CN101548016A - 产率相关性状增强的植物及使用来自yabby蛋白家族的共有序列制备其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及分子生物学领域，并且涉及增强植物多种经济学上重要的产率相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节植物中CRC相关(Crabs Claw)多肽编码核酸的表达来增强植物的产率相关性状的方法。本发明还涉及具有调节的CRC相关蛋白质编码核酸表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产率相关性状。本发明还提供了在本发明方法中有用的构建体。

Description

产率相关性状增强的植物及使用来自YABBY蛋白家族的共有序列制备其的方法

发明领域

本发明总体上涉及分子生物学领域，并且涉及增强植物多种经济学上重要的产率相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节植物中CRC相关多肽编码核酸的表达来增强在非生物胁迫条件下生长的植物的产率相关性状的方法。

背景技术

不断增长的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地助长了提高农业效率研究之势。传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，此类选育技术有若干缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常含有异质的遗传组分，当这些异质的遗传组分从亲本植物传递时不一定总是产生期望的性状。分子生物学的进展已经使人类能够修饰动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般为DNA或RNA的形式)以及随后将遗传物质引入植物。这类技术有能力输送具多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。

具有特别经济意义的一种性状是增加的产率。产率通常定义为作物可测量经济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产率直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构造(例如，分枝的数量)、种子产量、叶子衰老等等。根的发育、营养吸收、胁迫耐受性和早期活力也是决定产率的重要因素。因此优化上述因素也可以促进作物产率的增加。

种子产率是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的枝条和根的来源)和胚乳(发芽和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存性高分子，以充盈谷粒。

对于许多作物而言，另一重要的性状是早期活力(early vigour)。改良早期活力是温带和热带稻类栽培种的现代稻类育种项目的重要目标。长根对于水栽稻的恰当土壤锚固至关重要。在直接向涝地里播种稻米的情况下，以及在植物必须迅速穿过水出苗的情况下，较长的枝条与活力有关。在进行条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于优良的出苗至关重要。改造植物早期活力的能力在农业上将具有极其重要的意义。例如，一直以来早期活力弱限制了在欧洲大西洋地区引入基于玉米带种质的玉米(玉蜀黍，Zea maysL.)杂交种。

另一重要的性状在于改良的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是全世界作物损失的主要原因，使大多数主要作物植物平均产率降低50％以上(Wang等，Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可由干旱、盐度、极端温度、化学毒性及氧化胁迫引起。提高非生物胁迫植物耐受性的能力将对全世界农场主带来重大的经济利益，并将使人们能够在不利条件下、在否则将不可能进行作物栽培的地区进行作物栽培。

因此通过优化上述因素之一可以增加作物产率。

视最终用途而定，可能更优先修饰某些产率性状。例如，对于诸如饲料或木材生产或者生物燃料资源等应用，可能期望植物营养部分的增长，而对于诸如面粉、淀粉或油料生产等应用，可能特别期望种子参数的增长。即便是在种子参数之中，也可能更优先其中的一些，这取决于应用。多种机制可促成增加的种子产率，无论形式是增加的种子大小、还是增加的种子数量。

增加植物产率(种子产率和/或生物量)的一种方法可以是通过修饰植物的内在生长机制，如细胞周期或者参与植物生长或防御机制的多种信号传递路径。

现已发现，通过调节植物POI(目的蛋白质，Protein Of Interest)编码核酸在植物中的表达，可以改良植物的多种生长特性。

发明背景

被子植物的叶子通常呈近轴-远轴(背腹性)不对称。侧生器官(lateralorgans)的近轴-远轴极性的建立涉及原基内在因子及其与其源自的顶端分生组织的相互作用。这些因子中有YABBY基因家族成员。YABBY蛋白据报道促进侧生器官的远轴细胞命运。CRABS CLAW(CRC)和INNER NOOUTER(INO)为两种YABBY蛋白，二者在繁殖器官中表达，并促进蜜腺发育和心皮融合(CRC)或者参与胚珠发育(INO)。其他YABBY基因在营养及繁殖器官中表达，并参与叶子(sensu lato，包括子叶、萼片和花瓣)发育。YABBY蛋白呈现出具有C₂C₂-锌指结构域和螺旋-环-螺旋YABBY结构域的典型结构。多种YABBY基因的表达模式表明至少一些功能是重叠的。

植物YABBY基因据报道还对胁迫、特别是冷冻胁迫做出应答(WO200216655)，但是未提供数据证明YABBY基因的异位表达导致胁迫抗性增加。此外还推测YABBY基因可用于修饰植物的木质素组成、木材组成或纤维组成(WO2005001050)。

发明概述

现已令人惊讶地发现，调节植物中CRC相关多肽编码核酸的表达，产生相对于对照植物具有增强的非生物胁迫耐受性的植物。适用于增强植物胁迫耐受性的具体CRC相关多肽类型在下文详细描述。

本发明提供了增强植物相对于对照植物的非生物胁迫耐受性的方法，包括调节植物中CRC相关多肽编码核酸的表达。

定义

多肽/蛋白质

术语“多肽”和“蛋白质”在文中互换使用，是指通过肽键连接起来的、任意长度的氨基酸多聚体。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在文中互换使用，是指任何长度的无支链形式的多聚核苷酸，所述核苷酸或者为核糖核苷酸或者为脱氧核糖核苷酸或者为两者的组合。

对照植物

选择合适的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物通常与待评估植物为相同的植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子(nullizygote)。无效合子是由于分离而丢掉转基因的个体。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。

同源物

蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有与其源自的未修饰蛋白质相似的生物活性和功能活性。

缺失是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。

插入是指在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。一般氨基酸序列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级约1到10个残基。N-或C-末端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。

取代是指蛋白质中的氨基酸用具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向性)的其他氨基酸替换。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽上的功能性限制而定也可以发生成簇取代；取代通常在大约1到10个氨基酸残基数量级。氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守取代表在本领域众所周知(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编辑)和下表1)。

表1：保守氨基酸取代的实例

 

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu；Val

可通过本领域众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作容易地进行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法是本领域众所周知的。例如，本领域的技术人员熟知在DNA预定位置进行取代突变的技术，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其他定点诱变方案。

衍生物

“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，与天然蛋白质的氨基酸序列如目的蛋白质相比，其可以包括用非天然产生的氨基酸残基进行的氨基酸取代、或者添加非天然产生的氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，与天然多肽的氨基酸序列相比，其可以包括天然改变的(糖基化、酰基化、异戊二烯化、磷酸化、豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改变的氨基酸残基。衍生物与其源自的氨基酸序列相比，还可以包括一个或多个非氨基酸替代或添加，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其他配体，如与之结合有利于衍生物检测的报告分子，以及相对于天然蛋白质的氨基酸序列而言非天然产生的氨基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然产生形式的蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物(关于标签肽的综述，请参见Terpe，Appl.Microbiol.Biotech nol.60，523-533，2003)。

直系同源物/旁系同源物

直系同源物和旁系同源物涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内的基因，其源自于祖先基因的复制；而直系同源物为来自不同生物体的基因，其起源于物种形成，并且也源自于共同的祖先基因。

结构域

术语“结构域”是指在进化相关蛋白质序列的比对中，在特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其他位置上的氨基酸可能因同源物不同而改变，但是在特定位置上高度保守的氨基酸则意味着对于蛋白质结构、稳定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸。“结构域”因其在所比对的家族蛋白质同源物序列中高度保守而得以鉴定，能够用作为标识符以确定任何所讨论的多肽是否属于先前鉴定到的多肽家族。

基序/共有序列/标签序列

术语“基序”或“共有序列”或“标签序列”(signature)是指进化相关蛋白质序列中短的保守区域。基序常常是高度保守的结构域部分，但也可能仅仅包括部分结构域，或者位于保守结构域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定义的结构域之外的话)。

杂交

本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的两核酸都处在溶液中。杂交过程也能够这样进行，即互补核酸之一固定于基质上，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也能够这样进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者通过例如照相平板印刷术固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。

术语“严格性”是指发生杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，对于特定序列而言，在确定的离子强度和pH值下，低严格条件选择为比热解链温度(T_m)低大约30℃。中等严格条件为温度比T_m低20℃，而高严格条件为温度比T_m低10℃。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。不过，由于遗传密码的简并性，核酸可以在序列上有偏差而依然编码基本上相同的多肽。因此有时可能需要中等严格杂交条件来鉴定这样的核酸分子。

