JP5277417B2 - ポリマー複合体を調製する方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００６年１１月３０日に出願された米国暫定出願第６０／８６１、９９５号および２００７年１１月１４日に出願された米国暫定出願第 号、代理人参照番号第４１７１４−８０２９．ＵＳ００号の利益を主張し、それらの内容は全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、概して、数ある態様の中でもとりわけ、１つ以上の水溶性ポリマーを活性剤に共有結合させる方法に関する。

長年にわたり、ポリエチレングリコール等の水溶性ポリマーを生物学的活性剤に共有結合させるために多くの合成法が用いられてきた。ＰＥＧ化の初期の試みは、典型的に、活性剤における複数の反応部位、最も一般的にはポリペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧの非特異性共有結合をもたらした。ポリペプチドの場合、共有結合のための最も一般的な反応基は、リジンのアルファまたはエプシロンアミノ基である。初期のＰＥＧ化化学は、典型的に、低分子量、直鎖ＰＥＧ試薬を使用し、ほとんどの複合体はアシル化により生成された（非特許文献１）。このような初期のＰＥＧ化薬剤は、しばしば、低い薬剤の効能もたらし、および／または低いバッチ間の再現性を呈した。

第２期のＰＥＧ化化学により、活性剤における複数の反応部位へのポリマーの共有結合におけるジオール混成、副反応、不安定な連結、および選択性の欠乏等の第１期のＰＥＧ化試薬に伴う多くの問題を解決するように考案された方法をもたらした（非特許文献１、前出）。とりわけ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド（特許文献１）、ＰＥＧビニルスルホン（特許文献２）、およびＰＥＧマレイミド（特許文献３）等の新ＰＥＧ試薬が開発され、その使用を伴う方法が記載された。分枝（特許文献４）および叉状ＰＥＧ（特許文献５）等の非直鎖ＰＥＧもまた、例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社およびＮＯＦ社等の企業からより広く入手可能になった。

治療薬剤の薬理特性および他の特性を向上するための１つの可能な手法として治療薬のＰＥＧ化が広く用いられるようになるにつれ、効果的な薬理特性を有する明確なＰＥＧ化した治療薬を一貫して形成するための合成上の課題は増加し続ける。このような方法は、特に大規模な製造に適応されるものである場合、理想的には複数の反応ステップを回避し、必要とされる保護、脱保護、および精製ステップの数を最小限に抑え、一貫した方法で、且つ合理的に高い収率で生成物を形成するべきである。

米国特許第５，２５２，７１４号明細書 米国特許第５，４４６，０９０号明細書 米国特許第６，６０２，４９８号明細書 米国特許第５，９３２，４６２号明細書 米国特許第６，４３７，０２５号明細書

Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４（２００２）、４５９−４７６

一態様において、ポリエチレングリコールポリマーを活性剤に共有結合させる方法を本明細書に提供する。本方法には、（ｉ）アミノ、ヒドロキシル、およびカルボキシル（ならびに反応エステル等の活性カルボキシル同等物）から成る群から選択される、第１の官能基を含む活性剤を提供するステップと、（ｉｉ）第１の官能基に反応する第２の官能基を含むポリエチレングリコールに活性剤を反応させるステップが含まれる。反応は、第１と第２の官能基との間の反応を促進し、それによりポリエチレングリコール−活性剤複合体が形成されるのに効果的な条件下において、カップリング試薬および４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート（ＤＰＴＳ）の存在下で実施される。

一実施形態においては、カップリング剤はカルボジイミドである。代表的なカップリング剤には、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’メチルカルボジイミド（ＴＢＭＣ）、およびＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＴＢＥＣ）から成る群から選択されるカップリング剤が含まれる。

好ましい実施形態においては、カップリング試薬は、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドである。

反応は、典型的に有機溶剤中で実施される。適切な溶剤には、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、およびテトラヒドロフランが含まれる。

さらなる実施形態においては、反応は、０℃から１００℃の範囲の温度、さらに好ましくは室温で実施される。

本方法のさらに別の実施形態においては、ＤＰＴＳの量は、該第１の官能基に対して約０．０５から０．７５当量、さらに好ましくは、該第１の官能基に対して約０．１０から０．６０当量の範囲である。

さらに付加的な実施形態においては、カップリング試薬の量は、該第１の官能基に対して約１．２５から５当量の範囲である。

好ましい第２の官能基には、アミノ、ヒドロキシル、およびカルボキシルが含まれる。

本方法の使用に適切な活性剤には、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、小分子、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および脂質が含まれる。

本方法の好ましい実施形態においては、活性剤は、ヒドロキシルまたはカルボキシルである第１の官能基を含む小分子である。一部の例においては、活性剤は、１つより多い該第１の官能基を有する。

特に好ましい小分子には、タキサン（例えば、ドセタキセルまたはパシリタキセル）およびカンプトセシンが含まれる。

さらにより好ましい実施形態においては、第１と第２の官能基との間の反応はエステル連結の形成をもたらす。

さらにより具体的な実施形態においては、本方法は、エステル連結を介し、ドセタキセル上の単一のヒドロキシル部位（例えば、２’ヒドロキシル部位）に共有結合したポリエチレングリコールを有するドセタキセル−ポリエチレン複合体の形成をもたらす。

本方法においては、ポリエチレングリコールは、多くの形状、例えば直鎖、分枝、叉状およびマルチアームポリエチレングリコールのいずれをも有し得る。好ましくは、ポリエチレングリコールは、約３から約２５本のアームを有するマルチアームポリマーである。

好ましいマルチアームポリマーは、ポリオールまたはポリアミンコアを有するポリマーである。典型的なポリオールコアには、グリセロール、トリメチロールプロパン、ソルビトール、ヘキサグリセロール、およびペンタエリトリトールを含む。

本方法の一実施形態においては、ポリエチレングリコールは、約１から約１０の第２の官能基を含む。さらにより具体的な実施形態においては、ポリエチレングリコールは、１、２、３、４、５、および６から選択される数の第２の官能基を含む。さらに別の実施形態においては、ポリエチレングリコールは、３、４、および５から選択される数の第２の官能基を有する。

本方法のさらに別の実施形態においては、活性剤は、１つより多い第１の官能基を含み、本方法は保護ステップを含まない。

本方法のさらに別の代替的な実施形態においては、活性剤は１つより多い第１の官能基（例えば、１つより多いヒドロキシル基）を含み、本方法は、活性剤上の単一部位のみに共有結合したポリエチレングリコールを有する複合体の形成をもたらすのに効果的である。

さらに別の実施形態において、本方法は、約１５％未満のＮ−アシル尿素副生物、好ましくは、約１０％未満のＮ−アシル尿素副生物、さらに好ましくは約５％未満のＮ−アシル尿素副生物の形成をもたらすのに効果的である。

本明細書に記載される本発明の特徴それぞれは、別途指定がない限り、本明細書に記載されるそれぞれおよび全ての実施形態に同様に適用するように意図されている。

本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、以下の図面の簡単な説明と併せて読めばより十分に明らかになるであろう。

実施例３に記載されるとおり、Ｈ４６０非小細胞肺癌腫瘍が移植されたメスの異種移植無胸腺ヌードマウスにおける、ドセタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇ）および「４−ａｒｍ−ＰＥＧ−２０ｋ−ＧＬＹ−ＤＯＣ」（２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、および６０ｍｇ／ｋｇ）として図面に示される４−ａｒｍ−ＰＥＧ_２０ｋ−グリシン−ドセタキセルの３つの異なる投与量のそれぞれのうちの２つの投与の経時効果を示す図表である。 実施例４に記載されるとおり、ＤＵ−１４５前立腺腫瘍を移植されたメスの異種移植無胸腺ヌードマウスにおける、ドセタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇ）および４−ａｒｍ−ＰＥＧ_２０ｋ−グリシン−ドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、および６０ｍｇ／ｋｇ）の３つの異なる投与量のそれぞれのうちの２つの投与の経時効果を示す図表である。 実施例５に記載するとおり、ＭＣＦ−７乳房腫瘍が移植されたマウスにおける、ドセタキセルおよび４−ａｒｍ−ＰＥＧ_２０ｋ−グリシン−ドセタキセルそれぞれの経時抗腫瘍効果を示す図表である。

以下、本発明の実施の形態について、より詳細に説明する。
しかしながら、本発明は、多くの異なる形状で具体化され、本明細書に示される実施形態に制限されると解釈するべきではなく、むしろこれらの実施形態は、本開示が詳細且つ完全であり、本発明の範囲を当業者に伝えるために提供される。

定義
本明細書で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、１つの（ａ）「ポリマー」への言及は、単一のポリマーならびに２つ以上の同一または異なるポリマーを含み、１つの（ａ）「複合体」への言及は、単一の複合体ならびに２つ以上の同一または異なるポリマーを含み、１つの（ａｎ）「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤ならびに２つ以上の同一または異なる賦形剤等を含む。

