CN101583380A

CN101583380A - 用于制备聚合物轭合物的方法

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Publication number: CN101583380A
Application number: CNA2007800442170A
Authority: CN
Inventors: 张文
Original assignee: Nektar Therapeutics AL Corp
Current assignee: Nektar Therapeutics
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2007-11-30
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2027-11-30
Also published as: CA2669541A1; WO2008066902A2; AU2007325631A1; CA2669541C; HK1137647A1; EP2104515B1; MX2009005780A; US20130079533A1; WO2008066902A3; US8937180B2; US20100010194A1; KR20090085080A; AU2007325631B2; AU2007325631B9; EP2104515A2; US8541608B2; US8354549B2; KR101441709B1; JP5277417B2; US20140005419A1

Abstract

本文提供的是用于将聚乙二醇聚合物共价连接到活性剂的简单且有效的方法。

Description

用于制备聚合物轭合物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2006年11月30日提交的美国临时申请第60/861,995号和于2007年11月14日提交的美国临时申请第_____号即代理人参考号41714-8029.US00的优先权权益，这些申请全部内容通过引用并入本文。

领域

除了其他方面之外，本发明通常涉及用于将一种或多种水溶性聚合物共价连接到活性剂的方法。

背景

多年以来，已经使用了很多种将水溶性聚合物如聚乙二醇共价连接到生物活性剂的合成方法。聚乙二醇化的早期尝试通常使得PEG非特异性共价连接到活性剂(最常见的是多肽或蛋白质)的多个反应位点。就多肽而言，最常见的用于共价偶联的反应基是赖氨酸的α或ε氨基基团。早期聚乙二醇化化学通常使用低分子量的线性PEG试剂，并且大部分轭合物(conjugate)通过酰化产生(Roberts，M.J.等人，Advanced Drug Delivery Reviews，54(2002)，459-476)。这些早期聚乙二醇化的药物经常产生差的药物性能和/或显示低的批间重现性。

第二代聚乙二醇化化学产生了设计用来克服很多与第一代聚乙二醇化试剂有关的问题-二醇污染、副反应、不稳定的键和缺乏将聚合物共价连接到活性剂的多个反应位点的选择性的方法(Roberts，M.J.等人，同上)。开发了新PEG试剂，其中包括，如PEG丙醛(美国专利第5,252,714号)、PEG乙烯基砜(美国专利第5,446,090号)和PEG马来酰亚胺(美国专利第6,602,498号)，并且描述了与它们的使用有关的方法。非线性PEG如分枝(美国专利第5,932,462号)和叉状PEG(美国专利第6,437,025号)也变得更广泛可得，例如可从公司如NektarTherapeutics和NOF得到。

尽管治疗剂的聚乙二醇化已更广泛地用作一种用于改善治疗剂药理学和其他性质的可行方法，但是用于连贯形成明确具有有益的药理学性质的聚乙二醇化治疗剂的合成挑战仍持续上升。特别是如果这些方法适合于大规模生产，它们应尽量避免多个反应步骤，并使所需的保护、脱保护和纯化步骤数减至最少，并以连贯的方式和适当的良好收率形成产物。

发明概述

在一个方面中，本文提供的是用于将聚乙二醇聚合物共价连接到活性剂的方法。所述方法包括以下步骤：(i)提供包含第一官能团的活性剂，所述第一官能团选自氨基、羟基和羧基(以及活化的羧基等同物，如反应性酯或类似物)，和(ii)将所述活性剂与包含对第一官能团具有反应性的第二官能团的聚乙二醇反应。所述反应在偶联剂和对甲苯磺酸4-(二甲氨基)-吡啶鎓盐(DPTS)的存在下、在有效促进第一官能团与第二官能团之间的反应的条件下进行，从而形成聚乙二醇-活性剂轭合物。

在一个实施方案中，所述偶联剂是碳二亚胺。代表性的偶联剂包括选自由如下组成的组的那些：二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-叔丁基-N’-甲基碳二亚胺(TBMC)和N-叔丁基-N’-乙基碳二亚胺(TBEC)。

在一个优选的实施方案中，所述偶联剂是N，N’-二异丙基碳二亚胺。

所述反应通常在有机溶剂中进行。合适的溶剂包括二氯甲烷、氯仿、乙腈和四氢呋喃(tehtrahydrofuran)。

在又一个进一步的实施方案中，反应在范围为0℃至100℃的温度、更优选在室温下进行。

在所述方法的又另一个实施方案中，DPTS的量范围为相对于所述第一官能团的约0.05当量至0.75当量，更优选为相对于所述第一官能团的约0.10当量至0.60当量。

在还有一个另外的实施方案中，所述偶联剂的量范围为相对于所述第一官能团的约1.25当量至5当量。

优选的第二官能团包括氨基、羟基和羧基。

适合在所述方法中使用的活性剂包括蛋白质、寡肽、多肽、小分子、抗体、核苷酸、寡核苷酸和脂质。

在所述方法的一个优选的实施方案中，所述活性剂是包含为羟基或羧基的第一官能团的小分子。在某些实例中，所述活性剂具有多于一个的所述第一官能团。

特别优选的小分子包括紫杉烷类(例如多烯紫杉醇或紫杉醇)和喜树碱类。

在还有一个甚至更优选的实施方案中，第一官能团与第二官能团之间的反应导致形成酯键。

在还有一个甚至更具体的实施方案中，所述方法导致形成具有通过酯键与多烯紫杉醇上单个羟基位点(例如2’羟基位点)共价连接的聚乙二醇的多烯紫杉醇-聚乙烯轭合物。

在所述方法中，所述聚乙二醇可具有许多种几何形状中的任一种，例如线性、分枝、叉状和多臂聚乙二醇。优选地，所述聚乙二醇是具有从约3个至约25个臂的多臂聚合物。

优选的多臂聚合物是包括多元醇或聚胺核的那些。示例性的多元醇核包括甘油、三羟甲基丙烷、山梨糖醇、六甘油和季戊四醇。

在所述方法的一个实施方案中，所述聚乙二醇包括约1个至约10个第二官能团。在一个甚至更具体的实施方案中，所述聚乙二醇包括选自1个、2个、3个、4个、5个和6个的多个第二官能团。在又一个实施方案中，所述聚乙二醇具有选自3个、4个和5个的多个第二官能团。

在所述方法的又另一个实施方案中，所述活性剂包括多于一个的第一官能团，且所述方法不包括保护步骤。

在所述方法的又另一个替代性实施方案中，所述活性剂包括多于一个的第一官能团(例如多于一个羟基基团)，且所述方法有效地导致形成具有仅与所述活性剂上单个位点共价连接的聚乙二醇的轭合物。

在又另一个实施方案中，所述方法有效地导致形成少于约15％的N-酰基脲副产物，且优选地，少于约10％的N-酰基脲副产物，且甚至更优选地，少于约5％的N-酰基脲副产物。