T_m是在确定的离子强度和pH值下，50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。T_m取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于T_m值大约16℃到32℃获得最大杂交速率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂交体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用可见(对于更高的浓度，此效应可以忽略不计)。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50％甲酰胺能够使杂交在30到45℃完成，尽管这将降低杂交速率。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使Tm值下降约1℃。依赖于杂交体类型，T_m值可以利用下列公式计算：

1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

Tm＝81.5℃+16.6×log₁₀[Na⁺]^a+0.41×％[G/C^b]-500×[L^c]^-1-0.61×％甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：

Tm＝79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^b)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

3)寡DNA或寡RNA^d杂交体：

<20个核苷酸：Tm＝2(l_n)

20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(l_n)

^a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内精确。

^b仅对于在30％到75％范围内的％GC精确。

^cL＝双链体的碱基对长度。

^d寡，寡核苷酸；l_n，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

非特异性结合可以通过许多已知技术中的任一来控制，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。对于非同源探针，可以通过改变如下条件之一来进行系列杂交：(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃降至42℃)，或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％降至0％)。熟练技术人员知晓可以在杂交过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。

除杂交条件外，杂交特异性通常还是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性的条件下进行。阳性杂交给出至少为背景两倍的信号。一般按如上来设置适用于核酸杂交试验或基因扩增检测操作的适宜严格条件。也可以选择更高或更低的严格条件。熟练技术人员知晓可以在洗涤过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。

例如，长于50个核苷酸的DNA杂交体的典型的高严格杂交条件包括在1×SSC中于65℃杂交或者在1×SSC和50％甲酰胺中于42℃杂交，接着在0.3×SSC中于65℃洗涤。长于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在4×SSC中于50℃杂交或者在6×SSC和50％甲酰胺中于40℃杂交，接着在2×SSC中于50℃洗涤。杂交体的长度是针对杂交核酸预期的长度。当已知序列的核酸进行杂交时，杂交体的长度可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域进行确定。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以另外地包括5×Denhardt’s试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml片段化的变性鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。

为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)的《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989及年度更新资料)。

剪接变体

本文所用的术语“剪接变体”包括这样的核酸序列变体，其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换、置换或添加，或者其中内含子已被缩短或增长。这样的变体基本上保持了蛋白质的生物活性；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性区段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。预测和分离这类剪接变体的方法是本领域众所周知的(参见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics 6：25)。

等位基因变体

等位基因或等位基因变体为处于相同的染色体位置上的给定基因的可选形式。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多数生物体的天然存在的多态性品系中形成最大的一组序列变体。

基因改组/定向进化

基因改组或定向进化为重复DNA改组，继之适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰生物活性的蛋白质的核酸变体或其部分(Castle等(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

调控元件/控制序列/启动子

术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中均可互换使用，按广义来理解，指能够实现与之相连的序列表达的调控核酸序列。术语“启动子”通常是指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，其参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合，由此指导有效连接的核酸进行转录。上述术语包括源自经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括精确转录起始所必需的TATA盒，以及具有或没有CCAAT盒序列)，以及另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，它们通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。所述术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下其可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达。

“植物启动子”包含能够介导编码序列区段在植物细胞中表达的调控元件。从而，植物启动子无需为植物来源的，而是可以来源于病毒或微生物，例如，来源于攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以来源于植物细胞，例如，来源于待被欲在本发明方法中表达的以及本文所述的核酸序列转化的植物。这对于其他“植物”调控信号同样适用，例如“植物”终止子的情况。位于可用于本发明方法的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，而不会干扰启动子、开放读框(ORF)或者3’调控区如终止子或远离ORF的其他3’调控区的功能或活性。此外还有可能通过修饰启动子的序列而增强其活性，或者将其完全替换为活性更强的启动子、甚至是来自异源生物体的启动子。为在植物中表达，核酸分子必须如上文所述的那样，有效连接于或者包含适宜的启动子，其中所述启动子将在正确的时间点以所需的空间表达模式表达所述基因。

为鉴定功能上等同的启动子，可以例如通过将启动子与报告基因有效连接、测定所述报告基因在植物多种组织中的表达水平和模式，来分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。众所周知的适宜报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性可以确定启动子活性。然后可以将该启动子强度和/或表达模式与参照启动子(如本发明方法中所用的启动子)相比较。可选地，可以利用本领域公知的方法，如Northern印迹(RNA分析)结合放射自显影图的光密度测量分析、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996 Genome Methods 6：986-994)，通过定量mRNA水平或者将本发明方法所用核酸的mRNA水平与持家基因如18S rRNA的mRNA水平进行比较，来测定启动子强度。通常，“弱启动子”旨在表示驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”旨在表示每个细胞大约1/10,000个转录物到大约1/100,000个转录物、到大约1/500，0000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者说以每个细胞大约1/10个转录物到大约1/100个转录物、到大约1/1000个转录物的水平表达。

有效连接

本文所用的术语“有效连接”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，从而启动子序列能够起始目的基因的转录。

组成型启动子

“组成型启动子”是指在生长和发育的大多数但不必是所有阶段，并且在大多数环境条件下在至少一种细胞、组织或器官中转录激活的启动子。下表2给出了组成型启动子的实例。

表2：组成型启动子的实例

 

基因来源	参考文献
		肌动蛋白	McElroy等，Plant Cell，2：163-171，1990
HMGP	WO 2004/070039
		CAMV 35S	Odell等，Nature，313：810-812，1985
CaMV 19S	Nilsson等，Physiol.Plant.100：456-462，1997
		GOS2	de Pater等，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992，WO 2004/065596
泛素	Christensen等，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992
		稻亲环蛋白	Buchholz等，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994
玉米H3组蛋白	Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
		苜蓿H3组蛋白	Wu等，Plant Mol.Biol.11：641-649，1988
肌动蛋白2	An等，PlantJ.10(1)；107-121，1996
		34S FMV	Sanger等，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443
核酮糖二磷酸羧化/加氧酶小亚基	US 4,962,028
		OCS	Leisner(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(5)：2553
SAD1	Jain等，Crop Science，39(6)，1999：1696
		SAD2	Jain等，Crop Science，39(6)，1999：1696
Nos	Shaw等(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：7831-7846
		V-ATPase	WO 01/14572
Super启动子	WO 95/14098
		G-盒蛋白质	WO 94/12015

遍在启动子

遍在启动子基本上在生物体的所有组织或细胞中都有活性。

发育调控型启动子

发育调控型启动子在某些发育阶段或在经历发育改变的植物部分中有活性。

诱导型启动子

诱导型启动子将响应于化学(有关综述请参见Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境或物理刺激而具有诱导的或增加的转录起始；或者可以是“胁迫诱导型”，即在植物接触各种胁迫条件时激活；或者是“病原体诱导型”，即在植物接触各种病原体时激活。

器官特异性/组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性的启动子是能够在某些器官或组织，如在叶、根、种子等组织中优先起始转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是主要在植物根中转录激活的启动子，基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。能够仅在某些细胞中起始转录的启动子在文中称为“细胞特异性”启动子。

种子特异性启动子主要在种子组织中，但不必仅在种子组织中(渗漏表达的情况)转录激活。种子特异性启动可以在种子发育和/或发芽期间激活。

如文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中转录激活的启动子，基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允许有在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。

组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中转录激活，基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允许有在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。

终止子

术语“终止子”包括如下控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，发送对初级转录物进行3’加工和多聚腺苷酸化以及终止转录的信号。终止子可以源自天然基因、多种其他植物基因、或T-DNA。例如，待加入的终止子可以源自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其它植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

调节

与表达或基因表达相关联时，术语“调节”是指与对照植物相比，所述基因表达的表达水平被改变的过程，所述表达水平可以增加或降低。原始未调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或随后进行翻译的mRNA的任何类型的表达。术语“调节活性”应理解为对本发明核酸序列或编码蛋白质的表达的如下任何改变，所述改变导致植物产率增加和/或生长增加。

表达

术语“表达”或“基因表达”是指一种或多种特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别指一种或多种基因或遗传构建体转录为结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，后者随后翻译或不翻译为蛋白质。该过程包括DNA的转录、以及所产生mRNA产物的加工。