本発明を記載し主張する上で、以下の用語は以下に記載する定義に従い使用される。

「官能基」は、典型的に、有機合成の正常状態下で、それが結合される構造と、さらなる官能基を有する他の構造との間の共有結合を形成するために使用することができる基である。官能基は、概して、複数の化学結合および／ヘテロ原子を含む。本明細書に記載されるポリマーおよび活性剤に使用する好ましい官能基を以下に記載する。

「反応」という用語は、有機合成の従来の条件下で容易にまたは実用的な速度で反応する官能基を指す。これは、反応しない、または反応するために強力な触媒または非実用的な反応条件を必要としない基（つまり、「非反応性」または「不活性」基）とは対照的である。

反応混合物内の分子上に存在する官能基に関連して、「容易に反応しない」とは、反応混合物内で望ましい反応を生成するのに効果的な条件下で、おおむね原形を保つ基を示す。

カルボン酸の「活性化誘導体」は、求核試薬と容易に、一般的には、非誘導体化されたカルボン酸よりもさらに容易に反応するカルボン酸誘導体を指す。活性化カルボン酸は、例えば、酸ハロゲン化物（酸塩化物等）、無水物、炭酸塩、およびエステルを含む。このようなエステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル等のイミダゾリルエステル、およびベンゾトリアゾールエステル、ならびにイミドエステルを含む。活性誘導体は、例えば、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウム・ヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢＯＰ）等の様々な試薬のうちの１つとのカルボン酸の反応により原位置で形成することができ、好ましくは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）または１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡＴ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルロリン酸（ＨＡＴＵ）、またはビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸塩化物（ＢＯＰ−ＣＩ）と組み合わせて使用される。

官能基の「化学的同等物」は、実質的に官能基と同種の反応性を有するものである。例えば、ＳＮ２反応を受ける１つの官能基は、別のこのような官能基と機能的に同等であるとみなされる。

「保護基」は、特定の反応条件下において、分子内の特定の化学的反応性官能基の反応を防止または阻止する部分である。保護基は、保護される化学的反応性の基の種類、ならびに使用される反応条件および分子内における追加の反応基または保護基の存在により異なる。保護することが可能な官能基には、例として、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、カルボニル基等が含まれる。カルボン酸の代表的な保護基は、エステル（ｐ−メトキシベンジルエステル等）、アミドおよびヒドラジド、アミノ基に対しては、カルバミン酸塩（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル等）およびアミド、ヒドロキシル基に対しては、エーテルおよびエステル、チオール基に対しては、チオエーテルおよびチオエステル、カルボニル基対しては、アセタールおよびケタール、等が含まれる。そのような保護基は、当業者には周知であり、例えば、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＧ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９、およびそれに引用される参考文献に記載されている。

「保護された形態」の官能基は、保護基を有する官能基を指す。本明細書において、「官能基」という用語またはそのいかなる同義語は、その保護された形態を含むことを意図する。

本明細書において、「ＰＥＧ」または「ポリ（エチレングリコール）」は、いかなる水溶性ポリ（エチレンオキシド）をも含むことを意図する。典型的に、本発明に使用するＰＥＧは、例えば、末端酸素が合成変換中に置換されたかどうかにより、２つの以下の構造、すなわち、「−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−」または「−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−１ＣＨ_２ＣＨ_２−」のうちの１つを備える。変数（ｎ）は、３から３０００であり、末端基およびＰＥＧ全体の構造は異なり得る。「ＰＥＧ」は、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−であるサブユニットを、ほとんど、つまり、５０％より多く含むポリマーを意味する。本発明に使用するＰＥＧには、以下の詳細に記載される様々な分子量、構造または形状を有するＰＥＧが含まれる。

ＰＥＧ等の本発明の水溶性ポリマーとの関連における「分子量」は、ポリマーの公称平均分子量を指し、典型的に、サイズ排除クロマトグラフィー、光散乱技術、または、１、２、４−トリクロロベンゼンにおける固有の速度決定により決定される。ＰＥＧ等の水溶性ポリマーとの関連における分子量は、数平均分子量または重量平均分子量のいずれかで表される。別途記載がない限り、本明細書における分子量の全ての言及は、重量平均分子量を指す。両方の分子量、数平均および重量平均の決定は、ゲル浸透クロマトグラフまたは他の液体クロマトグラフ技術を用いて測定することができる。数平均分子量を決定するための、末端基分析または束一性性質の測定（例えば、凝固点降下、沸点上昇、または浸透圧）の使用、または重量平均分子量を決定するための光散乱技術、超遠心分離法、または粘度測定の使用等、分子量値を測定する他の方法を使用することもできる。本発明のポリマーは、典型的に、約１．２未満、約１．１５未満、約１．１０未満、約１．０５未満、および約１．０３未満等の低多分散値を有する多分散（つまり、ポリマーの数平均分子量および重量平均分子量が等しくない）である。本明細書において、時には、重量平均分子量または数平均分子量のいずれかを有する単一の水溶性ポリマーに言及されるが、そのような言及は、単一の水溶性ポリマーが規定の分子量を有する水溶性ポリマーの組成物から得られたことを意味すると理解されるであろう。

本明細書において「リンカー」という用語は、有機ラジカルコアおよびポリマーセグメント等の接続部分を結ぶ原子または原子の集合を指すために使用される。リンカー部分は、加水分解的に安定し得、または生理学的に加水分解あるいは酵素的に分解可能な連結であり得る。

本明細書において「スペーサー」という用語は、ポリマーセグメントおよび活性剤Ｄ等の連結部分を結ぶ原子の集合を指すために使用される。スペーサー部分は、加水分解的に安定している、または生理学的に加水分解あるいは酵素的に分解可能な連結を含み得る。

「加水分解可能な」結合は、生理学的条件下で、水（つまり、加水分解される）に反応する比較的弱い結合である。水中で加水分解する結合の傾向は、２つの中心原子を結合する連結の一般的な種類によるだけでなく、これらの中心原子に結合した置換基にもよって異なる。例示的な加水分解に不安定な結合には、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシル基エステル、イミン、オルトエステル、ペプチド、およりオリゴヌクレオチドが含まれる。

「加水分解に安定した」連結または結合は、水中で実質的に安定した、つまり、長期期間にわたり、いかなる相当の程度にも、生理学的条件下で加水分解しない化学結合（典型的には共有結合）を指す。加水分解に安定した連結の例には、以下を含むがそれらに限定されない。炭素−炭素結合（例えば、脂肪族鎖における）、エーテル、アミド、ウレタン等。一般的に、加水分解に安定した連結は、生理学的条件下で、１日当たり約１−２％未満の加水分解率を呈するものである。代表的な化学結合の加水分解率は、ほとんどの標準的な化学の教科書で見ることができる。

形状またはポリマー構造の全体に関する「マルチアーム」は、３つ以上のポリマー含有「アーム」を有するポリマーを指す。したがって、マルチアームポリマーは、その構造またはコア構造により、３つのポリマーアーム、４つのポリマーアーム、５つのポリマーアーム、６つのポリマーアーム、７つのポリマーアーム、８つのポリマーアーム、またはそれ以上のアームを有することがある。ある特定の種類の高度に分岐したポリマーは、本発明の目的では、マルチアームポリマーの構造とは異なる構造を有すると考えられる樹木状ポリマーまたはデンドリマーである。

「分岐点」は、ポリマーが直鎖構造から１つ以上の追加のポリマーアームに分かれるまたは分岐する、１つ以上の原子を有する分岐点を指す。マルチアームポリマーは、１つの分岐点または複数の分岐点を有し得る。

「デンドリマー」は、全ての結合が通常の分枝パターンおよびそれぞれが分岐点となる反復単位を持つ、中心の焦点またはコアから放射状に出現する球形の単分散ポリマーである。デンドリマーは、コアカプセル等の特定の樹枝状特性を呈し、それが、他の種類のポリマーとの違いとなる。

「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ全体的または完全にを意味し、例えば、９５％より多い、ある一定量を意味する。

「アルキル」は、典型的に長さが約１から２０原子の範囲の炭化水素鎖を指す。このような炭化水素鎖は、必ずしもそうである必要はないが、望ましくは飽和し、分枝または直鎖であり得るが、典型的に直鎖が好ましい。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、３−メチルペンチル等を含む。本明細書において、「アルキル」は、３つ以上の炭素原子に言及する際にシクロアルキルを含む。

「低級アルキル」は、１から６個の炭素原子を含むアルキル基を指し、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルにより例示される直鎖または分枝であり得る。

「シクロアルキル」は、好ましくは３個から約１２個の原子、さらに好ましくは３個から約８個から成り、架橋、融解、またはスピロ環状化合物を含む飽和または不飽和環状炭化水素鎖を指す。

