本上不含其它异构体的其分离和纯化形式，并且R5或R7可以选自H，C1-C6烷基或取代的烷基和卤素。
本发明的化合物可以具有不对称中心并且可以作为外消旋物、外消旋混合物或作为各非对映体或对映体出现，诸如(S)6-甲氧基甲基(8S，9S，13S，14S，17S)-13-甲基-7，8，9，11，12，14，15，16，17-十氢环戊[a]菲-3，17-二醇；(R)6-甲氧基甲基(8S，9S，13S，14S，17R)-13-甲基-7，8，9，11，12，14，15，16，17-十氢环戊[a]菲-3，17-二醇；(R)6-甲氧基甲基(8R，9S，13R，14S，17R)-13-甲基-7，8，9，11，12，14，15，16，17-十氢环戊[a]菲-3，17-二醇(NDC-1022)；或(S)6-甲氧基甲基(8R，9S，13R，14S，17R)-13-甲基-7，8，9，11，12，14，15，16，17-十氢环戊[a]菲-3，17-二醇(NDC-1033)。
本发明的一个实施方案涉及制备6取代的雌二醇类的R或S型对映体，R或S型非对映体的方法。制备(例如不对称合成)和分离(例如分级结晶和色谱方式)这类异构体形式的方法为本领域公知的或易于通过采取本文教导的方法获得。一种这类方法描述在共同悬而未决的美国申请SN11/541,987中，将该文献的教导完整地引入本文。
本发明的另一个实施方案涉及制备雌二醇的6-羟甲基或6-甲氧基甲基衍生物的方法。制备雌二醇衍生物的反应方案如下方案1中所示。这类方法可以包括使雌二醇的叔丁基二甲基甲硅烷基衍生物与LIDAKOR/THF/甲醛反应而得到6-羟基化化合物，随后进行如下的这类步骤：(i)水解而得到雌二醇的6-羟甲基衍生物NDC-1066；和/或(ii)用硫酸二甲酯处理，随后水解而得到雌二醇的6-甲氧基甲基衍生物NDC-1033。可以通过进一步氧化NDC-1033的C-17羟基位置获得NDC-1088。
在一种备选的手段中，还可以通过包括如下这类步骤的方法制备 本发明的化合物：(i)保护雌二醇化合物，(ii)用LIDAKOR/丁基锂/二异丙基胺/叔戊酸钾使被保护的雌二醇化合物的苄型6-位酰化，(iii)用氢化铝锂还原6位醛，(iv)使雌二醇化合物的被保护区域脱保护。制备雌二醇衍生物的反应方案如下方案2中所示。
可以通过如下所示方案中所述合成本发明的化合物：
方案1制备本发明的化合物
方案2-制备本发明化合物的可替代方法
作为本文所述类型的合成操作或其直接变型过程中可利用的、本发明的各种甲氧基烷基衍生物仅限于选择的烷化剂，诸如关注本发明的本领域技术人员理解的这类衍生物，所述这类变型也是本领域技术人员可以理解的。因此，不受限制，各种C1-C6烷基和取代的烷基(例如C1-C6直链，取代的直链，支链和取代的支链烷基，这类取代基为本领域所理解的)试剂可以如本文所述用于制备相应的甲氧基烷基衍生物。
本发明涉及治疗哺乳动物受试者(例如人体患者)癌症的方法。在 本发明的该方面中提供了抑制肿瘤或癌细胞生长的方法。在这类方法中，使细胞暴露于或者接触式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或水合物：
式(I)
其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7和R9独立地为氢，C1-C6烷基或取代的烷基，卤素，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷部分；且 符号表示单键或双键，并且当 符号为双键且构成3或17位上的酮基时，R7或R6相应地不存在；符号---表示在10位上存在或不存在键；且 符号表示与立体化学无关的任意类型的键。这些化合物还包括对映体，其它立体化学异构体，水合物，溶剂合物，互变体及其药学上可接受的盐。
这些方法可以用于治疗任意的肿瘤，所述的肿瘤可以直接或间接受到激素和/或雌激素相关活性影响，包括，但在任何方面均不限于与乳腺，胰腺，肺，结肠，前列腺，卵巢癌，以及脑，肝，脾，肾，淋巴结，小肠，血细胞，骨，胃，子宫内膜，睾丸，卵巢，中枢神经系统，皮肤，头和颈，食道或骨髓癌以及血癌相关的实体瘤，所述的血癌诸如白血病，急性前髓细胞性白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，脊髓发育不良，骨髓增生性疾病或顽固性贫血。
