CN101120948A - 一种具有化学保护、癌症预防和治疗用途的化合物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有化学保护、癌症预防和治疗用途的化合物组合物及其制备方法。该组合物包括异硫氰酸酯和有机硒，其重量比为：10～100∶0.01～1.0(按硒元素计)。该组合物可用于提高哺乳动物体内II型酶和抗氧化酶化学保护量，可用于预防和治疗急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、B细胞白血病、T细胞白血病、肝癌、肺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、阴茎癌、黑色素瘤和脑瘤。
Description
发明背景
I.发明领域
本发明涉及一种具有化学保护、癌症预防和治疗用途的化合物组合物及其制备方法。本发明涉及一种提高哺乳动物体内II型酶诱导物和抗氧化酶化学保护量的方法。本发明涉及一种抑制癌细胞生长、促进癌细胞凋亡、抑制肿瘤形成的方法。本发明还涉及一种从十字花科植物中制备异硫氰酸酯和有机硒的方法。
II.背景
流行病学研究发现，富含水果和蔬菜的饮食可降低多种癌症的发病率。在众多纷繁复杂的植物中，十字花科植物具有非常突出的抗癌作用。这主要是因为十字花科植物含有大量的抗氧化物质和某些可以调节致癌因子代谢的化合物。已经有大量的研究工作证实十字花科植物中的化学物质，硒、异硫氰酸酯(isothiocyanates)在十字花科植物的抗癌作用占据主导地位。
十字花科植物中广泛含有硒元素。硒元素是人体生长所必需的，在人和动物体内起抗氧化作用，保护心血管和心肌的健康。硒和金属有很强的亲和力，是一种自然的对抗重金属的解毒剂，也可降低黄曲霉菌的毒性。此外，硒元素还有保护视觉器官的健全功能，刺激免疫球蛋白及抗体的产生，增强机体对疾病的低抗力等。实验证明，补充硒有预防一系列化学致癌物诱发肿瘤的作用。硒通过抵抗氧化损伤、抑制转录因子、调控癌基因、防止肿瘤蛋白合成、刺激细胞凋亡、增强肌体免疫系统(包括细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫)，拮抗化学致癌物质，促进DNA损伤修复等机制来抑制肿瘤的发生。
十字花科的植物含有大量的硫代葡萄糖苷，已经有100多种硫代葡萄糖苷从十字花科植物中发现。若植物细胞发生破损，硫代葡萄糖苷水解酶，即硫代葡萄糖苷酶(myrosinase，thioglucoside glucohydrolase；EC 3.2.23.1)被释放出来，并水解硫代葡萄糖苷，生成硫酸氢盐、葡萄糖和一系列葡萄糖苷配基，这些配基在经过分子内的重排形成异硫氰酸酯。
异硫氰酸酯的生理功能
1、抑制肿瘤的形成
大量实验证明，异硫氰酸酯对食道癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌及大肠癌等都有很好的防治效果。
2、抗氧化功能
异硫氰酸酯并不是直接行使功能的抗氧化剂，这是由于异硫氰酸基团不可能在生理条件下参与氧化或还原反应。然而，越来越多的证据表明异硫氰酸酯却可以间接增加动物细胞的抗氧化能力。
3、提高组织的谷胱甘肽水平
异硫氰酸酯会激发位于γ-glutamylcysteine合成酶基因5’端上游区的抗氧化响应因子，从而促使γ-glutamylcysteine合成酶的合成。该酶是谷胱甘肽合成中的限速步骤，该酶的增加可以导致机体合成大量的谷胱甘肽。
4、调节机体酶的组成；
异硫氰酸酯可以抑制细胞合成I型酶(如细胞色素P450)，诱导细胞合成II型解毒酶(如谷胱甘肽转移酶、NAD(P)H-醌还原酶、血红素氧化酶)，使细胞免受活性氧的攻击。
