CN102018723A

CN102018723A - 一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法及其应用

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Publication number: CN102018723A
Application number: CN2010105801934A
Authority: CN
Inventors: 张景红; 杨礼
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: CN102018723B

Abstract

本发明公开一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，包括如下步骤：1)制备提取用砷化矿细粉；2)海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉后得到含砷提取液，及此种含砷化合物提取液在抗肿瘤药物中应用。本发明所制备的含砷化合物提取液其抑制肿瘤药物活性成分明确，与同类、一线的抗癌化合物亚砷酸相比具有药效增强、毒性降低的特点。

Description

一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法及其应用。

背景技术

自从我国研制的纯品三氧化二砷注射液问世以来，由于其良好的抗肿瘤效果，在给患者带来福音，延长寿命的同时也带来了良好的社会效益。然而目前使用的三氧化二砷注射液一般采用高纯度的化学药品而制，尚存在价格昂贵，临床使用肝肾毒性加大，难以普及等缺陷。为此，寻找更多的天然含砷药物，开发更多天然、低毒和高效含砷化和物，作为现有一线抗癌砷剂三氧化二砷的补充或替代品，将是现代创新中药的迫切要求。近年的研究发现，一度因为毒性较大而不被重用的As₂O₃，被发现不是P-糖蛋白作用底物，不会被P-糖蛋白泵出细胞外，在肿瘤产生MDR（多药耐药）时，可用低毒剂量As₂O₃ 进行有效的治疗，As₂O₃高效地逆转了多种耐药肿瘤细胞（白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌等）的耐药，并在肿瘤耐药机理研究中取得突的进展，为此引发各国学者的广泛兴趣。而在砷剂的减毒、增效研究方面，本发明人课题组的研究发现，海洋微生物代谢并溶解的各种形态砷及其组合物，其在动物组织中砷蓄积毒性大幅度降低，在动物体内几乎没有分布。与此同时，体内外药理活性试验表明，海洋微生物多形态代砷化合物，不仅可以诱导多药耐药白血病细胞凋亡，而且可以下调MDR1/P-gp耐药基因，达到其逆转多药耐药的作用。而且更重要的是，其诱导效应强于同类砷剂亚砷酸。所以，亚砷酸（As₂O₃在水中溶解的主要形式）并非是逆转肿瘤多药耐药作用的唯一活性物质，从天然矿物资源中开发多种形态的代谢砷作为As₂O₃的重要补充，将是极有应用前景的药物开发方向。

在我国天然矿物砷资源非常丰富，主要以硫化矿形式存在。最重要的矿物包括：砷黄铁矿（FeAsS）、毒砂（FeAsS）、斜方砷铁矿（Fe₂AS₃）、砷镍矿（NiAS₂)、红砷镍矿（NiAS）、砷钴矿（CoAsS₂）、砷黑幻铜矿（Cu4As₁₂S₁₃）、硫砷铜矿（Cu₃AsS₄）、砷铂矿（PtAs₂）、铁硫砷钴矿[C（OFe）AsS]、雄黄矿（As₂O₃、鸡冠石）、雌黄矿（As₂S₃）等。而在这些矿物药物中、雄黄矿（As₂S₃）、雌黄（As₂S₃）和雄黄矿（As₂O₃、鸡冠石）已经作为中国药典法定的药物在治疗肿瘤、寄生虫、杀虫等方面取得显著的疗效。但是，与其药理、药效的研究力度相比，其提取工艺的研究相对滞后，虽然采用传统和现代工艺包括水飞、水飞+醋制、精制、纳米化、微粉化，在一定程度上提高了吸收和生物利用度，但是由于无法得到大量和减毒、多形态的活性砷化合物，其毒性仍然较大。而在另一方面：本发明课题组公开中国发明2006102000675专利中，采用多种冶金用嗜酸性硫杆菌提取雄黄、自然铜、朱砂等矿物药物，单方面解决这些矿物的溶解问题，提高了药物的生物利用度，但是使用这些技术增加雄黄溶解度的同时，加入了大量的辅助元素（铁和铁的化和物），由于这些外加元素的影响，往往使我们难于从这一复杂的体系中用简单的方法同时提取大量的砷酸（V）、亚砷酸（V）和或二甲基砷酸（Ｖ）等含砷化和物，加之大量可溶性砷的溶出，在提高药效的同时，雄黄的急性毒性急剧增大。尚未从更本上解决雄黄毒性的问题，加之研究的砷矿物种类较少，实际应用仍有许多问题。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法及其应用。本发明所制备的含砷化合物提取液其抑制肿瘤药物活性成分明确，与同类、一线的抗癌化合物亚砷酸相比具有药效增强、毒性降低的特点。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，包括如下步骤：1)制备提取用砷化矿细粉；2) 海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉。

