CN101553237B - 精细胞分离方法和含有其中所用适体或核酸序列的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种与哺乳动物精细胞表面上的靶分子结合的适体或适体池和一种产生所述适体的方法。所述方法包含使不同核酸分子的集合与所述靶分子在有利于至少一种所述核酸分子与所述靶分子结合的条件下接触以形成至少一种包含与所述靶分子结合的核酸分子的复合物,其中每个所述核酸分子都包含至少一段随机核苷酸序列。然后分离所述复合物与未结合的核酸分子和未结合的靶分子,且从所分离的复合物中回收结合的核酸分子。使用所述适体基于诸如精细胞是否含有X染色体或Y染色体等精细胞质量来分离所述精细胞。
Description
相关申请案
本申请案主张2006年8月30日申请的美国临时专利申请案第60/824,069号的优先权,其全文以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及通过使用以高亲和力和特异性或优先性与含有X染色体或Y染色体的精细胞特异性结合的核酸、尤其适体从细胞、尤其哺乳动物精细胞的群体中鉴别和分离细胞的方法和组合物。
背景技术
选择具有期望特征的精细胞的能力仍是人工繁殖的重要目标。鉴别和分离用于性别选择的精细胞的高效且经济的方法将对畜牧业和尤其牛肉和乳品工业来说具有重要的经济意义。举例来说,在牛肉工业中,公牛因其体型而具有比母牛高的商业价值,所以允许富集公牛的方法将给使用这些技术的牧场主带来明显的竞争优势。另一方面,在乳品工业中,通常更需要产乳乳牛。然而,目前仅一小部分牛牧场主采用涉及性别特异性精细胞的人工授精方法作为产生具有期望性别的牲畜的手段。尽管存在能够控制和计划牛库存的性别组成的优势,但这种方法并未较广泛地用于工业中,因为采用流式细胞术技术将精细胞分选成性别特异性精细胞的目前方法费用高且涉及授精之前精细胞的不可逆染色。基于精细胞质量、物理特征或含量鉴别和分离精细胞的费用较低且侵入性较弱的方法还将在许多动物和人类繁殖技术中获得重要应用。
发明内容
本发明提供至少一种与可通过细胞、尤其哺乳动物精细胞的表面接触到的靶分子结合的适体或核酸序列和一种产生所述适体或核酸序列的方法。所述方法包含使不同核酸分子的集合与所述靶分子在有利于至少一种所述核酸分子与所述靶分子结合的条件下接触以形成至少一种包含与所述靶分子结合的核酸分子的复合物,其中每个所述核酸分子都包含至少一段随机核苷酸序列。然后分离所述复合物与未结合的核酸分子和未结合的靶分子,且从所分离的复合物中回收结合的核酸分子。
本发明进一步提供一种或一种以上特异性核酸分子或适体,优选寡核苷酸,更优选DNA分子,其优先与含有X染色体的精细胞(以下称为“X精细胞”)或含有Y染色体的精细胞(以下称为“Y精细胞”)结合且优选优先与X精细胞中的一个更好地结合或以显著不同的亲和力与X精细胞和Y精细胞的每种类型结合。
本发明还提供一种与哺乳动物精细胞上的靶分子结合的分离非天然存在核酸序列或适体,其包含选自由以下序列组成的群组的核苷酸序列:选自由SEQ ID NO:3-35组成的群组的核苷酸序列或其靶分子结合部分。
本发明还提供一种使用适体或核酸序列鉴别、选择和分离X精细胞和Y精细胞的方法。所述方法优选包含通过使X精细胞和Y精细胞与至少一种本发明适体接触来分离哺乳动物精细胞和基于所述细胞优先结合适体的能力将其分离成两种或两种以上群体。
本发明进一步包括由所述分离方法产生的X精细胞群体和Y精细胞群体。本发明进一步包含一种包含由本发明方法产生的精细胞群体的人工授精试剂盒和一种通过向哺乳动物投与所选择的精细胞群体使哺乳动物人工授精的方法。
本发明还提供与诸如精细胞活力、运动性、功能、刺激和保藏等精细胞质量相关的诊断和技术手段,以及通过建立选择性分选从各种物种、个体和试样获得的精液或精细胞的方法解决授精率、受精率和期望后代的出生率的诊断和技术手段。
附图说明
图1是展示9轮适体选择后DNA适体池对活分选公牛精子的特异性的流式细胞术图(A=与天然DNA文库结合的Y分选公牛精液细胞;B=与X细胞特异性适体池结合的Y分选公牛精液细胞;C=与天然DNA文库结合的X分选公牛精液细胞;和D=与X细胞特异性适体池结合的X分选公牛精液细胞)。
图2A展示所富集X细胞特异性适体池的结合分析。精细胞的荧光共聚焦图像(左图)和精细胞的光学图像(右图)。(a)X特异性适体池与X细胞,(b)X特异性适体池与Y细胞,(c)天然DNA文库与X细胞。
图2B展示所富集Y细胞特异性适体池的结合分析。精细胞的荧光共聚焦图像(左图)和精细胞的光学图像(右图)。(a)Y特异性适体池与Y细胞,(b)Y特异性适体池与X细胞,(c)天然DNA文库与Y细胞。
具体实施方式
在本发明的上下文中,适体被定义为一类配体或核酸序列,这些术语在整个本说明书中可互换使用;适体也指寡聚体或寡核苷酸,即,优先与诸如多肽、短肽、酶、蛋白质、脂质、糖脂、磷脂、糖蛋白、碳水化合物、小分子或诸如受体等细胞表面分子、细胞外基质或支架分子或离子通道等特定靶分子结合的核酸。本发明的适体是经由互补形相互作用以高亲和力和特异性与靶分子结合的配体或单链寡核苷酸。本发明的适体或核酸序列能够与靶分子结合或形成复合物,所述结合或形成的程度或亲和力高于将与经推测不含X精细胞或Y精细胞表面上的靶或可通过所述表面接触到的靶的污染或对照分子结合的适体。与Y精细胞相比,本发明的适体或核酸序列可优先与X精细胞表面上的靶分子结合,或反之亦然。核酸可为单链或双链DNA、单链或双链RNA和其任何化学修饰。修饰包括(但不限于)提供将额外电荷、极化性、氢键合、静电相互作用、流动性(fluxionality)或标签并入核酸碱基或核酸分子中作为整体的其它化学基团的修饰。适体优选为DNA分子。其最优选为寡核苷酸。
这些分子的长度大于一个核苷酸且可包括诸如二聚体或三聚体等短序列,其可为产生结合靶的特异性核酸分子的中间体。本发明的适体包括具有任何长度但优选小于200个核苷酸、优选小于150个核苷酸、优选小于100个核苷酸、优选小于80个核苷酸、更优选小于60个核苷酸、更优选小于40个核苷酸、优选小于35个核苷酸、优选小于30个核苷酸、优选小于25个核苷酸、优选小于20个核苷酸、优选小于15个核苷酸且优选小于10个核苷酸的核酸分子。这些寡核苷酸通常长约15-60个核苷酸。
在本发明的上下文中,适体被理解为包括单克隆适体和多克隆适体。如本文中所使用,单克隆适体是与同一靶结合的具有相同核苷酸序列的适体,且多克隆适体是与同一靶结合但核苷酸序列中存在一定变化的适体。单克隆适体为优选的。如本文中所使用,适体优选为能够与如本文中所述的靶分子复合或结合的寡核苷酸。适体与其靶分子的亲和力或复合是程度问题且通过适体与靶分子结合的能力高于其与对照或污染分子结合的能力而得以测量。因此,适体特异性在含义上与适用于抗体的特异性类似。
一旦由本文中所揭示的方法中的一种鉴别出结合但优先结合X精细胞或Y精细胞的适用适体,这些适体就可由诸如合成、重组和纯化方法等产生核酸分子的任何已知方法来制备。另外,在使适体与精细胞接触后可使适体与另一分子连接以帮助检测和/或分离。重要的是所述另一分子不会显著影响或干扰适体与靶分子的结合亲和力。适用的标签将包括已知适用于蛋白质、肽、代谢物和抗体的分离和检测的标签,诸如荧光或生物素部分或磁性珠粒或适用于分离的其它类型的珠粒。
本发明的适体或核酸序列可单独使用或与对相同靶分子具有特异性的其它适体组合使用。通过比较X精细胞或Y精细胞的表面上或表面附近的特异性靶分子或可能的另一靶分子的两种或两种以上已知适体,将知道含有相同一致序列的不同适体。如果将分离X精细胞和Y精细胞,那么重要的是采用一种或一种以上对一种细胞或另一种细胞具有特异性或优先性的适体来提供最佳分离以获得含X精细胞或含Y精细胞的精液群体。
本发明方法鉴别和选择针对精细胞表面蛋白质或其它精细胞表面靶(包括(但不限于)碳水化合物、脂质、核苷酸和可能易于与特异性适体结合的其它小分子)的适体。在一个实施例中,本发明提供一种产生与哺乳动物精细胞表面上的靶分子结合的适体的方法。使不同核酸分子的集合与很可能位于细胞表面上或从细胞表面突出的易于与这些分子结合的靶分子在有利于至少一种核酸分子与靶分子之间结合的条件下接触。每个核酸分子都含有至少一段随机核苷酸序列。这提供核酸分子的变化。接触引起形成至少一种包含至少一种与靶分子结合的核酸分子的复合物。然后分离所述复合物与未结合核酸分子和未结合靶分子。然后,从所分离的复合物中回收结合的核酸分子,从而提供期望适体。在另一个实施例中,所述方法包含扩增所回收的核酸分子以产生其它分子的另一步骤。在另一个优选实施例中,进一步混合所回收且扩增的分子(即,适体)与含有优选位于细胞表面上或可通过细胞表面接触到的易于结合的靶分子的X精细胞和Y精细胞的集合,且重复上述步骤工序足够多的次数直到回收到具有期望特异性/优先性和结合亲和力的适体。与细胞的DNA序列的对照池相比,适体更特异性地与相同细胞上的靶分子结合。在一个替代性实施例中,接触步骤包含培育分子以形成平衡混合物且分离步骤包含毛细管电泳。
细胞表面上的靶分子优选为对X精细胞或Y精细胞具有独特性且不会与每种类型的细胞交叉反应的分子。所述靶分子可为蛋白质、肽、酶、脂质、糖脂、磷脂、糖蛋白、碳水化合物、小分子或诸如受体等细胞表面分子、细胞外基质或支架分子或离子通道。蛋白质最优选区分X精细胞与含有Y染色体的Y精细胞。
在本发明的一个实施例中,本发明的方法以反复方式执行,如此存在以下重复步骤:(a)使不同核酸(即,适体)的集合与可通过细胞表面接触到的靶分子接触以形成至少一种复合物,所述复合物包含至少一种与可通过细胞表面接触到的靶分子结合的核酸分子,(b)分离复合物与未结合的核酸分子和未结合的靶分子;和(c)从所分离的复合物回收结合的核酸分子。在这一实施例中,从步骤(c)的所分离复合物回收的多个适体用于下一轮所述方法的步骤(a)中。在本发明的一个实施例中,将分选精细胞的步骤(即,上述步骤(a)、(b)和(c))重复1次或1次以上、2次或2次以上、3次或3次以上、4次或4次以上、5次或5次以上、6次或6次以上、7次或7次以上、8次或8次以上、9次或9次以上、10次或10次以上、11次或11次以上以产生对X精细胞或Y精细胞具有特异性的适体池。所分选适体可由所属领域中已知的方法纯化且由已知方法或供应商测序。
由本文中所揭示的方法所产生的代表性适体包含与哺乳动物精细胞上的靶分子结合的分离非天然存在核酸序列,所述核酸序列包含选自由以下序列组成的群组的核苷酸序列:
(a)选自由SEQ ID NO:3-35组成的群组的核苷酸序列或其靶分子结合部分;