除非另有指出，本发明中在此描述的特征中的每一个表示同样地应用到如本文所述的每一类和每一个实施方案。

当与下列详述结合阅读时，本发明的这些和其他对象和特征将变得更加明显。

附图简述

图1是如在实施例3中所述、表示三种不同剂量的多烯紫杉醇(10mg/kg、20mg/kg和30mg/kg)和图中表示为“4臂PEG-20k-GLY-DOC”的4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇(20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg)中每一种的两个剂量在移植有H460非小细胞肺癌肿瘤的雌性异种移植无胸腺裸小鼠中的效应随时间的图示。

图2是如在实施例4中所述、表示三种不同剂量的多烯紫杉醇(10mg/kg、20mg/kg和30mg/kg)和4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇(20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg)中每一种的两个剂量在移植有DU-145前列腺肿瘤的雌性异种移植无胸腺裸小鼠中的效应随时间的图示。

图3是如在实施例5中所述、表示多烯紫杉醇和4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇分别在移植有MCF-7乳腺肿瘤的小鼠中的抗肿瘤效应随时间的图示。

发明详述

现在在下文中将更详细地描述本发明。但是，本发明可以以很多不同的形式体现，且不应理解为受限于本文所列举的实施方案；相反，提供了这些实施方案以使公开内容更彻底且完整，并将本发明范围完全传达给本领域技术人员。

定义

必须注意到，除非本文另有明确规定，否则在本说明书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数形式。因此，例如，提及的“聚合物”包括单个聚合物和两个或更多个相同或不同的聚合物，提及的“轭合物”是指单个轭合物和两个或更多个相同或不同的轭合物，提及的“赋形剂”包括单个赋形剂和两个或更多个相同或不同的赋形剂，等。

在描述和要求保护本发明时，根据下文所述的定义使用下列术语。

“官能团”是在正常的有机合成条件下可用于在与之连接的结构和通常具有其他官能团的另一种结构之间形成共价键的基团。所述官能团一般包括多个键和/或杂原子。下文描述了在本文提供的聚合物和活性剂中使用的优选的官能团。

术语“反应性(reactive)”是指在常规的有机合成条件下容易地或以实际速率反应的官能团。这与不会反应或者为了反应需要强催化剂或不实际的反应条件的那些基团(即“无反应性”或“惰性”基团)相反。

关于反应混合物中分子上存在的官能团，“非易反应性”表示该基团在有效产生期望反应的条件下在反应混合物中保持大部分完整。

羧酸的“活化的衍生物”是指易与亲核体反应、通常与未衍生化的羧酸相比与亲核体反应容易得多的羧酸衍生物。活化的羧酸包括，例如酰基卤(如酰基氯)、酸酐、碳酸盐(carbonate)和酯。这些酯包括，例如咪唑基酯和苯并三唑酯和酰亚胺酯如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。活化的衍生物可通过羧酸与各种试剂中的一种反应而原位形成，所述试剂如六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷鎓盐(PyBOP)，优选与1-羟基苯并三唑(HOBT)或1-羟基-7-偶氮苯并三唑(HOAT)；六氟磷酸O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓盐(HATU)；或双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BOP-Cl)组合使用。

官能团的“化学等同物”是基本上具有与所述官能团相同类型的反应性的基团。例如，一个经历SN2反应的官能团被认为是另一个这种官能团的功能等同物。

“保护基”是在某些反应条件下防止或阻断分子中特定的化学反应性官能团的反应的部分。所述保护基根据受保护的化学反应基的类型以及待使用的反应条件和分子中存在的其他反应基或保护基而改变。可受保护的官能团包括，例如羧酸基团、氨基基团、羟基基团、硫醇基团、羰基基团及类似官能团。代表性的羧酸保护基包括酯类(如对甲氧基苄酯)、酰胺类和酰肼类；代表性的氨基基团保护基，包括氨基甲酸酯类(如叔丁氧基羰基)和酰胺类；代表性的羟基基团保护基，包括醚类和酯类；代表性的硫醇基团保护基，包括硫醚类和硫酯类；代表性的羰基基团保护基，包括缩醛和缩酮；等。这些保护基为本领域技术人员众所周知，并且例如在T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups in Organic Synthesis(有机合成的保护基)，第三版，Wiley，New York，1999和在其中所引用的参考文献中描述。

“受保护形式”的官能团是指具有保护基的官能团。如本文所用，术语“官能团”或其任何同义词意指包括其受保护的形式。

本文所用的“PEG”或“聚(乙二醇)”意指包括任何水溶性聚(氧化乙烯)。通常地，本发明中使用的PEG将包括以下两种结构中的一种：“-(CH₂CH₂O)_n-”或“-(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂-”，这取决于是否末端氧例如在合成转化时被替代。变量(n)为3至3000，且所有PEG的末端基团和结构可改变。“PEG”表示包含大多数也就是说超过50％的是-CH₂CH₂O-的亚单元的聚合物。本发明中使用的PEG包括具有在下文更为详述的多种分子量、结构或几何形状的PEG。

在本发明的水溶性聚合物如PEG的背景中的“分子质量”是指聚合物标称的平均分子质量，这通常由尺寸排阻色谱法、光散射技术或在1，2，4-三氯苯中的固有速率测定来确定。在水溶性聚合物如PEG的背景中的分子量可表示为数均分子量或重均分子量。除非另有指出，本文所有提及的分子量是指重均分子量。数均和重均这两种分子量测定都可使用凝胶渗透色谱法或其他液体色谱技术来测量。也可使用用于测量分子量值的其他方法，如使用末端基团分析或测量依数性(例如冰点下降、沸点提高或渗透压)来确定数均分子量或者使用光散射技术、超离心法或粘度测定法来确定重均分子量。本发明的聚合物通常为多分散的(即聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，具有低多分散性值如少于约1.2、少于约1.15、少于约1.10、少于约1.05和少于约1.03。如本文所用，有时候会提及具有重均分子量或数均分子量的单个水溶性聚合物；应理解，这些提及表示单个水溶性聚合物是从具有所述分子量的水溶性聚合物的组合物中获得的。

术语“连接体(linker)”在本文用来指原子或原子的集合，其用于连接互连部分如有机基核和聚合物片段。连接体部分可以是水解稳定的或可包括生理学上可水解或可酶促降解的键。

术语“间隔基”在本文用来指原子的集合，其用于连接互连部分如聚合物片段和活性剂D。间隔基部分可以是水解稳定的或可包括生理学上可水解或可酶促降解的键。

“可水解的”键是在生理条件下与水反应(即被水解)的相对弱的键。键在水中水解的趋势不仅取决于连接两个中心原子的键的一般类型，而且取决于与这些中心原子连接的取代基。示例性的水解不稳定的键包括羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。

“水解稳定的”键(linkage)或键(bond)是指化学键，通常是共价键，其在水中基本上是稳定的，也就是说在生理条件下在延长的一段时间内不发生达到任何可察觉程度的水解。水解稳定的键的实例包括但不限于以下：碳-碳键(例如在脂肪族链中)、醚、酰胺、聚氨酯(urethanes)及类似的水解稳定的键。一般地，水解稳定的键是在生理条件下显示每天少于约1-2％的水解速率的键。代表性的化学键的水解速率可在大部分标准的化学教科书中发现。

