CN101561441A

CN101561441A - 液体型纤维蛋白原(fib)检测试剂的制备方法

Info

Publication number: CN101561441A
Application number: CNA2008100914572A
Authority: CN
Inventors: 肖国伟
Original assignee: Shanghai Long Island Biotec Co Ltd
Current assignee: Shanghai Long Island Biotec Co Ltd
Priority date: 2008-04-15
Filing date: 2008-04-15
Publication date: 2009-10-21

Abstract

本发明涉及一种液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂的制备方法。该试剂主要用于监测凝血障碍、出血性疾病、弥漫性血管凝血(DIC)、糖尿病、酸中毒、动脉粥样硬化等病症。随着血栓与止血检测在临床上的广泛应用，纤维蛋白原(FIB)检测已成为出血和血栓检验的常规检测项目，具有重要的临床诊断意义。该方法采用牛凝血酶为主要原料，使用Von clauss法(NCCLS推荐)制备新型液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂。新颖的稳定系统解决了液体状态保持试剂稳定性的难题，具有敏感性高、使用方便、实验误差小、稳定性强、兼容性好、成本低等优点。

Description

液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂的制备方法

技术领域

本发明涉及临床诊断试剂，具体涉及一种液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂的制备方法，该方法还包括液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂的主要组成部分。

背景技术

纤维蛋白原(Fibrinogen，FIB)是肝脏合成的一种血浆球蛋白，是体内重要的凝血因子，其主要的生理功能是作为凝血因子I参与体内凝血过程。血浆中的纤维蛋白原在过量凝血酶的作用下，它会由可溶的蛋白转变为不可溶的聚合物，从而形成纤维蛋白凝块。血浆的凝血酶凝集时间和纤维蛋白原含量成反比，在凝血酶过量的情况下，测定血浆的凝集时间，通过纤维蛋白原标准曲线计算公式便可得到待测纤维蛋白原含量。

近年来，大量临床及流行病学研究发现血浆纤维蛋白原(Fib)水平的变化与凝血障碍、出血性疾病、弥漫性血管凝血(DIC)以及炎症反应等有密切关系。健康成人正常纤维蛋白原含量范围是200～400mg/dL，FIB含量增高主要见于糖尿病、酸中毒、动脉粥样硬化、急性传染病、急性肾炎尿毒症及轻度肝炎等病症，FIB含量降低主要见于DIC、原发性纤溶症、重度肝炎、肝硬化等病症。随着血栓与止血检测在临床上的广泛应用，纤维蛋白原(FIB)检测已成为出血和血栓检验的常规检测项目，具有重要的临床诊断意义。

目前测定纤维蛋白的方法众多，大体上分三大类，(1)可凝固蛋白质，又称功能法。(2)物理、化学测定法。(3)免疫学测定法。在正常情况下三者密切相关。实验证明在异常情况下，三者有明显的差异。功能法测定是建立在Fib经凝血酶作用后形成纤维蛋白凝块基础上的，最能直接反映Fib的凝血功能。物理化学法是根据蛋白质的理化特性建立的，这种方法特异性差，影响因素多。免疫学方法目前多采用抗Fib多克隆抗体与Fib起免疫反应，其所针对的抗原决定簇也存在于纤维蛋白质单体，纤维蛋白原降解产物(FDP)和异常Fib中，因而特异性比较差。

克劳斯法(Von clauss法)为功能法，是美国国家临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的方法，能直接反映纤维蛋白原的凝血功能。其测定原理是稀释血浆中纤维蛋白原在过量凝血酶作用下形成稳定纤维蛋白，以5％凝集为终点，测量稀释血浆的凝固时间而定量纤维蛋白原含量。该法操作简便、快速，结果与Jocdbsson法(WHO与NIBSC推荐的参考方法)相比相关性良好。

近年来，随着自动血凝分析仪的广泛使用，纤维蛋白原的测定趋于自动化和标准化。测定过程受多种因素的影响，其中试剂的质量是最关键因素，由于目前国内的纤维蛋白原检测试剂普遍存在产品质量不稳定、敏感性差的问题，致使检测结果不稳定，不同的临床检验实验室之间测得的结果难以比较，尽管采用WHO标准参照品，但仍难以把误差降低到可接受的水平，因此目前临床实验室所使用的试剂绝大部分为进口产品，价格昂贵。另一方面，由于液体制剂在使用的过程中不需复溶，不存在因所用水的质量或体积差异给测定结果造成的误差，有利于测定标准化的实现，因此成为凝血检测试剂的发展方向。

发明内容

(一)发明目的

本发明的目的是提供一种具有敏感性高、使用方便、实验误差小、稳定性强、兼容性好的液体FIB检测试剂的制备方法，最终目的是将应用该方法制成的检测试剂在临床检验上广泛应用，使FIB检验实现标准化。

(二)发明的优势

本发明采用牛凝血酶为主要原料，使用Von clauss法(NCCLS推荐)制备新型液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂。液体试剂具有使用方便的优点，不需复溶，避免各实验室使用蒸馏水不同、复溶体积不准确而造成的测定偏差；试剂稳定性强，开瓶后37℃能稳定30天以上；同时，该试剂兼容性强，可满足使用不同型号血凝仪的检测需要。

(三)发明内容详述

本发明的特征在于由牛凝血酶、纤维蛋白原标准品、缓冲液和稳定剂制备而成。液体FIB检测试剂中各试剂的终浓度依次为：牛凝血酶(≥100U/mL)，纤维蛋白原标准品(3000mg/dL)，20mM pH7.5Tris-HCI，0.5％聚乙二醇，0.25％牛血清白蛋白，3％甘油，0.1％羟基丁酸盐甲苯，0.1％叠氮钠，20mM pH7.5巴比妥钠，150mM氯化钠、0.1％明胶。