「不干渉置換基」は、分子内に存在する場合に、典型的に、分子内に含有される他の官能基に反応しない基である。

例えば、「置換アルキル」にあるような「置換」という用語は、Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチル等、ハロ、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびイオド、シアノ、アルコキシ、低級フェニル、置換フェニル、等を含むがそれらに限定されない１つ以上の不干渉置換基で置換された部分（アルキル基）を指す。フェニル環上の置換では、置換基はいかなる配向であり得る（つまり、オルト、メタ、またはパラ）。

「アルコキシ」は、Ｒがアルキルまたは置換アルキル、好ましくは、Ｃ_１−Ｃ_２０アルキル（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ等）、好ましくは、Ｃ_１−Ｃ_７である−Ｏ−Ｒ基を指す。

「求電子試薬」は、求電子中心、つまり求電する中心を有し、求核試薬と反応することが可能なイオン、原子、またはイオン化され得る原子の一群を指す。

「求核試薬」は、求核中心、つまり求電子中心を求める中心を有し、求電子試薬と反応することが可能なイオンまたは原子、あるいはイオン化され得る原子の一群を指す。

本明細書において、「活性剤」には、生体内または体外で示すことができ、多くの場合有益な薬理学的効果を提供するいかなる薬剤をも含む。本明細書において、これらの用語は、患者に局所的または全身的効果を生むいかなる生理学的または薬理学的に活性な物質をもさらに含む。

本明細書において同義的に使用される「二官能性」または「二価性」は、その中に、典型的にポリマー末端に含有される２つの官能基を有するポリマー等の実体を意味する。官能基が同じ場合は、実体は、ホモ二官能性またはホモ二価性であると称される。官能基が異なる場合は、ポリマーは、ヘテロ二官能性またはヘテロ二価性であると称される。

本明細書に記載される塩基性または酸性反応物は、中性、荷電、およびそれらのいかなる対応する塩形態をも含む。

本明細書において「対象」、「個体」または「患者」という用語は、同義的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳類を指す。哺乳類は、ネズミ科、齧歯類、サル、ヒト、家畜、スポーツ用動物、およびペットを含むがそれらに限定されない。このような対象は、典型的に、本明細書に記載されるポリマー活性剤複合体の形状である必要はないが、典型的に、本発明のポリマーの投与により予防また治療することができる状態を患っているまたはその状態になり易い。

特に一定量に関して、「約」という用語は、前後５％の偏差を含むことを意味する。

「任意の」または「任意に」は、その後に記述される状況が生じるまたは生じない場合があることを意味し、記述には、状況が生じる場合、およびそれが生じない場合が含まれる。

「小分子」は、典型的に約１０００未満の分子量を有する有機、無機、または有機金属化合物と広く定義することができる。本発明の小分子は、約１０００未満の分子量を有するオリゴペプチドおよび他の生分子を含む。

本発明の複合体に関する「活性剤部分」は、薬剤（またはその活性化または化学的に改変された形状）のポリマーとの共有結合により生じた、共有結合までの改変されていない親活性剤の一部または残基を指す。活性剤部分とマルチアームポリマーとの間の加水分解結合の加水分解の際に、活性剤自体が放出される。

概要
ドセタキセル（タキソテール（登録商標））は、主に乳房、卵巣および非小細胞肺癌の治療に使用される化学療法剤である（Ｌｙｓｅｎｇ−Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ＫＡ、Ｆｅｎｔｏｎ、Ｃ．Ｄｒｕｇｓ、２００５；６５（１７）：２５１３−３１）。それは、パクリタキセルの半合成アナログであり、その化学構造において、２つの位置でパクリタキセルとは異なる。パクリタキセルおよびドセタキセルの主な化学的相違点は、側鎖上の３’−窒素（ＢＯＣ対ベンゾイル）およびタキソイドコアの１０位における置換である（遊離アルコール対アセテート）。両タキソイドは、望ましくない副作用の多くに関連し、それらの難水溶性は、臨床応用の妨げとなる。

そのような不利点を打開しようと、プロドラッグおよびパクリタキセルの様々なアナログを合成するために、様々な方法が記述されてきた。一方で、ドセタキセルは、体内および体外分析の両方において、より活性であり、従って、ドセタキセルは、より有望な改変の候補になると思われるが、非常に少数のドセタキセルの改変に向けた研究しか報告されていない。この相違は、恐らく、少なくともある程度、ドセタキセルの化学構造によるものである。ドセタキセルは、１、７、１０および２’位に位置する４個の遊離ヒドロキシル基を含む。具体的には、７、１０、２’位における３個の第２級アルコールは、薬剤の単一の部位および同様に複数の反応基を有するいかなる薬剤の修飾を試みる際にも多くの問題を引き起こす。報告されているドセタキセルの誘導体の多くは、親化合物から直接調製されるのではなく、保護前駆体から調整される。このような合成方法は、所要のキラル中心を得るために、多くの場合、多段階の反応および複雑な化学変換を伴う。
一部の研究者は、ドセタキセル上の特定のヒドロキシル基を選択的に保護する試みを行ったが、低反応収率および得られた位置異性体の分離における問題により限られた成果しか得られていない。改変または薬物送達強化活性剤の合成は、そのような方法を経済的に魅力的にするために、実用的な収率をもたらす必要がある。

従来のジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルアミノピリジン結合化学を用いて典型的なＰＥＧ−ドセタキセル複合体を調製するための発明者らの取り組みは、有意な量の１つ以上の副生成物の形成をもたらし、それは、恐らく、少なくとも部分的には、使用されたＰＥＧ試薬上の活性基の立体的に障害される環境によるものである。

前述を考慮して、発明者らはＰＥＧ複合体、特に小分子の複合体を調製する簡単な方法の早急な必要性を認識した。そのような方法は、結合前に小分子上の活性基の保護を必要としない。そのような方法は、複数の反応基を有する小分子に特に有利であり、本明細書に記載されている。

従来の結合
複数の活性基を有する薬剤から単一部位ポリマー修飾活性剤を調製するための従来の合成技術は、典型的に、複数の選択的に保護／脱保護ステップを必要とする多段階の反応を伴う。そのような反応は、低い収率および望ましい生成物の分離における問題により妨げられることが多い。保護活性剤先駆体の使用を回避する試みにおいて、発明者らは、まず、参考例１Ａで詳細に説明される具体的なマルチアームポリマーへの典型的な小分子であるドセタキセルの直接結合を試みた。ドセタキセルの構造を以下に示し、矢印は、化学変換を受けることが可能な分子の複数のヒドロキシル基を示す。

簡潔に述べると、マルチアームＰＥＧ試薬、４−アーム−ＰＥＧ_２０ｋ−グリシンを、従来のカップリング試薬であるジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジン（ＤＣＣ／ＤＭＡＰ）を使用して、ドセタキセルと反応させた。反応は、（ｉ）相当量の副生物であるＮ−アシル尿素を生成し、（ｉｉ）分析および精製が困難であった。

まず候補小分子であるドセタキセルがリンカーであるグリシン（Ｆｍｏｃ−グリシン）で改変され、続いてＰＥＧ試薬に共有結合する、望ましい生成物を生成させる代替的な方法が試みられた（参考例１Ｂ）。残念ながら、精製後に、望ましい２’−グリシン修飾ドセタキセルの収率は、約２０％と非常に低く、いくつかの異なる位置異性体の形成を伴った。

合成方法
とりわけ上述の技術的問題を打開するために、発明者らは、１つ以上の保護基を有する活性剤から開始する必要なく（つまり、非保護出発物質を使用する）、不要な副反応を抑制し、高い収率且つ純度の望ましい生成物の形成を促進するＰＥＧ複合体を調節するためのカップリング反応を開発した。

本明細書に提供される合成方法は、４−（ジメチルアミノ）ピリジンおよびｐ−トルエンスルホン酸により形成された分子錯体を使用し、高い収率且つ純度のＰＥＧ複合体の形成をもたらす。本明細書に記載される合成経路は、不要な副反応を抑制するのに効果的であり、粗生成物は、大抵、単純な沈殿により精製することができる。

特に、本明細書は、ポリエチレングリコールポリマーを活性剤に共有結合させる方法を提供する。本方法には、（ｉ）例えば、アミノ、ヒドロキシル、およびカルボキシル（およびそれらの活性同等物）から選択される第１の官能基を含む活性剤を提供するステップと、（ｉｉ）活性剤を第１の官能基と反応する第２の官能基を含むポリエチレングリコールに反応させるステップが含まれる。反応には、第１と第２の官能基との間の反応を促進するのに効果的な条件下で、結合剤および４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート（ＤＰＴＳ）の存在下で実施され、ポリエチレングリコール−活性剤複合体を形成する。