就聚合物的几何形状或全部结构而言，“多臂”是指聚合物具有3个或更多个聚合物所包含的“臂”。因此，多臂聚合物可具有3个聚合物臂、4个聚合物臂、5个聚合物臂、6个聚合物臂、7个聚合物臂、8个聚合物臂或更多，这取决于其构型和核结构。高度分枝的聚合物的一种具体类型是树枝状聚合物或树枝状大分子(dendrimer)，其为了本发明的目的，被认为具有不同于多臂聚合物结构的结构。

“支化点”是指包括一个或多个原子的分叉点，在所述分叉点聚合物从线性结构分裂成或分枝成一个或多个另外的聚合物臂。多臂聚合物可具有一个支化点或多个支化点。

“树枝状大分子”是球形的、尺寸单分散的聚合物，在该聚合物中所有键从中心焦点或核呈放射状，具有规则的分支式样和具有重复单元，每个重复单元贡献支化点。树枝状大分子显示某些树枝状态性质如核包封(core encapsulation)，使它们不同于其他类型的聚合物。

“大致上”或“基本上”是指几乎全部或完全，例如，某一给定量的95％或更多。

“烷基”是指烃链，通常长度范围为约1个至20个原子。这些烃链优选但不必然是饱和的，且可以是支链或直链，尽管通常直链是优选的。示例性的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基及类似烷基。如本文所用，当提及三个或更多个碳原子时，“烷基”包括环烷基。

“低级烷基”是指包含1个至6个碳原子的烷基基团，且可以是直链或支链，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基。

“环烷基”是指饱和的或不饱和的环状烃链，包括优选由3个至约12个碳原子、更优选3个至约8个碳原子组成的桥接、稠合或螺环化合物。

“无扰取代基(Non-interfering substituent)”是当存在于分子中时，通常是对其他包含在分子内的官能团无反应性的那些基团。

例如在“取代的烷基”中的术语“取代的”是指被一个或多个无扰取代基取代的部分(例如烷基基团)，所述无扰取代基例如但不限于：C₃-C₈环烷基，例如环丙基、环丁基等；卤素，例如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基、低级苯基；取代的苯基；及类似无扰取代基。对于苯环上的取代基而言，所述取代基可以在任何方向(即邻位、间位或对位)。

“烷氧基”是指-O-R基，其中R是烷基或取代的烷基，优选C₁-C₂₀烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等)，优选C₁-C₇。

“亲电子体”是指离子、原子或可以是离子的原子集合，它们具有亲电子中心(即寻找电子的中心)，能与亲核体反应。

“亲核体”是指离子或原子或可以是离子的原子集合，它们具有亲核中心(即寻找亲电子中心的中心)，且能与亲电子体反应。

本文所用的“活性剂”包括提供经常有益的、可在体内或体外得以证明的一些药理学效应的任何剂。如本文所用，这些术语进一步包括任何生理学上或药理学上活性的物质，其在患者中产生局部效应或全身效应。

本文可互换使用的“双官能的(Difunctional)”或“双功能的(bifunctional)”表示诸如聚合物的实体具有包含在该聚合物中的、通常是在聚合物末端的两个官能团。当所述官能团相同时，该实体被称为是同型双官能的(homodifunctional)或同型双功能的(homobifunctional)。当所述官能团不同时，该聚合物被称为是异双官能的(heterodifunctional)或异双功能的(heterobifunctional)。

本文所述的碱性或酸性反应物包括中性的、荷电的以及其任何对应的盐形式。

术语“受治疗者”、“个体”或“患者”在本文可互换使用，且是指脊椎动物，优选哺乳动物。哺乳动物包括但不限于鼠类、啮齿动物类、猿猴类、人、农场动物、竞技动物(sport animal)和宠物。这些受治疗者通常患有或易患病状，所述病状可通过施用通常但不必然是本文所述的聚合物-活性剂轭合物形式的本发明聚合物来预防或治疗。

特别就给定量提及时，术语“约”表示包括加或减5％的偏差。

“任选的”或“任选地”表示随后描述的情况可以发生或可以不发生，以使该描述包括情况发生的实例和情况不发生的实例。

“小分子”可广泛定义为通常具有少于约1000的分子量的有机化合物、无机化合物或有机金属化合物。本发明的小分子包括具有少于约1000的分子量的寡肽和其他生物分子。

在提及本发明轭合物时“活性剂部分”是指未修饰的母体活性剂的部分或残余部分(residue)，一直到由药物(或者其活化的或化学修饰的形式)与聚合物共价连接形成的共价键。在活性剂部分与多臂聚合物之间的可水解键水解后，释放出活性剂本身。

综述

多烯紫杉醇

是化学治疗剂，其主要用来治疗乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌(Lyseng-Williamson KA，Fenton，C.Drugs，2005；65(17)：2513-31)。它是紫杉醇的半合成类似物，且在其化学结构的两个位置不同于紫杉醇。紫杉醇和多烯紫杉醇之间的主要化学差异是侧链上的3’-氮的取代基(BOC vs.苯甲酰基)和紫杉烷核的10-位(游离醇 vs.乙酸酯)。这两种紫杉烷类都与许多不希望的副作用有关，并且它们的弱的水溶性阻碍其临床应用。

在努力克服这些缺点的过程中，已经描述了多种合成紫杉醇的前体药物和各种类似物的方法。相比之下，已报道的针对多烯紫杉醇修饰的研究明显更少，即使在体外和体内测定中多烯紫杉醇比紫杉醇都更具活性，由此看来使得多烯紫杉醇成为了一个用于修饰的更有前途的候选物。这种差异可能是由于，至少部分是由于多烯紫杉醇的化学结构。多烯紫杉醇包括位于1、7、10和2’-位的四个游离羟基基团。明确地，当尝试该药物或者同样具有多个反应基的任何药物的单个位点修饰时，在7、10、2’-位的三个仲醇带来了相当大的挑战。很多报道的多烯紫杉醇衍生物不是直接由母体化合物而是由受保护的前体制备的。

这种合成方法经常包括获得所需手性中心的多步骤反应和复杂的化学转化。一些研究员已尝试选择性地保护多烯紫杉醇上的特定羟基基团，但是由于低反应收率和难以分离所得的位置异构体，故很少获得成功。修饰的或增强药物递送的活性剂的合成必须产生合理的收率以使任何这类方法更具有经济上的吸引力。

部分发明者使用常规的二环己基碳二亚胺/二甲氨基吡啶偶联化学制备示例性的PEG-多烯紫杉醇轭合物的努力导致形成大量的一种或多种副产物——这可能是由于，至少部分是由于所用PEG试剂上的活化基团的空间位阻环境。

由前述看来，发明者已认识到对用于制备PEG轭合物、特别是小分子轭合物的简单方法的迫切需要，其中这类方法在轭合之前不需要保护小分子上的反应基。这类方法对具有多个反应基的小分子特别有利，并在本文中详细描述。