增加的表达/过表达

如本文所用的术语“增加的表达”或“过表达”表示超出原始野生型表达水平的任何形式的表达。

增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的记载，这包括，例如通过适当的启动子、转录增强子或翻译增强子的使用而驱动的过表达。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入适当位置(一般是非异源形式多核苷酸的上游)，从而上调目的多肽编码核酸的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代，体内地改变内源启动子(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或者将分离的启动子引入植物细胞中使其相对于本发明基因具有恰当的方向和距离，从而控制基因的表达。

如果期望多肽表达，通常期望在多核苷酸编码区的3’末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码区的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev.1：1183-1200)。通常这类内含子被放置在转录单位5’末端附近时，其增强基因表达的作用最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6以及Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见TheMaize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N.Y.(1994)。

内源基因

本文述及的“内源”基因不仅指见于植物之中的天然形式的所讨论基因(即未经人为干预)，而且指随后(重新)引入到植物中的分离形式的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这样的转基因的转基因植物可以发生转基因表达的大幅下降和/或内源基因表达的大幅下降。分离的基因可以从生物体中分离，或者可以是人工例如通过化学合成制备的。

降低的表达

本文述及的“降低的表达”或者表达“下降或基本上消除”应理解为表示内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物降低。所述下降或基本上消除按照递增的优选顺序是与对照植物相比，下降至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多。降低表达的方法对于本领域技术人员而言是公知的。

可选择标记(基因)/报告基因

“可选择标记”、“可选择标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因，该基因在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择被本发明的核酸构建体转染或转化了的细胞。这些标记基因通过各种不同的原理使得能够鉴定核酸分子的成功转移。适宜的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可视选择。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予例如对博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供抗

抗性的bar；提供抗草甘膦抗性的aroA或gox，或赋予例如对咪唑啉酮、膦丝菌素或磺酰脲抗性的基因)、或者提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或导致木糖利用的木糖异构酶，或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性)。可视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS，或β-半乳糖苷酶及其有色底物，例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这里仅仅是列出了一小部分可用的标记。技术人员对这类标记极为熟悉。优选根据不同生物体和选择方法来使用不同的标记。

已知，取决于所用的表达载体和所用的转染技术，当核酸向植物细胞进行稳定或瞬时整合时，仅少数细胞能摄入外来DNA，并将其整合入基因组(如果期望的话)。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记能够例如在突变体中使用，在所述突变体中所述基因例如通过常规方法缺失而没有功能。此外，编码可选择标记的核酸分子与编码本发明多肽或用于本发明方法的序列可以在同一个载体中引入宿主细胞，或者在分开的载体中引入。已由所引入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。

由于一旦成功引入核酸后，将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明引入核酸的方法有利地采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二个携带标记基因。很大比例的转化体将接收或者对于植物而言(高达40％或以上的转化体)含有两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的一部分，即被T-DNA侧翼包围的序列，其通常是表达盒。随后可通过杂交(cross)从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合进转座子的标记基因与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10％)，一旦成功进行了转化，转座子将跳离宿主细胞基因组并丢失。在另一些情况下，转座子跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交消除标记基因。研发了可以或便于检测此类事件的微生物学技术。另一有利的方法有赖于称为重组系统的方法，其优势在于可以免除杂交消除步骤。最著名的这类系统称为Cre/lox系统。Crel为重组酶，且切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦成功进行了转化，将因Crel重组酶的表达而得以切除。其他重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.CellBiol.，149，2000：553-566)。根据本发明的核酸序列可以位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。

转基因的/转基因/重组

出于本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”当与例如，核酸序列，含有所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体，或用根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物体相关时，是指所有这些构建体通过重组方法产生，其中：

(a)编码可用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或

(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)(a)和(b)

不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，该修饰可以为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境应理解为指在起源植物中的或存在于基因组文库之中的天然基因组或染色体座位。在基因组文库的情况下，优选保持核酸序列的天然遗传环境，至少是部分地保持。该环境至少位于核酸序列一侧，序列长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当天然存在的表达盒——例如编码可用于本发明方法的多肽的相应核酸序列与该核酸序列的天然启动子之间天然存在着的组合——经非天然的合成(“人工”)方法如诱变处理而被修饰时，此表达盒成为转基因表达盒。例如，合适的方法描述在US 5,565,350或WO 00/15815中，

因此，如上文所述，为了本发明目的，转基因植物应理解为表示：在所述植物的基因组中，本发明方法中所用的核酸不在其天然基因座上，该核酸可以为同源或异源表达。不过，正如所提到的那样，转基因也表示：当在植物基因组中，根据本发明的核酸或本发明方法中所用的核酸位于其天然位置上时，所述序列已相对于天然序列被修饰，和/或该天然序列的调控序列已被修饰。转基因优选指：根据本发明的核酸在基因组中于非天然的座位上表达，即同源表达，或者优选发生核酸的异源表达。优选的转基因植物在文中述及。

转化

本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。可以使用本发明的遗传构建体转化能够通过器官发生或者胚胎发生随后进行克隆繁殖的植物组织，并从其再生整个植物。具体选择的组织将因可得的和最适于待转化的具体物种的克隆繁殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可将多核苷酸瞬时或稳定地导入宿主细胞，其可保持非整合状态例如作为质粒。可选择地，可将其整合入宿主基因组。然后以本领域技术人员已知的方法将所得的转化的植物细胞用于再生转化的植物。

外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，可使用几种转化方法中的任一方法将目的基因导入适宜的祖先细胞。可以利用转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括脂质体的使用、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、DNA至植物的直接注射、基因枪轰击(particle gun bombardment)、使用病毒或花粉的转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等人(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)、原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等人(1985)Bio/Technol3，1099-1102)、至植物材料内的显微注射(Crossway A等人，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的微粒轰击(Klein TM等人，(1987)Nature 327：70)；使用(非整合型)病毒的感染等。优选通过农杆菌介导的转化产生转基因植物，包括转基因作物植物。一种有利的转化法是植物原位(in planta)转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，证明使转化了的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基尤为有利。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。农杆菌介导的稻转化方法包括众所周知的稻转化方法，例如在任一如下文献中描述的方法：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)：271-282，1994)，其公开的内容在此并入本文作为参考就如同陈述了其全部内容那样。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1)：13-22，2002)中所述，其公开的内容全部地并入本文作为参考。作为举例说明，所述方法还由B.Jenes等，Techniques for GeneTransfer，在Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，例如用作模式植物的植物，像拟南芥(Arabidopsis thaliana，其在本发明范围内不视为作物植物)；或者作物植物，例如作为举例的烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中浸没擦伤的叶子或切碎的叶子，然后在合适的培养基中培养之。通过根癌农杆菌的植物转化例如已由

和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877描述，或者尤其是可从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants，卷1，En gineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页获知。

除了转化体细胞(其随后必须再生为完整植株)以外，还可以转化植物分生组织的细胞，特别是可以发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，可以用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育的植物收获种子，其中一定比例经转化因而是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet208：274-289；Feldmann K(1992).在C Koncz，N-H Chua和J Shell编辑Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。可选的方法基于花序的反复去除以及莲座叶丛中心切割部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，一种特别有效的方法是真空渗入法，及其改良方法如“花器浸蘸法”(floral dip)。对于拟南芥的真空渗入，用农杆菌悬液在减压下处理完整植株[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而对于“花器浸蘸法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998).The Plant J.16，735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中为母系遗传，从而降低或消除了转基因通过花粉传播的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中系统性展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体基因组中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述由Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)Progress towardscommercialization of plastid transformation technology.Trends Biotechnol.21，20-28给出。最近报道了形式为不含标记的质体转化体的其他生物技术方法，所述转化体可以利用瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。

T-DNA激活标签

T-DNA激活标签(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括将通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb处，从而在构型上使启动子能够指导靶向基因的表达。通常天然启动子对靶向基因表达的调控被破坏，基因由新引入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。可以例如，通过农杆菌感染将此T-DNA随机插入植物基因组中，并导致插入T-DNA附近的基因的表达被修饰。得到的转基因植物将由于紧靠引入的启动子的基因的修饰表达而表现出显性表型。