ポリエチレングリコール試薬
ポリエチレングリコール試薬は、多くの形状、例えば直鎖、分枝、叉状、およびマルチアームポリエチレングリコールのいずれかを有することができる。ＰＥＧ試薬は、少なくとも１つの活性剤上の官能基との反応に適切な官能基（本明細書において、概して、活性剤に含有される１つ以上の官能基とそのような官能基を区別するために「第２の官能基」という）を含み、望ましい複合体を形成する。活性剤に結合するための典型的な官能基には、アミノ、ヒドロキシル、およびカルボキシルが含まれ、適用できる場合には、それらの活性型を含むことを意図する
使用に適したＰＥＧ試薬には、Ｎｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ、２００５−２００６に記載される試薬、ＮＯＦ社から販売される活性ＰＥＧ等が含まれる。

本方法の特定の一実施形態において、ポリエチレングリコールは、約３から約２５のアームを有するマルチアームポリマー、さらに好ましくは、３、４、５、６、７、８、９、および１０のアームから選択される数のアームを有するマルチアームポリマーである。

マルチアームポリマーは、米国特許第２００５／０１１２０８８号に記載されるポリマーコア等の、ポリオールまたはポリアミンコア等の多くの異なるポリマーコアのいずれかを含み得る。１つ以上のＰＥＧアームが広がるマルチアームポリマーコアを形成するのに好ましいポリオールには、グリセロール、トリメチロールプロパン、ソルビトールまたはペンタエリスリトール等の還元糖、およびヘキサグリセロール等のグリセロールオリゴマーが含まれる。

典型的に、ポリエチレングリコール試薬の総数平均分子量は、約８００ダルトン（Ｄａ）から約１００、０００Ｄａ、さらに好ましくは、約１０、０００Ｄａから約６０、０００Ｄａ、最も好ましくは、約１５、０００から約６０、０００Ｄａである。とりわけ、約５、０００Ｄａ、約８、０００Ｄａ、約１０、０００Ｄａ、約１２、０００Ｄａ、約１５、０００Ｄａ、約２０、０００Ｄａ、約２５、０００Ｄａ、約３０、０００Ｄａ、約３５、０００Ｄａ、約４０、０００Ｄａ、約４５、０００Ｄａ、約５０、０００Ｄａ、約６０、０００Ｄａの数平均分子量を有するポリマーが、特に好ましい。ポリマーがマルチアームポリマーである場合において、マルチアームポリマーの実際の分子量は、当然のことながら、ポリマーアームの数、および全体のマルチアームポリマーにおける各ポリマーアームの分子量、ならびに、ポリマーの多分散性の程度により異なる。

典型的に、ポリエチレングリコールは、約１から約１０の第２の官能基を含む。例えば、ポリエチレングリコールは、多くの１、２、３、４、５、および６から選択される数の第２の官能基を含む。

本発明の方法における使用に適した具体的なマルチアームポリマー試薬ならびにそれらに対応する複合体は、米国特許第２００５／０１１２０８８号に記載される。

本方法の使用に好ましいマルチアームポリマーは、以下を含み、以下の構造は、１つ以上のＰＥＧアーム（理想的には各ＰＥＧアーム）を活性剤に連結する付加的リンカーまたは官能基をさらに含む。

および

ｎは、典型的に約５から約４００の範囲であり、ｍは、０から約５の範囲である。

特に好ましいマルチアーム試薬の１つは、グリシンリンカーが別の適切なリンカーにより置換される場合もあるが、４−アーム−ＰＥＧ−グリシン（構造を以下に示す）である。

本方法により形成することが出来る理想的複合体に対応する具体的構造を、親ポリオール内の各ヒドロキシルはポリマーアームに変換され、各ポリマーアームはそこに共有結合された薬剤を有することを仮定して、以下に提供する。以下の具体的な実施例において、典型的にＱはＯに対応するが、同様にＳ、−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−に対応するように考慮される場合があり、ＰＯＬＹはポリエチレングリコールに対応する。

前述の具体的な構造に関して、Ｘは、典型的に、ほとんどの加水分解結合が活性剤Ｄに直接結合する加水分解結合を有するスペーサーを表す。ポリマーと各薬剤の分子との間の全体的な連結は、好ましくは、エステル連結等の加水分解で分解可能な部分を含み、それにより、活性剤がマルチアームポリマーコアから時間と共に放出される。スペーサーが具体的に何であるかは、少なくとも部分的に、本方法に使用される特定のＰＥＧ試薬により異なる。

多くの場合、加水分解連結の少なくとも１つの原子が、非修飾型で活性剤に含有され、加水分解連結の加水分解がＸ内に含まれる際に、活性剤Ｄが放出される。一般的に言えば、スペーサーは、約４原子から約５０原子、または好ましくは約５原子から約２５原子、またはさらに好ましくは約５原子から約２０原子の長さの原子を有する。典型的に、スペーサーは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０から成る群から選択される原子の長さである。原子の鎖長を考えると、全体の距離に寄与する原子のみが考えられる。例えば、−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２ ＣＨ_２ Ｏ−ＣＨ_２ ＣＨ_２ Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−の構造を有するスペーサーは、置換基がスペーサーの長さに有意に寄与すると考えられないため、１１原子の鎖長を有する。

活性剤
本方法の使用に適した活性剤には、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、小分子、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および脂質が含まれる。好ましくは、活性剤は、ヒドロキシルまたはカルボキシル、あるいはポリエチレングリコール試薬との共有結合に適した他の任意の部分のいずれかである第１の官能基を含む小分子である。ある例においては、活性剤は、１つより多い第１の官能基を有することができる。本明細書に提供される方法は、そのような活性剤に特に有利である。

特定の実施形態において、活性剤部分は、約１０００未満の分子量を有する小分子である。さらにさらなる実施形態において、小分子薬剤は、約８００未満、またはさらに約７５０未満の分子量を有する。さらに別の実施形態において、小分子薬剤は、約５００未満、または一部の例において、さらに約３００未満の分子量を有する。

好ましい活性剤部分は、抗癌剤を含む。少なくとも１つのヒドロキシル基を有する腫瘍崩壊剤が特に好ましい。

特に好ましい小分子は、タキサン（例えば、ドセタキセルまたはパシリタキセル）およびカンプトセシンを含む。

本明細書において「カンプトセシン化合物」という用語は、植物性アルカロイド２０（Ｓ）−カンプトセシン、ならびにその薬学的に活性誘導体、アナログおよび代謝体を含む。カンプトセシン誘導体の例には、９−ニトロ−２０（Ｓ）−カンプトセシン、９−アミノ−２０（Ｓ）−カンプトセシン、９−メチル−カンプトセシン、９−クロロ−カンプトセシン、９−フルオロ−カンプトセシン、７−エチルカンプトセシン、１０−メチル−カンプトセシン、１０−クロロ−カンプトセシン、１０−ブロモ−カンプトセシン、１０−フルオロ−カンプトセシン、９−メトキシ−カンプトセシン、１１−フルオロ−カンプトセシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン（ＳＮ３８）、１０、１１−メチレンジオキシカンプトセシン、および１０、１１−エチレンジオキシカンプトセシン、および７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０、１１−メチレンジオキシカンプトセシン、７−エチル−１０−（４−（１−ピペリジン）−１−ピペリジン）−カルボニロキシ−カンプトセシン、９−ヒドロキシ−カンプトセシン、および１１−ヒドロキシ−カンプトセシンが含まれるがそれらに限定されない。特に好ましいカンプトセシン化合物には、カンプトセシン、イリノテカン、およびトポテカンを含む。

ある種の好ましいカンプトセシン化合物は、以下の一般化された構造に対応する。

式中、Ｒ_１−Ｒ_５は、水素、ハロ、アシル、アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル）、置換アルキル、アルコキシ（例えば、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ
、置換アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アジド、アミド、ヒドラジン、アミノ、置換アミノ（例えば、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノ）、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルカルボニルアミノ、カルバモイルオキシ、アリールスルホニルオキシ、アルキルスフホニルオキシ、−Ｃ（Ｒ_７）＝Ｎ−（Ｏ）_ｉ−Ｒ_８（式中、Ｒ_７は、Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、またはアリールであり、ｉは、０または１であり、Ｒ_８は、Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、または複素環である）Ｒ_９Ｃ（Ｏ）Ｏ−（式中、Ｒ_９はハロゲン、アミノ、置換アミノ、複素環、置換複素環である）、または、Ｒ_１０−Ｏ−（ＣＨ２）_ｍ−（ｍは、１から１０の整数であり、Ｒ_１０は、アルキル、フェニル、置換フェニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環、または置換複素環である）から成る群からそれぞれ個別に選択され、あるいは、
Ｒ_２はＲ_３と共に、または、Ｒ_３はＲ_４と共に置換または非置換メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、またはエチレンオキシを形成し、
Ｒ_６は、ＨまたはＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、ハロアルキル、またはヒドロキシアルキルである。