常规偶联

由具有多个反应基的剂制备单个位点聚合物修饰的活性剂的常规合成技术通常包括需要多个选择性保护/脱保护步骤的多步骤反应。这些反应经常受到低收率和难以分离所需产物的阻碍。在尝试避免使用受保护的活性剂前体中，发明者首次尝试将示例性的小分子多烯紫杉醇直接偶联到说明性多臂聚合物，如在实施例1A中详述。多烯紫杉醇的结构如下所示，其中箭头示出分子中能进行化学转化的多个羟基基团。

简要来说，多臂PEG试剂4臂PEG_20k-甘氨酸利用常规偶联剂二环己基碳二亚胺和二甲氨基吡啶(DCC/DMAP)与多烯紫杉醇反应。该反应(i)产生大量的副产物N-酰基脲，且(ii)难以分析和纯化。

还开发了形成期望产物的替代性方法，在所述方法中候选物小分子多烯紫杉醇首先用连接体甘氨酸(Fmoc-甘氨酸)修饰，之后与PEG试剂共价连接(实施例1B)。遗憾的是，纯化之后，期望的2’-甘氨酸修饰的多烯紫杉醇的收率很低，约为20％，并且伴随有数种不同的位置异构体的形成。

合成方法

为了克服上述的技术问题，除了别的之外，发明者已发展用于制备PEG轭合物的偶联反应，其抑制不希望的副反应并且促进形成良好收率和纯度的期望产物，而不必从具有一种或多种保护基的活性剂开始(即利用未受保护的起始物料)。

本文提供的合成方法利用由4-(二甲氨基)吡啶和对甲苯磺酸形成的分子复合物来实现形成高收率和高纯度的PEG轭合物。本文所述的合成路径有效地抑制不希望的副反应，且粗产物经常可通过简单沉淀而得以纯化。

特别地，本文提供的是用于将聚乙二醇聚合物与活性剂共价连接的方法。所述方法包括以下步骤：(i)提供含有第一官能团的活性剂，所述第一官能团例如选自氨基、羟基和羧基(以及其活化等同物)，和(ii)将所述活性剂与包含对第一官能团具有反应性的第二官能团的聚乙二醇反应。所述反应在偶联剂和对甲苯磺酸4-(二甲氨基)-吡啶鎓盐(DPTS)的存在下、在有效促进第一官能团与第二官能团之间的反应的条件下进行，从而形成聚乙二醇-活性剂轭合物。

聚乙二醇试剂

聚乙二醇试剂可具有许多种几何形状中的任一种，例如线性、分枝、叉状和多臂聚乙二醇。PEG试剂包含至少一个适于与活性剂上的官能团反应的官能团(在本文一般称为“第二官能团”，以便区分这种官能团与包含在所述活性剂中的一个或多个官能团)，从而形成期望的轭合物。用于与活性剂偶联的示例性官能团包括氨基、羟基和羧基，并且在适用时，旨在包括其活化形式。

适于应用的PEG试剂包括在Nektar Advanced PEGylationCatalog，2005-2006中所述的那些PEG试剂、得自NOF Corporation的活化PEG及类似PEG试剂。

在所述方法的一个具体实施方案中，所述聚乙二醇是具有约3个至约25个臂的多臂聚合物，或更优选地，是具有选自3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和10个臂的许多臂的多臂聚合物。

多臂聚合物可包括许多种不同聚合物核如多元醇或聚胺核，如在美国专利申请第2005/0112088号中所述的那些中的任一种。优选的形成多臂聚合物核(一个或多个PEG臂从该聚合物核延伸)的多元醇包括甘油、三羟甲基丙烷、还原糖如山梨糖醇或季戊四醇，和甘油低聚体如六甘油。

通常地，聚乙二醇试剂的总数均分子量为约800道尔顿(Da)至约100,000Da，更优选为约10,000Da至约60,000Da，最优选为约15,000至约60,000Da。除了其他数均分子量之外，特别优选具有约5,000Da、约8,000Da、约10,000Da、约12,000Da、约15,000Da、约20,000Da、约25,000Da、约30,000Da、约35,000Da、约40,000Da、约45,000Da、约50,000Da和约60,000Da的数均分子量的聚合物。在这种情况下，聚合物是多臂聚合物，当然，多臂聚合物的实际分子量取决于聚合物臂的数目和整个多臂聚合物中每个聚合物臂的分子量，以及聚合物的多分散性程度。

通常地，聚乙二醇包括约1个至约10个第二官能团。例如，聚乙二醇可包含选自1个、2个、3个、4个、5个和6个的许多个第二官能团。

适于在本方法中使用的说明性多臂聚合物试剂以及其对应的轭合物在美国专利申请第2005/0112088号中描述。

优选的用于本方法的多臂聚合物包括下式，其中下列结构可进一步包括连接一个或多个PEG臂(理想的是，PEG臂中的每个)与活性剂的其他连接体或官能团：

其中n的范围通常为从约5至约400，且m的范围从0至约5。

一种特别优选的多臂试剂是4臂PEG-甘氨酸(结构如下所示)，尽管甘氨酸连接体可被任何其他合适的连接体替代：

下面提供的是表示可由该方法形成的理想化轭合物的说明性结构，假定母体多元醇中的羟基的每一个已转化成聚合物臂并且每个聚合物臂具有与其共价连接的药物。在下面说明性实例中，Q通常表示O，但是可同样地被认为表示S、-NH-或-NH-C(O)-，且POLY表示聚乙二醇。

关于前述的示例性结构，X表示最典型地包括可水解键的间隔基，其中所述可水解键与活性剂D直接连接。聚合物和每个药物分子之间的所有键优选地包括可水解降解的部分如酯键，以使所述活性剂随时间从多臂聚合物核中释放。间隔基的特定同一性将至少部分取决于在本方法中所使用的具体PEG试剂。

通常地，可水解键的至少一个原子被包含在未修饰形式的活性剂中以使含在X内的可水解键水解之后，释放出活性剂D。一般来说，间隔基具有从约4个原子至约50个原子、或更优选地从约5个原子至约25个原子、或甚至更优选地从约5个原子至约20个原子的原子长度。通常地，间隔基具有选自由4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个和20个原子组成的组的原子长度。当考虑原子链长度时，仅考虑有助于所有间距的原子。例如，具有-CH₂-C(O)-NH-CH₂ CH₂ O-CH₂ CH₂ O-C(O)-O-结构的间隔基具有11个原子的链长，因为不认为取代基有效地有助于间隔基的长度。

活性剂

适于在本方法中使用的活性剂包括蛋白质、寡肽、多肽、小分子、抗体、核苷酸、寡核苷酸和脂质。优选地，所述活性剂是包含第一官能团的小分子，所述第一官能团是羟基或羧基，或适于与聚乙二醇试剂共价连接的任何其他部分。在某些实例中，所述活性剂可具有多于一个的第一官能团。本文所提供的方法尤其有利于这些活性剂。

在一个特定的实施方案中，所述活性剂部分是具有少于约1000的分子量的小分子。在还有其他的实施方案中，所述小分子药物具有少于约800、或甚至少于约750的分子量。在还有另一个实施方案中，所述小分子药物具有少于约500、或在某些实例中甚至少于约300的分子量。