目前已报道的方法中，有些在可以使硫代葡萄糖苷酶变性或失活的温度下处理十字花科的植物，从而大多数硫代葡萄糖苷无法被水解生成异硫氰酸酯，并通过此方法制作含有硫代葡萄糖苷的制品。在人体内硫代葡萄糖苷只有很少的部分可转变为异硫氰酸酯。已经证实硫代葡萄糖苷不是哺乳动物II型酶的诱导物，而且硫代葡萄糖苷可以显著的诱导I型酶，并产生大量的活性自由基，从而对人体健康造成伤害(参见Perocco等人，Mutation Research，595，(2006)，125-136)。有些方法在高温下将十字花科植物的硫代葡萄糖苷酶变性或失活后，加入外源的硫代葡萄糖苷酶将硫代葡萄糖苷水解生成异硫氰酸酯，却将十字花科植物中同样具有高效生物保护活性的硒弃置不用，不但造成极大的浪费，而且必将显著降低这些制品的疗效。因此，在本领域中需要确定将对人体健康造成伤害的硫代葡萄糖苷最大限度的转变为异硫氰酸酯，以及去除硫代葡萄糖苷增加异硫氰酸酯的十字花科植物提取物的制备方法，需要确定以十字花科植物制备含硒提取物的方法，也需要确定异硫氰酸酯与有机硒同时给药是否产生协同作用，减少给药剂量和降低毒副作用，同样需要确定以十字花科植物制备含硒和异硫氰酸酯的制备方法。此外，高含量的硫代葡萄糖苷会抑制并显著减少十字花科植物积累有机硒，同样高含量的有机硒会抑制并显著减少十字花科植物合成硫代葡萄糖苷(Keck和Finley，Food and Chemical Toxicology，44，(2006)695-703)。因此，还需要确定添加外源的硒和/或化学合成的异硫氰酸酯的化合物组合物的制备方法。
发明要点
本发明的目的是提供富含化学保护、防癌、抗癌的化合物组合物。
本发明的另一个目的是提供含有大量II型酶诱导物和抗氧化酶诱导物而基本上没有I型酶诱导物的化合物组合物。
本发明还有一个目的是提供含有大量抑制癌细胞生长、促进癌细胞凋亡、抑制肿瘤形成的化合物组合物。
这些目的以及其他目的可通过制备具有化学保护、癌症预防和治疗用途的组合物来实现，其中包括治疗剂量的异硫氰酸酯和有机硒。
本发明的另一个实施例提供一种含有大量II型酶诱导物和抗氧化酶诱导物而基本上没有I型酶诱导物的化合物组合物。
本发明还有一个实施例提供一种含有大量抑制癌细胞生长、促进癌细胞凋亡、抑制肿瘤形成的化合物组合物。
本发明的实施例提供了在适当的剂量和配比，异硫氰酸酯和硒共同作用与机体和肿瘤细胞，产生协同的治疗和预防作用。
本发明的另一个实施例提供一种含有大量异硫氰酸酯的化合物组合物。化合物组合物的生产是通过制备十字花科植物的提取物来实现。所用的十字花科植物包括十字花科植物的种子、芽苗、花、茎、叶和根，或其中任何组织的组合。
本发明的另一个实施例提供一种含有大量异硫氰酸酯十字花科植物提取物的方法，方法包括十字花科植物粉碎后，加水水解，水解可通过内源或外源的硫代葡萄糖苷酶来进行，并采用无毒溶剂进行提取。
本发明还有一个实施例提供一种从十字花科植物提取物中纯化异硫氰酸酯的方法，采用CO2超临界工艺制备异硫氰酸酯提取物。
本发明还有一个实施例提供一种从十字花科植物提取物中纯化异硫氰酸酯的方法，将十字花科植物的无毒溶剂提取物经硅胶柱除杂、吸附、洗脱，获得高纯度的异硫氰酸酯提取物。
本发明还有一个实施例提供一种从十字花科植物提取物中纯化异硫氰酸酯的方法，将十字花科植物的无毒溶剂提取物用水或低浓度乙醇溶液溶解，经大孔吸附树脂吸附、除杂、洗脱，获得高纯度的异硫氰酸酯提取物。
本发明还有一个实施例提供一种从十字花科植物提取物中纯化异硫氰酸酯方法，采用分子蒸馏技术纯化，获得高纯度的异硫氰酸酯提取物。
本发明还有一个实施例提供一种从十字花科植物提取物中纯化异硫氰酸酯的方法，采用C18反相制备柱技术纯化，获得高纯度的异硫氰酸酯提取物。
本发明还有一个实施例提供一种含有有机硒的化合物组合物。化合物组合物的生产是通过制备十字花科植物的提取物来实现。所用的十字花科植物包括十字花科植物的种子、芽苗、花、茎、叶和根，或其中任何组织的组合。
本发明的另一个实施例提供一种含有有机硒的十字花科植物提取物的方法。