TILLING

术语“TILLING”为“靶向诱导的基因组局部损伤”(Targeted InducedLocal Lesions In Genomes)的缩写，是一种用于产生和/或鉴定编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质的核酸的诱变技术。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以在强度、位置或时间(例如，如果突变影响启动子的话)上呈现出修饰的表达。这些突变变体可以比其天然形式基因呈现更高的活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING一般遵循的步骤有：(a)EMS诱变(Redei GP和KonczC，(1992)In Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，SchellJ编辑，新加坡，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)InMeyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，第137-172页；LightnerJ和Caspar T，(1998)InJ Martinez-Zapater，J Salinas编辑，Methods on Molecular Biology，82卷Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和合并(p ooling)；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以使异源双链体能够形成；(e)DHPLC，其中合并物中异源双链体的存在在色谱图中检测为额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。用于TILLING的方法在本领域内是众所周知的(McCallum等人，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；由Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50进行综述)。

同源重组

同源重组允许向基因组中的指定选择位置引入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规使用的标准技术，其用于低等生物体如酵母或苔藓剑叶藓属(physcomitrella)。在植物中进行同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBO J.9(10)：3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotechnol 15(2)：132-8)，而且也存在着不考虑靶生物体的一般通用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。

产率

术语“产率”通常表示具有经济价值的可测量产出，其一般是与特定作物、面积和/或时期相关的。各植物部分基于其数量、大小和/或重量对产率直接做出贡献，或者说真正的产率是每平方米作物的年产率，用总产量(包括收获的产量和估定的产量)除以种植的平方米来确定。术语植物的“产率”可能与该植物的营养性生物量(根和/或枝条的生物量)、繁殖器官、和/或繁殖体(如种子)相关。

早期活力

“早期活力”是指活跃健康且很好均衡的生长，特别是在植物生长的早期阶段，其可以由植物的适度(fitness)的增强引起，例如，由植物更好地适应其环境(即优化能源资源的利用，并在枝条和根之间进行分配)引起。具有早期活力的植物也显示出增加的幼苗存活和更佳的作物齐苗(establisment)，这往往产生高度均一的田地(作物以齐整的方式生长，即大多数植物基本上同时达到发育的各阶段)，以及更优更高的产率。因此，早期活力可以通过测量多种因子来确定，如千粒重、萌发率、出苗率、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和枝条生物量，等等。

增加/提高/增强

术语“增加”、“提高”或“增强”可互换，且在本发明意义上表示与文中所定义的对照植物相比，产率和/或生长多出至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％或40％。

种子产率

增加的种子产率可表现为如下一个或多个方面：a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以是以单粒种子和/或每棵植株和/或每平方米为基础的种子重量增加；b)每棵植株的花数的增加；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表达为饱满种子数与种子总数的比率)的增加；e)增加的收获指数，其表达为可收获部分如种子的产率与总生物量的比率；f)增加的千粒重(TKW)，这通过计数饱满种子数和它们的总重量外推得到。TKW增加可来自于种子大小和/或种子重量的增加，并且也可来自胚和/或胚乳大小的增加。

种子产率的增加也可表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产率的增加自身也可表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产率也可以导致改变的构造，或可以作为改变的构造的结果而发生。

绿度指数(greenness index)

如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿色值相对于红色值(在用于编码颜色的RGB模型中)之比。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、在营养利用度下降的生长条件下，测量开花前末次成像时的植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，测量干旱后首次成像时的植物绿度指数。

植物

本文所用术语“植物”涵盖整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一种都包含目的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都包含目的基因/核酸。

尤其可用于本发明方法的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括选自如下植物的饲料或豆科牧草、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍茎剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、滨草(Ammophilaarenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpusspp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avenafatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、簕竹属物种(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(如欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝型油菜(Brassica rapa ssp.)[芸苔、油菜籽油菜、芜菁])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、苔草(Carex elata)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Caryaspp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、爪哇木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomumspp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可拉属(Colaspp.)、黄麻属物种(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynaraspp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(如非洲油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、子(Eleusine coracana)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)(如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthusspp.)(如向日葵(Helianthus annus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、地杨梅(Luzulasylvatica)、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(如番茄(Lycopersiconesculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme)、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、西印度樱桃(Malpighiaemarginatu)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryzaspp.)(如稻(Oryza sativa)，阔叶稻(Oryza latifolia))、黍糜(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、香芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmitas australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poaspp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanumspp.)(如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番柿(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticum spp.)(如小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆锥小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、面包小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolumminus)、旱金莲(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。

发明详述

现已令人惊讶地发现，调节植物中CRC相关多肽编码核酸的表达，可以使这些植物在非生物胁迫条件下生长时相对于对照植物具有增强的产率相关性状。根据第一种实施方案，本发明提供了增强在非生物胁迫条件下生长的植物相对于对照植物的产率相关性状的方法，包括调节植物中CRC相关多肽编码核酸的表达。如本文所用的术语“非生物胁迫”不包括冷胁迫。

调节(优选增加)CRC相关多肽编码核酸表达的优选方法是在植物中引入和表达CRC相关多肽编码核酸。

下文述及的任何“可用于本发明方法的蛋白质”应理解为表示如本文所定义的CRC相关多肽。下文述及的任何“可用于本发明方法的核酸”应理解为表示能够编码这样的CRC相关多肽的核酸。待引入植物(从而可用于实施本发明方法)的核酸是编码现在将要描述的蛋白质类型的任何核酸，下文也称为“CRC相关核酸”或“CRC相关基因”。

如本文定义的术语“CRC相关”多肽指任何这样的氨基酸序列，其从N-末端到C-末端包含：Cys2Cys2-锌指结构域、转录激活结构域和YABBY(螺旋-环-螺旋)结构域。转录激活结构域参与DNA结合，并且优选富含Ser和Pro残基。Bowman和Smyth(Development 126，2387-2396，1999)所定义的YABBY结构域类似于HMG蛋白中的螺旋-环-螺旋结构域。SMART中定义的YABBY结构域(在InterPro中的等同物为：IPR006780，而在Pfam中为：PF04690)范围更广，且涵盖上述锌指结构域、Ser和Pro富含区和螺旋-环-螺旋结构域。如本文所定义的“YABBY结构域”是指SMART/InterPro/Pfam数据库中定义的YABBY结构域。

优选Cys2Cys2-锌指结构域包含如下基序之一或两者兼而有之：

(E/G/D)(Q/R/H)(I/L)(C/G/Y)(H/Y/C)V(Q/R)C(G/S/N/T)(F/I/Y)(C/R)(T/A/D/Q/N/S)T(I/V/L)L(L/A/S)V(S/N/G)(V/I)P(基序1，SEQ ID NO：56)；

(V/A/T)V(T/A/P)V(R/Q/K)CG(H/C)C(T/G/S/N)(基序2，SEQ ID NO：57)。

优选基序1具有序列：

(E/G/D)(Q/R/H)(I/L)(C/G/Y)(H/Y/C)V(Q/R)C(G/S/N/T)(F/I/Y)(C/R)(T/A/D/N/S)T(I/V/L)L(L/A/S)V(S/G)(V/I)P(SEQ ID NO：45)；更优选基序1具有序列：

(E/D)HL(C/Y)YVRC(S/N/T)(F/I/Y)(C/R)(N/S)T(I/V/L)L(A/S)VG(V/I)P；

而基序2优选具有序列：(V/A/T)V(T/A/P)V(R/Q/K)CGHC(T/G/S/N)(SEQ ID NO：46)；更优选基序2的序列为TVTVKCGHC(G/S/N)。

最优选基序1和2分别具有序列：

EHLYYVRCSICNTILAVGIP和TVTVKCGHCG。

此外优选Cys2Cys2-锌指结构域序列还包含如下基序之一：

LLVSV(基序3，SEQ ID NO：47)，

(K/D/E)TVTV(基序4，SEQ ID NO：58)，优选基序4为(D/E)TVTV(SEQ ID NO：48)。

优选螺旋-环-螺旋结构域包含基序5至7中的一个或多个：

(K/R)PPE(K/R)(R/K)(Q/H)R(A/T/V/L)PSAYN(基序5，SEQ ID NO：59)，

(K/R)(E/K/D)EI(R/K/Q)R(L/I)(K/E)(A/I/S/T)(Q/E/M/S/A/G)(N/Y/E/K)P(基序6，SEQ ID NO：50)，

H(K/R)(E/Q)AFS(L/A/T/S/M)AAKNWA(H/K/R)(基序7，SEQ ID NO：51)。

优选基序5具有序列KPPE(K/R)(R/K)(Q/H)R(A/T/L)PSAYN(SEQIDNO：49)，更优选基序5具有序列KPPEKK(Q/H)RLPSAYN，

