CN101554384A - 一种雄黄注射液的制备方法及其用途 - Google Patents

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张爽
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本发明为一种雄黄注射液的制备方法及其用途，主要涉及一种经过微生物处理的雄黄为原料，添加硫代硫酸钠，酒石酸，注射用水等辅料后制成的一种新型抗肿瘤注射液，无论是在体外还是在体内，该注射液均显示对包括肝癌，胃癌，肺癌，白血病等在内的多种癌症有明显的治疗效果，同时可降低治疗毒性。

Description

一种雄黄注射液的制备方法及其用途
技术领域：
本发明为一种雄黄注射液的制备方法及其用途。具体的讲是以传统中药雄黄经过微生物处理而得到的雄黄溶解液为主要原料，添加辅料后制成的一种新型抗肿瘤雄黄注射液。该发明涉及它的制备方法及其用途，属于抗肿瘤药物领域。
背景技术：
肿瘤是恶化非常迅速的一种疾病，在很大程度上威胁着人类的身体健康，且其发病率呈逐渐上升趋势。由于其发病机理尚未清楚，国内外比较一致的观点是：肿瘤是正常细胞长期在外因和内因作用下发生基因调控的质变，导致过度增殖的后果。
近年来雄黄在临床上已成功用于急性与慢性粒细胞白血病的治疗以及其它肿瘤细胞的治疗，因此越来越受到国内外学者的广泛关注，成为矿物中药研究的一个热点。
矿物药雄黄是中华民族的瑰宝，但是由于其水不溶性，导致口服用药量大，生物利用度低，毒性高等问题，严重制约了矿物中药雄黄的发展。
目前最先进的做法是将雄黄制备成为超微颗粒和纳米级粉体，这在一定程度上使雄黄的吸收、生物利用度等方面得到了不同程度的提高，增强了药效。但是这类处理仍然只能以混悬液入药，尚存在服用困难和口服后易引起病人胃肠道刺激等问题，毒性大的问题仍然存在，加之生产纳米雄黄需要大型设备和先进的技术，普及使用尚有困难。
目前，一项高新生物技术微生物冶金技术异军突起。在一定的空气、pH、温度条件下，一些特殊的细菌(氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌等)可将不溶性的硫化矿转变为可溶性的矿石溶解液，然后对所需元素进行回收。该技术低成本、无污染，在冶金业已得到广泛应用。雄黄也是一种硫化矿，可被浸矿微生物溶解。
本发明为一种雄黄注射液的制备方法及其用途。具体的讲是以传统中药雄黄经过上述微生物处理而得到的雄黄溶解液为主要原料，添加辅料后制成的一种新型抗肿瘤雄黄注射液，与传统雄黄制剂相比，其易于吸收，生物利用度高，毒性低，对多种癌症具有良好疗效。
发明内容：
按照中国发明专利申请2006102000676中公开的矿物药细菌处理方法制备雄黄溶解液，实施方案如下：称取过200目筛的雄黄粉末0.5g于灭菌后的250ml锥形瓶中，加入灭菌后的9k无铁液体培养基90ml，用硫酸调pH至1.75，待pH稳定后，接种体积分数为20％氧化亚铁硫杆菌和终浓度为1.0g/L Fe2+。在30℃、135r/min条件下震荡培养。实验过程中采用1∶1(体积比)的硫酸调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的水分。摇瓶浸出30天后停止，减压抽滤收集上清液，调节浸出液pH至7左右，过0.22微米滤膜除菌后即得雄黄微生物溶解液。
取雄黄微生物溶解液5ml，添加硫代硫酸钠0.05g，酒石酸0.02g，注射用水5ml，调节pH至6.0，过0.22微米滤膜除菌后即得雄黄注射液。
本发明雄黄注射液对包括肝癌，胃癌，肺癌，白血病等在内的多种癌细胞有明显的抑制作用，可用于治疗多种类型的癌症。
具体实施方式：
实施例1：雄黄注射液的制备
按照中国发明专利申请2006102000676中公开的矿物药细菌处理方法处理雄黄，实施方案如下：称取过200目筛的雄黄粉末0.5g于灭菌后的250ml锥形瓶中，加入灭菌后的9k无铁液体培养基90ml，用硫酸调pH至1.75，待pH稳定后，接种体积分数为20％的氧化亚铁硫杆菌和终浓度为1.0g/L Fe2+。在30℃、135r/min条件下震荡培养。实验过程中采用1∶1(体积比)的硫酸调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的水分。摇瓶浸出30天后停止，减压抽滤收集上清液，调节浸出液pH至7左右，过0.22微米滤膜除菌后即得雄黄微生物溶解液。
取雄黄微生物溶解液5ml，添加硫代硫酸钠0.05g，酒石酸0.02g，注射用水5ml，调节pH至6.0，过0.22微米滤膜除菌后即得雄黄注射液。雄黄注射液中砷含量为最重要的质量标准，在实施例2和实施例3中，亚砷酸氯化钠注射液浓度和雄黄注射液浓度皆为砷含量，砷含量采用毛细管电泳间接紫外检测方法进行测定。
实施例2：雄黄注射液的抗肿瘤效果
细胞培养：用RPM1640培养基，加10％牛血清、青霉素100U/ml，置37℃、5％CO2条件下培养肝癌细胞株HepG-2、胃癌细胞株MGC-803、肺癌细胞株Lewiw和白血病细胞株K562。每2～3天换一次培养液。