此外，用于治疗各种癌症状态的本发明化合物的给药可以包括给予式(I)的化合物与其它辅助癌症疗法，诸如化疗，放疗，基因疗法， 激素疗法和其它本领域公知的癌症疗法的组合。目前披露的化合物与其它抗癌药或化疗药的联合用药属于本发明的范围。这类活性剂的实例可以在V.T.Devita和S.Hellman(编辑)，第6版(2001年2月15日)，LippincottWilliams & Wilkins Publishers的CancerPrinciples and Practice of Oncology中找到。本领域普通的医师，兽医或临床医师能够基于药物的具体特性和涉及的癌症确认哪些活性剂的组合为有用的。这类抗癌药包括如下：雌激素受体调节剂，雄激素受体调节剂，类视色素受体调节剂，细胞毒性剂，抗增殖剂，异戊二烯蛋白转移酶抑制剂，HMG-CoA还原酶抑制剂，EHV蛋白酶抑制剂，逆转录酶抑制剂，芳香酶抑制剂和血管生成抑制剂。
在本发明的至少一个方面中，本发明人例证了下表I中的本发明化合物：
表I
R1，R2，R3，R4：独立地为H，C1-C6烷基，取代的烷基或卤素
R5，R7：H，C1-C6烷基，取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷
R6：H，C1-C6烷基或取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷，此时 为单键；不存在，此时 为双键。
表I-接续
R1，R2，R3，R4：独立地为H，C1-C6烷基，取代的烷基或卤素
R5，R7：H，C1-C6烷基，取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷
R6：H，C1-C6烷基或取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷，此时 为单键；不存在，此时 为双键。
表I-接续
R1，R2，R3，R4：独立地为H，C1-C6烷基，取代的烷基或卤素
R5，R7：H，C1-C6烷基，取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷
R6：H，C1-C6烷基或取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷，此时 为单键；不存在，此时 为双键。
*NDC-1033；**NDC-1022
表I中优选的化合物包括化合物15和20。本发明的至少一个方面涉及这些优选的化合物，其使用和制备方法。
在本发明的至少另一个方面中，本发明人例证了如下表II中所示的本发明化合物：
表II
R1，R2，R3，R4：独立地为H，C1-C6烷基，取代的烷基或卤素
R5：H，C1-C6烷基，取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷
R6：H，C1-C6烷基或取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷
R8：H，C1-C6烷基或取代的烷基，此时 为单键；不存在，此时 为双键。
表II
R1，R2，R3，R4：独立地为H，C1-C6烷基，取代的烷基或卤素
R5：H，C1-C6烷基，取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷
R6：H，C1-C6烷基或取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷
R8：H，C1-C6烷基或取代的烷基，
此时 为单键；不存在，此时 为双键。
表II-接续
R1，R2，R3，R4：独立地为H，C1-C6烷基，取代的烷基或卤素
R5：H，C1-C6烷基，取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷
R6：H，C1-C6烷基或取代的烷基，硫酸酯或葡萄糖醛酸苷
R8：H，C1-C6烷基或取代的烷基，
此时 为单键；不存在，此时 为双键。
*NDC-1077，此时R8为甲基；**NDC-1011，此时R8为甲基；
***NDC-1110，此时R8为甲基；****NDC-1044，此时R8为甲基。
表II中优选的化合物包括化合物89，90，98和128。本发明的至少一个方面涉及这些优选的化合物，其使用和制备方法。
用于治疗如本文所述鉴定的癌症状态的一个具体的非限制性实例包括式(I)的化合物的应用，它具有下式(IX)：
(IX)A-NDC-1033 (IX)B-NDC-1022
用于治疗如本文所述鉴定的癌症状态的另一个具体的非限制性实例包括式(I)的化合物的应用，它具有下式(X)：
(X)A-NDC-1066v (X)B-NDC-1055
上述活性化合物还可以作为体外测定法的组成部分使用，例如，以便确定候选宿主是否能够得益于使用所述化合物治疗。本发明的任意活性化合物也可以作为标准品使用，例如，在测定法中以便鉴定其它活性化合物，其它抗增殖药，其它抗炎药等。