(b)大体上与(a)的所述核苷酸序列同源且结合所述精细胞上的所述靶分子的能力大体上与(a)的所述核苷酸序列相同的核苷酸序列或其靶分子结合部分;和
(c)结构大体上与(a)或(b)的所述核苷酸序列相同且结合所述精细胞上的所述靶分子的能力大体上与(a)或(b)的所述核苷酸序列相同的核苷酸序列或其靶分子结合部分。
上述分离非天然存在核酸序列还涵盖,核苷酸1-20的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-35或其靶分子结合部分中缺失;核苷酸61-80的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-10和12-35或其靶分子结合部分中缺失或核苷酸44-63的至少一部分从SEQ ID NO:11或其靶分子结合部分中缺失;核苷酸1-20的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-35中缺失和/或其中核苷酸61-80的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-10或12-35或其靶分子结合部分中缺失或核苷酸44-63的至少一部分从SEQ ID NO:11或其靶分子结合部分中缺失;且DNA序列包含SEQ ID NO:3-10或12-35或其靶分子结合部分的核苷酸21-60或SEQID NO:11或其靶分子结合部分的核苷酸21-43。
本发明还涵盖包含至少一种选自由以上[0020]和[0021]中所列举的所有核酸序列组成的群组的核酸序列的组合物。
本发明方法进一步包含扩增所回收的核酸分子以产生其它核酸分子的步骤。接触步骤(a)可包含培育分子以形成平衡混合物且其中分离步骤包含毛细管电泳。
本发明方法进一步包含与大体上与模板核酸序列互补的引物一起培育每一轮后的不同核酸分子或适体的集合和含有靶分子的精细胞。模板核酸序列是对应于在多个适体内不变(或恒定)的适体片段的序列。适体优选来自DNA文库,且这一模板核酸序列为载体序列。接触步骤(a)进一步包含阴性选择步骤,继之以阳性选择步骤。使用流式细胞术已知技术定量多个所回收的适体。
适体可结合的精细胞上的靶分子选自由蛋白质、肽、酶、脂质、糖脂、磷脂、糖蛋白、碳水化合物、小分子或细胞表面分子组成的群组。在一个优选实施例中,靶分子是精细胞上所含的靶分子,且靶分子通过比较结合或无结合或差异结合来区分至少一种X精细胞与至少一种Y精细胞。由这一方法鉴别的精细胞是牛精细胞或人类精细胞。
与精细胞特异性结合的适体可由所属领域中已知的方法鉴别,这些方法包括(但不限于)细胞分选和流式细胞术技术。本发明方法提供一种制备允许分离哺乳动物X精细胞与哺乳动物Y精细胞的适体的方法,其中所述方法产生第一组与第一样品中的X精细胞结合的适体和第二组与第二样品中的Y精细胞结合的适体;且所述方法进一步包含:(d)比较第一组适体和第二组适体以由排除方法鉴别至少一种仅与X精细胞或Y精细胞结合的适体。哺乳动物精细胞的第一样品和第二样品是由流式细胞术和细胞分选产生。
制备精子特异性适体的方法进一步包含接触步骤(a),接触步骤(a)进一步包含:(a1)使不同核酸分子的第一集合与第一哺乳动物X精细胞样品中所含的靶分子在有利于核酸分子与X精细胞之间结合的条件下接触以形成至少一种复合物,所述复合物包含至少一种与至少一种X精细胞结合的核酸分子,其中每个核酸分子都包含至少一段随机核苷酸序列;和(a2)使不同核酸分子的第二集合与第二哺乳动物Y精细胞样品中所含的靶分子在有利于核酸分子与Y精细胞之间结合的条件下接触以形成至少一种复合物,所述复合物包含至少一种与至少一种Y精细胞结合的核酸分子,其中每个核酸分子包含至少一段随机核苷酸序列;其中分离步骤(b)和回收步骤(c)由此产生针对X精细胞的适体和针对Y精细胞的适体。由这一方法回收的适体是与X精细胞结合的适体和与Y精细胞结合的适体。
产生精子特异性适体的方法进一步包含在步骤(a)之前进行至少1轮核酸分子与包含哺乳动物X精细胞和Y精细胞的未分选细胞群体的接触。分离步骤(b)还进一步包含分离与适体结合的精细胞与适体的步骤且回收步骤(c)进一步包含回收所分离的精细胞。哺乳动物精细胞优选为牛精细胞或人类精细胞。
在本发明的一个实施例中,在数轮分选X和Y精细胞/适体选择之前可执行数轮未分选适体选择。举例来说,可执行1到5轮未分选适体选择。本发明包括在数轮分选适体选择之前包含3轮未分选适体选择的方法。如技术方案1所述的方法进一步包含与大体上与模板核酸序列互补的引物一起培育不同核酸分子的集合和靶分子。
在一个替代性和优选实施例中,本发明提供一种产生允许分离X精细胞与Y精细胞的适体的方法。获得第一X精细胞样品,且获得第二Y精细胞样品。产生第一组与第一样品中的X精细胞结合的适体,且产生第二组与第二样品中的Y精细胞结合的适体。比较第一组适体与第二组适体以由排除方法鉴别至少一种与X精细胞结合或与Y精细胞结合的适体。通常鉴别若干不同的与任一类型的细胞结合的适体。
第一和第二含有Y精细胞或X精细胞的哺乳动物精细胞样品优选由所属领域的技术人员已知的流式细胞术和细胞分选技术产生。这些技术揭示于1992年8月4日颁布的美国专利第5,135,759号中。流式细胞仪通常测量当先前经荧光染料处理的精子穿过激光束时所发射的荧光量。染料与DNA结合。因为X染色体比Y染色体含有更多的DNA,所以雌性(X)精子比雄性(Y)精子吸收更多染料且发射更多荧光。为检测X精子与Y精子之间DNA的微小差异,使精子单行穿过激光束以测量个别精子的DNA含量。这允许由细胞分选器分离个别X精细胞和Y精细胞。已利用类似细胞分选方法分选的分选X精细胞和Y精细胞可购自商业来源。
适体优选由包含以下步骤的方法产生:(a)使不同核酸分子的第一集合与第一Y精细胞样品在有利于核酸分子与Y精细胞之间结合的条件下接触以形成至少一种复合物,所述复合物包含至少一种与至少一种带Y染色体的精细胞结合的核酸分子,其中每个核酸分子都包含至少一段随机核苷酸序列;(b)使不同核酸分子的第二集合与第二X精细胞样品在有利于核酸分子与X精细胞之间结合的条件下接触以形成至少一种复合物,所述复合物包含至少一种与至少一种X精细胞结合的核酸分子,其中每个核酸分子都包含至少一段随机核苷酸序列;(c)分离复合物与未结合的核酸分子和未结合的靶分子;和(d)从复合物回收结合的核酸分子,由此产生针对Y精细胞的适体和针对X精细胞的适体。
在一个优选实施例中,通过使适体与含有X精细胞和Y精细胞的精细胞样品接触、由流式细胞术和细胞分选分离精细胞及确定推定X结合适体与X精细胞结合且推定Y结合适体与Y精细胞结合来测试和验证适体。适体通常经例如荧光部分标记以允许适当鉴别。
产生本发明适体可使用所属领域的技术人员已知的各种特定技术。一种这样的技术是德国卢肯瓦尔德阿普塔莱斯(AptaRes,Luckenwalde,Germany)的梦诺莱克斯(MonoLex)方法。这一方法包括以下步骤:(1)合成具有随机序列区的寡核苷酸文库;(2)使寡核苷酸亲和吸附于靶;(3)沿亲和树脂亲和分选寡核苷酸;(4)将具有不同亲和程度的寡核苷酸分离成许多池,每池包含多个适体;(5)扩增所分离的核苷酸池(其产生多克隆适体);和(6)通过克隆和测序鉴别个别寡核苷酸(其产生单克隆适体)。
另一技术称为指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands byExponential enrichment,SELEX)方法。SELEX方法和其变化形式描述于美国专利第5,861,254号、第6,261,774B1号、第6,376,190B1号、第6,506,887B1号、第6,706,482B2号和第6,730,482B2号中。这一方法包括以下步骤:(1)使优选包含随机序列的片段的核酸的混合物与靶在有利于结合的条件下接触;(2)分离未结合的核酸与那些与靶分子特异性结合的核酸;(3)解离核酸-靶复合物;(4)扩增从核酸-靶复合物解离的核酸以得到核酸的配体富集混合物;和(5)按照得到靶分子的高特异性、高亲和力适体所希望或所必需,重复先前步骤多个循环。
相关方法是美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)2004,126,20-21中所述的毛细管电泳-SELEX(capillary electrophoresis-SELEX,CE-SELEX)方法。这一技术使用电泳分离结合序列与非活性序列。选择是在自由溶液(free solution)中进行。结合靶的活性序列经历与亲和毛细管电泳中所见类似的迁移率变动(mobility shift)。将活性序列与非活性序列分离且作为个别部分收集。
一种鉴别和分离适体的优选方法是如以下文献中所述的平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NonEquilibrium Capillary Electrophoresis of Equilibrium Mixtures,NECEEM)方法:美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)2002,124,13674-13675;分析化学(Anal.Chem.)2003,75,1382-1386;克瑞勒夫(Krylov),“用于适体发展、表征和分析应用的NECEEM(NECEEM for Development,Characterization and Analytical Utilization ofAptamers),”国际实验室(Lab Plus International),2005年11月;和克瑞勒夫(Krylov),“平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM):一种生物筛选的新颖方法(Nonequilibrium Capillary Electrophoresis of Equilibrium Mixtures(NECEEM):A NovelMethod for Biological Screening),”生物分子筛选杂志在线优先出版(J.Biomol.ScreenOnline First),2006年1月17日。
简单来说,这种方法从与靶蛋白质混合且培育形成平衡混合物的天然DNA文库(每个序列在统计上是独特的)开始。具有高亲和力的DNA分子与靶蛋白质结合,而具有低亲和力的DNA分子不结合。然后向毛细管中引入平衡混合物填料,且施加高电压。在非平衡条件下由无凝胶毛细管电泳分离DNA-靶的平衡部分与DNA的平衡部分。在这些条件下,靶的迁移率比DNA高,且靶-DNA复合物的迁移率通常介于DNA的迁移率与靶的迁移率之间。在电场中,因此区带分离,且三个组分之间的平衡不再维持。DNA-靶复合物开始解离,这在三个峰之间产生DNA和靶的“弥散(smear)”。由于分离效率高,因此解离DNA和靶的重附着可忽略。