本发明的另一个实施例提供一种含有有机硒的十字花科植物提取物中添加天然或化学合成的异硫氰酸酯化合物组合物及其制备方法。
本发明的另一个实施例提供一种含有异硫氰酸酯的十字花科植物提取物中添加有机硒的化合物组合物及其制备方法。
本发明还有一个实施例提供了一种制备异硫氰酸酯与HP-β-环糊精包合物的方法。
本发明的其他目的、特征和优点可从实例明显看出。然而，应当理解表述本发明较佳实施方案的详细说明和具体实施例只是用于描述，因为根据这些详细描述在本发明的范围和思路内所作的各种变化和改进对于本领域技术人员是显而易见的。因此，这种变化或这样的改进并不意味是对本发明的限制。参考权利要求书，来确定本发明的全部范围。
具体实施例
实施例1含有异硫氰酸酯的十字花科植物提取物的制备
将十字花科植物的种子、芽苗、花、茎、叶或根粉碎，加入5倍pH值为7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，水解2小时。将得到的水解液，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯提取液，减压蒸馏，回收乙酸乙酯后，得到十字花科植物的粗提物。硫代葡萄糖苷在十字花科植物中的含量变化很大，不同品种、不同生长环境以及同一植株的不同生长阶段、同一植株的不同部位含量都存在差别。以青花菜为例，不同部位的青花菜植物组织经乙酸乙酯提取后，莱菔硫烷(sulforaphane，1-异硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷)在提取物中的含量见表1。如上所制得的十字花科植物的粗提物中莱菔硫烷的含量采用高效液相色谱测定。色谱柱为反相C18柱，流动相为乙腈和水，柱温为30℃，检测波长为254nm，流速1.0ml/min，进样量为10μl，采用梯度洗脱，从20％的乙腈20min内升至100％的乙腈。从表1可以看出异硫氰酸酯在十字花科植物不同部位的含量存在较大差别。
表1莱菔硫烷在不同青花菜植物组织提取物中的百分含量(n＝3)
| 青花菜植物组织 | 莱菔硫烷在提取物中的百分含量(％) |
| 种子芽苗花茎叶根 | 5.6±0.26.5±0.52.3±0.80.91±0.030.85±0.060.35±0.09 |
实施例2采用硅胶柱层析技术从十字花科植物提取物中纯化异硫氰酸酯
将实施例1得到的十字花科植物提取物经硅胶除杂，再用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液溶解，经硅胶吸附后，再用乙酸乙酯洗去硅胶上吸附的低极性杂质，最后用乙醇洗脱目标产物，减压蒸馏以除去有机溶剂，得到纯化的异硫氰酸酯产品。
以青花菜种子为例，称取100g青花菜种子，研磨成粉末状，加入500mlpH值为7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，水解2小时。水解后的混合物加入500ml的乙酸乙酯，离心，收集乙酸乙酯，重复此步骤3次，将三次的乙酸乙酯相混合，经5克100-200目的硅胶吸附极性杂质后，减压蒸馏浓缩为黄褐色油状的莱菔硫烷粗产品，含量为15.52％。得到的莱菔硫烷粗产品溶解于600ml体积比为8∶2的石油醚和乙酸乙酯溶液，经30克100-200目的硅胶吸附后，再用100ml乙酸乙酯除杂，最后用300ml乙醇洗脱莱菔硫烷，减压蒸馏回收乙醇，纯度为54.2％。如上所制得的产品中莱菔硫烷的含量采用实施例1中的高效液相色谱测定。
实施例3采用大孔吸附树脂层析技术从十字花科植物提取物中纯化异硫氰酸酯产品
将实施例1得到的十字花科植物提取物用去离子水或10％乙醇水溶液溶解，用等体积的石油醚脱出低极性杂质，水相经大孔吸附树脂吸附后，再用水洗去极性杂质，最后用乙醇水溶液洗脱目标产物，减压蒸馏回收乙醇，再用乙酸乙酯萃取目标产物，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到纯化的异硫氰酸酯产品。