所述的制备提取用砷化矿细粉的步骤为：将砷化矿粉粹至200目后，加入1mol/L的硫酸和三氯化铁的混合液中，然后在转速为180 r/min、温度为30℃的恒温摇床中培养15 d，得到提取液；将提取液用孔径为0.45 μm 的滤膜过滤，得到滤液；所述滤液在温度为20℃、磁力搅拌转速为800～1000 r/min 的条件下进行反应沉淀，2 min 后过滤，得到沉淀物；然后沉淀物用去离子水洗涤后，在60℃温度下干燥，即得砷化矿超微粉体细粉。

所述的砷化矿采用砷黄铁矿（FeAsS）、毒砂（FeAsS）、斜方砷铁矿（Fe₂A_S3）、砷镍矿（NiAS₂)、红砷镍矿（NiAS）、砷钴矿（CoAsS₂）、砷黑幻铜矿（Cu4As12S13）、硫砷铜矿（Cu₃AsS₄）、砷铂矿（PtAs₂）、铁硫砷钴矿[C（OFe）AsS]、雄黄矿（As₂O₃、鸡冠石）、雌黄矿（As₂S₃）中的一种或多种天然矿物。（以上砷化矿都为市售原料）

所述的海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉的步骤为：称取0.1g 200目砷化矿超微粉体细粉，于灭菌后的250mL 锥形瓶中，加入LA液体培养基90mL ，调节pH为5.0，待稳定后，接种体积分数为20％的海洋微生物菌种，无菌对照中不加菌种；然后在30℃ 、振荡速度为18Or / min 时摇瓶浸出15d；过程中定期检测调节pH 值，用蒸馏水补充所蒸发的水分，定时进行处理液中砷酸（V）、亚砷酸（V）和或甲基砷酸（V）和或二甲基砷酸（DMA）和或三甲基胂氧（TMAO）和或砷硼烷（AsB）和或砷胆碱（AsC）的含量检测，当上述多种成分的总含量低于0.1％后，停止震荡培养，过滤除菌后取上清液，该上清液就是含砷化合物或含有该提取物的组合物，可直接做为药品或者用于制备药品的原料。

所述的LA液体培养基为酵母膏5g ，蛋白胨10g ，氯化钠10g ，琼脂1 g，脱脂奶粉1g。

所述的海洋微生物菌种采用：海水产碱菌（英文名：Alcaligenes aquamarinus），粪产碱杆菌(英文名：Alcaligenes faecalis)，氧化醋酸杆菌（英文名：Acetobacter oxydans），生黑醋杆菌（英文名：Acetobacter melanogenum），产酸克雷伯氏菌（英文名： Klebsiella oxytoca），嗜酸乳杆菌(英文名：Lactobacillus. acidophilus)，乳酸乳杆菌(英文名：Lactobacillus. Lactis)，短小芽孢杆菌（英文名： Bacillus pumilus），球形芽孢杆菌（英文名：Bacillus sphaericus），棒杆菌(英文名：Corynebacterium)，北京棒杆菌(英文名：Corynebacterium pekinense)，钝齿棒杆菌(英文名：Corynebacterium crenatum)，谷氨酸棒杆菌(英文名：Corynebacterium glutamicum)、乳糖发酵短杆菌(英文名：Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(英文名：Brevibacterium flavum)中的一种或多种；且各菌种组合中菌种量的组合比例为等比或非等比。当处理液中采用不同的多种菌种组合以及多种菌种不同组合比例时，可以克服由于砷矿物存在来源、产地和组成的差异造成处理条件及效果的不同。（以上菌种都为市售菌种）