优选的活性剂部分包括抗癌剂。特别优选的是具有至少一个羟基基团的溶瘤剂(oncolytics)。

本文所用的术语“喜树碱化合物”包括植物碱20(S)-喜树碱以及其药学活性的衍生物、类似物和代谢产物。喜树碱衍生物的实例包括但不限于：9-硝基-20(S)-喜树碱、9-氨基-20(S)-喜树碱、9-甲基-喜树碱、9-氯-喜树碱、9-氟-喜树碱、7-乙基喜树碱、10-甲基-喜树碱、10-氯-喜树碱、10-溴-喜树碱、10-氟-喜树碱、9-甲氧基-喜树碱、11-氟-喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、10，11-亚甲基二氧基喜树碱和10，11-亚乙基二氧基喜树碱、和7-(4-甲基哌嗪基亚甲基)-10，11-亚甲基二氧基喜树碱、7-乙基-10-(4-(1-哌啶基(piperdino))-1-哌啶基)-羰氧基-喜树碱、9-羟基-喜树碱和11-羟基-喜树碱。特别优选的喜树碱化合物包括喜树碱、伊立替康和托泊替康。

某些优选的喜树碱化合物符合如下一般结构。

其中R₁-R₅各自独立地选自由以下组成的组：氢；卤；酰基；烷基(例如C1-C6烷基)；取代的烷基；烷氧基(例如C1-C6烷氧基)；取代的烷氧基；链烯基；炔基；环烷基；羟基；氰基；硝基；叠氮基；酰氨基；肼；氨基；取代的氨基(例如单烷氨基和二烷氨基)；羟基羰基(hydroxcarbonyl)；烷氧基羰基；烷基羰氧基；烷基羰基氨基；氨基甲酰基氧基；芳基磺酰基氧基；烷基磺酰基氧基；-C(R₇)＝N-(O)_i-R₈，其中R₇是H、烷基、链烯基、环烷基或芳基，i是0或1，且R₈是H、烷基、链烯基、环烷基或杂环；且R₉C(O)O-，其中R₉是卤素、氨基、取代的氨基、杂环、取代的杂环或R₁₀-O-(CH₂)_m-，其中m是1-10的整数且R₁₀是烷基、苯基、取代的苯基、环烷基、取代的环烷基、杂环或取代的杂环；或

R₂与R₃一起或R₃与R₄一起形成取代的或未取代的亚甲基二氧基、亚乙基二氧基或亚乙基氧基；且

R₆是H或OR’，其中R’是烷基、链烯基、环烷基、卤烷基或羟烷基。

示例性的取代基包括羟基、氨基、取代的氨基、卤、烷氧基、烷基、氰基、硝基、羟基羰基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基羰基氨基、芳基(例如苯基)、杂环和糖基基团。

在一个特别优选的实施方案中，D是伊立替康，其中20-位羟基上的H在最终的多臂前体药物轭合物中不存在。

在又另一个实施方案中，D是紫杉醇或多烯紫杉醇。一个特别优选的D是多烯紫杉醇，其中2’位的H在最终的多臂聚合物轭合物中不存在。

优选地，本发明中所用的活性剂具有至少一个游离羟基、羧基、硫基、氨基基团或适于与聚合物共价连接的类似基团(即“柄(handle)”)。优选地，活性剂具有至少一个当与聚乙二醇试剂反应时适于形成可水解键的官能团，但是也可具有2个、3个、4个或更多个这样的官能团。优选地，所述聚合物仅与所述活性剂中这些官能团中的一个连接(即仅在单个位点连接)。

在小分子(或任何分子)中的期望的连接点空间受阻的情况下，单个步骤轭合反应可能难以达到有意义的收率。在这些情况下，该分子中期望的连接点(例如多烯紫杉醇中的2’羟基)或PEG试剂可通过与短连接体或间隔基部分的反应而被官能化。这种方法可适用于很多小分子，特别是具有难以接近到来的反应性聚合物的共价连接位点的那些小分子。所用的优选连接体包括t-BOC-甘氨酸或具有受保护的氨基基团和可用的羧酸基团的其他氨基酸(参见Zalipsky等人，“Attachment of Drugs to Polyethylene Glycols(药物与聚乙二醇的连接)”，Eur.Polym.J.，第19卷，No.12，第1177-1183页(1983))。参见，例如本文实施例1A和1B。优选的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸。

其他合适的间隔基还可用于替代上述的氨基酸。

偶联剂

本方法中所用的优选偶联剂是碳二亚胺类。代表性的偶联剂除了其他之外，包括选自由以下组成的组的那些：二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-叔丁基-N’-甲基碳二亚胺(TBMC)、N-叔丁基-N’-乙基碳二亚胺(TBEC)和1，3-二-对甲苯基碳二亚胺。这些偶联剂可从例如Sigma-Aldrich获得。

一个特别优选的偶联剂是N，N’-二异丙基碳二亚胺。

对甲苯磺酸4-(二甲氨基)-吡啶鎓盐(DPTS)

所述偶联反应通常是在对甲苯磺酸4-(二甲氨基)-吡啶鎓盐即由4-(二甲氨基)吡啶和对甲苯磺酸形成的1∶1分子复合物的存在下进行的(Jeffrey S.Moore和Samuel I.Stupp，Macromolecules，1990，23，65-70)。优选地，所述试剂是在使用之前新鲜制备的。

所述试剂是非吸湿性的，且可在室温下长期贮存。

反应条件

所述偶联反应通常在有机溶剂中进行。合适的溶剂除了其他之外，包括二氯甲烷、氯仿、乙腈和四氢呋喃。

通常地，所述偶联反应在范围为约0℃至约100℃的温度下进行。优选地，所述反应在室温下(即没有加热或冷却)进行，且可伴随搅拌。室温的范围通常为从约18℃至约23℃。

一般地，DPTS的量范围为相对于第一官能团(即活性剂中期望的连接点)的约0.05当量至约0.75当量，更优选为相对于第一官能团的约0.10当量至0.60当量。所述偶联剂的量一般范围为相对于第一官能团的约1.25当量至5当量。优选的第一官能团是羟基和羧基。

优选的第二官能团(即存在于聚乙二醇试剂中的反应基)包括氨基、羟基和羧基以及其活化等同物，当然，其中选择第一官能团和第二官能团使之相互反应。

优选地，第一官能团与第二官能团之间的反应导致形成酯键(例如，由羧酸或活化羧酸与醇的羟基基团的反应产生)。

在某些实例中，所述活性剂包括多于一个的第一官能团，并且所述方法不包括(或缺少)保护步骤，以使所得的轭合物产物仅在单个“第一官能团”位点得以修饰。

本方法的一个显著的优点是使由碳二亚胺偶联剂产生的N-酰基脲副产物形成降至最低。一般地，所述方法有效地导致形成少于约15％的N-酰基脲副产物，并且优选地，少于约10％的N-酰基脲副产物，并且甚至更优选地，少于约5％的N-酰基脲副产物。参见实施例2，其中合成方法导致形成具有通过酯键与多烯紫杉醇上的单个羟基位点(例如2’羟基位点)共价连接的聚乙二醇的多烯紫杉醇-聚乙烯轭合物，而没有形成可检测量的N-酰基脲副产物。