以青花菜种子为例，称取100g青花菜种子，研磨成粉末状，加入500ml pH值为7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，水解2小时。水解后的混合物加入500ml的乙酸乙酯，离心，收集乙酸乙酯，重复此步骤3次，将三次的乙酸乙酯相混合，减压蒸馏浓缩为黄褐色油状的莱菔硫烷粗产品，含量为5.52％。得到的莱菔硫烷粗产品溶解于1000ml去离子水，用等体积的石油醚脱脱脂3次，脱脂后的水相经50ml SP825大孔吸附树脂吸附后，再用100ml去离子水除杂，最后用600ml 65％乙醇水溶液洗脱莱菔硫烷，减压蒸馏回收乙醇，再用乙酸乙酯萃取莱菔硫烷3次，减压蒸馏回收乙酸乙酯，纯度为65.2％。如上所制得的产品中莱菔硫烷的含量采用实施例1中的高效液相色谱测定。
实施例4采用分子蒸馏技术从十字花科植物提取物中纯化异硫氰酸酯产品
将实施例2或实施例3得到的十字花科植物提取物采用分子蒸馏技术精制，可得到高纯度的异硫氰酸酯产品。
以青花菜种子为例，经实施例2或实施例3得到的莱菔硫烷产品，利用刮膜式短程蒸馏设备提纯莱菔硫烷工艺条件是：进料速率250ml/h，操作压力0.1Pa，蒸馏温度136℃，搅拌速度130r/min。应用刮膜式分子蒸馏设备对莱菔硫烷粗产品原料进行提纯，经过三级分离操作就可以将原料中的莱菔硫烷的纯度提高到85％以上。如上所制得的产品中莱菔硫烷的含量采用实施例1中的高效液相色谱测定。
实施例5高纯度的异硫氰酸酯产品的制备
以青花菜种子为例，取种子100g，烘干，粉碎，脱油后的粉末加80％乙醇室温搅拌萃取，固液比1∶10，萃取2h，分离乙醇萃取液，重复提取3次，合并乙醇萃取液，回收乙醇，萃取物加水调浓度为1g生药/ml，上AB-8大孔吸附树脂，用60％的乙醇洗脱目标硫苷，回收乙醇，加外源的萝卜种子粗提黑芥子酶0.5g，5倍体积水搅拌1h，室温水解。水解产物用乙酸乙酯萃取，30℃减压回收乙酸乙酯，得粗莱菔硫烷提取物，得率8.33％。装入CO2流体超临界萃取釜萃取，温度37℃，压力20MPa，所得莱菔硫烷提取物含量80.61％。如上所制得的产品中莱菔硫烷的含量采用实施例1中的高效液相色谱测定。
实施例6采用C18反相制备柱精制异硫氰酸酯产品
取实施例5所得莱菔硫烷1.0g，50ml用10％甲醇水溶液溶解，经0.45μm膜过滤，滤液用C18反相制备柱(30cm×4.5cm)分离，25％甲醇-水系统洗脱，检测波长254nm，收集含莱菔硫烷的组分，经等体积的乙酸乙酯萃取三次，减压回收乙酸乙酯，得720mg莱菔硫烷纯品，含量98.21％。如上所制得的产品中莱菔硫烷的含量采用实施例1中的高效液相色谱测定。
实施例7十字花科植物提取异硫氰酸酯后有机硒的回收
以含硒的青花菜种子为例，经实施例1提取异硫氰酸酯的青花菜种子为原料在pH9的水溶液浸提3次，每次浸提50min，固液比1∶10，浸提温度50℃的条件下，离心合并上清液，用截留分子量5000u的超滤膜超滤，取截留液冷冻干燥，制备得含硒产品，蛋白质含量达83.37％，产品中硒的含量11.5mg/kg。
实施例8用本发明化合物组合物制备药物颗粒剂
取按实施例7制得硒代蛋白质4.35kg(含硒元素50.00mg)，取按实施例3所得莱菔硫烷提取物76.70g(含莱菔硫烷50.00g)，溶于含食用植物色素的95％的乙醇100-200ml中，将乙醇溶液喷洒在573.50g糊精上，充分混匀，再将含莱菔硫烷提取物的糊精加入到植物有机硒提取物中，充分搅拌至颜色均匀，95％的乙醇制颗粒，晾干，分装成每袋重5.0g的颗粒剂1000袋。
实施例9用本发明化合物组合物制备胶囊剂