至少在本发明的一个方面中，评价候选化合物的雌激素受体拮抗活性。可以通过本领域中公知的各种方法对化合物是否为雌激素受体拮抗剂进行评价。在本申请中，可以通过按照本文所述的筛选方法进行荧光素酶结合测定来确定这类能力。
在本发明该方面的一个更优选的实施方案中，通过使用ER(α)或ER(β)+ERE-tk-荧光素酶报道构建体的表达构建体瞬时转染CV-1细胞来评价雌激素受体结合能力。然后将细胞分成对照组和候选组，其中对照组不接受处理，或使用单独的雌二醇(1nM)处理，而候选组接受雌二醇+不同浓度的Endece化合物。在16-24小时后，收集细胞并且使用商购测定试剂盒测定荧光素酶活性。
在本发明的另一个方面中，测定候选化合物的IC50或半数最大抑制浓度，以便评价体内应用的药物功效和可能的给药方案。本领域技术人员能够易于使用常用的公知方法确定这类信息。正如本领域中充分描述的，IC50表示并且确定了需要多少具体物质/分子将某些生物过程抑制50％。在这种情况中，将候选化合物的IC50测定为与媒介物对照组细胞相比产生50％响应的浓度。
本文所述的本发明化合物的盐意旨无毒性的“药学上可接受的盐”。然而，其它盐可以用于制备本发明的化合物或其药学上可接受的盐。当本发明的化合物包含碱性基团时，术语″药学上可接受的盐″ 中包括的盐意旨一般通过使游离碱与合适的有机或无机酸反应制备的无毒性盐。有代表性的盐包括本领域中公知的任意这类盐。如果本发明的化合物携带酸性部分，那么其合适的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐，例如钠或钾盐；碱土金属盐，例如钙或镁盐；和与合适的有机配体形成的盐，例如季铵盐。
为了治疗哺乳动物受试者，诸如人体患者，对该哺乳动物受试者给予有效量的本发明的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐，以便促进癌细胞或靶向的肿瘤生长暴露或接触。可以根据经验确定有效的剂型，给药方式和剂量，并且做出这类决定属于本领域技术人员的范围。本领域普通的医师，兽医或临床医师应理解剂量根据所用具体化合物的活性，疾病过程和/或进展状态，给药途径，化合物的排泄速率，患者的肾功和肝功，治疗期限，对受试者给予的任意其它药物的鉴定，年龄，大小等医学领域众所周知的因素的不同而改变。正如本文讨论的，可以以诸如片剂，胶囊(它们各自包括缓释或定时释放制剂)，丸剂，粉末，微粉化组合物，颗粒，酏剂，酊剂，混悬液，糖浆剂和乳剂这类口服剂型给予本发明的化合物。同样，还可以以静脉内(快速浓注或输注)，腹膜内，局部(例如滴眼液)，皮下，肌内或透皮(例如贴剂)形式，均使用制药领域普通技术人员众所周知的形式给予它们。此外，本领域普通的医师，兽医或临床医师易于确定用于预防，抗击或阻止疾患进展所需的药物有效量并且开据其处方。
在用于指定的作用时，本发明的口服剂量在约0.01mg/kg体重/天(mg/kg/天)-约100mg/kg/天，优选0.01-10mg/kg/天，且最优选0.1-5.0mg/kg/天。就口服给药而言，优选以含0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，50.0，100和500毫克活性组分的片剂形式提供组合物，以便根据症状调整所治疗患者的剂量。药剂一般包含约0.01mg-约500mg活性组分，优选约1mg-约100mg活性组分。在通过静脉内恒定速率输注过程中的最优选剂量在约0.1-约10mg/kg/分钟。可以以每日单剂量给予本发明的化合物，或可以以每日两次，三次或四次的分次剂量给予总每日剂量。
如本文所述，本发明的化合物可以与其它抗癌药或其它增强用于哺乳动物受试者的治疗方案的活性剂联用。在疗法过程中对有这类疗法需要的患者或这类患者区域在不同时间单独给予这类联合用药中的各成分或同时分次给予或单一组合形式。由此应将本发明理解为包括所有同时或交替治疗的这类方案，并且由此解释术语″给药″。可以理解本发明化合物与其它用于治疗靶向的癌症情况的药剂的联合用药的范围主要包括与用于治疗涉及雌激素起作用的病症的任意药物组合物的任意组合。
本文所用的术语″组合物″用以包括包含具体用量的具体组分的产品和直接或间接由具体用量的具体组分的联合用药产生的任意产品。
便利或理想的是制备、纯化和/或处理前体药物形式的活性化合物。本文所用的术语″前体药物″涉及在代谢时产生期望的活性化合物或其自身为活性化合物的化合物。该过程包括，例如在适当位置，诸如3，6，10或17位上添加磷酸酯部分。一般而言，前体药物为无活性的或其活性低于活性化合物，但提供有利的处理，给药或代谢特性。例如，某些前体药物为活性化合物的醚类；在代谢过程中，醚基被裂解而得到活性药物。此外，某些前体药物是以酶促方式被活化而得到活性化合物或在进一步的化学反应时产生活性化合物的化合物。因此，在本文披露的治疗方法中，术语″给药″应包括使用具体披露的化合物或使用可能未具体披露、但在对患者给药后在体内转化成具体化合物的化合物治疗所述的各种疾患。这些化合物的代谢物包括在将本发明化合物导入哺乳动物受试者时产生的活性物质种类。