经本方法制备的期望的聚乙二醇-活性剂轭合物的收率通常大于约70％，优选大于约75％，更优选大于约80％，甚至更优选大于85％，且最优选大于90％。

可进一步纯化前体药物产物。纯化和分离的方法包括沉淀、之后过滤和干燥，以及色谱法。适宜的色谱法包括凝胶过滤色谱法和离子交换色谱法。

效用

本文所提供的方法适于制备许多PEG-轭合物中的任一种，并且特别有利于制备具有与分子中的单个反应位点(该分子具有多于一个的这种反应位点)共价连接的PEG的轭合物，而避免多个保护/脱保护步骤、低收率并使不希望的副反应降至最低。本文所提供的合成方法极其有效，且非常适于大规模生产。

此外，已显示示例性的根据本文提供的方法所形成的4臂PEG-甘氨酸-多烯紫杉醇轭合物作为抗癌剂特别有用。参见，例如实施例3、4和5。这种说明性轭合物在显著减少某些实体瘤的生长中有效，如通过小鼠中的代表性肺癌、前列腺癌和乳腺癌体内研究所证明。

应理解，尽管已描述了本发明连同其优选的特定实施方案，但是前文的描述以及随后的实施例旨在说明，而不是限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优点和修饰对本发明所属领域技术人员来说是明显的。

本文提及的所有文章、书籍、专利和其他出版物的全部内容据此通过引用并入。

实施例

除非另有指出，本发明的实施将使用常规的有机合成技术及类似的技术，这些技术都在本领域的技能水平内。如果这些技术未在本文中详细列出，则它们全部在文献中描述。试剂和材料都市售可得，除非另有明确说明。参见，例如，J.March，Advanced Organic Chemistry：Reactions Mechanisms and Structure(高等有机化学：反应机理和结构)，第4版，(New York：Wiley-Interscience，1992)，同上和Comprehensive Organic Functional Group Transformations II(综合性有机官能团转化II)，第1-7卷，第2版：1995-2003合成文献的综述(有机化学丛书)，Katritsky，A.R.等人编，Elsevier Science。

在下列实施例中，已努力确保关于所用数字的准确性(例如量、温度等)，但是应解释一些试验误差和偏差。除非另有规定，温度是以摄氏度计，并且压力为在海平面的大气压或接近海平面的大气压。

尽管将提及为本领域普通技术人员已知的其他缩写，还将使用其他试剂和材料，并且还将使用其他为本领域普通技术人员已知的方法，但是为了便利的原因，仍提供了以下列表和方法描述。

缩写

CM 羧甲基或羧基亚甲基(-CH₂COOH)

DCC 1，3-二环己基碳二亚胺

DCM 二氯甲烷

DIC N，N’-二异丙基碳二亚胺

DPTS 对甲苯磺酸4-(二甲氨基)-吡啶鎓盐

DMF 二甲基甲酰胺

DMAP 4-(N，N-二甲氨基)吡啶

DMSO 二甲亚砜

DI 去离子的

HCl 盐酸

HOBT 羟基苄基三唑

HPLC 高效液相色谱法

IPA 异丙醇

K或kDa 千道尔顿

MALDI-TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间

MeOH 甲醇

MW 分子量

NMR 核磁共振

RT 室温

SCM 琥珀酰亚胺基羧甲基(-CH₂-COO-N-琥珀酰亚胺基)

SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SEC 尺寸排阻色谱法

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

TLC 薄层色谱法

材料与方法

多烯紫杉醇

购自中国杭州HETD药物化工有限公司。

4臂PEG_20k-CM和4臂PEG_20k-SCM从4臂PEG_20k-OH(Nektar，Huntsville，Alabama)制得。

下列试剂的来源如下：甘氨酸叔丁酯(98％，Aldrich)；4-二甲氨基吡啶(DMAP，99％，Aldrich)；N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC，99％，Acros)，N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC，99％，Acros)，N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，99％，Aldrich)和对甲苯磺酸(PTSA，98.5％，Aldrich)，并且所有试剂在到货时即使用。在使用之前干燥溶剂。

DPTS：对甲苯磺酸通过苯溶液的共沸蒸馏而干燥，之后添加DMAP在苯中的等摩尔溶液。将所得悬浮液冷却至室温，并经抽滤收集固体。

4臂PEG_20k-甘氨酸具有下列结构：

所有¹HNMR数据通过由Bruker制造的300或400MHz NMR光谱仪产生。

实施例1

A.4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇的合成：DMAP-DCC偶联

将4臂PEG_20k-甘氨酸(500mg，0.025mmol)溶解于10mL二氯甲烷(DCM)中。边搅拌边将4-二甲氨基吡啶(19mg，0.15mmol)和DCC(32mg，0.15mmol)加入到PEG溶液。5分钟后加入多烯紫杉醇(121mg，0.15mmol)，并将反应混合物在室温下继续搅拌另外的24小时。结束后，将反应混合物在醚/IPA(1∶1)的混合溶剂系统中沉淀。通过抽滤收集所得的白色固体，将之再溶解于DCM(2mL)，并使用二乙醚单溶剂系统(100mL)再沉淀，抽滤后得到期望的产物。

¹H NMR分析显示存在显著量的N-酰基脲(δ1-2.5ppm)副产物。随后通过HPLC的药物释放研究显示了约40％PEG(每个聚合物分子的一个或多个羧基)部分转化成N-酰基脲(DMAP-DCC偶联反应中常见的副产物)。因为N-酰基脲副产物不能水解回到原先的PEG起始物料，所以产物纯度特征极其复杂。而且，PEG起始物料对于转化成N-酰基脲的部分是不可回收的。不进行产物混合物的进一步表征即结构、载药量(drug loading)、释放率。

B.替代方法：

甘氨酸连接体与多烯紫杉醇的共价连接

鉴于低收率且难以从实施例1A中所形成的混合物中纯化期望的轭合物产物，因此研究了制备期望轭合物的替代方法。

与其说研究了在偶联剂的存在下4臂PEG_20k-甘氨酸与多烯紫杉醇的直接反应，还不如说研究了甘氨酸在多烯紫杉醇2’位的共价连接，然后与对应的PEG试剂偶联以形成期望的4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇。

使用1当量的受保护的Fmoc-甘氨酸，以便致力于使各位点而不是2’位的修饰降至最低。反应条件在下面反应流程中示出。

在硅胶柱上纯化后，期望的轭合物(A)的收率仅为20％。由于2’-修饰的多烯紫杉醇的低收率和所形成的多个反应产物，所以不进行进一步转化成4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇。

实施例2

4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇的合成

4臂PEG_20k-甘氨酸多烯紫杉醇的全部合成在上面流程中示出。“4*”表示假设载药量完全时，每4臂聚合物中多烯紫杉醇分子的理论数目。

A.4臂PEG_20k-甘氨酸叔丁酯的制备

将4臂PEG_20k-CM(12.5g，0.625mmol)溶解于100mL DCM中。然后在搅拌下将4-二甲氨基吡啶(610mg，5.00mmol)和DCC(625mg，3.00mmol)加入到溶液中。搅拌5分钟后，加入甘氨酸叔丁酯HCl(503mg，3.00mmol)并将混合物在室温下继续搅拌过夜。结束后，使用醚/IPA(1∶1)的混合溶剂系统将反应混合物沉淀，抽滤后得到期望的4臂PEG_20k-甘氨酸叔丁酯产物(10.5g，0.525mmol，收率84％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ4.11(d，8H)，4.05(s，8H)，3.90-3.37(m，^-1900H)，1.48(s，36H)。