基序6具有序列(K/R)(E/D)EI(K/Q)RIK(A/S/T)(E/A/G)(N/K)P，而

基序7具有序列HREAFS(A/T/S/M)AAKNWA(K/R)。

最优选基序5、6和7具有序列：

KPPEKKQRLPSAYN(基序5)，

RDEIQRIKSANP(基序6)，

HREAFSAAAKNWAK(基序7)。

按照递增的优选顺序，“CRC相关”多肽序列包含1、2、3、4、5、6或所有7个上述基序。

可选地，CRC相关蛋白质按照递增的优选顺序与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的总体序列同一性，前提是所述蛋白质包含一个或多个上文所列的保守基序。总体序列同一性利用全局比对算法如GAP程序(GCGWisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法来确定，优选采用默认参数。当仅考虑保守结构域或基序(如基序1至7)时，此时的序列同一性与总体序列同一性相比通常要更高。

可用于本发明方法的蛋白质及其编码核酸的实例在下文实施例1表A中给出。优选CRC相关蛋白质具有这样的氨基酸序列，当利用之根据Lee等(Development 132，5021-5032，2005)构建CRC相关系统发生树时，其倾向于与Lee等(2005)所定义的CRC-相关或INO-相关蛋白质群而非任何其他蛋白质群聚类。

术语“结构域”和“基序”在本文“定义”部分进行了定义。存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.(In)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology)Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编辑，53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或者Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002)。进行蛋白质序列芯片(in silico)分析的一组工具可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)(Gasteiger等ExPASy：the proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis.Nucleic Acids Res 31：3784-3788(2003))。也可以利用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。

为比较而进行序列比对的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48：443-453)来寻找可以使匹配数最大化且空位数最小化的两序列间的全局比对(即跨越全序列)。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分比，并对两序列之间的相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的成对比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软件包(Campanella等BMC Bioinformatics.2003年7月10日4：29.MatGAT：an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)的方法之一，也可以确定全局相似性和同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定的结构域。可以利用上述程序采用默认参数针对完整核酸或氨基酸序列或者针对选择的结构域或保守基序来确定序列同一性值。

此外，CRC相关蛋白质(至少其天然形式)推定为转录因子。本领域公知用于测定转录因子生物活性的方法，实施例6提供了更多细节。另外，CRC相关蛋白质一般在花相关组织而非营养组织中表达，这与包含YABBY结构域的其他蛋白质不同。

本发明以SEQ ID NO：1所示的核酸序列转化植物来进行举例说明，其编码多肽序列SEQ ID NO：2。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的任何POI编码核酸或CRC相关多肽来实施。

CRC相关多肽编码核酸的实例在本文实施例1表A中给出。这样的核酸可用于实施本发明的方法。实施例1表A中给出的氨基酸序列为SEQID NO：2所示CRC相关多肽的直系同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直系同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。可以通过进行所谓的交互BLAST搜索容易地找到更多直系同源物和旁系同源物。通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例1表A中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的一次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)(在查询序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的情况下，二次BLAST将会针对拟南芥序列)。然后比较一次和二次BLAST的结果。如果一次BLAST中分值靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中事件之列，则找到了旁系同源物；如果一次BLAST中分值靠前的命中事件不来自查询序列源自的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列处于最高命中事件之列，则找到了直系同源物。

分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助相关基因的聚类可视化，和鉴定直系同源物和旁系同源物。

核酸变体也可用于实施本发明的方法。这类核酸变体的实例包括编码实施例1表A中所示任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，其中“同源物”和“衍生物”如本文所定义。同样可用于本发明方法的有编码实施例1表A所示任一氨基酸序列的直系同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。可用于本发明方法的同源物和衍生物与其源自的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物活性和功能活性。

可用于实施本发明方法的其他核酸变体包括CRC相关多肽编码核酸的部分、与CRC相关多肽编码核酸杂交的核酸、CRC相关多肽编码核酸的剪接变体、CRC相关多肽编码核酸的等位基因变体，以及通过基因改组获得的CRC相关多肽编码核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位基因变体和基因改组如本文所述。

CRC相关多肽编码核酸无需是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了增强植物产率相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A所示任一核酸序列的部分、或者编码实施例1表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。

例如，可以通过对核酸进行一个或多个缺失来制备所述核酸的“部分”。“部分”可以以分离的形式使用，或者可将其与其他编码(或非编码)序列融合，以便例如，产生组合了若干活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比针对该蛋白质部分所预测到的要大。

可用于本发明方法的“部分”编码如本文所定义的CRC相关多肽，并与实施例1表A所示氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选“部分”是实施例1表A所示任一核酸的部分，或是编码实施例1表A所示任一氨基酸序列的直系同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选“部分”长至少400、450、500、550、600、650、700个连续核苷酸，所述连续核苷酸来自实施例1表A所示任一核酸序列或者编码实施例1表A所示任一氨基酸序列的直系同源物或旁系同源物的核酸。最优选“部分”是核酸SEQ ID NO：1的部分。优选“部分”编码这样的氨基酸序列的片段，当利用之根据Lee等(Development 132，5021-5032，2005)构建CRC相关系统发生树时，其倾向于与Lee等(2005)所定义的CRC-相关或INO-相关蛋白质群而非任何其他蛋白质群聚类。

可用于本发明方法的另一类核酸变体为在降低的严格条件下、优选在严格条件下，能够与本文所定义的CRC相关多肽编码核酸或者本文所定义的“部分”杂交的核酸。

根据本发明，提供了增强植物产率相关性状的方法，包括在植物中引入和表达能够与实施例1表A所示任一核酸杂交的核酸，或者包括在植物中引入和表达能够与编码实施例1表A所示任一核酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交的核酸。

可用于本发明方法的杂交序列编码如本文所定义的CRC相关多肽，与实施例1表A所示氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选杂交序列能够与实施例1表A所示任一核酸杂交、或与任一前述序列的部分杂交，其中部分如上文所定义；或者杂交序列能够与编码实施例1表A所示任一氨基酸序列的直系同源物或旁系同源物的核酸杂交。最优选杂交序列能够与SEQIDNO：1所示的核酸或其部分杂交。

优选杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，当利用其全长根据Lee等(Development 132，5021-5032，2005)构建CRC相关系统发生树时，其倾向于与Lee等(2005)所定义的CRC-相关或INO-相关蛋白质群而非任何其他蛋白质群聚类。

可用于本发明方法的另一类核酸变体为编码前文所定义的CRC相关多肽的剪接变体，其中剪接变体如本文所定义。

根据本发明，提供了增强植物产率相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A所示任一核酸序列的剪接变体、或编码实施例1表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

优选的剪接变体是SEQ ID NO：1所示核酸的剪接变体，或编码SEQID NO：2的直系同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选剪接变体编码这样的氨基酸序列，当利用之根据Lee等(Development 132，5021-5032，2005)构建CRC相关系统发生树时，其倾向于与Lee等(2005)所定义的CRC-相关或INO-相关蛋白质群而非任何其他蛋白质群聚类。

可用于实施本发明方法的另一类核酸变体为前文所定义的CRC相关多肽编码核酸的等位基因变体，其中等位基因变体如本文所定义。

根据本发明，提供了增强植物产率相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A所示任一核酸的等位基因变体，或者包括在植物中引入和表达编码实施例1表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位基因变体。

可用于本发明方法的等位基因变体与CRC相关多肽SEQ ID NO：2及实施例1表A所示的任一氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。等位基因变体天然存在，并且这些天然等位基因的用途包含于本发明的方法中。优选等位基因变体为SEQ ID NO：1的等位基因变体，或编码SEQ ID NO：2的直系同源物或旁系同源物的核酸的等位基因变体。优选等位基因变体编码这样的氨基酸序列，当利用之根据Lee等(Development 132，5021-5032，2005)构建CRC相关系统发生树时，其倾向于与Lee等(2005)所定义的CRC-相关或INO-相关蛋白质群而非任何其他蛋白质群聚类。