所述的海洋微菌种优选采用海水产碱菌，钝齿棒杆菌和黄色短杆菌三种，且菌种量的组合比例为等比。

所述的摇瓶提取方式也可采用槽浸、柱浸、罐浸、生物反应器、发酵罐处理以及微生物固定化处理方式替换，特别是当进行放大生产时通过上述方法进行砷化矿的生物提取处理。

一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采用上述方法制备所得的含砷提取液单独或与其它药物原料配伍或加入药学上可以接受的辅料后能分别制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤，杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸（V）、亚砷酸（V）、甲基砷酸（V）、二甲基砷酸（DMA）、三甲基胂氧（TMAO）、砷硼烷（AsB，arsenobetaine）、砷胆碱（AsC，arsenocholine）提取物中的一种或者多种；且上述提取物的含量之和占药物总量的0.1%—100%。

本发明的有益效果为：（1）本发明的目的是利用特殊海洋微生物，海水产碱菌、粪产碱杆菌、钝齿棒杆菌和氧化醋酸杆菌对天然药物含砷矿物进行微生物提取。在此过程中，含砷矿物中所含的砷可以被海洋微生物氧化、溶解和甲基化代谢，从而促进有效成分得以充分释放。形成多价态的含砷化合物例如：砷酸（Ⅲ）和亚砷酸（V）。另一方面，利用特殊海洋微生物氧化砷（Ⅲ）形成砷（V）的能力，产生毒性较低砷酸（V）和或甲基砷酸（V）和或二甲基砷酸（DMA）和或三甲基胂氧（TMAO）和或砷硼烷（AsB）和或砷胆碱（AsC）等多种天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物。据此，就可以达到产生多种毒性比三氧化二砷更小、抑制肿瘤作用更强的新的有药用价值成分的目的。（2）本发明操作过程简单，提取物，经过简单分离就可以使用，不需要繁杂的提取分离措施做进一步处理。本发明利用特殊海洋物代谢，产生毒性较低砷酸（V）、亚砷酸（V）和或甲基砷酸（V）和或二甲基砷酸（DMA）和或三甲基胂氧（TMAO）和或砷硼烷（AsB）和或砷胆碱（AsC）等天然含砷化合物，以上活性剂的剂量将因配方而异。一般的剂量为每单位制剂中含砷酸（Ｖ）、亚砷酸（V）和或甲基砷酸（V）和或二甲基砷酸（DMA）和或三甲基胂氧（TMAO）和或砷硼烷砷硼烷（AsB，arsenobetaine）和或砷胆碱（AsC）和或砷胆碱（AsC）的提取物之和为药物总量的0.1 ％一100 ％，也可根据不同的剂型选择不同的剂量。（3）本发明涉及的海洋微生物种类多，培养条件简单，不需要极端的嗜酸、嗜碱或者强酸性等极端培养条件。不仅单一的微生物可以产生多种天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物，而且更重要的是，如表1所示：二种或三种微生物组合或更多微生物组合，在同一工艺条件下，可以产生含量更高、或者形态更丰富的天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物。

具体实施方式

实施例1

本实施例的一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，包括如下步骤：1)制备提取用砷化矿细粉；2) 海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉。所述的砷化矿采用砷黄铁矿（FeAsS）、毒砂（FeAsS）、斜方砷铁矿（Fe₂A_S3）、砷镍矿（NiAS₂)、红砷镍矿（NiAS）、砷钴矿（CoAsS₂）、砷黑幻铜矿（Cu4As12S13）、硫砷铜矿（Cu₃AsS₄）、砷铂矿（PtAs₂）、铁硫砷钴矿[C（OFe）AsS]、雄黄矿（As₂O₃、鸡冠石）、雌黄矿（As₂S₃）中的一种或多种天然矿物。当然以上的12种含砷矿物是比较常见的，但是本发明并不局限于这12种，其他的含砷矿物也同样适用。所述的制备提取用砷化矿细粉的步骤为：将砷化矿粉粹至200目后，加入1mol/L的硫酸和三氯化铁的混合液中，然后在转速为180 r/min、温度为30℃的恒温摇床中培养15 d，得到提取液；将提取液用孔径为0.45 μm 的滤膜过滤，得到滤液；所述滤液在温度为20℃、磁力搅拌转速为800～1000 r/min 的条件下进行反应沉淀，2 min 后过滤，得到沉淀物；然后沉淀物用去离子水洗涤后，在60℃温度下干燥，即得砷化矿超微粉体细粉。