典型的な置換基には、ヒドロキシル、アミノ、置換アミノ、ハロ、アルコキシ、アルキル、シアノ、ニトロ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルカルボニルアミノ、アリール（例えば、フェニル）、複素環、およびグリコシル基を含む。

特に好ましい一実施形態において、Ｄは、イリノテカンであり、２０−位ヒドロキシル上のＨは、最終のマルチアームプロドラッグ複合体に存在しない。

さらに別の実施形態において、Ｄは、パシリタキセルまたはドセタキセルである。１つの特に好ましいＤは、ドセタキセルであり、２’位のＨは、最終のマルチアームポリマー複合体に存在しない。

好ましくは、本発明に使用するための活性剤は、ポリマーへの共有結合に適する、少なくとも１つの遊離ヒドロキシル、カルボキシル、チオ、アミノ基等（つまり、「ハンドル」）を有する。好ましくは、活性剤は、ポリエチレングリコール試薬と反応する際に、加水分解連結を形成するのに適した少なくとも１つの官能基を有するが、２、３、４、またはそれ以上のそのような官能基を有することもできる。好ましくは、ポリマーは、活性剤内のそのような活性基の１つのみに結合される（つまり、単一部位にのみ結合される）。

小分子（またはいかなる分子）内の望ましい結合点が立体的に妨害される場合、単一ステップの共役反応は、有意な収率で得ることは困難な場合がある。そのような場合において、分子内の望ましい結合点（例えば、ドセタキセル内の２’ヒドロキシル）、またはＰＥＧ試薬のいずれかは、短いリンカーまたはスペーサー部分との反応により官能化することができる。そのような方法は、多くの小分子、特に反応ポリマーがアクセスできない共有結合部位を有する小分子に適用することができる。使用するのに望ましいリンカーはｔ−ＢＯＣ−グリシン、または保護アミノ基および使用可能なカルボン酸基を有する別のアミノ酸を含む（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｔｏ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌｓ”，Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１２，ｐｐ．１１７７−１１８３（１９８３）を参照されたい）。例えば、本明細書の参考例１Ａおよび１Ｂを参照されたい。好ましいアミノ酸には、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンを含む。

別の適切なスペーサーは、上述のアミノ酸の代わりに使用することもできる。

結合試薬
本発明の方法における使用に好ましいカップリング試薬は、カルボジイミドである。代表的なカップリング剤は、とりわけ、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−メチルカルボジイミド（ＴＢＭＣ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＴＢＥＣ）、および１、３−ジ−パラ−トリルカルボジイミドから成る群から選択される薬剤を含む。そのようなカップリング剤は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から販売されている。

１つの特に好ましいカップリング剤は、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドである。

４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム−）ｐ−トルエンスルホナート（ＤＰＴＳ）
カップリング反応は、典型的に、４−（ジメチルアミノ）ピリジンおよびパラ−トルエンスルホン酸によって形成される１：１の分子錯体である、４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム−）ｐ−トルエンスルホナートの存在下で実施される（Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｓ．Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｓａｍｕｅｌ Ｉ．Ｓｔｕｐｐ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９０、２３、６５−７０）。好ましくは、試薬は使用前に新しく調製される。

試薬は、含水ではなく、室温で長期間保存することができる。

反応条件
カップリング反応は、典型的に、有機溶剤内で実施される。適した溶剤は、とりわけ、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、およびテトラヒドロフランを含む。

典型的に、カップリング反応は、約０℃から約１００℃の範囲の温度で実施される。好ましくは、反応は、室温で実施され（つまり加熱または冷却がない）、撹拌を伴うことがある。室温は、典型的に、約１８℃から約２３℃の範囲である。

概して、ＤＰＴＳの量は、第１の官能基に対して約０．０５から約０．７５当量の範囲（つまり、活性剤内の望ましい結合部分）であり、さらに好ましくは、第１の官能基に対して約０．１０から約０．６０当量の範囲である。カップリング試薬の量は、概して、第１の官能基に対して約１．２５から５当量の範囲である。好ましい第１の官能基は、ヒドロキシルおよびカルボキシルである。

好ましい第２の官能基（つまり、ポリエチレングリコール試薬内に存在する反応基）は、アミノ、ヒドロキシル、およびカルボキシル、ならびにそれらの活性化した同等物を含み、当然のことながら、第１および第２の官能基は、互いに反応するように選択される。

好ましくは、第１と第２の官能基との間の反応は、エステル連結の形成をもたらす（例えば、カルボン酸または活性カルボン酸とアルコールのヒドロキシル基との反応によりもたらされる）。

特定の例において、活性剤は、１つより多い第１の官能基を含み、その方法は、保護するステップを含まず（または存在しない）、それにより複合生成物は、「第１の官能基」部位のみで改変される。

この方法の著しい利点の１つは、カルボジイミドカップリング剤から生じるＮ−アシル尿素副生物が僅かであることである。概して、本方法は、約１５％未満のＮ−アシル尿素副生物、好ましくは、約１０％未満のＮ−アシル尿素副生物、さらに好ましくは、５％未満のＮ−アシル尿素副生物の形成をもたらすのに効果的である。合成方法が、検知可能な量のＮ−アシル尿素副生物が存在しない、ドセタキセル上の単一ヒドロキシル部位（例えば、２’ヒドロキシル部位）に、エステル連結を介する、共有結合するポリエチレングリコールを有するドセタキセル−ポリエチレン複合体の形成をもたらす実施例２を参照されたい。

この方法により調製された望ましいポリエチレングリコール−活性剤の収率は、典型的に、約７０％を上回り、好ましくは、約７５％を上回り、さらに好ましくは、約８０％を上回り、さらに好ましくは８５％を上回り、最も好ましくは９０％を上回る。

プロドラッグ生成物は、さらに精製することができる。精製方法および単離方法は、沈殿後のろ過および乾燥、ならびにクロマトグラフィーを含む。適切なクロマトグラフ法は、ゲルろ過クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを含む。

実用性
本明細書に提供される方法は、多くのＰＥＧ複合体のいずれの調製にも適しており、複数の保護／脱保護ステップ、低い収率を回避し、不要な副反応を最小限に抑えながら、１つより多い反応部位を有する分子内の単一の反応部位に共有結合するＰＥＧを有する複合体の調製に特に有利である。本明細書に提供される合成方法は、非常に効果的であり、大規模な製造への適応に適している。

加えて、本明細書に提供される方法に従い生成された典型的な４−アームＰＥＧ−グリシン−ドセタキセル複合体は、抗癌剤として特に有用であることが明らかになっている。例えば、実施例３、４および５を参照されたい。そのような具体的な複合体は、マウスの体内研究における代表的な肺、前立腺、および乳房癌で明らかなように、特定の固形癌腫瘍の成長を有意に低下させるのに効果的である。

発明は、その好ましい特定の実施形態に関連して記載され、前述の説明ならびにその後に続く実施例は、説明を目的としており、本発明の範囲を制限するものではないことを理解するものとする。本発明の範囲内の他の態様、利益および修正は、本発明が関連する当業者に明らかである。

本明細書で参照される全ての論文、本、特許明細書、および他の出版物は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

特に指示がない限り、本発明の実行は、当業者のレベル内である有機合成等の従来の技術を用いる。そのような技術は、本明細書に詳しく説明されていないものについては、文献に十分に記載されている。具体的にそれに反する記述がない限り、試薬および物質は、市販されている。例えば、Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４ｔｈ Ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２）（前出）、 および、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ、Ｖｏｌｕｍｅｓ １−７、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．：
Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ １９９５−２００３（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｅｄｓ．Ｋａｔｒｉｔｓｋｙ、Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｉｅｎｃｅを参照されたい。

以下の実施例において、使用する数字（例えば、量、温度等）に関する正確度を確実にするために努力がなされているが、一部の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指示がない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は海抜における気圧、あるいはその気圧に近いものである。

当業者に周知の他の略語が参照され、他の試薬および物質が使用され、当業者に周知の他の方法が使用されるが、以下のリストおよび方法の説明は利便性のために提供される。

略語
ＣＭ カルボキシメチルまたはカルボキシメチレン（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）
ＤＣＣ １、３−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ 塩化メチレン
ＤＩＣ Ｎ、Ｎ’ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＰＴＳ ４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＰ ４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
Ｄｌ 脱イオン
ＨＣｌ 塩酸
ＨＯＢＴ ヒドロキシベンジルトリアゾール
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＡ イソプロピルアルコール
ＫまたはｋＤａ キロダルトン
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ マトリクス補助レーザー脱離イオン化飛行時間
ＭｅＯＨ メタノール
ＭＷ 分子量
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＲＴ 室温
ＳＣＭ サクシンイミジルカルボキシメチル（−ＣＨ_２−ＣＯＯ−Ｎ−サクシンイミジル）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム−硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
材料と方法
ドセタキセル（タキソテール（登録商標））は、中国（ＣＨＩＮＡ）のＨａｎｇｚｈｏｕ ＨＥＴＤ Ｐｈａｒｍ＆Ｃｈｅｍ社から購入した。