取按实施例5制得的莱菔硫烷提取物62.03g(含莱菔硫烷50g)，取药用级硒代蛋氨酸(含量99％)200.75mg(含硒元素80mg)。将200.72mg硒代蛋氨酸加适量食用色素拌匀，用倍比递增法与237.77g糊精混匀，再将硒代蛋氨酸糊精分次加入62.03g莱菔硫烷中，充分搅拌至颜色均匀，95％的乙醇制颗粒，晾干，用2号空心胶囊，分装成每粒重0.3g的胶囊剂1000粒。
实施例10用本发明化合物组合物制备HP-β-环糊精包和物
取按实施例6制得的高纯度的莱菔硫烷10g，采用低温饱和水溶液法按莱菔硫烷∶HP-β-环糊精＝1∶10的比例进行包合。莱菔硫烷溶于乙醇，HP-β-环糊精制成饱和水溶液，将莱菔硫烷乙醇溶液逐滴加入HP-β-环糊精饱和水溶液，搅拌2h，静置，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液冷冻干燥，得白色疏松的莱菔硫烷与HP-β-环糊精包合物，包合率为86％。
实施例11用本发明化合物组合物制备冻干粉针
取实施例10法制备的莱菔硫烷与HP-β-环糊精包合物580g(含莱菔硫烷50g)，取药用级硒代蛋氨酸(含量99％)62.7mg(含硒元素25.0mg)，加注射用水溶解，调pH 5-6，用0.22μm的微孔滤膜过滤，溶液注入西林瓶中，冷冻干燥，封口，制得冻干粉针1000支。
实施例12诱导II型解毒酶和抗氧化酶活性的比较
诱导物活性是衡量化合物诱导II型解毒酶和抗氧化酶活性的能力的量度。在本发明中，诱导II型解毒酶活性是用鼠体内肝癌细胞的醌还原酶(Quinonereductase，QR)活性的生物测定法来测定的，诱导抗氧化酶活性是用鼠体内肝癌细胞的硫氧还蛋白酶(Thioredoxin reductase，TR)活性的生物测定法来测定的。鼠肝癌细胞Hepalclc7培养在一个恒温的CO2(CO2浓度5％)培养箱中24小时，箱内温度37℃，培养基为加了10％胎牛血清(FCS)、链霉素、青霉素的α-MEM培养基。将本发明的化合物组合物用0.9％生理盐水稀释成所需浓度的样品加入培养基，再培养细胞24小时，测定诱导QR和TR的活性(QR活性的测定方法参见Prochaska和Santamaria，Anal.Biochem.169：328-336(1988)，TR活性的测定方法参见Holmgren和Bjornstedt，Methods Enzymol.252，199-208(1995)和Hill等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.234，293-295(1997))。
表2诱导II型解毒酶和抗氧化酶活件的比较(n＝3)
| 样品 | QR活性(nmol/min/mg) | TR活性(mU/min) |
| 空白样品A样品B | 32±538±682±9 | 41±643±885±8 |
注：样品A不含有硒(Se)和莱菔硫烷，
样品B含0.5μM硒(Se)和1μM莱菔硫烷(SFN)。
从表2中可以看出，诱导醌还原酶(QR)活性和硫氧还蛋白酶(TR)活性是制剂中的Se和异硫氰酸酯(SFN)而获得的。因此，制剂中的硒和异硫氰酸酯是所必需的。
实施例13抑制人肺腺癌A549细胞生长并促进癌细胞凋亡
将对数生长期人肺腺癌A549细胞接种与24孔培养板内，培养24h，吸取上清液，加入拟定浓度的本发明化合物组合物的培养液，设实验对照孔(0.5％DMSO+细胞)。在培养24、48h，更换培养液继续培养，甲醛固定，Giemsa染色，镜下计数每孔＞50个细胞以上的集落数目，计算集落形成抑制率，抑制率(％)＝(1-实验组集落数/对照组集落数)×100％。实验结果见表3。
采用流式细胞术，取对数生长期的A549细胞，细胞浓度为5×105/ml，接种于24孔培养板中每孔2ml，实验组分别加入拟定浓度的的本发明化合物组合物的培养液，对照组加PBS，CO2孵箱内继续培养48h，分别收集各组细胞，(每组细胞数＞1×106)，加70％的乙醇500μl固定，4℃过夜，PBS洗涤，离心后细胞沉淀中加入PI染色液0.5ml，上机计算细胞凋亡率。结果见表4。