组分按以下顺序到达毛细管的末端:(1)游离靶的平衡部分;(2)NECEEM期间DNA-靶解离所形成的游离靶;(3)完整DNA-靶的剩余部分;(4)NECEEM期间DNA-靶解离所形成的游离DNA;和(5)游离DNA的平衡部分。在时间窗中从毛细管的输出物中收集部分。最宽的适体收集窗包括DNA-靶复合物和NECEEM期间从DNA-靶复合物解离的DNA。
优选靶是具有性别特异性或者允许基于性别选择或其它期望特征鉴别或分离精子的精细胞上的多肽(肽和蛋白质)。这些多肽的实例揭示于美国专利第4,191,749号、第4,448,767号、第5,021,244号、第6,153,373号和第6,489,092号和美国专利申请公开案2003/0162238A1中。举例来说,公开专利申请案揭示具有如下特征的经分离的性染色体特异性蛋白质:(a)X染色体特异性,(b)与牛精细胞的细胞膜相关,和(c)在SDS-PAGE上具有约32kDa的分子量。
一旦选择出合适适体,就可由包括酶促技术的所属领域的一般技术人员众所周知的许多技术或经由化学合成产生和繁殖所述适体。可经由已知化学技术加入其它化学基团。这些基团包括荧光素或生物素和产生可检测信号的其它基团。另外,可使用经修饰核苷酸保护适体以免被核酸酶降解。这些经修饰核苷酸包括2′-O-甲基和2′-氟衍生物。
在一些实施例中,如上所述所选择和/或产生的适体将用于基于精细胞带有X染色体还是Y染色体、异常数目的性染色体或其它期望精细胞特征分离精细胞群体的分析中。在一个优选实施例中,分离哺乳动物精细胞的方法包含以下步骤:1)使哺乳动物精细胞与本发明适体接触;和2)基于精细胞与适体结合的能力将精细胞分离成两种或两种以上群体。在一个实施例中,所述方法包含分离与适体结合的精细胞与适体且回收所分离的精细胞的另一步骤。在另一个实施例中,回收未与适体结合的精细胞。
在一个替代性实施例中,可能使用一种以上类型的适体。因此,分离方法中可使用两种或两种以上本发明的适体且这些适体可含有与相同靶分子结合的一致序列。本发明方法所产生的适体适用于与靶分子且更具体来说那些为X精细胞和Y精细胞的精细胞上的靶分子结合。
这一方法产生基于细胞的某些期望特征选择和分离的精细胞群体。所分离的群体可与适体结合或未与适体结合。如果期望群体与适体结合,那么优选分离精细胞与适体分子。精细胞优选为牛精细胞。在一个优选实施例中,精细胞含有Y染色体。在一个替代性优选实施例中,精细胞仅含有X染色体。
在另一个实施例中,本发明提供一种产生允许分离X精细胞与Y精细胞的适体或核酸序列的方法。使所制备的这种适体与X和Y精细胞的混合群体接触,且适体优先与X精细胞结合且分离这些结合适体-X精细胞复合物与最初的混合精细胞群体,留下富含Y精细胞的群体。可处理结合适体-含X精细胞复合物以释放含X精细胞以使其可作为细胞群体分离。
可例如如下使用通过使用适体分离精细胞的分析。用诸如X精子特异性适体等本发明适当适体涂布购得的显微磁性珠粒。这些珠粒将放在诸如玻璃皿等适当容器中的精细胞悬浮液中。因为细胞表面上存在性染色体特异性蛋白质,所以X精细胞然后将与珠粒上的X精子特异性/优先性适体结合,而Y精细胞不会结合或将以较小的优先性结合。然后利用磁铁将珠粒吸到玻璃皿的侧边。然后回收具有Y染色体的精细胞。也可使用可用于捕获和回收适体的其它类型的珠粒。利用涂有与精细胞结合的物质的磁性珠粒的其它技术揭示于美国专利申请公开案第2003/0068654A1号、第2004/0142384A1号和第2005/0114915A1号中。
在另一个实例中,可使用精细胞凝集作用。在这一方法中,可将活的未分选精子悬浮于无血清活体外培养基中且暴露于Y或X精细胞特异性/优先性适体。处理后,在玻璃棉过滤器中过滤培养基,且使用滤液中的精子执行活体外受精。
在另一个实例中,针对X或Y精细胞特异性表面蛋白质的适体可分别与X或Y精细胞结合且使X或Y精细胞失活,且可阻止其使卵子受精。未与适体结合的精细胞可保持使卵子受精的活力和活性。因此,本发明提供一种产生富集活性X或Y精细胞的精液样品且因此能够增加后代为期望性别或具有性染色体相关特性的基因的概率的方法。
在另一个实例中,可将天然精子制剂暴露于例如结合Y特异性分子的第一适体。可将暴露精子与仅与第一适体结合的第二适体与免疫吸附底物的结合物一起悬浮于无蛋白质稀释液中以形成结合物/精子制剂,由此Y精子与底物结合。然后可通过底物的特异性结合从底物中回收Y精子。
本文中所述的方法提供基于质量和合意性因素分离精子的手段,这些因素包括精细胞运动性、功能、刺激和保藏,其可影响包括(但不限于)人类、马、牛、猪、猫、狗、水牛、公牛(oxen)和麋鹿等哺乳动物的各种物种的生育率、授精率、受精率、后代健康和后代合意性。
本文中所述的基于期望特征分离精子的方法可最小化机械处理对精子的损害从而使精子具有提高的活力。所述方法不具侵袭性、不需要与细胞内部结构化学结合、涉及的操作最少且价格低廉。其对设备或仪器的要求最低且其易于由所属领域的技术人员进行。
通过一种或一种以上本发明方法制备的适体也可用于评估精子的其它特征。举例来说,其可用于测定精子质量,测定雄性生育性,鉴别健康精子或鉴别异常或受损精子。
本发明的分离精细胞优选用于哺乳动物的人工授精。哺乳动物优选是牛科哺乳动物。人工授精的方法包含利用所属领域的技术人员已知的技术向哺乳动物投与精子。
本发明进一步包含一种供哺乳动物人工授精的试剂盒。试剂盒至少含有本发明的分离精细胞群体和任选的向哺乳动物投与精细胞群体的其它组件或装置。试剂盒优选含有于插入雌性动物阴道的管中的个别精细胞样品。所述样品管在所属领域中称为“细管(straw)”。
或者,本发明的分离精子可用于哺乳动物的活体外受精。哺乳动物优选是人类。
实例
精子适体选择方法
本发明的选择特异性适体的优选方法采用一种利用若干轮未分选、分选X和/或分选Y精细胞与DNA文库的培育且最后步骤为收集具有DNA结合物的溶液且将所述溶液用作PCR和抗生蛋白链菌素珠粒上的链分离的模板的方法。申请者已确定6轮以上根据本发明的精子适体选择最佳。优选如下文所述执行7轮、更优选8轮且甚至更优选9轮选择。然而,必要时,可执行9轮以上选择以获得与特异性靶分子结合的适体。应了解,下文所述的方案可在不影响方案结果但会导致产生与靶分子结合的特异性适体的温度、体积和其它参数方面有变化。这些变化为所属领域的技术人员所知。
适体选择的第1-3轮
制备细胞:
通过将细管放在37℃的水中达1分钟来解冻精子等分试样,然后将细胞保持在室温(20-25℃)(RT)下。
1.取1细管未分选精细胞(约0.5ml和107个细胞)。
2.加入1ml含聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)的精液缓冲液。
3.在1.5ml小瓶中在17℃下在300×g下离心精细胞12分钟。
4.去除缓冲液且将细胞再悬浮于1ml新制PVA-精液缓冲液中。
5.在1.5ml小瓶中在17℃下在300×g下离心精细胞12分钟。
6.将精细胞再悬浮于300μl新制PVA-精液缓冲液中且利用血细胞计数器计数细胞。通过加入600μL缓冲液稀释细胞到约2×106个细胞/毫升(每20微升40000个细胞)。
7.通过加热到94℃达约3分钟,然后冷却到RT使溶解于含有2.5mM MgCl2的PBS(磷酸盐缓冲生理食盐水缓冲液)中的50μM天然DNA文库(从集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologyies,IDT)(珊瑚村,爱荷华州(Coralville,IA))定制订购)与下列序列发生退火:5′-CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG(SEQ ID NO:1)-(40N)-GGC TTC TGG ACT ACC TAT GC(SEQ ID NO:2)-3′。
8.向40μL细胞等分试样中加入2μL 1mM的F引物(正向引物,从IDT定制订购,具有以下序列:5′-CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG-3′)(SEQ ID NO:1),直到最终浓度为50μM。F引物是文库的开头20个核苷酸。其在选择中用作本底DNA。这一序列经选择以降低文库的至少一种恒定区不会参与结合的可能性,且如果这一序列被去除将产生较短适体序列但不会改变结合性质。
9.向20μL具有50μM F引物的含精细胞等分试样中加入4μL 100μM退火文库。
10.在室温下培育1小时。
11.加入200μL新制PVA-精液缓冲液且在17℃下在300×g下离心12分钟。
12.去除上清液且将离心块再溶解于另外的200μL PVA-精液缓冲液中。
13.在17℃下在300×g下离心12分钟。
14.去除上清液且将离心块再溶解于另外的200μL PVA-精液缓冲液中。
15.在17℃下在300×g下离心12分钟。
16.去除上清液且加入20μL 10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)且在95℃下培育细胞5分钟。
17.在20000rpm下离心细胞残骸20分钟。
18.收集上清液且用作利用F引物和经生物素标记R-引物(反向引物,从IDT定制订购,具有以下序列:5′-生物素-GGC TTC TGG ACT ACC TAT GC-3′)(SEQ ID NO:2))的PCR的模板且在抗生蛋白链菌素磁性珠粒上执行链分离。
完成上述步骤1-18构成完成一轮。18的上清液视为第1轮(R1)适体池且直接加以使用或利用已知PCR技术扩增。对于第2轮(R2),对根据步骤1-6制备的未分选细胞的新样品使用R1适体池代替步骤7中的天然DNA文库。在第3轮(R3)中,对于未分选细胞的新样品,然后直接利用第2轮完成的步骤18的上清液或第2轮(R2)适体池或使用已知PCR技术使其扩增且代替步骤7中的DNA文库加入。然后在下述第4轮的步骤7中使用第3轮的步骤18的上清液或第3轮(R3)适体池。
第4-11轮(分选细胞的阳性和阴性选择)
制备细胞:
通过将细管放在37℃的水中达1分钟来解冻精子等分试样(分选含X细胞或分选含Y细胞),然后将细胞保持在室温(20-25℃)下。
1.取1细管分选X细胞和1细管分选Y细胞。