４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−ＣＭおよび４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−ＳＣＭは、４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−ＯＨ（Ｎｅｋｔａｒ社、アラバマ州アンツヴィル）から調製された。

以下の試薬の供給源は次のとおりである。グリシンｔｅｒｔ−ブチルエステル（９８％、Ａｌｄｒｉｃｈ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、９９％、Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、９９％、Ａｃｒｏｓ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、９９％、Ａｃｒｏｓ）Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、９９％、Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ、９８．５％，Ａｌｄｒｉｃｈ）。全ての試薬は入手したままの状態で使用された。溶剤を使用前に乾燥した。

ＤＰＴＳ：ｐ−トルエンスルホン酸をベンゾール溶液の共沸蒸留に続いて、ベンゾール中のＤＭＡＰの等モル溶液の添加により乾燥した。得られた懸濁液は、室温で冷却され、吸引ろ過により固体が収集された。

４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシンは、以下の構造を有する。

全ての^１ＨＮＭＲデータは、Ｂｒｕｋｅｒ社製造の３００または４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光器により得られた。

参考例１
Ａ．４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルの合成：ＤＭＡＰ−ＤＣＣカップリング
４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン（５００ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬの塩化メチレン（ＤＣＭ）中に溶解した。４−ジメチルアミノピリジン（１９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（３２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、ＰＥＧ溶液に撹拌して添加した。５分後に、ドセタキセル（１２１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌し続けた。終了次第、反応混合物を、エーテル／ＩＰＡ（１：１）の混合溶液系内で沈殿させた。得られた白色固体を、吸引ろ過により収集し、ＤＣＭ（２ｍＬ）中に溶解し、吸引ろ過後にジエチルエーテル（１００ｍＬ）の単一溶液系を使用して沈殿させ、望ましい生成物を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ分析は、有意な量のＮ−アシル尿素（δ１−２．５ｐｐｍ）副生物の存在を示した。ＨＰＬＣにより検査されたその後の薬物放出は、約４０％のＰＥＧ（各ポリマー分子の１つ以上のカルボキシ基）が、部分的にＮ−アシル尿素副生物（ＤＭＡＰ−ＤＣＣカップリング試薬における一般的な副生物）に変換されたことを明らかにした。Ｎ−アシル尿素副生物は加水分解して従来のＰＥＧ出発物質に戻ることができないため、生成物純度の形状は、非常に複雑である。その上、ＰＥＧ出発物質は、Ｎ−アシル尿素に変換された部分については復元することはできない。生成混合物のさらなる特性、すなわち、構造、薬物負荷、放出率の解析は、実施されなかった。

Ｂ．代替方法：
グリシンリンカーのドセタキセルへの共有結合
低い収率および参考例１Ａで形成された混合物から望ましい複合生成物を精製する際の問題を考慮して、望ましい複合体を精製するための代替方法が試みられた。

カップリング試薬の存在下における４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシンとドセタキセルの直接的反応ではなく、むしろドセタキセルの２’位でのグリシンの共有結合を試み、続いて、対応するＰＥＧ試薬にカップリングして、望ましい４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルを形成した。

２’位以外の部位での改変を最小限に抑えるために、保護されたＦｍｏｃ−グリシンの同等物の１つが使用された。反応条件を、以下の反応スキームに示す。

シリカゲルカラムの精製に続き、望ましい複合体（Ａ）の収率は、２０％のみであった。２’−改変ドセタキセルの低い収率および形成された複数の反応性生物により、４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルへのさらなる変換は実施されなかった。

実施例２
４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルの合成

４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルの全般的な合成は、上記のスキームに示される。「４＊」は、完全な薬物負荷を想定した４−アーム−ポリマーのドセタキセル分子の理論数を表す。

Ａ．４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシンｔ−ブチルエステルの調製
４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−ＣＭ（１２．５ｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）を１００ｍｌ ＤＣＭ中に溶解した。それから、４−ジメチルアミノピリジン（６１０ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（６２５ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）を、撹拌して溶液に添加した。５分間撹拌した後、グリシンｔ−ブチルエステル−ＨＣＩ（５０３ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌し続けた。終了次第、反応混合物をエーテル／ＩＰＡ（１：１）の混合溶液系を使用して沈殿し、吸引ろ過後に、所望の４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシンｔ−ブチルエステル生成物を得た（１０．５ｇ、０．５２５ｍｍｏｌ、収率８４％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣＩ_３）δ４．１１（ｄ、８Ｈ）、４．０５（ｓ、８Ｈ）、３．９０−３．３７（ｍ、約１９００Ｈ）、１．４８（ｓ、３６Ｈ）
Ｂ．４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシンｔ−ブチルエステルの４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシンへの脱保護
４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシンｔ−ブチルエステルを、トリフルオロ酢酸／塩化メチレン（ＴＦＡ／ＤＣＭ、３：１）を使用し、室温で３時間撹拌して脱保護した。生成物を、エーテル（６００ｍＬ）を反応混合物に添加して沈殿させ、吸引ろ過後に、所望の４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン（９．２ｇ）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣＩ_３）δ４．１１（ｄ、８Ｈ｝）、４．０５（ｓ、８Ｈ）、３．９０−３．３７（ｍ、約１９００Ｈ）。

Ｃ・４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルの調製
ドセタキセル（７７６ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）および４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン（４．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのＤＣＭ中に溶解し、それから、新たに調製したＤＰＴＳ（１５５ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）、（Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｓ．Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｓａｍｕｅｌ Ｉ． Ｓｔｕｐｐ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９０、２３、６５−７０）およびＤＩＣ（４０４ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を撹拌して添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し続けた。反応混合物を、エーテル／ＩＰＡ（１：１）の混合溶液系を使用して沈殿させた。得られた白色固体を、吸引ろ過により収集し、５ｍｌのＤＣＭ中に溶解し、エーテルの単一の溶液系（３００ｍＬ）を使用して沈殿させ、吸引ろ過後に、所望の４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルを得た。収率（ステップＣ）９０％。

^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣＩ_３）δ８．１２（ｄ、８Ｈ）、７．７３（ｍ、４Ｈ）、７．６１（ｍ、４Ｈ）、７．５２（ｍ、８Ｈ）、７．４１（ｍ、８Ｈ）、７．３３（ｍ、８Ｈ）、６．２０（ｔ、４Ｈ）、５．６９（ｍ、８Ｈ）、５．６０（ｍ、４Ｈ）、５．３６（ｓ、４Ｈ）、５．２２（ｍ、４Ｈ）、４．９７（ｄ、４Ｈ）、４．３３（ｍ、８Ｈ）、４．３０（ｍ、１２Ｈ）、４．０６（ｄ、８Ｈ）、３．９８（ｓ、８Ｈ）、３．９０−３．２４（ｍ、約１９００Ｈ）、２．６０（ｍ、４Ｈ）、２．３６（ｍ、２０Ｈ）、１．９６（ｓ、１２Ｈ）、１．８６（ｍ、８Ｈ、１．７５（ｓ、１２Ｈ）、１．６８（ｍ、８Ｈ）、１．３５（ｓ、３６Ｈ）、１．２５（ｓ、１２Ｈ）、１．１３（ｓ、１２Ｈ）。全ての化学シフト値はｐｐｍである。（δ）
Ｄ．４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルの薬物負荷および加水分解
薬物負荷は、^１Ｈ ＮＭＲ（８％）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（６．２％）分析手法により決定され、加水分解率（リン酸緩衝液中）は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより単独に決定された。

^１ Ｈ ＮＭＲによる薬物負荷の算定：
異なるＰＥＧ−ドセタキセル濃度の試料を用意し、スキャン数は試料の濃度により異なった。得られた全てのスペクトラムの平均プロトンピーク積分を基に、薬物負荷が決定された。

ＨＰＬＣによる薬物負荷および加水分解率の算定
機器：ＨＰ１１００
カラム：Ｃ_１８カラム
移動相：Ａ：Ｈ_２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル
流率：０．５ｍＬ／分
勾配表：

薬物負荷の決定：薬物負荷および加水分解率は以下の通り実験的に決定された。上述のＨＰＬＣ方法を使用し、１０．８ｍｇのドセタキセルをアセトニトリル／ＰＢＳ（１：１、１０ｍＬ、ｐＨ７．４）の混合溶液系中に溶解した。この原液を、以下の濃度のドセタキセル溶液を得るために連続的にさらに希釈した。５４０μｇ／ｍＬ、４０５μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、２１６μｇ／ｍＬ、１０８μｇ／ｍＬおよび５４μｇ／ｍＬ。各濃度のピーク面積を得、標準曲線を作成した。それから、３０．４ｍｇの４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−ドセタキセルを１０ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４中に溶解した。この溶液をろ過し、それから、０．３ｍＬの一定分量を１０個の個別のＨＰＬＣバイアルに入れた。これらのバイアルを３７℃で保管し、試料内に存在する全てのＰＥＧ−ドセタキセルおよび浮遊ドセタキセルが確実に溶解されるように、使用前に０．３ｍＬのアセトニトリルを添加した。各注入に１つのバイアルを使用し、２００時間（８．３日）の間に様々な時点で注入が行われた。ＰＥＧ−複合体から放出された遊離薬物の出現は、監視され、終了時点に標準曲線に対する最終濃度が決定された。