本发明的化合物可以为有效抗增殖药的前体药物。表现出低或中度内在活性的化合物可以作为前体药物起作用，并且以代谢方式被活化(例如在体内)而生成更有效的化合物。这种情况尤其用于可以通过在肿瘤中表达的酶来实现代谢活化的癌症疗法。作为底物起作用的前体药物可以被CYP19，17β-HSD，HS-脱甲基酶或其它甾体连接酶代谢而生成有效的抗癌药。依西美坦的(R)或(S)-6-甲氧基烷基衍生物提示它对除乳腺癌之外的许多形式的癌症具有活性。对NDC-1011对映体观 察到了在抑制来源于乳腺，肺，结肠，前列腺，子宫内膜和卵巢癌的细胞系中的肿瘤细胞生长中的活性。例如，肿瘤细胞生长的体外研究在为CYP19阳性(MDA-MB-213和SK-OV-3)的细胞系中最高并且在CYP19阴性(MCF-7和NIH:OVCAR-3)的那些细胞系中降低，这表明NDC-1011可以作为前体药物起作用。参见如下NDC-1077和NDC-1011结构的式(XI)和(XII)。
(XI)NDC-1077 (XII)NDC-1011
尽管不受任何理论约束，但是例如，如果NDC-1011为前体药物，那么任意数量的身体正常类固醇生成酶应对NDC-1011化合物具有活性，由此将NDC-1011转化成(多种)活性代谢物。本发明的该方面可以以相同的方式适用于S和R型非对映体。
本发明的前体药物化合物可以以与对内源性雄烷二酮观察到的类似的方式起作用，NDC-1011通过CYP19使NDC-1011的C-3碳上发生羟基化而被转化成芳族环，从而产生代谢物NDC-1099。参见雌二醇生物合成路线中的图1，其中雄烷二酮通过CYP19被转化成雌酮。NDC-1099可以通过17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)的可逆作用进一步在C-17碳上进行羟基化而得到二醇化合物NDC-1022。
与雌二醇一样，二醇化合物NDC-1022具有芳族环，但在C-6碳上的甲氧基烷基取代基方面不同于雌二醇。NDC-1011代谢成二醇化合物NDC-1022可以以如图2中所示的任何顺序发生。例如，通过17β-HSD形成的NDC-1044因CYP19芳构化活性被转化成NDC-1022二醇。
不受任何理论约束，已经报导了雌二醇通过C17-OH(通过His 524)和C3-OH(通过Arg 394和Glu 353)结合雌激素受体(ERα和ERβ)的 受体配体袋。与雌二醇一样，ERα和ERβ的相同配体袋中NDC-1022二醇的结合可以通过类似的氨基酸结合发生。另外，在化合物NDC-1022的C-6碳上存在甲氧基烷基取代基可以改变正常配体结合受体的构型，从而产生可以解释观察到的抗肿瘤活性的改变的活性。
此外，涉及NDC-1011(或NDC-1011的代谢物之一)的C-6甲基的脱甲基酶活性可以表明形成三醇代谢物NDC-1055。由于在C-3，C-6和C-17碳上存在醇基，所以这类NDC-1055三醇代谢物可以结合一定范围组织中涉及C-3，C-6和C-17醇类的不同组合的广谱甾体激素受体。这类代谢物的一个实例包括如下所示的式(VII)B的化合物：
(VII)B-NDC-1055
本发明的药物制剂包括适合于口服，鼻部，局部(包括口含和舌下)，直肠，阴道和/或非肠道给药的那些。通过本领域技术人员公知的常规方法将活性组分配制成药学上可接受的剂型，而与选择的给药途径无关。
可以与载体物质合并成单一剂型的活性组分的量根据所治疗的宿主，具体给药方式和所有上述其它因素的不同而改变。与载体物质合并成单一剂型的活性组分的量一般为有效产生治疗作用的最低剂量的活性组分的量。
制备药物制剂或组合物的方法包括将活性组分与载体和任选一种或多种辅助组分混合的步骤。一般而言，通过将活性组分均匀和紧密混入液体载体或固体载体细粉或它们两者，且然后如果需要使产物成形，由此制备制剂。
适合于口服给药的本发明制剂可以为胶囊，扁囊剂，丸剂，片剂，锭剂(使用矫味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)，粉末，颗粒 或为在水或非水液体中的溶液或混悬液或为水包油型或油包水型液体乳剂或酏剂或糖浆剂或为锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)和/或为口腔洗剂等的形式，它们各自包含预定量的活性组分。还可以将活性组分作为大丸剂，药糖剂或糊剂给药。