2.然后向每个管中加入200μl新制PVA精液缓冲液,在17℃下在300×g下离心12分钟,去除上清液,留下约10μl,加入200μl新制PVA-精液缓冲液且全部转移到200μlPCR小瓶中。
3.在0.2ml PCR小瓶(较小小瓶提高细胞回收率)中在17℃下在300×g下离心细胞12分钟且去除缓冲液,留下约20μl。
4.向每个管中加入60μl新制PVA精液缓冲液且分入2个管中,每管30μl。
5.利用血细胞计数器计数细胞。应为约2×106个细胞/毫升(每20微升4×104个细胞)。
6.向细胞悬浮液中加入R3适体池(参见上述第3轮步骤18)之前约1-2分钟,加入F引物,直到最终浓度为50μM(向20μL细胞中加入1μl 1mM)。
7.对于阴性选择,制备以下混合物:
A.具有50μM F4和先前选择轮的5nM X适体池(或R3适体池,只有当其是向前轮选择时)的Y细胞。
B.具有50μM F4和先前选择轮的5nM Y适体池(或R3适体池,只有当其是向前轮选择时)的X细胞。在室温下培育混合物1小时且离心细胞(300×g,17℃,12分钟)。取上清液且在阳性选择中加以使用。向每个X和Y细胞等分试样中加入F引物直到最终浓度为50μM且加入等量的先前步骤的上清液。
C.向X细胞中加入部分1的上清液以得到2.5nM X适体池和50μM F4。
D.向Y细胞中加入部分2的上清液以得到2.5nM Y适体池和50μM F4。
8.在室温下培育混合物1小时。
9.加入200μL新制PVA-精液缓冲液且在17℃下在300×g下离心12分钟。
10.去除上清液且将离心块再溶解于另外的200μL PVA-精液缓冲液中。
11.在17℃下在300×g下离心12分钟。
12.去除上清液且将离心块再溶解于另外的200μL PVA-精液缓冲液中。
13.在17℃下在300×g下离心12分钟。
14.去除上清液且加入20μL缓冲液且在95℃下培育细胞5分钟。
15.在20000rpm下离心细胞残骸20分钟。
16.收集上清液或适体池且用作PCR和抗生蛋白链菌素磁性珠粒上的链分离的模板。
第4-9轮或更多轮的适体选择的一轮包括上述步骤1-16。然后向下一轮第5轮的步骤7中加入第4轮适体池,然后向下一轮第6轮的步骤7中加入第5轮适体池,然后向下一轮第7轮的步骤7中加入第6轮适体池,然后向下一轮第8轮的步骤7中加入第7轮适体池,然后向下一轮第9轮的步骤7中加入第8轮适体池,然后向下一轮的步骤7中加入第9轮适体池,且可相应继续重复任何其它轮。
这些适体选择轮的目标是获得与Y或X精细胞特异性结合的适体池。因此,至少应操作选择方法的第7轮来获得与靶分子特异性结合的适体,更优选至少应操作第8轮且最优选至少应操作第9轮或更多轮来获得对含Y精子和含X精子具有特异性的适体池。
申请者提出上述方法可用于制备任何类型的靶特异性适体,只要在适体选择轮中用含有鉴别细胞(未分选或分选)的靶分子的细胞池替换未分选和分选的Y精细胞和X精细胞。
适体选择方法中所产生的适体的细胞细胞术分析
执行以下方法以提供经标记DNA池和提供供另外可节省制备时间和成本的分析用的足量DNA。已知技术不对称PCR导致产生DNA链中的一条。为确定适体池是否是良好的结合物,将不对称PCR技术所产生的标记适体与精细胞混合且使其经受细胞流式细胞术分析。使用天然DNA文库作为对照。
制备以下混合物,其含有:1μM Alexa 647(从IDT以定制引物获得)标记正向引物(5′-Alexa 647-CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG-3′)(SEQ ID NO:1)、50nM反向引物(5′-GGC TTC TGG ACT ACC TAT GC-3′)(SEQ ID NO:2)、50mM KCl、10mMTris-HCl(pH8.6)、2.5mM MgCl2、三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)各200μM和0.05单位/微升Taq DNA聚合酶。
执行20个PCR循环,其包括由在94℃下熔融10秒,在56℃下退火10秒且在72℃下延伸10秒组成的PCR循环。第一个循环具有30秒的延伸熔融步骤。作为模板,使用每个选择轮后的纯化单链适体池。PCR完成后,利用手册中描述且为所属领域的技术人员所知的标准程序,利用30kDA截断DNA纯化塔(purification column)(Microconultracel YM-30,来自密理博(Millipore)(拜德福,马萨诸塞州,美国(Bedford,MA,USA)))纯化产物。
制备细胞:通过将细管放在37℃的水中达1分钟来解冻精子等分试样,然后将细胞保持在室温(20-25℃)下。
取1细管或1细管以上的未分选细胞(约0.5ml和107个细胞)。
1.加入1ml PVA精液缓冲液。
2.在1.5ml小瓶中在17℃下在300×g下离心细胞12分钟。
3.去除缓冲液且将细胞再悬浮于1ml新制PVA缓冲液中。
4.在1.5ml小瓶中在17℃下在300×g下离心细胞12分钟。
5.将细胞再悬浮于300μl新制含PVA精液缓冲液中且利用血细胞计数器计数细胞。
6.稀释细胞到约2×106个细胞/毫升(每20微升20000-40000个细胞);和
7.然后等分200μl细胞+10μl 1mM F4引物,每份20μl。
同时:
1.取1细管或1细管以上的分选X细胞和1细管或1细管以上的分选Y细胞。
2.在17℃下在300×g下离心12分钟,去除上清液,留下约10μL,加入200μl新制PVA精液缓冲液且全部转移到200μl PCR小瓶中。
3.在0.2ml PCR小瓶(较小小瓶提高细胞回收率)中在17℃下在300×g下离心细胞12分钟且去除缓冲液,留下约20μl。
4.然后向每个管中加入200μl新制PVA精液缓冲液。
5.利用血细胞计数器计数细胞,应为约2×106个细胞/毫升(每20微升4×104个细胞)。
6.混合X细胞混合物与1mM F引物,最终浓度为50μM,且制备按照分析所需的多个20μL等分试样。
7.混合Y细胞混合物与1mM F引物,最终浓度为50μM,且制备按照分析所需的多个20μL等分试样。
8.混合未分选细胞与1mM F引物,最终浓度为50μM,且制备按照分析所需的多个20μL等分试样。
9.使溶解于含有2.5mM MgCl2的PBS中的纯化DNA文库和池退火(加热到94℃达约3分钟,然后在室温下冷却)。
10.向20μL含有具有50μM F4的精细胞的等分试样中加入适量的每个来自上述适体选择轮的待测试适体池,最终浓度为约10nM。
制备以下混合物:未分选、分选X和分选Y细胞,每个具有天然DNA文库和来自每个选择轮的池。
11.在室温下培育1小时。
12.加入200μL新制PVA-精液缓冲液且在17℃下在300×g下离心12分钟。
13.去除上清液且加入200μL新制PVA-缓冲液且全部转移到细胞细胞术管中,和
14.在分析之前约2-3分钟加入碘化丙啶(propidium iodide,PI,一种核酸染色剂和死细胞标记物,西格玛阿尔德里奇(Sigma Aldrich))且再加入200μL PVA-精液缓冲液。
图1提供由本发明方法获得的适体的分析,其中执行9轮适体选择和利用流式细胞术的分析。每个活精子群体由8,000个到9,000个细胞代表。活细胞群体由死细胞染色剂碘化丙啶与死细胞区分。
比较X分选细胞与天然文库的结合与X分选细胞与X适体池的结合(图1,分别为迹线C和D),结果展示X适体池与X细胞的亲和力比天然文库高约10倍。所述数据展示精细胞特异性适体是在选择过程期间从文库获得。然后,比较X适体池与X分选细胞的结合亲和力与X适体池与Y分选细胞的结合亲和力(图1,分别为迹线D和B)表明适体与X细胞的亲和力比与Y细胞的亲和力高约20倍。所有上述数据以及Y细胞与天然DNA文库的亲和力和Y细胞与X适体池的亲和力(图1,分别为迹线A和B)相对类似的事实证明本发明方法产生可与X细胞特异性结合且对Y细胞不具有亲和力或具有极小亲和力的X细胞特异性适体。
关于Y细胞与天然DNA文库和Y细胞与Y适体池的结合,数据(未图示)展示Y细胞与Y适体池结合比其与表示Y特异性适体的天然DNA文库结合好。
6轮选择后,执行结合实验且X适体池对X细胞展示较强结合亲和力且对Y细胞展示较弱结合亲和力且甚至不展示结合亲和力(图2A)。Y适体池对X和Y细胞都展示结合亲和力(图2B)。利用荧光标记DNA和荧光共聚焦显微术观察结合。利用非运动细胞测量信号。
本发明方法通常提供与可能位于或可能不位于细胞表面上但应可通过细胞、诸如优选X精细胞或Y精细胞的表面接触到的靶分子结合的适体。本文中所述的细胞细胞术分析提供一种测定如本文中所述的单轮适体选择轮的最后步骤中所获得的适体池是否含有一种或一种以上与靶分子结合的适体的方法。应回顾数据且比较适体池与含靶分子的样品的结合。应比较所述结合数据与相同适体池与天然DNA文库、优选自其中首先获得适体池作为阴性对照的文库的任何结合。另外,还应针对第二或第三不含靶分子的样品比较适体池结合。展示与适体池与天然DNA文库的结合相比,适体池与靶分子的结合较高的结果视为阳性优先结合。另外,如本文中所揭示的其它选择轮可增加适体池的结合亲和力。另外,如果希望基于与一种细胞特异性结合而不与另一种细胞特异性结合来分离两种细胞群体(诸如分离X和Y精细胞),那么除比较适体池与天然DNA文库的结合外,还应就适体池与优选靶分子以及含希望与靶分子分离的“非靶”分子的样品的结合对适体池结合加以分析。在后一种情况下,应分析所有这些比较以选择与特异性靶分子结合且不与想与靶分子分离的细胞或分子结合或以较小程度或较小优先性与之结合的适体池。因此,利用适体分离不同精细胞群体需要分析和比较不同对照和阴性对照。
表1提供根据以上提供的程序的第9轮后从适体池中获得的优先与X精细胞结合且不与Y精细胞结合或以比与X精细胞小的优先性与Y精细胞结合的适体。表1中的适体(SEQ ID NO:3-35)展示每个序列5′端和3′端处的核苷酸部分,加有下划线。这些部分代表用于从天然文库NP40产生适体的适体的恒定区,对应于5′端处的正向引物CTCCTC TGA CTG TAA CCA CG(SEQ ID NO:1)和3′端处的反向引物GGC TTC TGG ACTACC TAT GC(SEQ ID NO:2)。这些恒定区各自的长度为20个核苷酸。本发明适体打算涵盖SEQ ID NO:3-35中的每一个的核苷酸长度序列或其部分。在另一个实施例中,本发明适体包含SEQ ID NO:3-10和12-35或其部分的核苷酸21-60和SEQ ID NO:11或其部分的核苷酸21-43。对于将视为本发明含义内的适体的适体(SEQ ID NO:3-35)或所列举的序列的部分,必须以比任何污染或对照细胞高的亲和力优先与X或Y精细胞上的靶分子结合。