从表3、表4的结果可以看出，与空白对照组相比，本发明化合物组合物可显著抑制人肺腺癌A549细胞生长、促进癌细胞凋亡，并呈剂量依赖性，且异硫氰酸酯与有机硒在一定的比例范围内，呈现协同效应。
表3本发明化合物组合物对人肺腺癌A549细胞集落形成的抑制作用(
，n＝3)
| 组别 | 抑制率(％) | ||
| 24h | 48h | 72h | |
| 对照组实验组 Se 60.0nMSFN 6.25μM12.5μM25.0μM50.0μMSFN 6.25μM+Se 60nMSFN 12.5μM+Se 60nMSFN 25.0μM+Se 60nM | 05.9218.6534.2150.3262.7338.7668.3590.12 | 015.4433.1258.8264.1574.6960.2987.92100.0 | 021.3545.7967.4178.3285.5174.53100.0100.0 |
表4发明化合物组合物对人肺腺癌A549细胞凋亡率的影响(
，n＝3)
| 组别 | 凋亡率(％) |
| 对照组实验组 Se 60.0 nMSFN 12.5 μMSFN 25.0 μMSFN 50.0 μMSFN 12.5μM+Se 60nMSFN 25.0μM+Se 60nMSFN 50.0μM+Se 60nM | 1.05±0.313.18±1.167.03±1.7222.77±4.1437.45±4.8218.57±3.0724.19±4.6148.73±4.28 |
实施例14对小鼠S180实体瘤的抑制作用
取昆明小鼠50只(18-22g，雌雄各半)，按移植性肿瘤研究法接种S180实体型瘤：在无菌操作下取瘤块，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内加生理盐水稀释成1∶3的瘤细胞悬液，细胞数为(1～2)×107/ml，每次抽吸前将细胞混匀，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2ml(含活细胞数1×107)，24h后称重，随机分为模型组和给药组，每组10只动物。各组小鼠体重无显著差异。模型组给等体积蒸馏水，给药组用实施例10制得的莱菔硫烷与PH-β-CD包合物以及硒代蛋氨酸，按拟定剂量配制水溶液，灌胃给药。连续给药12天，停药次日处死动物，称体重并剥离皮下瘤块，称瘤体重量，计算肿瘤抑制率，瘤重抑制率％＝[(模型组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/模型组的平均瘤重]×100％。实验结果见表5。
表5本发明化合物组合物对小鼠S180肉瘤的作用(n＝10)
| 组别 | 剂量 | 瘤重(g) | 抑瘤率(％) |
| 模型组给药组 | N.SSFN 75mg/kgSFN 50mg/kgSFN 75mg/kg+Se 0.5mg/kgSFN 50mg/kg+Se 0.5mg/kg | 2.47±0.531.31±0.551.85±0.641.03±0.711.52±0.69 | /52.9645.1060.3049.46 |
从表5的结果可以看出，与空白对照组相比，本发明化合物组合物可明显抑制移植性肿瘤S180实体型瘤的生长，并呈剂量依赖性。
实施例15本发明药物对人肺腺癌A549肺癌实体瘤的抑制作用
取C57BL/6小鼠50只，接种小鼠人肺腺癌A549肺癌实体瘤，将人肺腺癌细胞按常规方法复苏扩增，用注射器抽取癌细胞悬浮液接踵于裸鼠前腋部皮下，每个部位接种0.2ml，(含活细胞数1×107)，24h后称重，随机分为模型组和给药组，每组10只动物。各组裸鼠体重无显著差异。模型组给等体积蒸馏水，给药组按实施例10制得的莱菔硫烷与PH-β-CD包合物以及硒代蛋氨酸，按拟定剂量配制水溶液，灌胃给药。连续给药12天，停药次日处死动物，称体重并剥离皮下瘤块，称瘤重量，计算肿瘤抑制率，瘤重抑制率％＝[(模型组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/模型组的平均瘤重]×100％。实验结果见表6。