在用于口服给药的本发明的固体剂型(胶囊，片剂，丸剂，锭剂，粉末，颗粒等)中，将前体药物、活性组分(以其微粉化形式)与一种或多种药学上可接受的载体混合，所述载体诸如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或如下的任意种：(1)填充剂或增充剂，诸如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如，例如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季胺类化合物；(7)湿润剂，诸如，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)滑润剂，诸如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇类，十二烷基硫酸钠，及其混合物；和(10)着色剂。就胶囊，片剂和丸剂而言，药物组合物还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物还可以用作使用诸如乳糖或奶糖这类赋形剂和高分子量聚乙二醇类的软和硬填充胶囊的填充剂。
可以通过任选使用一种或多种辅助组分压制或模制制备片剂。可以使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂制备压制片。可以通过在合适的机器中模制使用惰性液体稀释剂润湿的活性组分粉末的混合物来制备模制片。
可以任选使用包衣材料和壳，诸如肠溶衣和其它制药领域众所周知的包衣材料给本发明药物组合物的片剂和其它固体剂型，诸如锭剂，胶囊，丸剂和颗粒刻痕或制备它们。还可以使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素将它们配制成使其中的活性组分缓慢释放或控释以便提供所需的释放特性，其它聚合物基质，脂质体和/或微球。例如，可以 通过经截留细菌的滤膜过滤使它们无菌。这些组合物还可以任选包含遮光剂并且可以具有它们任选以延缓方式仅仅或者优选在胃肠道的某些部位释放活性组分的组成。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物物质和蜡。活性组分还可以在微囊化形式中。
用于活性组分口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂，微乳，溶液，混悬液，糖浆剂和酏剂。除活性组分外，液体剂型还可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，诸如，例如，水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，诸如乙醇，异丙醇，乙酸乙酯，丁醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，乙二醇，油(特别是棉籽油，花生油，玉米油，胚油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油)，甘油，戊醇，聚乙二醇四氢呋喃酯和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯类及其混合物。
除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂，诸如湿润剂，乳化剂和悬浮剂，甜味剂，矫味剂，着色剂，香味剂和防腐剂。混悬液除包含活性组分外还包含悬浮剂，例如，乙氧基化醇类，聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯类，微晶纤维素，偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)，膨润土，琼脂和黄蓍胶及其混合物。
可以将本发明用于直肠或阴道给药的药物组合物的制剂制成栓剂，可以通过将活性组分与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载体混合制备栓剂，所述的无刺激性赋形剂或载体包括，例如，可可脂，聚乙二醇，蜡或水杨酸酯，其在室温下为固体，而在体温下为液体，且由此在直肠或阴道腔熔化并且释放活性组分。本发明适合于阴道给药的制剂还包括阴道环，棉塞，霜剂，凝胶，糊剂，泡沫或喷雾剂，它们包含本领域公知公知为合适的这类载体。
用于活性组分局部或透皮给药的剂型包括粉末，喷雾剂，软膏剂，糊剂，霜剂、洗剂，凝胶，溶液，贴剂和吸入剂。可以在无菌条件下混合活性组分与药学上可接受的载体，并且可能需要任意的缓冲剂或抛射剂。