所述的海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉的步骤为：称取0.1g 200目砷化矿超微粉体细粉，于灭菌后的250mL 锥形瓶中，加入LA液体培养基90mL（培养基：酵母膏5g ，蛋白胨10g ，氯化钠10g ，琼脂1 g，脱脂奶粉1g），调节pH为5.0，待稳定后，接种体积分数为20％的海洋微生物菌种，无菌对照中不加菌种；然后在30℃ 、振荡速度为18Or / min 时摇瓶浸出15d；（摇瓶提取方式也可采用槽浸、柱浸、罐浸、生物反应器、发酵罐处理以及微生物固定化处理方式替换，特别是当进行放大生产时通过上述方法进行砷化矿的生物提取处理）。过程中定期检测调节pH 值，用蒸馏水补充所蒸发的水分，定时进行处理液中砷酸（V）、亚砷酸（V）和或甲基砷酸（V）和或二甲基砷酸（DMA）和或三甲基胂氧（TMAO）和或砷硼烷（AsB）和或砷胆碱（AsC）的含量检测，当上述多种成分的总含量低于0.1％后，停止震荡培养，过滤除菌后取上清液，该上清液就是含砷化合物或含有该提取物的组合物，可直接做为药品或者用于制备药品的原料。

如表1所示，本实施例采用不同菌种及其不同的配比组合提取含砷化合物提取液后，其中砷酸（V）、一甲基砷酸（V）、二甲基砷酸（V）的含量分析结果：（采用毛细管电泳分离法进行检测：条件为：BGE：PDC/10 mmol.L^-1和CTAOH/1 mmol.L^-1、电压25 KV、温度25℃、pH 11.0、紫外检测波长设定在216 nm。）

其中A:海水产碱菌；B粪产碱杆菌；C：氧化醋酸杆菌；D：生黑醋杆菌；E：产酸克雷伯氏菌，F：嗜酸乳杆菌；G：乳酸乳杆菌；H：短小芽孢杆菌；I：球形芽孢杆菌；J：棒杆菌；K：北京棒杆菌；L：钝齿棒杆菌；M：谷氨酸棒杆菌；N：乳糖发酵短杆菌；O：黄色短杆菌,X为15种菌的等比例混合物。

表1表明，本发明处理液中的菌种可以优选海水产碱菌，钝齿棒杆菌和黄色短杆菌的组合，或者再在其内加入菌种粪产碱杆菌，或者为氧化醋酸杆菌，或者为生黑醋杆菌，或者产酸克雷伯氏菌，或者嗜酸乳杆菌，或者乳酸乳杆菌，或者短小芽孢杆菌，或者球形芽孢杆菌，或者棒杆菌，或者北京棒杆菌，或者谷氨酸棒杆菌、或者乳糖发酵短杆菌之中中任选的细菌复合组成，各菌种相对量可以为等比例关系，也可以是非等比关系。本发明处理液中也可以接种上述各细菌中的任意单一菌种，但这类处理液处理的效果相对要低于用不同菌种组合的处理液。对于由于来源、产地和组成等原因造成一定差异砷化矿药物，其处理液中的菌种还可在上述等比例关系的基础上适当改变菌种组合比例。

实施例2

本发明制备的含砷化合物提取液的动物急性毒性试验测定试验：本实施例选用实施例1中优选的海水产碱菌，钝齿棒杆菌和黄色短杆菌等比组合制备的含砷化合物提取液。

小鼠20只，雌雄各半，一次性ig本发明提取液0.2ml/10g（砷酸V，289.3mg/mL；一甲基砷酸V，168.3mg/mL，二甲基砷酸V，69.7mg/ mL），然后观察小鼠活动情况及有无死亡，持续7天，发现与As₂S₃常规粗粉相比，小鼠死亡数降低，从表3结果可以看出，（表 3为本发明制备的提取液和亚砷酸小鼠口服后砷在体内分布变化情况）As₂S₃提取液的LD₅₀值明显大于亚砷酸钠注射液（见表2，表2为本发明制备的提取液和亚砷酸小鼠口服LD₅₀变化情况表），由此说明其毒性小于亚砷酸钠注射液。采用海洋微生物（A:L:O=1:1:1；海水产碱菌：钝齿棒杆：菌黄色短杆菌）提取，其中砷在各个组织分布极少，几乎没有蓄积，与其他给药组相比，具有显著差异（P＜0.05或P＜0.01) 。以上试验说明，利用本发明工艺提取As₂S₃可以得到三种比亚砷酸毒性低的砷形态化合物。