表6本发明化合物组合物对小鼠人肺腺癌A549实体瘤的作用(
，n＝10)
| 组别 | 剂量 | 瘤重(g) | 抑瘤率(％) |
| 模型组给药组 | N.SSFN 75mg/kgSFN 50mg/kgSFN 75mg/kg+Se 1.0mg/kgSFN 50mg/kg+Se 1.0mg/kg | 1.38±0.450.62±0.161.02±0.210.38±0.130.76±0.28 | /55.0726.0972.4644.92 |
从表6的结果可以看出，与空白对照组相比，本发明化合物组合物可明显抑制移植性肿瘤人肺腺癌A549肺癌实体瘤的生长，并呈剂量依赖性。
实施例16对小鼠艾氏腹水癌(EAC)的生命延长作用
取昆明小鼠50只(18-22g，雌雄各半)，按腹水瘤移植接种常规方法接种小鼠艾氏腹水癌(EAC)。取出小鼠接种后第5～7天的腹水，用生理盐水稀释到细胞数为1×107/ml，然后给小鼠腹腔常规接种腹水癌细胞液。24h后随机分为模型组和给药组，每组10只动物。各组裸鼠体重无显著差异。模型组给等体积蒸馏水，给药组按实施例10制得的莱菔硫烷与PH-β-CD包合物以及硒代蛋氨酸，按拟定剂量配制水溶液，灌胃给药或腹腔注射给药，连续给药12天，停药，称体重。而后正常饲养，观察各组小鼠生存天数，观察时间为60天，计算生命延长率，生命延长率(％)＝[(给药组平均生存天数-模型组平均生存天数)/模型组的平均生存天数]×100％。实验结果见表7。
从表7的结果可以看出，与空白对照组相比，本发明化合物组合物对小鼠艾氏腹水癌呈显著的生命延长作用，并呈剂量依赖性。
(接下页)
表7本发明化合物组合物对小鼠腹水瘤EAC的作用(
，n＝10)
| 组别 | 剂量 | 口服 | 腹腔注射 | ||
| T(存活)/d | 生命延长率(％) | T(存活)/d | 生命延长率(％) | ||
| 模型组给药组 | N.SSFN 75mg/kgSFN 50mg/kgSFN 75mg/kg+Se 0.5mg/kgSFN 50mg/kg+Se 0.5mg/kgSFN25mg/kg+Se 0.5mg/kg | 15.07±2.1935.63±6.5226.49±5.7140.31±7.2329.75±5.65/ | /136.4375.78167.4997.41/ | 14.87±2.4136.51±7.3525.37±6.2841.26±7.8030.15±6.6524.50±6.74 | /145.5370.61177.47102.7664.76 |
实施例17本发明药物对小鼠肝腹水癌(HepA)的生命延长作用
取昆明小鼠50只，接种小鼠肝腹水癌(HepA)方法同接种EAC。24h后随机分为模型组和给药组，每组10只动物。各组小鼠体重无显著差异。模型组给等体积蒸馏水，给药组按实施例10制得的莱菔硫烷与PH-β-CD包合物以及硒代蛋氨酸，按拟定剂量配制水溶液，灌胃给药或腹腔注射给药，连续给药12天，停药，称体重。而后正常饲养，观察各组小鼠生存天数，观察时间为60天，计算生命延长率，生命延长率(％)＝[(给药组平均生存天数-模型组平均生存天数)/模型组的平均生存天数]×100％。实验结果见表8。
从表8的结果可以看出，与空白对照组相比，本发明化合物组合物对小鼠肝腹水癌呈显著的生命延长作用，并呈剂量依赖性。
(接下页)
表8本发明化合物组合物对小鼠腹水肝癌HepA的作用(
，n＝10)
| 组别 | 剂量 | 口服 | 腹腔注射 | ||
| T(存活)/d | 生命延长率(％) | T(存活)/d | 生命延长率(％) | ||