软膏剂，糊剂，霜剂和凝胶除包含活性组分外还可以包含赋形剂，诸如动物和植物脂肪，油，蜡，石蜡，淀粉，黄蓍胶，纤维素衍生物， 聚乙二醇类，硅氧烷类，膨润土，硅酸，滑石粉和氧化锌或其混合物。粉末和喷雾剂除活性组分外还可以包含赋形剂，诸如乳糖，滑石粉，硅酸，氢氧化铝，硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂还可以包含常用的抛射剂，诸如氯氟烃类和挥发性未取代的烃类，诸如丁烷和丙烷。
还可以通过局部应用合适的鼻内媒介物或通过透皮途径，使用本领域技术人员众所周知的那些透皮贴剂形式以鼻内形式给予本发明的化合物。透皮递送系统在整个剂量方案中提供了连续给药。透皮贴剂附加了使活性组分受控递送至身体的优点。可以通过溶解，分散，或是将活性组分掺入适当的介质，诸如弹性基质材料制备这类剂型。吸收促进剂还可以用于增加活性组分通过皮肤的流量。可以通过提供速率控制膜或将活性组分分散于聚合物基质或凝胶中控制这类流动速率。
还可以以脂质体递送系统的形式，诸如小单层脂质体，大单层脂质体和多层脂质体给予本发明的化合物。脂质体可以由各种磷脂类构成，诸如胆固醇，十八酰胺或磷脂酰胆碱类。
可以通过使用单克隆抗体作为化合物分子所偶联的各载体来递送另一种递送模式的本发明化合物。还可以使本发明的化合物与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这类聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙甲基丙烯酰胺-苯酚，聚羟乙基天冬酰胺-苯酚或聚环氧乙烷-被棕榈酰残基取代的聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可以与一类用于实现药物控释的生物可降解聚合物偶联，所述聚合物例如为聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸和聚乙醇酸共聚物，聚ε己内酯，聚羟基丁酸，聚原酸酯类，聚缩醛类，聚二氢吡喃类，聚氰基丙烯酸酯类和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。
适合于非肠道给药的本发明的药物组合物包含活性组分与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水或非水溶液，混悬液或乳剂或在临用前用无菌可注射溶液或分散液再溶解的无菌粉末，其可以包含抗氧化剂，缓冲剂，使制剂与指定接受者的血液等渗的溶质或悬浮或增稠剂。
可以用于本发明药物组合物的合适的水和非水载体的实例包括水，乙醇，多元醇(诸如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，诸如橄榄油，和可注射的有机酯类，诸如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣材料，诸如卵磷脂，通过维持所需的粒度，并且通过使用表面活性剂维持适当的流动性。
这些组合物还可以包含佐剂，诸如湿润剂，乳化剂和分散剂。还期望在组合物中包括等渗剂，诸如糖类，氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸收的试剂，诸如单硬脂酸铝和明胶使可注射的药物剂型延长吸收。
在某些情况中，为了延长活性组分的作用，期望从皮下或肌内注射中缓慢吸收药物。可以通过使用具有水溶性差的结晶或非晶形物质的液体混悬液实现这一目的。然后活性组分的吸收速率取决于其溶出速率，由此可以依赖于晶体粒度和晶型。可选择地，通过将活性组分溶于或悬浮于油媒介物来延缓非肠道给药的活性组分的吸收。
通过使活性组分在生物可降解聚合物，诸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成微囊基质而制备可注射的长效剂型。根据活性组分与聚合物之比和所用具体聚合物性质的不同，可以控制活性组分释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将活性组分俘获在与身体组织相容的脂质体或微乳中制备长效可注射制剂。例如，可以通过经截留细菌的滤膜过滤使可注射物质无菌。
可以将制剂提供在单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶，并且可以储存在冻干条件下，仅需要在使用前即刻添加无菌液体载体，例如注射用水。可以由上述类型的无菌粉末，颗粒和片剂制备临时注射溶液和混悬液。
本发明的药物组合物还可以以兽用制剂的形式使用，包括适合于如下的那些：(1)口服给药，例如，混合了饲料的兽用顿服药(水或非水溶液或混悬液)，片剂，大丸剂，粉末，颗粒或丸粒，施用于舌的糊剂；(2)非肠道给药，例如″皮下，肌内或静脉内注射用安瓿，例如为无菌溶液或混悬液，如果合适，通过乳房内注射，其中将混悬液或溶 液通过其乳头导入动物乳房；(3)局部施用，例如，为施用于皮肤的霜剂，软膏剂或喷雾剂；或(4)阴道内，例如，为阴道环，霜剂或泡沫或本领域技术人员适合于对关注区域给药的任意其它方法。