表1中的DNA序列代表位于第9轮适体池中的所选序列。若干序列以多个拷贝存在于适体池中。
表1
SEQ ID NO:3
CTCCTCTGACTGTAACCACGCACCGAATACAGACTGTAAAGACAGAAAGTTCATAAACGTGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:4
CTCCTCTGACTGTAACCACGTACGCTATTATTATTCAATAACGATAAGACTTATAATATAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:5
CTCCTCTGACTGTAACCACGTATAATCATCGGGGTAAGTTGAGGCATTATCTACGCCATAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:6
CTCCTCTGACTGTAACCACGATACCAATACGTAAATTCTATAAGGCATACATATTATACAAGCATAGGTA GTCCAGAAGCC
SEQ ID NO:7
CTCCTCTGACTGTAACCACGTCTGGAACATGATGCAGGTGTCTAACAGTATGAATACTTGGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:8
CTCCTCTGACTGTAACCACGCTGTCGACTACAGATCACTACTTTCGCTAAGGTACCTCAAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:9
CTCCTCTGACTGTAACCACGTATAACGTTTTTCATCTATTTGTTTACTTAATACCTAATAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:10
CTCCTCTGACTGTAACCACGATTGTATTAGTTAACGATACTTATTATTTGTAAGTTATTAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:11
CTCCTCTGACTGTAACCACGAATAACATTACATATAGTTACTTGCATAGGTAGTCCAGAAGCC
SEQ ID NO:12
CTCCTCTGACTGTAACCACGGTAAACATGATAATAATACTTCTCCTTTTGTAATGGATTTGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:13
CTCCTCTGACTGTAACCACGGGTACATATATCCCTATTAATTGACACATATATTTACTTAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:14
CTCCTCTGACTGTAACCACGCATCATTTCGCTAATAGATAAAGTGTTCGTCGTCAGAGCAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:15
CTCCTCTGACTGTAACCACGATACATTTACGTAAATTCTATTAACATTTATATTCTACATGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:16
CTCCTCTGACTGTAACCACGTAATATTAACTTTAAACTCCAATACTGTTATTTATCAAGTGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:17
CTCCTCTGACTGTAACCACGGTATATCGACTTATTACAATGATAAGTATTATTAAACTTAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:18
CTCCTCTGACTGTAACCACGAAACATTACATGGAACTTGATCGTTTAGGATAATAAATGCGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:19
CTCCTCTGACTGTAACCACGTGTACCACTTTCTGTTACGCTAATGGCACACTACACTTAAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:20
CTCCTCTGACTGTAACCACGTAACTTGGAATAATACTTCTTGTAAATTTTGCATAGGTAGTCCAGAAGCC
SEQ ID NO:21
CTCCTCTGACTGTAACCACGTAAATATATGAGTTATTTATGAGTTCATTGAATTCTACTTGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:22
CTCCTCTGACTGTAACCACGGAGTCAGCCTGATCTACCTTCAAAGGCCACTAGGCCTTGAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:23
CTCCTCTGACTGTAACCACGTATACTTACTTTACTAAAACTACTACTAAGTAAGTAAACAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:24
CTCCTCTGACTGTAACCACGTATCACTTACATTTAAATCAATGTATATCAATATTTTAGTGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:25
CTCCTCTGACTGTAACCACGTCAGGATAATGATCATAAGATATCTTTATGTATATACTATGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:26
CTCCTCTGACTGTAACCACGCCAGTTCGTCATCAGATTCCATCTTTAGCTACTTACAACTGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:27
CTCCTCTGACTGTAACCACGCAAAAGTCACTGGCCGTTCGAGTTATATGAGTAGGGAGAGGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:28
CTCCTCTGACTGTAACCACGCCAGACCGGATCCCTGATGTATTTATTTTCGGAAGGTTGAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:29
CTCCTCTGACTGTAACCACGTAATGAGTGACGAAAGTGTCAGATGGAGCCTTCTACCTGTGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:30
CTCCTCTGACTGTAACCACGCGATTAAAACCGGCAGTTATCTCTTAGCAAGCCTGATCCTGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:31
CTCCTCTGACTGTAACCACGGGTTCAATGTAAGGGTTGGTGTGGTTGGACTAGCGCTCAGTGCATAGGTA GTCCAGAAGCC
SEQ ID NO:32
CTCCTCTGACTGTAACCACGGCATATGTGAGCATCGAATAGCTGGCGACGAACCAGATTCGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:33
CTCCTCTGACTGTAACCACGACGACAGTCATCCCTGACTCGGATCTTACATGTCGTTACAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:34
CTCCTCTGACTGTAACCACGTTAAATCTTATAGGATTCTAGTGTACAAATATATAACTTAGCATAGGTAG TCCAGAAGCC
SEQ ID NO:35
CTCCTCTGACTGTAACCACGCAAAAGTCACTGGCCGTTCGAGTTATATGAGTAGGGAGAGGCATAGGTAG TCCAGAAGAT
除非另外定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。本文所提及的所有公开案、专利申请案、专利和其它参考文献全文都以引用的方式并入本文中。本文中使用措词“一”描述本发明的任何方面应解释为指示一种或一种以上。
虽然本发明已就其某些优选实施例加以描述且已出于说明的目的阐述了许多细节,但对所属领域的技术人员来说将显而易见本发明容许其它实施例且在不脱离本发明基本原则的情况下本文中所述的某些细节可作重大改变。
序列表
<110>比奥塞尔恩公司
<120>精细胞分离方法和含有其中所用适体或核酸序列的组合物
<130>BICE-003/01WO
<150>US 60/824,069
<151>2006-08-30
<160>35
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可能是经荧光标记的ALEXA 647
<400>1
ctcctctgac tgtaaccacg 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>可能经生物素标记
<400>2
ggcttctgga ctacctatgc 20
<210>3
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>3
ctcctctgac tgtaaccacg caccgaatac agactgtaaa gacagaaagt tcataaacgt 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>4