基因改组或定向进化也可用于产生上文所定义的CRC相关多肽编码核酸的变体；其中术语“基因改组”如本文所定义。

根据本发明，提供了增强植物产率相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A所示任一核酸序列的变体，或者包括在植物中引入和表达编码实施例1表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，其中所述变体核酸通过基因改组获得。

优选通过基因改组获得的变体核酸编码这样的氨基酸序列，当利用之根据Lee等(Development 132，5021-5032，2005)构建CRC相关系统发生树时，其倾向于与Lee等(2005)所定义的CRC-相关或INO-相关蛋白质群而非任何其他蛋白质群聚类。

此外，还可利用定点诱变获得核酸变体。若干方法可用来实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编辑)。

CRC相关多肽编码核酸可以来自任何天然或人工的来源。可以通过有意的人为操作在组成和/或基因组环境上修饰核酸，使之不同于天然形式。优选CRC相关多肽编码核酸来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科(Brassicaceae)，最优选核酸来自稻。

实施本发明的方法产生具有增强的产率相关性状的植物。特别地，实施本发明的方法产生相对于对照植物具有增加的产率的植物，尤其是具有增加的种子产率。术语“产率”和“种子产率”在本文“定义”部分有更详细的说明。

本文所述及的增强的产率相关性状应理解为表示植物一个或多个部分的生物量(重量)的增加，所述部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。特别地，这样的可收获部分为种子，并且实施本发明的方法使得植物相对于对照植物的种子产率具有增加的种子产率。

以玉米为例，产率增加可以表现为如下一个或多个方面：每平方米建植(established))的植物数的增加；每株植物的穗数的增加；行数、行粒数、粒重、千粒重、穗长度/直径的增加；种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数并乘以100)的增加，等等。以稻为例，产率增加可以表现为如下一个或多个方面的增加：每平方米的植物数、每株植物的圆锥花序数、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花朵(小花)数(其表达为饱满种子数占主圆锥花序(primary panicles)数的比率)、种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数并乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。

本发明提供了增加植物相对于对照植物的产率、特别是种子产率的方法，所述方法包括调节植物中本文所定义的CRC相关多肽编码核酸的表达。

由于本发明的转基因植物具有增加的产率，这些植物可以呈现出，相对于对照植物在其生命周期相应阶段的生长速率而言，增加的生长速率(至少在其部分生命周期中)。

增加的生长速率可以是对植物的一个或多个部分(包括种子)特异的，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生长速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解为表示从成熟干种子生长至植物产生类似于起始材料的成熟干种子的阶段所需的时间。此生命周期可以受到诸如早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速率的增加可以出现在植物生命周期的一个或多个阶段，或者出现在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比原来可能的情况更晚播种和/或更快收获(类似的效果可以通过较早的开花时间获得)。如果生长速率充分增加，可以允许再播种同种植物物种的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着再播种和收获稻类植物)。与此类似，如果生长速率充分地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种和收获玉米植物，随后，例如，播种和任选地收获大豆、马铃薯或任何其他适合的植物)。在一些作物植物的情况下，也可能可以从同一砧木得到额外次数的收获。改变植物的收获周期可以导致每平方米年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获的次数的增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还可能允许在更广阔的地域栽培转基因植物，这是因为种植作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，就可以避免这类不利条件。可以通过从生长曲线获得多种参数来确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小的50％所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小90％所需的时间)等等。

根据本发明一个优选的方面，实施本发明的方法产生相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，本发明提供了增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节植物中本文所定义的CRC相关多肽编码核酸的表达。

无论植物处于非胁迫条件下还是暴露于不同的胁迫，都可以发生与对照植物相比，产率和/或生长速率的增加。植物通常通过更缓慢地生长来对暴露于胁迫作出反应。在重度的胁迫条件下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度的胁迫在此处定义为植物暴露于该胁迫后、不导致植物停止生长和丧失重新生长的能力的任何胁迫。在本发明的意义上，轻度胁迫导致受胁迫的植物与在非胁迫条件下的对照植物相比，生长减少不足40％、35％或30％，优选不足25％、20％或15％，更优选不足14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、农药处理)的进步，在栽培的作物植物中通常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的减弱的生长通常是农业上不期望的特征。轻度胁迫可以是植物每天接触到的生物和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以由干旱或过多的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、冷或冰冻温度引起。非生物胁迫可以是由水胁迫(特别由于干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。然而，在本发明中，术语“非生物胁迫”不包括冷胁迫。生物胁迫通常是由病原体例如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的胁迫。

特别地，可以在非胁迫条件下或在轻度到重度干旱条件下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产率的植物。如Wang等(Planta(2003)218：1-14)所报道的那样，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物化学和分子变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫相互联系，并可以通过相似的机制诱发生长和细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫和高盐度胁迫之间存在着的一种特别高程度的“对话(cross-talk)”。例如，干旱和/或盐度主要表现为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫通常激活相似的细胞信号传递路径和细胞应答，如应激蛋白的产生、抗氧化剂的上调、相容溶质的累积以及生长阻抑。如本文所用的术语“非胁迫”条件为那些允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员知晓给定区域的正常土壤条件和气候条件。

实施本发明的方法产生在非胁迫条件下或在轻度到重度干旱条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产率的植物。因此，根据本发明，提供了增加在非胁迫条件下或在轻度到重度干旱条件下生长的植物的产率的方法，所述方法包括调节植物中CRC相关多肽编码核酸的表达。如本文所用的术语“重度干旱条件”或“重度干旱胁迫”是指其中对照植物与在非胁迫条件下生长的对照植物相比产率损失至少为50％的那些条件。

实施本发明的方法产生在营养不足条件下、特别是在氮缺乏条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产率的植物。因此，根据本发明，提供了增加在营养不足条件下生长的植物的产率的方法，所述方法包括调节植物中CRC相关多肽编码核酸的表达。营养不足可以因诸如氮、磷及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等养分缺乏所致。

本发明包括可由根据本发明的方法获得的植物或其部分(包括种子)。所述植物或其部分含有编码如上文所定义的CRC相关多肽的核酸转基因。

本发明还提供遗传构建体和载体，以利于在植物中引入和/或表达CRC相关多肽编码核酸。可以将基因构建体插入适于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体中，该载体可以是可商购的载体。本发明还提供了如本文所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供这样的构建体，其含有：

(a)编码如上文所定义的CRC相关多肽的核酸；

(b)一个或多个能够驱动(a)中核酸序列表达的控制序列；和任选的

(c)转录终止序列。

优选地，编码CRC相关多肽的核酸如上文所定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文所定义。

可以使用含有任何上述核酸的载体转化植物。技术人员充分知晓载体中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择并繁殖含目的序列的宿主细胞。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。

有利地，可以使用任何类型的天然或合成启动子驱动核酸序列的表达。组成型启动子在所述方法中特别有用。优选所述组成型启动子还是遍在启动子。关于各种启动子类型的定义，敬请参见本文“定义”部分。

应当清楚本发明的可实施性并不局限于SEQ ID NO：1所示的CRC相关多肽编码核酸，而且本发明的可实施性也不局限于由组成型启动子所驱动的CRC相关多肽编码核酸的表达。

组成型启动子优选为GOS2启动子，优选来自稻的GOS2启动子。还优选组成型启动子为基本上类似于SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：52的核酸序列，最优选组成型启动子如SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：52所示。另一可用于本发明方法的组成型启动子为高迁移率组蛋白(HMGP)启动子；优选HMGP启动子来自稻HMGB1基因，最优选HMGP启动子如SEQ ID NO：60所示。有关组成型启动子的更多实例，敬请参见本文“定义”部分表2。

任选的，还可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选构建体含有与SEQ ID NO 55实质上相似或完全相同的表达盒，含GOS2启动子和编码CRC相关多肽的核酸。

另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域技术人员会知道适合用于进行本发明的终止子和增强子的序列。如“定义”部分所说明的那样，也可以向5’非翻译区(UTR)或在编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列为本领域技术人员公知或者可以容易地获得。