薬物負荷値は、４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセル生成物内のポリマーに共有結合したドセタキセル分子の平均数をいう。４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセル生成物の算出された分子量は、４−アーム−ポリマー当たり４ドセタキセル分子と想定して、およそ２３、２３２である。ドセタキセルの分子量は、８０８である。完全な薬物負荷（ポリマー当たり４ドセタキセル）を想定すると、生成物に含有される薬物の理論的重量百分率は、（３２３２／２３２３２）１００または１３．９％である。ＨＰＬＣにより決定された、実際に確認された薬物重量は、ポリマー当たりのドセタルの平均数１．７８に相当する、６．２％であった。^１Ｈ ＮＭＲで決定された薬物負荷値は、ポリマー当たりのドセタキセル分子の平均数約２．３に相当する８％であった。したがって、本調製では、両方の方法の平均を基にすると、ポリマー当たりのドセタキセル分子の平均数は、２．００よりやや高い。

半減期の決定。半減期として報告される加水分解率の決定には、薬物負荷において上述したのと同様の分析手法を用いた。薬物放出が完了した時点で、半減期は、遊離薬物の濃度（面積％）が５０％と同等になる時間を測定する、または完全な直鎖の場合は、プロットの勾配（１−Ｓ％対時間）を測定して算出され、以下の式を用いた。

半減期＝Ｉｎ（２）／スロープ
４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−ドセタキセルの半減期は、１５．３時間と決定された。

実施例３
ＮＣＩ−Ｈ４６０肺腫瘍が移植されたマウスにおける４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルの抗腫瘍活性
ヒトＮＣＩ−Ｈ４６０肺腫瘍（それぞれ３０から４０断片）が、マウスの右腋窩部位付近に皮下的に移植された（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｓ：ＮＣｒ ｎｕ／ｎｕ）。移植日を、０日とし、腫瘍は、治療前に体重につき１００−２４５ｍｇの重量に到達するまで放置した。

動物は、治療初日の平均腫瘍重量が互いにできるだけ近くなるような形で、無作為にグループに分けられた。

治療：マウスは、試験化合物または媒体（生理食塩水）の１回または２回の静脈内投与を受けた。

腫瘍測定：初回の注射投与後に週２回、動物の体重および腫瘍が測定された。腫瘍量は、キャリパー測定（ｍｍ）により測定され、以下の楕円球体の式を使用した：ＬｘＷ^２／２＝ｍｍ^３、式中、ＬおよびＷは、各測定で収集されたより大きい方の、およびより小さい方の垂直の寸法を指す。この式は、単位密度（１ｍｍ^３＝１ｍｇ）を想定して、腫瘍重量を算出するためにも使用された。

研究期間：瀕死状態のいかなる動物、または腫瘍が４０００ｍｇに到達した、潰瘍がある、または剥がれ落ちた動物を研究終了前に安楽死させた。

結果 ２つの異なる有効性に関する研究が行われた。第１の研究は、Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ腫瘍に対する４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−ドセタキセルおよびドセタキセルの効果を評価した。図１６Ａ〜図１６Ｃは、腫瘍増殖への各化合物の単一投与の効果を示す。２０および４０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化されたドセタキセルの投与は、ＰＥＧ化されていない浮遊化合物よりも向上した抗腫瘍効果を提供したことが認められた。１０ｍｇ／ｋｇの投与は、２つの化合物との間で有意な差異を示した。

第２の研究において、抗腫瘍効果（Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ腫瘍）は、無胸腺ヌードマウスにおいて最大許容投与量まで測定された。動物は、最大３０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルおよび最大６０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ドセタキセルに耐えた。

図１は、腫瘍成長への各化合物の２回の容量（ｑ７ｄ×２）の効果を示す。ＰＥＧ化された化合物は、ドセタキセル化合物よりも向上した抗腫瘍効果を提供することは、結果から再び明らかである。容量反応は、３つのＰＥＧ化されていない薬物投与量を比較した際、３つのＰＥＧ化された薬物投与量の中で明確である。

実施例４
ＤＵ−１４５前立腺腫瘍が移植されたマウスにおける４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルの抗腫瘍活性
研究は、使用された腫瘍がＤＵ−１４５前立腺腫瘍であったことを除き、実施例３に記載の通りに実施された。

抗腫瘍効果は、前立腺腫瘍（ＤＵ−１４５）に対して、各化合物の最大許容量まで測定された。動物は、最大３０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルおよび最大６０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ドセタキセルに耐えた。

図２は、各化合物の２回の容量（ｑ７ｄ×２）の抗腫瘍効果を示す。ＰＥＧ化された化合物は、７８日間の観察期間中、全ての試験された３回の容量において腫瘍成長を完全に抑制したことが、結果から再び明らかである。ドセタキセル化合物は、優れた活性を示したが、腫瘍は回復し、３０〜５０日後に成長した。

実施例５
ＭＣＦ−７乳房腫瘍が移植されたマウスにおける４−アーム−ＰＥＧ_２０Ｋ−グリシン−ドセタキセルの抗腫瘍活性
最大１００匹のマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｓ：ＣＤ−１ Ｆｏｘ ｎｌ ｎｕ）が、細胞摂取の少なくとも２日前に、皮下の１７β−エストラジオール（エストロゲン）ペレット（１．００ｍｇ／ペレット、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、米国フロリダ州サラソタ）を、頸部態様に外科的に移植された。これらのペレットは、移植後、９０日間で０．０１１ｍｇ／日の率でエストロゲンを放出する。手術後、０．１ｍＬのリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）／マトリゲル（登録商標）（１：１ｖ／ｖ）中のおよそ１ｘ１０^６ＭＣＦ−７細胞が、右脇腹に皮下的に注入された。腫瘍は、５０−１５０ｍｍ^３の範囲に到達するまで放置された。本研究における０日は、投与の初日に相当する。

動物は、治療初日の平均腫瘍重量が互いにできるだけ近くなるような形で、無作為にグループに分けられた。

治療：マウスは、試験化合物または媒体（生理食塩水）の１回または２回の静脈内投与を受けた。

腫瘍測定：初回の注射投与後に週２回、動物の体重および腫瘍が測定された。腫瘍量は、キャリパー測定（ｍｍ）により測定され、以下の楕円球体の式を使用した。ＬｘＷ^２／２＝ｍｍ^３、式中、ＬおよびＷは、各測定で収集されたより大きい方、およびより小さい方の垂直の寸法を指す。この式は、単位密度（１ｍｍ^３＝１ｍｇ）を想定して腫瘍重量を算出するためにも使用された。

研究期間：瀕死状態のいかなる動物、または腫瘍が１５００ｃｃに到達した、潰瘍がある、または剥がれ落ちた動物を研究終了前に安楽死させた。

結果：抗腫瘍効果は、１０、２０および３０ｍｇ／ｋｇの容量で乳房腫瘍（ＭＣＦ−７）に対して測定された。結果は、２つの高用量において、試験された両方の化合物で腫瘍成長の完全な抑制を示した。図３は、１０ｍｇ／ｋｇ容量（ｑ７ｄ×２）の抗腫瘍効果を示す。