尽管参照某些实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员可以理解可以通过未描述的实施方案实施本发明，提出所述的实施方案是为了例证目的，而非起限定作用。因此，待批权利要求的范围不应限于本文包含的实施方案的描述。
方案1和2中给出的用于制备上述表I和II中例示的化合物的一般方法进一步通过下列实施例例证。具体地，如下所示的实施例1-5例证了方案1和2中用于制备6-烷氧基烷基雌二醇化合物的方法。在实施例4中明确了评价雌激素受体结合能力的实例，并且在实施例5中给出了本发明优选化合物的IC50的最终评价及其对比功效。除非另有具体描述，否则所有原料物质和试剂均具有标准商品级，并且无需进一步纯化使用，或易于通过常规方法由这类物质制备。有机合成领域普通技术人员公认可以改变原料物质和反应条件以便获得期望的终产物。
实施例1
制备6-羟甲基-雄甾-1，4-二烯-3，17二酮的方法
在反应系统中，将足量的(+)雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，12.2当量的吡咯烷，催化的乙酸(acietic acid)，变性乙醇(95/5乙醇/甲醇)和6-7％四氢呋喃(THF)加热至30-40℃下最少16小时，以便形成1，3-二吡咯烷并雄甾-3，5-二烯-17-酮。一旦根据HPLC面积确定ADD含量达到低于3％或它变稳定或产生的二吡咯烷并雄甾二烯开始恢复成ADD，就将该反应混合物冷却至5±5℃。然后收集所得化合物并且用冷变性乙醇洗涤。根据HPLC面积的百分比，产率一般为70-80％，基于干燥时的纯度一般为90-95％。
然后在室温下将产生的1当量的1，3-二吡咯烷并雄甾-3，5-二烯-17-酮与2.6当量的福尔马林(甲醛)在10ml二氯甲烷中混合。随后用2％硫酸溶液将该反应混合物酸化至pH约2。因此，形成有机层，用 2％硫酸和1∶1水/盐水洗涤。然后将溶剂交换成甲苯(约10ml/g)，其中产物结晶为甲苯交换蒸发物。收集，洗涤并且干燥所述产物而得到6-羟甲基-雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮。只要有此要求，那么本领域技术人员就可以通过使用本领域的公知技术进一步改变6位上的立体化学。
实施例2
制备化合物NDC-1022和NDC-1033的方法
正如方案2中概括的，按照下列方式合成雌二醇衍生物NDC-1022，NDC-1033。通过使化合物1与二氢吡喃在THF中反应，使用甲苯磺酸或樟脑磺酸作为催化剂制备被保护的雌二醇化合物2。因为本领域技术人员可以理解该反应为平衡反应并且在这种条件下可能无法进行完成。因此，可以在该反应混合物中发现两种单保护的雌二醇类。这类粗反应混合物可以与乙腈一起进行研磨步骤，产生以约70％产率结晶的所需双-THP雌二醇。
正如方案2中所示，通过使用称作LiDAKOR：丁基锂，二异丙基胺和叔戊酸钾的强碱混合物使苄型6-位酰化获得关键的中间体化合物3。在-70℃的这类条件下，本领域技术人员可以理解在苄型位置上吸引质子。然后通过柱色谱法纯化中间体化合物3而得到糖浆状物，产率约为50％，其中仍然包含少量杂质和柱溶剂。使用过量的氢化铝锂还原醛而得到高产率的外消旋羟甲基雌二醇化合物4，为玻璃状泡沫。
为了制备NDC-1022和NDC 1033，通过使用氢化钠和甲基碘使化合物4甲基化制备中间体化合物7。通过柱色谱法纯化化合物7而得到玻璃状泡沫。使被保护基团脱保护可以产生外消旋6-甲氧基甲基雌二醇化合物8。使用手性制备型HPLC分离对映体而得到化合物NDC-1022和NDC-1033。就化合物NDC-1022而言，获得了＞95∶5R∶S的手性纯度。就化合物NDC-1033而言，获得了86∶14S∶R的手性纯度。在本领域技术人员水平范围内可以充分使用NMR测定6-位的绝对立体化学，其中4-和6-质子为诊断上有价值的。
实施例3
制备NDC-1055和NDC-1066的方法
使用与实施例2中所述相同的方法，合成化合物4。然后使用催化的氯化氢在甲醇中实现化合物4的脱保护，并且使用手性制备型HPLC分离外消旋化合物5而得到两种级分，一种富含NDC-1055，而另一种富含NDC-1066。就每种化合物而言，分别实现＞95∶5R∶S和S∶R的手性纯度。通过NMR确立6-位的绝对立体化学，其中4-和6-质子为诊断特征的。
实施例4
使用荧光素酶活性测定雌激素受体结合能力的方法。
将雌激素受体-阴性CV-1肾细胞维持在37℃下和加湿的5％CO2气体环境中的含4.5g/L葡萄糖的补充了10％胎牛血清和100单位/ml青霉素-链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基中。