本发明的遗传构建体可以还包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

为检测本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择含有这些核酸的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报告基因)。因此，遗传构建体可以任选地含有可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分有更详细的说明。标记基因一旦不再需要，可以从转基因细胞中除去或切除之。进行标记去除的技术在本领域公知，有用的技术在上文“定义”部分有说明。

本发明还提供了产生相对于对照植物具有增强的产率相关性状的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达任何编码如前文所定义的CRC相关多肽的核酸。

更具体地，本发明提供了产生具有增强的产率相关性状、特别是增加的(种子)产率的转基因植物的方法，所述方法包括：

(i)向植物或植物细胞中引入和表达CRC相关多肽编码核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

(i)中的核酸可以是任何能够编码如本文所述的CRC相关多肽的核酸。

可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其它部分)。根据本发明优选的方面，优选通过转化将核酸引入植物。术语“转化”在本文“定义”部分有更详细的说明。

遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者

和Willmitzer的出版物。

通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能方案是使用合适的选择剂，将种子，酌情在消毒之后，种在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对转化的植物筛选可选择标记如上文所述标记的存在。

DNA转移和再生之后，还可评价推定转化的植物，例如用Southern分析(DNA印迹)，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞经转化含有表达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的砧木嫁接到非转化的接穗上)。

本发明显然延及由本文所述方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，唯一的要求是所述后代呈现出与在本发明方法中产生的亲本相同的基因型和/或表型特征。

本发明也包括含有分离的编码上文所定义的CRC相关多肽的核酸的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。对于用于本发明方法的核酸或载体、表达盒或构建体或载体，其宿主植物原则上有利地为能够合成在本发明方法中使用的多肽的所有植物。

本发明的方法有利地适用于任何植物。尤其可用于本发明方法的植物包括属于植物界超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或豆科牧草、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、芸苔(canola)、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选植物是谷类。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。

本发明也延及植物的可收获部分，例如但不限于：种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。本发明还涉及由这样的植物的可收获部分衍生的、优选直接衍生的产品，如干丸(pellet)或干粉、油类、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

根据本发明优选的方面，受调节的表达是增加的表达。增加核酸或基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的记录，并且实例在“定义”部分提供。

如上文所述，调节CRC相关多肽编码核酸表达的优选方法是在植物中引入和表达CRC相关多肽编码核酸；然而，实施所述方法的效果，即增强产率相关性状也可以利用其他众所周知的技术实现，包括但不限于：T-DNA激活标签、TILLING、同源重组。这些技术的说明在“定义”部分提供。

本发明还包括编码如本文所述的CRC相关多肽的核酸以及这些CRC相关多肽在增强植物任一上述产率相关性状中的用途。

可以在育种程序中使用编码本文所述CRC相关多肽的核酸或所述CRC相关多肽本身，其中鉴定可能与CRC相关多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。可以使用所述核酸/基因或所述CRC相关多肽本身定义分子标记。接着可以将此DNA或蛋白质标记在育种程序中使用，以在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产率相关性状的植物。

CRC相关多肽编码核酸/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变异；可选的，此类程序可以以一组无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR进行等位基因变体的鉴定。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的、提供增加的产率的、优良等位基因变体。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位基因变体的植物的生长行为来进行选择。可以在温室或田地中监测生长行为。其它任选的步骤包括将经鉴定含有优良等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生感兴趣表型特征的组合。

CRC相关多肽编码核酸还可以作为探针，用于对包含其的基因进行遗传和物理作图以及用作与那些基因连锁的性状的标志物。这样的信息可以在植物育种中使用，以培育具有所期望表型的株系。CRC相关多肽编码核酸的这类应用仅需要长度至少15个核苷酸的核酸序列。CRC相关多肽编码核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用POI编码核酸探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)《分子克隆：实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1：174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。另外，可以使用核酸探测含有一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述一组个体为一个确定的遗传杂交的亲本和子代。记录DNA多态性的分离，并用于计算CRC相关多肽编码核酸在先前用此群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和应用描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员众所周知的。

核酸探针也可以用来进行物理作图(即在物理图谱上安置序列；参见Hoheisel等In：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，核酸探针可用于进行直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个kb到几百个kb；参见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏性的提高可以允许在FISH作图中应用较短的探针。

用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。采用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定用于作图杂交的亲本之间在相应于本发明核酸序列的区域中的DNA序列差异。但是，通常这对作图方法不是必要的。

根据本发明的方法得到如前文所述具有增强的产率相关性状的植物。这些性状还可以组合其它经济上有利的性状，如其它产率增强性状、对其他非生物和生物胁迫的耐受性、改变多种构造特征和/或生物化学和/或生理学特征的性状。

附图说明

现参考以下附图描述本发明，其中：

图1显示了如SEQ ID NO：2所示的CRC相关蛋白质的结构域结构：锌指结构域为粗体，其中保守的Cys残基以下划线标出；螺旋-环-螺旋结构域为斜体并以下划线标出；而Ser/Pro富含结构域位于这两个区域之间。

图2显示了CRC相关蛋白质的多重比对。星号表示相同的氨基酸，冒号表示高度保守的取代，而圆点表示不太保守的取代。

图3显示了双元载体(binary vector)，用于在稻中增加表达处于GOS2启动子(SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：56)控制之下的拟南芥CRC相关蛋白质编码核酸。

图4详述了用于实施本发明方法的序列实例。

实施例

现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明。如下实施例并非旨在完全界定或以其他方式限制本发明的范围。

DNA操作除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols第一卷和第二卷的标准方法进行。植物分子操作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。

实施例1：与本发明方法所用核酸序列相关的序列的鉴定

利用数据库序列搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库维护的序列中鉴定与SEQ ID NO：1相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)和/或与SEQ ID NO：2相关的蛋白质序列。BLAST程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间具有局部相似性的区域。对SEQ ID NO：1所编码的多肽运用TBLASTN算法，使用默认设置，开启过滤器，以滤过低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在有些情况下，可以调整默认参数以更改搜索的严格度。

除了可由NCBI获得的公共核酸序列之外，我们还按照上文所述的相同方法对私有序列数据库进行了搜索。

表A提供了与SEQ ID NO：1所示核酸序列及SEQ ID NO：2所示蛋白质序列相关的核酸及蛋白质序列列表。

表A：与用于实施本发明方法的核酸序列

(SEQ ID NO：1)相关的核酸序列以及相应的推断多肽

 

名称	来源生物	核酸SEQID NO：	多肽SEQID NO：	数据库登录号	状态
						AtCRC-相关-1	拟南芥	1	2	NM_105585	全长
AmtCRC-相关	无油樟(Amborellatrichopoda)	3	4	AJ877257	全长
						AmCRC-相关-1	金鱼草(Antirrhinummajus)	5	6	AJ559642	全长
AfCRC-相关	美丽耧斗菜(Aquilegiaformosa)	7	8	AY854797	全长
						CfCRC-相关	Capparis flexuosa	9	10	AY854798	全长
CsCRC-相关	甜橙(Citrussinensis)	11	12	CN185168	全长

 

ClsCRC-相关	Cleome sparsifolia	13	14	AY854803	全长
						GhCRC-相关-1	陆地棉	15	16	AY854804	全长
GhCRC-相关-2	陆地棉	17	18	AY854805	全长
						HcCRC-相关	Hedyotiscentranthoides	19	20	CB088054	全长
AtCRC-相关-2	拟南芥	21	22	AF195047	全长
						LaCRC-相关	Lepidiumafricanum	23	24	AY854802	全长
SlCRC-相关-1	番柿(Solanumlycopersicum)	25	26	AI771643	全长
						SlCRC-相关2	番柿	27	28	AI483816	全长
NtCRC-相关-1	烟草(Nicotianatabacum)	29	30	AY854799	全长
						NtCRC-相关2	烟草	31	32	AY854800	全长
AmCRC-相关-2	金鱼草	33	34	AY451400	全长
						NaCRC-相关	白睡莲(Nymphaeaalba)	35	36	AB092980	全长
OsCRC-相关	稻	37	38	AB106553	全长
						PhCRC-相关	碧冬茄(Petuniaxhybrida)	39	40	AY854801	全长
TaCRC-相关	小麦	41	42	AF545436	全长
						ZmCRC-相关	玉蜀黍	43	44	AY104291	全长