表3中﹡P＜0.05，或﹡﹡P＜0.01表示海洋组或亚砷酸与原粉组比较差异显著；#P＜0.05，或##P＜0.01表示海洋组与亚砷酸组比较差异显著。

实施例3

本实施例为抑制肿瘤活性测定试验：收集处于对数生长期的骨髓瘤细胞系U266，在50ml 细胞培养瓶中将细胞密度调整为1 ×10⁶细胞/ 瓶。加入适量本发明提取液或亚砷酸钠注射液，浓度调整二者终浓度均为2.5umol／L。培养24h后，收集细胞，用冷磷酸缓冲液( PBS，每升含NaCl 8.0 g、KCl 0.20 g 、Na₂HPO₄ 1.15 g 、KH₂PO₄ 0.20 g 、pH 7.4) 洗2 次，加入FITC-Annexin V和PI，轻轻混匀，于4 ℃避光放置30 min后，加入结合液(BindingBuffer)，在1 h内用流式细胞仪检测其早期凋亡率和晚期凋亡率。结果见表4，表4为本发明制备的提取液和亚砷酸钠注射液诱导骨髓瘤细胞U266凋亡的凋亡率比较。

从表4可见，本发明提取液与亚砷酸钠注射液相比，诱导骨髓瘤细胞U266凋亡的总凋亡率高于亚砷酸（81.12→65.78），而且其早期凋亡率明显大于（48.96→12.45）亚砷酸组，说明其抗癌活性明显好于亚砷酸钠注射液。据此说明，本发明其抑制肿瘤的效果，与一线的抗癌化和物亚砷酸相比，本发明提取液抑制肿瘤凋亡作用更为显著，达到了毒性更低、药效更强的药物效应。由此可见，海洋微生物提取天然砷矿物达到了产生毒性比亚砷酸更小、药效更强的新的有药用价值成分的目的。

实施例4

一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采用实施例1的方法制备所得的含砷提取液能制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤，杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸、亚砷酸、甲基砷酸、二甲基砷酸、三甲基胂氧、砷硼烷、砷胆碱提取物中的一种或者多种；且上述提取物的含量之和占药物总量的0.1% 。其中本实施例采用的制剂为：每单位制剂中含砷化合物含量组成经检测得到为：砷酸（V）0.1 ％；亚砷酸（V）0 ％；甲基砷酸（V）0％；二甲基砷酸（DMA）0 ％；三甲基胂氧（TMAO）0％；砷硼烷砷硼烷（AsB）0 ％；砷胆碱（AsC）0％。

实施例5

一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采用实施例1的方法制备所得的含砷提取液能制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤，杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸、亚砷酸、甲基砷酸、二甲基砷酸、三甲基胂氧、砷硼烷、砷胆碱提取物中的一种或者多种；且上述提取物的含量之和占药物总量的100% 。其中本实施例采用的制剂为：每单位制剂中含砷化合物含量组成经检测得到为：砷酸（V）25 ％；亚砷酸（V）25 ％；甲基砷酸（V）10％；二甲基砷酸（DMA）10 ％；三甲基胂氧（TMAO）10％；砷硼烷砷硼烷（AsB）10 ％；砷胆碱（AsC）10％。

实施例6

一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采用实施例1的方法制备所得的含砷提取液能制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤，杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸、亚砷酸、甲基砷酸、二甲基砷酸、三甲基胂氧、砷硼烷、砷胆碱提取物中的一种或者多种；且上述提取物的含量之和占药物总量的50% 。其中本实施例采用的制剂为：每单位制剂中含砷化合物含量组成经检测得到为：砷酸（V）12.5 ％；亚砷酸（V）12.5 ％；甲基砷酸（V）5％；二甲基砷酸（DMA）5％；三甲基胂氧（TMAO）5％；砷硼烷砷硼烷（AsB）5 ％；砷胆碱（AsC）5％。