MTT试验：将细胞以约1×105个/毫升的细胞密度接种于96孔板上，每孔100微升，培养过夜。分别于24小时、48小时、72小时按预设的浓度梯度加入雄黄注射液，每一梯度至少3个重复。继续培养24小时后，每孔加入5mg/ml的MTT20微升，继续置于37℃温育4小时，快速翻板法弃去上清液，每孔加入100微升DMSO或三联液，在酶标仪上检测，根据测得OD值计算半数抑制浓度IC50，具体数据如表1。
表1.雄黄注射液对细胞的生长抑制作用
Figure A20091030234100051
由表1可知，雄黄注射液在24h时对肝癌细胞株HepG-2抑制作用弱于市售的亚砷酸氯化钠注射液，对胃癌细胞株MGC-803、白血病细胞株K562的抑制作用弱于市售的亚砷酸氯化钠注射液，但对肺癌细胞株Lewis抑制作用于市售的亚砷酸氯化钠注射液几乎持平；48h及72h后对肝癌细胞株HepG-2、肺癌细胞株Lewis、胃癌细胞株MGC-803、白血病细胞株K562的抑制作用优于市售的亚砷酸氯化钠注射液。由此可知两种药物在肿瘤细胞的不同生长时期对其抑制强度不同，市售亚砷酸氯化钠注射液对细胞增殖初期的抑制作用强于雄黄注射液，而雄黄注射液对细胞增殖中后期的抑制作用强于亚砷酸氯化钠注射液。
实施例3：雄黄注射液的急性毒性
根据预试验，取禁食不禁水12h的小鼠180只，雌雄各半，体重20±2g，平均分成6组给药试验，腹腔注射给药法测定受试药对小鼠产生的急性毒性，砷的最大浓度为824.5ug/mL，给药后立即观察各组动物反应情况，连续观察2周，记录小鼠中毒情况，按照改良寇氏综合计算法的要求，根据公式计算：LD50＝lg-1[1gDm-1gr(∑P-0.5)]，由表2数据计算可得雄黄注射液的LD50＝5.45mg/kg；由表3数据计算可得亚砷酸氯化钠注射液的LD50＝3.08mg/kg
表2雄黄注射液的急性毒性
Figure A20091030234100052
Figure A20091030234100061
表3亚砷酸氯化钠注射液的急性毒性
  组别   鼠数(只)   剂量(ug/mL)   死亡数(只)   死亡率(％)
  1   10   640   10   100
  2   10   512   10   80
  3   10   409.6   6   60
  4   10   327.7   3   30
  5   10   261.9   1   10
  6   10   209.5   1   10
表2、表3的实验表明：雄黄注射液能在增强药效的同时，减小毒性，即本发明砷雄黄注射液达到了减毒增效的目的。
实验例4：雄黄注射液对S180实体瘤小鼠瘤体的抑制作用
选取昆明种小鼠40只，右腋皮下接种S180肉瘤细胞后，随机分成4组，即生理盐水组(阴性对照)，溶媒组，亚砷酸氯化钠注射液(0.003mg/g，阳性对照)，雄黄注射液组(0.003mg/g，实验组)。接种第二天后开始腹腔注射给药，各组每天给药1次，连续给药10天。于最后一次给药后次日处死小鼠，剥离瘤块，称重，计算抑瘤率。
表4.雄黄注射液对S180实体瘤小鼠瘤体的抑制作用
  组别   剂量(mg/g)   动物数(只)  瘤重(g)   抑瘤率(％)
  阴性对照组   --   10   0.3294   --
  溶媒组   0.003   10   0.3156   4.19
  阳性对照组   0.003   10   0.2222   32.54
  雄黄注射液   0.003   10   0.2182   33.76
由表4可知，与阴性对照组比较，雄黄注射液对小鼠S180肉瘤有明显抑制效果，其抑制效果与阳性对照相比不相上下，甚至更强。
实验例5：雄黄注射液对小鼠肝癌细胞H22瘤体的抑制作用
选取昆明种小鼠40只，右腋皮下接种H22细胞后，随机分成4组，即生理盐水组(阴性对照)，溶媒组，亚砷酸氯化钠注射液(0.003mg/g，阳性对照)，雄黄注射液组(0.003mg/g，实验组)。接种第二天后开始腹腔注射给药，各组每天给药1次，连续给药10天。于最后一次给药后次日处死小鼠，剥离瘤块，称重，计算抑瘤率。
表5.雄黄注射液对小鼠肝癌细胞H22瘤体的抑制作用
  组别   剂量(mg/g)   动物数(只)  瘤重(g)   抑瘤率(％)
  阴性对照组   --   10   2.9801   0
  溶媒组   0.003   10   2.9407   1.32
  阳性对照组   0.003   10   1.7323   41.87
  雄黄注射液   0.003   10   1.6315   44.52
由表5可知，与阴性对照组比较，雄黄注射液对小鼠肝癌细胞H22有明显的抑制效果，其抑制效果与阳性对照相比不相上下，甚至更强。

Claims (3)

1.本发明为一种雄黄注射液的制备方法及其用途，其特征在于该注射液是一种经过微生物处理的雄黄为原料，添加辅料后制成的一种新型抗肿瘤注射液，可用于肝癌，胃癌，肺癌，白血病等在内的多种癌症的治疗，同时可降低治疗毒性。
2.根据权利要求1所述的雄黄注射液，其特征在于该注射液以微生物处理处理雄黄后所得的溶解液为基本原料，雄黄微生物溶解液的具体制备方法按照中国发明专利申请2006102000675公开的方法进行。
3.根据权利要求1所述的雄黄注射液，其特征在于该注射液可用于肝癌，胃癌，肺癌，白血病等在内的多种癌症的治疗，同时可降低治疗毒性。
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