具体实施方式

实施例一：液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂的制备

液体纤维蛋白原FIB检测试剂由牛凝血酶试剂、产品稳定剂和FIB缓冲液所组成，其制备方法如下：

1.产品稳定剂的制备

依次称取5g聚乙二醇、2.5g牛血清白蛋白、1g羟基丁酸盐甲苯、1g叠氮钠，溶解于20mM pH7.5Tris-HCI缓冲液中，加入30mL甘油，混合均匀至外观为无色透明液体，定容至1L，4℃贮藏备用。

2.牛凝血酶试剂的制备

将牛凝血酶冻干粉(500U/mL，1mL/瓶)用产品稳定剂按比例稀释为终浓度≥100U/mL，4℃贮藏备用。

3.FIB缓冲液的制备

称取4.97g巴比妥钠、8.77g氯化钠加入蒸馏水适量使之溶解。另取1g明胶加入适量蒸馏水，加热溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.5，再用蒸馏水定容至1L，即得FIB缓冲液。

制备液体FIB检测试剂主要技术指标如下：

1.外观：凝血酶试剂(液体)应为无色液体，透明无异物；纤维蛋白原标准品应为白色或浅黄色疏松固体，无融化；缓冲液为无色液体，透明无异物。

2.试剂重复性：同一瓶试剂重复测定同一血浆样品，所测结果变异系数小于10％。

3.试剂批间差：不同瓶试剂测定同一血浆样品，所测结果变异系数小于10％。

4.试剂稳定性：在2℃～8℃存放不少于18个月。

实施例二：应用液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂的检测方法

1.纤维蛋白原标准曲线的绘制

将纤维蛋白原标准品(3000mg/dL)用FIB缓冲液依次按照比例1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30稀释成终浓度分别为600mg/dL、300mg/dL、200mg/dL、150mg/dL、100mg/dL，取此不同浓度的标准血浆各200uL，37℃预温3分钟，然后分别加入凝血酶试剂100uL(不需预温)，以CA530血凝仪(日本Sysmex公司产品)测定凝固时间。以不同浓度的纤维蛋白原标准品含量(mg/dL)为横坐标，以相应的凝固时间为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数R²≥0.99。

2.检测方法

将待测血浆用缓冲液作1∶10稀释，取待测血浆200uL，37℃预温3分钟，然后分别加入凝血酶试剂100uL(不需预温)，以CA530血凝仪(日本Sysmex公司产品)测定凝固时间，从标准曲线求得待测血浆的纤维蛋白原浓度。检测正常值范围是200-400mg/dL。

实施例三：液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂的稳定性检测

本发明试剂的稳定性检测包括开封后2-8℃稳定性、不开封2-8℃稳定性、未开封37℃加速破坏试验、长时稳定性试验。

开封后置于2-8℃贮藏条件下，30天之内正常质控血浆L-1测值在正常值范围内，且变化不大，实验数据如表1所示。

表1 2-8℃贮藏条件下本发明试剂的稳定性检测结果

在2-8℃条件下将该试剂贮存12个月，每隔一个月对该试剂做稳定性检测，检测仪器为CA530血凝仪，用与仪器配套的市售的APTT试剂做对照，所用血浆为太平洋公司的正常质控血浆L-1，检测结果如表2所示。

表2 本发明液体FIB与市售FIB试剂在2-8℃稳定性比较

37℃加速破坏条件下，正常质控血浆测值在1个月保持基本稳定，处于正常值范围，检测结果如表3所示。

表3 37℃加速破坏实验本发明FIB检测试剂稳定性检测

综上对以上各技术指标的考察结果证明，本发明方法生产的试剂操作简单、使用方便、敏感性好，稳定性强，与国外FIB检测试剂具有可比性，适合临床应用，可作为新一代标准化FIB试剂替代进口试剂。

Claims

1.一种液体型纤维蛋白原(FIB)检测试剂的制备方法，其特征在于它是牛凝血酶、纤维蛋白原标准品、缓冲液和稳定剂组成。

2.按权利要求1所述方法，其特征在于牛凝血酶的活力单位≥100U/mL。

3.按权利要求1所述方法，其特征在于纤维蛋白原标准品的终浓度2000～3000mg/dL。

4.按权利要求1所述方法，其特征在于缓冲液系由巴比妥钠、氯化钠和明胶组成。其中，巴比妥钠浓度为20～40mM，氯化钠60～200mM，明胶浓度0.05～0.2％，缓冲液pH7.4～pH8.0。

5.按权利要求4所述方法，其特征在于巴比妥钠缓冲液的最适浓度为20mM，最适pH为7.5，氯化钠最适浓度为150mM，明胶最适浓度0.1％。

6.按权利要求1所述方法，其特征在于稳定剂由下述原料制成：20～30mM pH7.5～8.0Tris-HCI，聚乙二醇0.4～1.0％，甘油2～5％，羟基丁酸盐甲苯0.05～1.5％，叠氮钠0.1～0.5％。

7.按权利要求6所述方法，其特征在于稳定剂以20mM pH7.5 Tris-HCI缓冲液配制。

8.按权利要求6所述方法，其特征在于稳定剂中聚乙二醇的最适添加量是0.5％、甘油最适添加量为3％、羟基丁酸盐甲苯最适添加量是0.1％、叠氮钠最适添加量0.1％。