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>4
ctcctctgac tgtaaccacg tacgctatta ttattcaata acgataagac ttataatata 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>5
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>5
ctcctctgac tgtaaccacg tataatcatc ggggtaagtt gaggcattat ctacgccata 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>6
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>6
ctcctctgac tgtaaccacg ataccaatac gtaaattcta taaggcatac atattataca 60
agcataggta gtccagaagc c 81
<210>7
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>7
ctcctctgac tgtaaccacg tctggaacat gatgcaggtg tctaacagta tgaatacttg 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>8
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>8
ctcctctgac tgtaaccacg ctgtcgacta cagatcacta ctttcgctaa ggtacctcaa 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>9
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>9
ctcctctgac tgtaaccacg tataacgttt ttcatctatt tgtttactta atacctaata 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>10
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>10
ctcctctgac tgtaaccacg attgtattag ttaacgatac ttattatttg taagttatta 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>11
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>11
ctcctctgac tgtaaccacg aataacatta catatagtta cttgcatagg tagtccagaa 60
gcc 63
<210>12
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>12
ctcctctgac tgtaaccacg gtaaacatga taataatact tctccttttg taatggattt 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>13
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>13
ctcctctgac tgtaaccacg ggtacatata tccctattaa ttgacacata tatttactta 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>14
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>14
ctcctctgac tgtaaccacg catcatttcg ctaatagata aagtgttcgt cgtcagagca 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>15
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>15
ctcctctgac tgtaaccacg atacatttac gtaaattcta ttaacattta tattctacat 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>16
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>16
ctcctctgac tgtaaccacg taatattaac tttaaactcc aatactgtta tttatcaagt 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>17
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>17
ctcctctgac tgtaaccacg gtatatcgac ttattacaat gataagtatt attaaactta 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>18
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>18
ctcctctgac tgtaaccacg aaacattaca tggaacttga tcgtttagga taataaatgc 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>19
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>19
ctcctctgac tgtaaccacg tgtaccactt tctgttacgc taatggcaca ctacacttaa 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>20
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>20
ctcctctgac tgtaaccacg taacttggaa taatacttct tgtaaatttt gcataggtag 60
tccagaagcc 70
<210>21
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>21
ctcctctgac tgtaaccacg taaatatatg agttatttat gagttcattg aattctactt 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>22
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>22
ctcctctgac tgtaaccacg gagtcagcct gatctacctt caaaggccac taggccttga 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>23
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>23
ctcctctgac tgtaaccacg tatacttact ttactaaaac tactactaag taagtaaaca 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>24
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>24
ctcctctgac tgtaaccacg tatcacttac atttaaatca atgtatatca atattttagt 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>25
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>25
ctcctctgac tgtaaccacg tcaggataat gatcataaga tatctttatg tatatactat 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>26
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>26
ctcctctgac tgtaaccacg ccagttcgtc atcagattcc atctttagct acttacaact 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>27
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>27
ctcctctgac tgtaaccacg caaaagtcac tggccgttcg agttatatga gtagggagag 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>28
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>28
ctcctctgac tgtaaccacg ccagaccgga tccctgatgt atttattttc ggaaggttga 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>29
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>29