前の説明に提示された教示の恩恵を有する、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明の多くの修正および他の実施形態を思いつくであろう。したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に制限されるものではなく、修正および他の実施形態は、付属の請求項の範囲内に含まれることを目的とすることを理解するものとする。本明細書において、特定の用語が使用されているが、一般的且つ記述的にのみ使用されており、制限する目的はない。
本発明の好ましい実施形態においては、例えば、以下が提供される。
（項１） ポリエチレングリコールポリマーを活性剤に共有結合させる方法であって、
アミノ、ヒドロキシルおよびカルボキシルから選択される第１の官能基を含む活性剤を提供するステップと、
前記活性剤を、カップリング試薬および４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート（ＤＰＴＳ）の存在下で前記第１の官能基と反応する第２の官能基を含むポリエチレングリコールと、前記第１と第２の官能基との間の反応を促進し、それによりポリエチレングリコール活性剤複合体を形成するために効果的な条件下で、反応させるステップと、
を含む、方法。
（項２） 前記カップリング試薬は、カルボジイミドである、上記項１に記載の方法。
（項３） 前記カップリング試薬は、シクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−メチルカルボジイミド（ＴＢＭＣ）、およびＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＴＢＥＣ）から成る群から選択される、上記項２に記載の方法。
（項４） 前記カップリング試薬は、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドである、上記項１に記載の方法。
（項５） 前記反応させるステップは、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフランから成る群から選択される有機溶剤内で実施される、上記項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項６） 前記反応させるステップは、０℃から１００℃の範囲の温度で実施される、上記項５に記載の方法。
（項７） 前記反応させるステップは、室温で実施される、上記項６に記載の方法。
（項８） 前記反応させるステップにおけるＤＰＴＳの量は、前記第１の官能基に対して約０．０５から０．７５当量の範囲である、上記項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項９） 前記反応させるステップにおけるＤＰＴＳの量は、前記第１の官能基に対して約０．１０から０．６０当量の範囲である、上記項８に記載の方法。
（項１０） 前記カップリング試薬の量は、前記第１の官能基に対して約１．２５から５当量の範囲である、上記項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項１１） 前記第２の官能基は、アミノ、ヒドロキシル、およびカルボキシルから成る群から選択される、上記項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項１２） 前記活性剤は、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、小分子、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および脂質から成る群から選択される、上記項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項１３） 前記活性剤は、タンパク質またはポリペプチドである、上記項１２に記載の方法。
（項１４） 前記活性剤は、小分子である、上記項１２に記載の方法。
（項１５） 前記活性剤は、ヒドロキシルまたはカルボキシルである第１の官能基を含む小分子である、上記項１４に記載の方法。
（項１６） 前記活性剤は、１つより多い前記第１の官能基を有する、上記項１５に記載の方法。
（項１７） 前記第１と第２の官能基との間の反応は、エステル連結の形成をもたらす、上記項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項１８） 前記小分子は、タキサンまたはカンプトセシンである、上記項１７に記載の方法。
（項１９） 前記小分子は、ドセタキセルまたはパクリタキセルである、上記項１８に記載の方法。
（項２０） 前記反応は、エステル連結を介し、ドセタキセル上の単一のヒドロキシル部位に共有結合したポリエチレングリコールを有するドセタキセル−ポリエチレングリコール複合体の形成をもたらす、上記項１９に記載の方法。
（項２１） 前記単一部位は、ドセタキセルの２’−ヒドロキシル基である、上記項２０に記載の方法。
（項２２） 前記ポリエチレングリコールは、直鎖、分枝、叉状、およびマルチアームポリエチレングリコールから成る群から選択される、上記項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項２３） 前記ポリエチレングリコールは、３から２５本のアームを備える、上記項２２に記載の方法。
（項２４） 前記ポリエチレングリコールは、３、４、５、６、７、８、９、および１０本から選択される数のアームを備える、上記項２３に記載の方法。
（項２５） 前記ポリエチレングリコールは、ポリオールまたはポリアミンコアを含む、上記項２４に記載の方法。
（項２６） 前記ポリエチレングリコールは、グリセロール、トリメチロールプロパン、ソルビトール、ヘキサグリセロール、およびペンタエリトリトールから選択されるポリオールコアを含む、上記項２５に記載の方法。
（項２７） 前記ポリエチレングリコールは、約１から約１０の前記第２の官能基を含む、上記項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項２８） 前記ポリエチレングリコールは、１、２、３、４、５および６から選択される数の前記第２の官能基を含む、上記項２７に記載の方法。
（項２９） 前記ポリエチレングリコールは、以下から選択される構造を備え、

および

式中、
ｎは、約５から約４００の範囲であり、
ｍは、０から５の範囲であり、
マルチアームポリマーの総分子量は、約１５００から約６０、０００ダルトンである、上記項２８に記載の方法。
（項３０） 前記活性剤は、１つより多い前記第１の官能基を備え、前記方法は、保護ステップを含まない、上記項２９に記載の方法。
（項３１） 前記活性剤は、ドセタキセルである、上記項３０に記載の方法。
（項３２） 前記ポリエチレングリコールは、

である、上記項３１に記載の方法。
（項３３） 前記反応させるステップは、その２’位のみで前記ポリエチレングリコールに共有結合したドセタキセルを有する複合体を形成する、上記項３２に記載の方法。
（項３４） 前記反応させるステップは、約２．１から３．７５の範囲の、ポリエチレングリコール当たりのドセタキセル分子の平均数を有する複合体を形成する、上記項３３に記載の方法。
（項３５） 前記反応させるステップは、約２．３から３．２の範囲の、ポリエチレングリコール当たりのドセタキセル分子の平均数を有する複合体を形成する、上記項３４に記載の方法。
（項３６） 前記反応させるステップは、約１５％未満のＮ−アシル尿素副生物の形成をもたらす、上記項１６に記載の方法。
（項３７） 前記反応させるステップは、約１０％未満のＮ−アシル尿素副生物の形成をもたらす、上記項３６に記載の方法。
（項３８） 前記反応させるステップは、約５％未満のＮ−アシル尿素副生物の形成をもたらす、上記項３７に記載の方法。
（項３９） 前記複合体の収率は、約７０％を上回る、上記項１から４のいずれか一項に記載の方法。

Claims (27)

1. ポリエチレングリコールポリマーをドセタキセルに共有結合させる方法であって、
   ドセタキセルを、カップリング試薬および４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホナート（ＤＰＴＳ）の存在下でドセタキセル内のヒドロキシル基と反応する官能基を含むポリエチレングリコールと、前記ドセタキセルとポリエチレングリコールとの間の反応を促進し、それにより、ドセタキセル内のヒドロキシル基に、エステル結合を介して、共有結合した単一のポリエチレングリコールを有するポリエチレングリコール−ドセタキセル複合体を形成するために、反応させるステップを含み、
   ここで、前記カップリング試薬は、カルボジイミドであり、そして
   ここで、前記官能基は、カルボキシルである、
   方法。
2. 前記カップリング試薬は、シクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−メチルカルボジイミド（ＴＢＭＣ）、およびＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＴＢＥＣ）から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記カップリング試薬は、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドである、請求項１に記載の方法。
4. 前記反応させるステップは、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、およびテトラヒドロフランから成る群から選択される有機溶剤内で実施される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記反応させるステップは、０℃から１００℃の範囲の温度で実施される、請求項４に記載の方法。
6. 前記反応させるステップは、室温で実施される、請求項５に記載の方法。
7. 前記反応させるステップにおけるＤＰＴＳの量は、前記ドセタキセル内のヒドロキシル基に対して０．０５から０．７５当量の範囲である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記反応させるステップにおけるＤＰＴＳの量は、前記ドセタキセル内のヒドロキシル基に対して０．１０から０．６０当量の範囲である、請求項７に記載の方法。
9. 前記カップリング試薬の量は、前記ドセタキセル内のヒドロキシル基に対して１．２５から５当量の範囲である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ドセタキセル内のヒドロキシル基は、ドセタキセルの２’−ヒドロキシル基である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ポリエチレングリコールは、直鎖、分枝、叉状、およびマルチアームポリエチレングリコールから成る群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ポリエチレングリコールは、３から２５本のアームを備える、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ポリエチレングリコールは、３、４、５、６、７、８、９、および１０本から選択される数のアームを備える、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ポリエチレングリコールは、ポリオールまたはポリアミンコアを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ポリエチレングリコールは、グリセロール、トリメチロールプロパン、ソルビトール、ヘキサグリセロール、およびペンタエリトリトールから選択されるポリオールコアを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ポリエチレングリコールは、１から１０の前記官能基を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ポリエチレングリコールは、１、２、３、４、５および６から選択される数の前記官能基を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ポリエチレングリコールは、以下から選択される構造を備え、
    

    

    
    および
    

    

    
    式中、
    ｎは、５から４００の範囲であり、
    ｍは、０から５の範囲であり、
    マルチアームポリマーの総分子量は、１５００から６０、０００ダルトンである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記方法は、保護ステップを含まない、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ポリエチレングリコールは、
    

    

    
    である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記反応させるステップは、その２’位のみで前記ポリエチレングリコールに共有結合したドセタキセルを有する複合体を形成する、請求項２０に記載の方法。
22. 前記反応させるステップは、２．１から３．７５の範囲の、ポリエチレングリコール当たりのドセタキセル分子の平均数を有する複合体を形成する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記反応させるステップは、２．３から３．２の範囲の、ポリエチレングリコール当たりのドセタキセル分子の平均数を有する複合体を形成する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記反応させるステップは、１５％未満のＮ−アシル尿素副生物の形成をもたらす、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記反応させるステップは、１０％未満のＮ−アシル尿素副生物の形成をもたらす、請求項２４に記載の方法。
26. 前記反応させるステップは、５％未満のＮ−アシル尿素副生物の形成をもたらす、請求項２５に記載の方法。
27. 前記複合体の収率は、７０％を上回る、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

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