B.4臂PEG_20k-甘氨酸叔丁酯脱保护形成4臂PEG_20k-甘氨酸

使用三氟乙酸/二氯甲烷(TFA/DCM，3∶1)将4臂PEG_20k-甘氨酸叔丁酯脱保护并在室温下搅拌3小时。通过将醚(600mL)加至反应混合物使产物沉淀，抽滤后得到期望的4臂PEG_20k-甘氨酸(9.2g)。

¹H NMR(CDCl₃)δ4.11(d，8H)，4.05(s，8H)，3.90-3.37(m，^-1900H)。

C.4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇的制备

将多烯紫杉醇(776mg，0.96mmol)和4臂PEG_20k-甘氨酸(4.0g，0.2mmol)溶解于50mL DCM中，然后在搅拌下加入新鲜制备的DPTS(155mg，0.53mmol)(Jeffrey S.Moore和Samuel I.Stupp，Macromolecules，1990，23，65-70)和DIC(404mg，3.2mmol)。在室温下继续搅拌反应混合物24小时。使用醚/IPA(1∶1)的混合溶剂系统使反应混合物沉淀。通过抽滤收集所得的白色固体，将之再溶解于5ml DCM中，并使用醚单溶剂系统(300mL)再沉淀，抽滤后得到期望的4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇。收率(步骤C)为90％。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.12(d，8H)，7.73(m，4H)，7.61(m，4H)，7.52(m，8H)，7.41(m，8H)，7.33(m，8H)，6.20(t，4H)，5.69(m，8H)，5.60(m，4H)，5.36(s，4H)，5.22(m，4H)，4.97(d，4H)，4.33(m，8H)，4.30(m，12H)，4.06(d，8H)，3.98(s，8H)，3.90-3.24(m，^-1900H)，2.60(m，4H)，2.36(m，20H)，1.96(s，12H)，1.86(m，8H)，1.75(s，12H)，1.68(m，8H)，1.35(s，36H)，1.25(s，12H)，1.13(s，12H)。所有化学位移值以ppm(δ)表示。

D.4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇的载药量和水解

通过¹H NMR(8％)和RP-HPLC(6.2％)分析方法测定载药量，而仅通过RP-HPLC测定水解速率(在磷酸盐缓冲液中)。

通过 ¹ H NMR计算载药量

制备不同的PEG-多烯紫杉醇浓度的样品，然后扫描次数随样品的浓度而变化。根据所有获得的波谱的平均质子峰积分，确定载药量。

通过HPLC计算载药量和水解速率

仪器：HP 1100

柱：C₁₈柱

流动相：A：H₂O中的0.1％TFA；B：乙腈

流速：0.5mL/分钟

梯度表：

时间(分钟)	A％	B％
时间(分钟)	A％	B％	0	60％	40％
15	0	90％	0	60％	40％

载药量测定：实验上如下测定载药量和水解速率：使用上述的HPLC法，将10.8mg多烯紫杉醇溶解于乙腈/PBS的混合溶剂系统(1∶1，10mL，pH 7.4)中。将这种储备溶液进一步连续稀释，得到下列浓度的多烯紫杉醇溶液：540μg/mL、405μg/mL、300μg/mL、216μg/mL、108μg/mL和54μg/mL。得到每种浓度的峰面积，从而产生标准曲线。然后将30.4mg 4臂PEG_20k-多烯紫杉醇溶解于10mL PBS，pH 7.4。将溶液过滤，然后将0.3mL的等分试样置于10个独立的HPLC小瓶中。将这些小瓶贮存在37℃下，并在使用之前，加入0.3mL乙腈以确保存在于样品中的所有PEG-多烯紫杉醇和游离多烯紫杉醇溶解。每次注入使用一个小瓶，并且在200小时的时程(8.3天)中于不同的时间点进行注入。监控游离药物从PEG-轭合物中释放的出现，并在结束后对照标准曲线测定终浓度。

载药量值是指在4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇产物中与聚合物共价连接的多烯紫杉醇分子的平均数目。假设每个4臂聚合物含有4个多烯紫杉醇分子，则计算出4臂PEG_20k-甘氨酸-多烯紫杉醇产物的分子量为约23,232。多烯紫杉醇的分子量为808。假设载药量完全(每个聚合物4个多烯紫杉醇)，则包含在产物中的药物的理论重量百分比为(3232/23232)100或13.9％。经HPLC测定，药物的实测重量为6.2％，这表示每个聚合物多烯紫杉醇的平均数目为1.78。通过¹H NMR测定的载药量值为8％，这表示每个聚合物多烯紫杉醇分子的平均数目为约2.3。因此，对于此次制备，根据两种方法的平均，每个聚合物多烯紫杉醇分子的平均数目略高于2.00。

半衰期测定.水解速率(报告为半衰期)的测定利用上文对于载药量所述的相同分析方法。一旦药物释放结束，通过测定游离药物的浓度(面积％)等于50％的时间或者如果线性极佳的情况下通过测定曲线的斜率(ln 1-S％v s.小时)并使用下列方程来计算半衰期：

半衰期＝ln(2)/斜率

测定4臂PEG_20k-多烯紫杉醇的半衰期为15.3小时。

实施例3

4臂PEG_20K-甘氨酸-多烯紫杉醇在移植有NCI-H460肺肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性

将人NCI-H460肺肿瘤(每个30至40个片段)皮下植入到小鼠(Charles Rivers Labs：NCr nu/nu)的右腋域附近。指定植入的当天为第0天，并在治疗前使肿瘤达到100-245mg的重量。

以在治疗的第1天中值肿瘤重量与彼此尽可能地接近的方式，将动物随机分组。

治疗：小鼠接受1种或2种静脉剂量的测试化合物或载体(盐水)。

肿瘤测量：称量动物，并在施用第一次注射后每周测量肿瘤两次。通过测径器测量值(mm)和使用如下椭圆形球体的公式测量肿瘤体积：L×W²/2＝mm³，其中L和W是指在每次测量所采集的较大和较小法线尺寸(perpendicular dimension)。假设单位密度为(1mm³＝1mg)，此公式还用于计算肿瘤重量。

研究持续时间：在研究终止前，将发现濒死的任何动物或其肿瘤达到4000mg、形成溃疡或脱落的任何动物实施安乐死。

结果.进行两种不同的效果研究。第1种研究评价了4臂PEG_20k-多烯紫杉醇和多烯紫杉醇抗H460 NSCLC肿瘤的效果。图16A-C说明了单剂量的每个化合物对肿瘤生长的作用。观察到，20mg/kg和40mg/kg剂量的聚乙二醇化多烯紫杉醇相比于未聚乙二醇化的游离化合物提供了改善的抗肿瘤作用。10mg/kg剂量在两个化合物之间显示出显著差异。