ctcctctgac tgtaaccacg taatgagtga cgaaagtgtc agatggagcc ttctacctgt 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>30
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>30
ctcctctgac tgtaaccacg cgattaaaac cggcagttat ctcttagcaa gcctgatcct 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>31
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>31
ctcctctgac tgtaaccacg ggttcaatgt aagggttggt gtggttggac tagcgctcag 60
tgcataggta gtccagaagc c 81
<210>32
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>32
ctcctctgac tgtaaccacg gcatatgtga gcatcgaata gctggcgacg aaccagattc 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>33
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>33
ctcctctgac tgtaaccacg acgacagtca tccctgactc ggatcttaca tgtcgttaca 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>34
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>34
ctcctctgac tgtaaccacg ttaaatctta taggattcta gtgtacaaat atataactta 60
gcataggtag tccagaagcc 80
<210>35
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>适体
<400>35
ctcctctgac tgtaaccacg caaaagtcac tggccgttcg agttatatga gtagggagag 60
gcataggtag tccagaagat 80
Claims (28)
1.一种组合物,其包含至少一种选自由以下组成的群组的核酸:
(a)SEQ ID NO:3-35组成的核酸;
(b)(a)的核酸,其中核苷酸1-20的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-35中缺失;
(c)(a)的核酸,其中核苷酸61-80的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-10和12-35中缺失,或核苷酸44-63的至少一部分从SEQ ID NO:11中缺失;
(d)(a)的核酸,其中核苷酸1-20的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-35中缺失,和/或其中核苷酸61-80的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-10或12-35中缺失,或核苷酸44-63的至少一部分从SEQ ID NO:11中缺失;和
(e)(a)的核酸,其中所述DNA包含SEQ ID NO:3-10或12-35的核苷酸21-60,或SEQ ID NO:11的核苷酸21-43。
2.一种分离含有至少一种靶分子的哺乳动物精细胞混合物的方法,其包含:
使所述哺乳动物精细胞与根据权利要求1所述的组合物接触一段足够长的时间以允许所述核酸与所述精细胞结合;
基于至少一种核酸与精细胞上的靶分子结合的能力将所述精细胞分离成两种或两种以上精细胞群体;和
将所述两种或两种以上与所述核酸结合的精细胞群体与所述核酸分离,和回收所述所分离的精细胞。
3.根据权利要求2所述的方法,其中核酸优先结合所述X精细胞且回收主要是X精细胞的群体。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述哺乳动物精细胞是牛精细胞或人类精细胞。
5.根据权利要求2所述的方法,其中至少一种所述精细胞群体包含Y精细胞或X精细胞。
6.根据权利要求2所述的方法,其中至少一种所述精细胞群体包含未结合所述核酸的精细胞。
7.根据权利要求2所述的方法,其中至少一种所述精细胞群体包含结合所述核酸的精细胞。
8.根据权利要求2所述的方法,其中所述组合物包含两种或两种以上不同的核酸。
9.根据权利要求2所述的方法,其中所述核酸与无磁性珠粒或磁性珠粒结合。
10.一种产生至少一种与哺乳动物X精细胞表面上的靶分子结合的核酸的方法,其包含以下步骤:
(i)使不同核酸分子的集合与所述靶分子在有利于至少一种所述核酸分子与所述靶分子之间结合的条件下接触,以形成至少一种包含所述与靶分子结合的至少一种核酸分子的复合物,其中每个所述核酸分子包含至少一段随机核苷酸序列;
(ii)将所述复合物与未结合的核酸分子和未结合的靶分子分离;
(iii)从所述所分离复合物回收结合核酸分子,其中所述结合核酸分子包含至少一种与所述靶分子结合的核酸;
其中步骤(i)、(ii)和(iii)重复1次或1次以上、2次或2次以上、3次或3次以上、4次或4次以上、5次或5次以上、6次或6次以上、7次或7次以上、8次或8次以上以产生对X精细胞优先的核酸;
其中至少一种核酸选自由以下组成的群组:
(a)SEQ ID NO:3-35组成的核酸;
(b)(a)的核酸,其中核苷酸1-20的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-35中缺失;
(c)(a)的核酸,其中核苷酸61-80的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-10和12-35中缺失或核苷酸44-63的至少一部分从SEQ ID NO:11中缺失;
(d)(a)的核酸,其中核苷酸1-20的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-35中缺失和/或其中核苷酸61-80的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-10或12-35中缺失或核苷酸44-63的至少一部分从SEQ ID NO:11中缺失;和
(e)(a)的核酸,其中所述DNA包含SEQ ID NO:3-10或12-35的核苷酸21-60或SEQ ID NO:11的核苷酸21-43;和
(iv)扩增所述所回收的核酸分子以产生其它核酸分子。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述接触步骤包含培育所述分子以形成平衡混合物且其中所述分离步骤包含毛细管电泳。
12.根据权利要求10所述的方法,其中所述靶分子选自由蛋白质、肽、脂质或碳水化合物组成的群组。
13.根据权利要求10所述的方法,其中所述靶分子是小分子。
14.根据权利要求10所述的方法,其中所述靶分子是细胞表面分子。
15.根据权利要求10所述的方法,其中所述靶分子是酶、糖脂、磷脂或糖蛋白。
16.根据权利要求10-15中任一所述的方法,其中所述靶分子是精细胞上所含的靶分子。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述靶分子区分至少一种X精细胞与至少一种Y精细胞。
18.根据权利要求16所述的方法,其中所述精细胞是牛精细胞或人类精细胞。
19.根据权利要求10所述的方法,其中步骤(iii)的所述所回收核酸随后用作步骤(i)中的不同核酸分子的集合。
20.根据权利要求10所述的方法,其进一步包含将所述不同核酸分子的集合和所述靶分子与大体上与模板核酸互补的引物一起培育。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述模板核酸是对应于在多个适体内不变的所述核酸的片段的序列。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述核酸来自DNA文库且所述模板核酸是载体序列。
23.根据权利要求10所述的方法,其中步骤(i)进一步包含阴性选择步骤,继之以阳性选择步骤。
24.根据权利要求10所述的方法,其中纯化所述所回收的核酸。
25.根据权利要求10所述的方法,其中利用流式细胞术定量多个所述所回收的核酸。
26.根据权利要求10所述的方法,其中所述核酸与无磁性珠粒或磁性珠粒结合。
27.一种产生允许分离X精细胞与Y精细胞的核酸的方法,其包含以下步骤:
(i)使X与Y精细胞的混合群体与优先结合所述X精细胞以形成结合核酸-X精细胞复合物的核酸接触;
(ii)将所述X精细胞与所述最初混合精细胞群体分离,留下富含Y的精细胞群体;和
(iii)从所述核酸-X精细胞复合物中释放所述结合X精细胞;和
(iv)回收所述X精细胞;
其中所述核酸包含:
(a)选自由SEQ ID NO:3-35组成的的核酸;
(b)(a)的核酸,其中核苷酸1-20的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-35中缺失;
(c)(a)的核酸,其中核苷酸61-80的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-10和12-35中缺失,或核苷酸44-63的至少一部分从SEQ ID NO:11中缺失;
(d)(a)的核酸,其中核苷酸1-20的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-35中缺失,和/或其中核苷酸61-80的至少一部分从所述SEQ ID NO:3-10或12-35中缺失,或核苷酸44-63的至少一部分从SEQ ID NO:11中缺失;和
(e)(a)的核酸,其中所述DNA包含SEQ ID NO:3-10或12-35的核苷酸21-60,或SEQ ID NO:11的核苷酸21-43。
28.根据权利要求27所述的方法,其中从步骤(ii)中回收所述Y精细胞。