实施例7

一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采用实施例1的方法制备所得的含砷提取液能制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤，杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸、亚砷酸、甲基砷酸、二甲基砷酸、三甲基胂氧、砷硼烷、砷胆碱提取物中的一种或者多种；且上述提取物的含量之和占药物总量的100%。其中本实施例采用的制剂为：每单位制剂中含砷化合物含量组成经检测得到为：砷酸（V）25％；亚砷酸（V）10 ％；甲基砷酸（V）5％；二甲基砷酸（DMA）30％；三甲基胂氧（TMAO） 10％；砷硼烷砷硼烷（AsB）10％；砷胆碱（AsC）10％。

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Claims

1.一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)制备提取用砷化矿细粉；2) 海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉后得到含砷提取液。

2.如权利要求1所述的一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，其特征在于所述的制备提取用砷化矿细粉的步骤为：将砷化矿粉粹至200目后，加入1mol/L的硫酸和三氯化铁的混合液中，然后在转速为180 r/min、温度为30℃的恒温摇床中培养15 d，得到提取液；将提取液用孔径为0.45 μm 的滤膜过滤，得到滤液；所述滤液在温度为20℃、磁力搅拌转速为800～1000 r/min 的条件下进行反应沉淀，2 min 后过滤，得到沉淀物；然后沉淀物用去离子水洗涤后，在60℃温度下干燥，即得砷化矿超微粉体细粉。

3.如权利要求2所述的一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，其特征在于：所述的砷化矿采用砷黄铁矿、毒砂、斜方砷铁矿、砷镍矿、红砷镍矿、砷钴矿、砷黑幻铜矿、硫砷铜矿、砷铂矿、铁硫砷钴矿、雄黄矿、雌黄矿中的一种或多种天然矿物。

4.如权利要求1所述的一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，其特征在于所述的海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉的步骤为：称取0.1g 200目砷化矿超微粉体细粉，于灭菌后的250mL 锥形瓶中，加入LA液体培养基90mL ，调节pH为5.0，待稳定后，接种体积分数为20％的海洋微生物菌种；然后在30℃ 、振荡速度为18Or / min 时摇瓶浸出15d；过程中定期检测调节pH 值，用蒸馏水补充所蒸发的水分，定时进行处理液中砷酸（V）、亚砷酸（V）和或甲基砷酸（V）和或二甲基砷酸（DMA）和或三甲基胂氧（TMAO）和或砷硼烷（AsB）和或砷胆碱（AsC）的含量检测，当上述多种成分的总含量低于0.1％后，停止震荡培养，过滤除菌后取上清液，该上清液就是含砷化合物或含有该提取物的组合物，可直接做为药品或者用于制备药品的原料。

5.如权利要求4所述的一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，其特征在于：所述的LA液体培养基为酵母膏5g ，蛋白胨10g ，氯化钠10g ，琼脂1 g，脱脂奶粉1g。

6.如权利要求4所述的一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，其特征在于所述的海洋微菌种采用：海水产碱菌，粪产碱杆菌，氧化醋酸杆菌，生黑醋杆菌，产酸克雷伯氏菌，嗜酸乳杆菌，乳酸乳杆菌，短小芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，棒杆菌，北京棒杆菌，钝齿棒杆菌，谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌中的一种或多种；且各菌种组合中菌种量的组合比例为等比或非等比。

7.如权利要求6所述的一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，其特征在于：所述的海洋微菌种采用海水产碱菌，钝齿棒杆菌和黄色短杆菌三种，且菌种量的组合比例为等比。

8.如权利要求4所述的一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，其特征在于所述的摇瓶提取方式用槽浸、柱浸、罐浸、生物反应器、发酵罐处理以及微生物固定化处理方式替换。

9.一种如权利要求1所述的海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，其特征在于：采用上述方法制备所得的含砷提取液能制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤，杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸（V）、亚砷酸（V）、甲基砷酸（V）、二甲基砷酸（DMA）、三甲基胂氧（TMAO）、砷硼烷（AsB）、砷胆碱（AsC）提取物中的一种或者多种；且上述提取物的含量之和占药物总量的0.1 ％一100 ％。