| 模型组给药组 | N.SSFN 75mg/kgSFN 50mg/kgSFN 75mg/kg+Se 0.5mg/kgSFN 50mg/kg+Se 0.5mg/kgSFN 25mg/kg+Se 0.5mg/kg | 14.75±2.1933.42±5.9724.38±6.7139.67±6.8628.35±6.65/ | /126.5865.29168.9592.2/ | 13.42±3.8432.26±7.2926.37±5.0336.43±7.4131.29±6.0721.16±4.91 | /140.3996.50171.46133.1657.68 |
Claims (10)
1.一种具有化学保护、癌症预防和治疗用途的化合物组合物，其中包括异硫氰酸酯和有机硒，其重量比为：10～100∶0.01～1.0(按硒元素计)。
2.权利要求1的药物组合，其包括异硫氰酸酯和有机硒及药物载体。
3.根据权利要求1-2所述的化合物组合物，其中所述的异硫氰酸酯可为莱菔硫烷(sulforaphane)，三芥酸甘油酯(erucin)，苯乙基异硫氰酸酯(phenethylisothiocyanate)及这些异硫氰酸酯的结构类似物或衍生物，包括从十字花科植物的种子、芽苗、花、茎、叶、根，或其中任何组织的组合中提取的或化学合成的。
4.根据权利要求1-2所述的化合物组合物，其中所述的有机硒，其包括：从富硒的十字花科或其它植物中提取的天然的或合成的硒代蛋白、硒代氨基酸、硒代多糖或有机硒盐。
5.一种提高哺乳动物体内II型酶和抗氧化酶化学保护量的方法，包括用权利要求1所述的化合物组合物进行有效量的给药。
6.一种抑制癌细胞生长、促进癌细胞凋亡、抑制肿瘤形成的方法，包括用权利要求1所述的化合物组合物进行有效量的给药。
7.从十字花科植物中制备异硫氰酸酯和有机硒以及制备异硫氰酸酯与HP-β-环糊精包合物的方法，其包括：
(1)将十字花科植物粉碎，加水水解，水解可通过内源或外源的硫代葡萄糖苷酶(黑芥子酶同工酶)来进行。
(2)所得水解产物用乙酸乙酯提取，得异硫氰酸酯粗品。
(3)所得提取物可用石油醚脱脂。
(4)所得提取物可采用硅胶柱层析吸附、除杂、洗脱，得高纯度的异硫氰酸酯。
(5)所得提取物可采用大孔吸附树脂吸附、除杂、洗脱，得高纯度的异硫氰酸。
(6)所得提取物可采用分子蒸馏技术纯化，得到高纯度的异硫氰酸酯
(7)将十字花科植物的种子、芽苗、花、茎、叶、根，或其中任何组织的组合干燥、粉碎，加甲醇或乙醇萃取，取醇提取液回收醇，得醇萃取物，萃取物经大孔吸附树脂，用乙醇洗脱硫代葡萄糖苷，再加外源性黑芥子酶进行水解，继续用乙酸乙酯萃取水解产物，再采用超临界CO2流体萃取，萃取物料后得异硫氰酸酯。
(8)所得提取物可采用C18反相制备柱技术纯化，得到高纯度的异硫氰酸酯
(9)将上述提取方法提取后的水溶液和残渣，离心分离水溶液，残渣加pH＝8-11的碱性溶液浸提3次，合并水溶液和碱提取液，离心，5000u超滤膜超滤，截留液冷冻真空干燥，制得含硒产品。
(10)取上述权利要求(8)制得的高纯度异硫氰酸酯按1∶10-200比例，采用低温饱和水溶液法，将异硫氰酸酯溶于乙醇，逐滴搅拌加入HP-β-环糊精，搅拌1-24h，冷藏，0.45μM滤膜过滤，取滤液冷冻干燥，得异硫氰酸酯与HP-β-环糊精包合物。
8.权利要求1所述化合物组合物的应用，其特征在于：所述癌症包括白血病和实体瘤。
9.权利要求8所述白血病为急性淋巴性白血病，慢性淋巴性白血病，B细胞白血病，T细胞白血病。
10.权利要求8所述实体瘤为肝癌、肺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、阴茎癌、黑色素瘤和脑瘤。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080213 |