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US9879222B2 (en) | 2007-12-14 | 2018-01-30 | Mofa Group Llc | Gender-specific separation of sperm cells and embryos |
US8440801B2 (en) | 2008-07-14 | 2013-05-14 | The University Of Tokyo | Aptamer against IL-17 and use thereof |
US8703416B2 (en) | 2008-07-17 | 2014-04-22 | Somalogic, Inc. | Method for purification and identification of sperm cells |
WO2010120518A2 (en) * | 2009-04-01 | 2010-10-21 | Biocern, Inc. | Sperm cell separation methods and compositions containing sperm cell targeting ligands for use therein |
GB0910826D0 (en) | 2009-06-23 | 2009-08-05 | Ovasort Ltd | Identification of sex-linked proteins |
WO2012174496A2 (en) * | 2011-06-17 | 2012-12-20 | Somalogic, Inc. | Method for purification and identification of sperm cells |
CN102796730A (zh) * | 2012-07-18 | 2012-11-28 | 海南广陵高科实业有限公司 | 一种从聚丙烯酰胺凝胶中回收核酸分子的方法 |
US10379026B2 (en) | 2012-08-29 | 2019-08-13 | Inguran, Llc | Cell processing using magnetic particles |
ES2914373T3 (es) | 2012-08-29 | 2022-06-10 | Inguran Llc | Eliminación magnética o identificación de células o de estructuras celulares dañadas o comprometidas |
RU2528870C2 (ru) * | 2012-11-06 | 2014-09-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясе | Аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека |
AU2014238740B2 (en) | 2013-03-22 | 2017-04-20 | The University Of Tokyo | Aptamer to IL-17 and use thereof |
WO2014177157A1 (en) * | 2013-05-03 | 2014-11-06 | Motilitycount Aps | Device for analysis of cellular motility |
DE102013218528B3 (de) | 2013-09-16 | 2014-12-24 | ViaMed GmbH | Vorrichtung zur Anreicherung von Spermatozoen |
US11008575B2 (en) * | 2015-07-28 | 2021-05-18 | The University Of North Carolina At Charlotte | DNA aptamers against cancer and uses thereof in delivery of therapy and diagnosis of cancer |
CN110607303A (zh) * | 2019-10-30 | 2019-12-24 | 多能干细胞再生医学科技(广州)有限公司 | 用于分离精子细胞群的核酸适体及方法 |
CN111876367A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-11-03 | 华侨大学 | 一种去除低质精子的方法 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2001988A (en) * | 1930-05-14 | 1935-05-21 | Cash A W Co | Control mechanism |
US4999283A (en) * | 1986-01-10 | 1991-03-12 | University Of Kentucky Research Foundation | Method for x and y spermatozoa separation |
US6001988A (en) * | 1990-06-11 | 1999-12-14 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High affinity nucleic acid ligands to lectins |
US5840482A (en) * | 1990-10-10 | 1998-11-24 | The Regents Of The University Of California | Y chromosome specific nucleic acid probe and method for determining the Y chromosome in situ |
WO1996015131A1 (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-23 | Pfizer Pharmaceuticals Inc. | Macrocyclic lactone compounds and their production process |
NZ313947A (en) * | 1995-08-11 | 1999-05-28 | Univ Guelph | Identification of non-sex and sex specific molecules; immunisation with antibodies |
ATE326228T1 (de) * | 1997-07-01 | 2006-06-15 | Vicam Lp | Verfahren zur geschlechtsbestimmung von säuger- nachkommenschaft |
US6126835A (en) * | 1998-05-15 | 2000-10-03 | Biocrystal Ltd. | Device and method for magnetic separation of biological molecules |
US20040142384A1 (en) * | 2003-01-16 | 2004-07-22 | Cohen Barb Ariel | Magnetic separator |
EP1494028A1 (en) * | 2003-07-03 | 2005-01-05 | Labsoft Diagnostics AG | Immunomagnetic separation of specific target cells |
US20050114915A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-05-26 | Vicam L.P. | Method for sex biasing spermatozoa |
WO2006029258A2 (en) * | 2004-09-07 | 2006-03-16 | Archemix Corp. | Aptamer medicinal chemistry |
WO2006078337A2 (en) * | 2004-11-04 | 2006-07-27 | The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Acting On Behalf Of Arizona State University | Methods to create fluorescent biosensors using aptamers with fluorescent base analogs |
WO2006091717A1 (en) * | 2005-02-24 | 2006-08-31 | Biocern, Inc. | Sperm cell separation methods and compositions |
CA2697960A1 (en) | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Biocern, Inc. | Sperm cell separation methods and compositions containing aptamers or nucleic acid sequences for use therein |
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Jayasena S D.Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodied in diagnostics.《Clinical Chemistry》.1999,第45卷(第9期),1628-1650. * |
Also Published As
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WO2008028081A2 (en) | 2008-03-06 |
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