然后以2×105个细胞/孔的密度将细胞铺板在6-孔平面的不含酚红的Dulbecco改进的Eagle培养基中，该培养基包含10％活性炭-葡聚糖-剥离的胎牛血清。使用LipofectAMINE试剂按照制造商的方案转染CV-1细胞。转染包含1.5μg报道质粒(包含含有胸苷激酶启动子和荧光素酶基因的单一ERE克隆的上游的ERE-tk-荧光素酶)和0.5μgERα或ERβ表达载体(分别包含CMV-ERα或CMV-ERβ全长编码序列)。
第二天，细胞不接受处理(对照组)或用单独的雌二醇(1nM)或用雌二醇+Endece化合物(以不同浓度)进行处理。16-24小时后，收集细胞并且测定荧光素酶活性。
开始时，用冰冷的磷酸缓冲盐水将细胞单层洗涤两次并且在250μl的1X细胞培养溶胞试剂(Promega，Madison，WI)中孵育15分钟。将细胞提取物转入新鲜试管并且使用荧光素酶测定系统(Promega)测定。就每次测定而言，用90μl的1X细胞培养溶胞试剂稀释10μl提取物。使用AutoLumat LB953发光计读取发光。
通过本文所述结合测定法鉴定的化合物或其盐为抑制雌二醇在雌二醇受体的配体结合位点上结合的化合物。具体地，其为关注导致细 胞增殖停止且由此发挥其药理学活性的化合物或其盐。如图3和4中所示，前导化合物NDC-1022，NDC-1033在结合雌激素受体方面表现出对雌二醇的强竞争行为，由此使细胞增殖活动停止。
实施例5
测定候选化合物的IC50值的方法。将所列的细胞系维持在适合于该细胞系的培养基中的约5％CO2，37℃，95％相对湿度中。每隔2-3天传代培养细胞并且以1×104个细胞/孔的密度在澄清底的96-孔培养板中铺板且在约5％CO2，37℃下孵育过夜，此后启动测定。为了开始进行细胞存活率测定，用新鲜培养基(100μL)替代细胞培养板中的培养基(100μL)。在新鲜培养基中一式两份连续地按照1∶2稀释测试品并且以在200μL总体积中0.46，1.37，4.12，12.35，37.04，111.1，333.3和1000μM的样品终浓度(≤1％DMSO)加入到细胞(100μL)中。将不含细胞的孔和含使用0.1％Triton-X溶胞的细胞的孔用于基线对照组。他莫昔芬用作每次测定的公知对照品并且DMSO仅作为媒介物对照组进行。将样品在约37℃下的加湿5％CO2气体环境中孵育72小时。在孵育期过程中每天将培养板监测一次，特别要关注汇合水平。如果在72小时孵育期结束前细胞达到汇合，那么此时就终止实验并且如下所述测定细胞存活率。
使用用于测定ATP水平的商购试剂盒根据发光测定细胞存活率。简言之，细胞培养板已经除去了培养基并且用100μL新鲜培养基替代，并且使缓冲液和冻干底物平衡至室温。缓冲液用于临在加入到细胞培养板的各孔中(100μL/孔)之前再溶解底物。将培养板放入Infinite M200培养板读数器，将其振摇10分钟，随后是10分钟的等待期，使用0.5秒的积分时间读取培养板，无减弱现象。
从总发光中扣除平均基线对照组(具有Triton X-100或无细胞的孔)而得到该孔的净发光。将该总数与仅DMSO的对照组比较。将IC50计算为与媒介物对照组细胞相比产生50％响应的浓度。图5和6描绘了测试结果。因此，本领域技术人员可以理解本发明请求保护的组合物的R构型优于其它立体异构体。

Claims (12)

1.具有如下结构的化合物：
其中：
R1，R2，R3，R4独立地选自H、C1-C6烷基和卤素；
R5，R6，R7独立地选自H、C1-C6烷基、-SO3H和葡萄糖醛酸苷。
2.权利要求1的化合物，其中R5为C1-C6烷基。
3.权利要求2的化合物，其中R6和R7独立地选自甲基、氢或HSO3-基团。
4.权利要求1的化合物，其中R5为甲基或氢，且R1，R2，R3，R4为氢。
5.权利要求4的化合物，其中R5是甲基。
6.权利要求4或5的化合物，其中所述化合物是R型或S型立体异构体。
7.权利要求2的化合物，其中R1、R2、R3、R4、R6和R7独立地是氢、甲基或乙基。
8.权利要求1的化合物，具有如下结构：
9.权利要求1的化合物，选自下组：
10.权利要求1的化合物在制备用于抑制癌细胞生长的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述化合物具有如下结构：
其中：
R1，R2，R3，R4独立地选自H、C1-C6烷基和卤素，
R5，R6独立地选自H、C1-C6烷基、-SO3H和葡萄糖醛酸苷。
12.权利要求10的用途，其中所述化合物具有选自下组的式：
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