在第2种研究中，测量最多达无胸腺裸小鼠的最大耐受剂量的抗肿瘤(H460 NSCLC肿瘤)效果。动物耐受最多30mg/kg的多烯紫杉醇和最多60mg/kg的PEG-多烯紫杉醇。图1说明了每个化合物的两种剂量(q7d×2)对肿瘤生长的作用。根据结果又可明显看出，聚乙二醇化的化合物相比于多烯紫杉醇化合物提供了改善的抗肿瘤作用。当与三种未聚乙二醇化的药物剂量比较时，剂量响应在三种聚乙二醇化的药物剂量中是清楚明显的。

实施例4

4臂PEG_20K-甘氨酸-多烯紫杉醇在移植有DU-145前列腺肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性

如上面实施例3所述进行此项研究，除了所使用的肿瘤为DU-145前列腺肿瘤。

评价最多达每个化合物的最大耐受剂量抗前列腺肿瘤(DU-145)的抗肿瘤效果。动物耐受最多30mg/kg的多烯紫杉醇和最多60mg/kg的PEG-多烯紫杉醇。

图2说明了每个化合物的两种剂量(q7d×2)的抗肿瘤作用。根据结果又可明显看出，在所有3种所测试的剂量下，聚乙二醇化的化合物完全抑制肿瘤生长，并且抑制持续78天观察期。多烯紫杉醇化合物显示良好的活性，但是肿瘤在30-50天后恢复并生长。

实施例5

4臂PEG_20K-甘氨酸-多烯紫杉醇在移植有MCF-7乳腺肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性

在细胞接种前至少2天，通过外科手术将17β-雌二醇(雌激素)小片(1.00mg/小片；Innovative Research of America，Sarasota，Florida，USA)皮下植入到多达100只小鼠(Charles Rivers Labs：CD-1 Fox nl nu)的颈部侧面(lateral side)。这些小片在植入后以0.011mg/天的速率释放雌激素达90天。手术后，将0.1mL体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Matrigel (1∶1 v/v)中约1×10⁶MCF-7细胞皮下注射到右肋中。使肿瘤达到50-150mm³的范围。此项研究的第0天表示给药的第一天。

肿瘤测量：称量动物，并在施用第一次注射后每周测量肿瘤两次。通过测径器测量值(mm)和使用如下椭圆形球体的公式测量肿瘤体积：L×W²/2＝mm³，其中L和W是指在每次测量所采集的较大和较小法线尺寸。假设单位密度为(1mm³＝1mg)，此公式还用于计算肿瘤重量。

研究持续时间：在研究终止前，将发现濒死的任何动物或其肿瘤达到1500cc、形成溃疡或脱落的任何动物实施安乐死。

结果：以10mg/kg、20mg/kg和30mg/kg的剂量评价抗乳腺肿瘤(MCF-7)的抗肿瘤效果。结果显示两种所测试的化合物在两种高剂量时都完全抑制肿瘤生长。图3说明了10mg/kg剂量(q7d×2)的抗肿瘤效果。

由于具有存在于前述描述中的教导的益处，故本发明所属领域技术人员可想到本发明的很多变更和其他实施方案。因此，应理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案，且预期变更和其他实施方案包括在所附权利要求的范围内。尽管本文使用特定术语，但是它们仅以通用和描述性的含义使用，并不出于限定的目的。

Claims

1.一种将聚乙二醇聚合物与活性剂共价连接的方法，所述方法包括以下步骤：

提供包含第一官能团的活性剂，所述第一官能团选自氨基、羟基和羧基，和

在偶联剂和对甲苯磺酸4-(二甲氨基)-吡啶鎓盐(DPTS)的存在下，在有效促进所述第一官能团与第二官能团之间的反应的条件下，将所述活性剂与包含对所述第一官能团具有反应性的第二官能团的聚乙二醇反应，从而形成聚乙二醇-活性剂轭合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述偶联剂是碳二亚胺。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述偶联剂选自由二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-叔丁基-N’-甲基碳二亚胺(TBMC)和N-叔丁基-N’-乙基碳二亚胺(TBEC)组成的组。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述偶联剂是N，N’-二异丙基碳二亚胺。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述反应步骤在选自由二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃组成的组的有机溶剂中进行。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述反应步骤在范围为0℃至100℃的温度下进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述反应步骤在室温下进行。

8.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中DPTS在所述反应步骤中的量范围为相对于所述第一官能团的约0.05当量至0.75当量。

9.根据权利要求8所述的方法，其中DPTS在所述反应步骤中的量范围为相对于所述第一官能团的约0.10当量至0.60当量。

10.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述偶联剂的量范围为相对于所述第一官能团的约1.25当量至5当量。

11.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述第二官能团选自由氨基、羟基和羧基组成的组。

12.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述活性剂选自由蛋白质、寡肽、多肽、小分子、抗体、核苷酸、寡核苷酸和脂质组成的组。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述活性剂是蛋白质或多肽。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述活性剂是小分子。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述活性剂是包含为羟基或羧基的第一官能团的小分子。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述活性剂具有多于一个的所述第一官能团。

17.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述第一官能团与第二官能团之间的反应导致形成酯键。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述小分子是紫杉烷或喜树碱。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述小分子是多烯紫杉醇或紫杉醇。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述反应导致形成具有通过酯键与多烯紫杉醇上单个羟基位点共价连接的聚乙二醇的多烯紫杉醇-聚乙烯轭合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述单个位点是多烯紫杉醇的2’-羟基基团。

22.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇选自由线性、分枝、叉状和多臂聚乙二醇组成的组。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述聚乙二醇包括3个至25个臂。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述聚乙二醇包括选自3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和10个的多个臂。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述聚乙二醇包括多元醇或聚胺核。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述聚乙二醇包括选自甘油、三羟甲基丙烷、山梨糖醇、六甘油和季戊四醇的多元醇核。

27.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇包括约1个至约10个所述第二官能团。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述聚乙二醇包括选自1个、2个、3个、4个、5个和6个的多个所述第二官能团。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述聚乙二醇包括选自以下的结构：

其中

n范围为从约5至约400，

m范围从0至5，且

多臂聚合物的总分子量的范围从约1500至约60,000道尔顿。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述活性剂包括多于一个的所述第一官能团，且所述方法不包括保护步骤。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述活性剂是多烯紫杉醇。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述聚乙二醇是：

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述反应步骤形成具有仅在其2’位与所述聚乙二醇共价连接的多烯紫杉醇的轭合物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述反应步骤形成了每个聚乙二醇所具有的多烯紫杉醇分子的平均数目范围为约2.1个至3.75个的轭合物。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述反应步骤形成了每个聚乙二醇所具有的多烯紫杉醇分子的平均数目范围为约2.3个至3.2个的轭合物。

36.根据权利要求16所述的方法，其中所述反应步骤导致形成少于约15％的N-酰基脲副产物。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述反应步骤导致形成少于约10％的N-酰基脲副产物。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述反应步骤导致形成少于约5％的N-酰基脲副产物。

39.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述轭合物的收率大于约70％。