在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究所(Institute forGenomic Research，TIGR)实验性地进行了装配并向公众公开。可以利用真核基因直系同源物(Eukaryotic Gene Orthologs，EGO)数据库来鉴定这样的相关序列，通过关键词搜索，或是采用BLAST算法运用目的核酸或多肽序列进行鉴定。

实施例2：CRC相关多肽序列的比对

Vector NTI(英骏公司，Invitrogen)的AlignX基于流行的渐进式比对Clustal算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003)Nucleic Acids Res 31：3497-3500)。利用邻接聚类算法能够构建系统发生树。默认值为空位开放罚分10，空位延伸罚分0，1，而选择的权重矩阵为Blosum 62(如果比对多肽的话)。可以进行微小的人工编辑以进一步优化比对。

利用在鉴定可用于实施本发明方法的多肽的过程中的相关多肽进行多重序列比对，结果示于图2。如图1所示的Cys2Cys2锌指和螺旋-环-螺旋结构域由于其序列保守性很容易识别。

实施例3：用于实施本发明方法的多肽序列之间全局同一性百分比的计算

用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用本领域可用方法之一即MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMCBioinformatics.2003 4：29.MatGAT：an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences.CampanellaJJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。

比较所用的参数有：

记分矩阵：Blosum 62

首个空位：12

延伸空位：2

多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分析结果示于表B。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。

与SEQ ID NO：2相比，用于实施本发明方法的多肽序列之间的同一性百分比可低至28％。不过，当比较特定结构域的同一性时(如YABBY结构域)，则这些百分比可变得较高。

实施例4：用于实施本发明方法的多肽序列中所含结构域的鉴定

蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of ProteinFamilies，Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索常用的标签数据库的整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，它们利用不同的方法学和有关已充分表征的蛋白质的多样化角度生物信息，以获得蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是一个大的多重序列比对和隐形Markov模型集，覆盖许多常见蛋白质结构域及家族。Pfam由位于英国的桑格研究所(Sanger Institute)服务器托管。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European BioinformaticsI nstitute)托管。

SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表C

表C：SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果

 

数据库	登录号	登录名
			Pfam	PF04690	YABBY
SUPERFAMILY	SSF47095	HMG盒
			SUPE RFAMILY	SSF57850	RING/U盒

实施例5：用于实施本发明方法的多肽序列的拓扑预测

利用TargetP 1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。根据该程序，基于如下任一N-端前序列的预测性存在，进行定位确定：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。最终预测所基于的分值并非真正的概率，且加起来并不必为1。不过，根据TargetP，得分最高的定位是最可能的，且分值之间的关系(可靠性级别)可作为所述预测的可靠性的指标。可靠性级别(RC)范围从1到5，其中1表示最强的预测。TargetP由丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器维护。

对于经预测含有N-端前序列的序列，还可以预测潜在的切割位点。

选择了多种参数，例如生物体类型(非植物或植物)、截断值设置(无、预先规定的截断值设置或者用户指定的截断值设置)以及切割位点的预测计算(是或否)。

SEQ ID NO：2所示多肽序列的TargetP1.1分析结果示于表D。选择的是“植物”生物体类型，未规定截断值，并要求转运肽的预测长度。未能清晰预测到亚细胞定位，仅有弱的线粒体定位预测。因此，CRC相关蛋白质可能定位在细胞核或细胞质中。

表D：SEQ ID NO：2所示多肽序列的TargetP 1.1分析

 

长度(AA)	181
		叶绿体转运肽	0.035
线粒体转运肽	0.186
		分泌路径信号肽	0.010
其他亚细胞靶向	0.882
		预测的定位	/
可靠性级别	2
		预测的转运肽长度	/

可以利用许多其他的算法进行这样的分析，包括：

●ChloroP 1.1，由丹麦技术大学服务器托管；

●蛋白质寻觅亚细胞定位预测软件(Protein Prowler SubcellularLocalisation Predictor)，1.2版，由澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所(Institute for Molecular Bioscience，University of Queensland，Brisbane，Australia)的服务器托管；

●PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5，由加拿大大阿尔贝塔埃德蒙顿阿尔贝塔大学(University of Alberta，Edmonton，Alberta，Canada)的服务器托管；

实施例6：CRC相关多肽的功能测定

如SEQ ID NO：2所示的多肽序列由于存在锌指结构域，可以与核酸以及蛋白质相互作用。DNA结合测定在本领域众所周知，包括PCR辅助DNA结合位点选择和DNA结合凝胶移位测定；关于综合参考书目，敬请参见Current Protocols in Molecular Biology，卷1和2，Ausubel等(1994)，Current Protocols。

如SEQ ID NO：2所示的蛋白质据推断与其他蛋白质相互作用(根据SMART数据库分析结果)，如表E所示。因而可以在酵母双杂交筛选中以候选配体蛋白质来测试CRC相关蛋白质的功能。双杂交测定法在本领域公知(Fields和Song，Nature，340：245-246，1989)。

表E：拟南芥中推定的SEQ ID NO：2相互作用因子

 

说明	标识符
		肌动蛋白11	At3g12110
AFO	At2g45190

实施例7：本发明方法所用核酸序列的克隆

使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR来扩增拟南芥CRC相关基因。PCR扩增所用的引物包括进行Gateway重组的AttB位点，为prm9238(SEQ ID NO：53；正义，起始密码子为粗体，AttB1位点为斜体：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaacctagaagagaaacca-3’)和prm9239(SEQ ID NO：54；反义，互补的，AttB2位点为斜体：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttatttttaggcttcttttcc-3’)。在标准条件下使用HifiTaq DNA聚合酶进行PCR。同样利用标准方法扩增和纯化644bp(包括attB位点)的PCR片段。接着进行(Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生Gateway术语所称的“进入(entry)克隆”即pCRCr。作为

技术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司(Invitrogen)。

随后进入克隆pCRCr与用于稻转化的目的载体(destination vector)pGOS2一起用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含如下功能性元件：植物可选择标记；可筛选标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：52或在所述表达盒中时为SEQ ID NO：55)位于此Gateway盒的上游。

在LR重组步骤之后，根据本领域众所周知的方法将所产生的表达载体pGOS2::CRCr(图3)转化进农杆菌菌株LBA4044。

实施例8：植物转化

稻转化

使用包含表达载体的农杆菌转化稻植物。使梗稻栽培种日本晴(ricejaponica cultivar Nipponbare)的成熟干种子脱壳。通过在70％的乙醇中孵育1分钟，然后在0.2％HgCl₂中孵育30分钟，之后用无菌蒸馏水洗涤6次，每次15分钟来进行消毒。然后在包含2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)中萌发无菌种子。在黑暗中孵育4周后，切取盾片来源的胚发生愈伤组织，然后在相同的培养基上进行繁殖。2周后，通过在相同的培养基上传代培养再另外2周来繁殖或增殖愈伤组织。在共培养前3天在新鲜培养基上传代培养胚发生愈伤组织块(以增强细胞分裂活性)。

包含表达载体的农杆菌株系LBA4404用于共培养。将农杆菌接种在具有适宜的抗生素的AB培养基上，在28℃下培养3天。然后收集细菌，将其悬浮在液体共培养培养基中直至大约为1的密度(OD₆₀₀)。然后将悬浮液转移至培养皿(Petri dish)，将愈伤组织浸渍在悬浮液中15分钟。然后将愈伤组织在滤纸上吸干，之后转移至固化的共培养培养基，在25℃下在黑暗中孵育3天。然后在选择剂存在的情况下在28℃下在黑暗中，在包含2，4-D的培养基上生长共培养的愈伤组织4周。在此期间，产生了快速生长的抗性愈伤组织岛。在将该物质转移至再生培养基和在光照下孵育后，胚发生潜力被释放，在接下来的4至5周中发育出芽。将芽从愈伤组织切下，然后在包含生长素的培养上孵育2至3周，然后将它们从所述培养基转移至土壤中。在温室中在高湿度和短日照下生长出变硬的芽(shoot)。

对于一个构建体产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室。在进行确认T-DNA插入物的拷贝数的定量PCR分析后，只保留展示对选择剂具抗性的单拷贝转基因植物用于T1种子的收获。然后在移植后3至5个月收获种子。该方法以50％多的比率产生了单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等人1993，Hiei等人1994)。

玉米的转化

使用由Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法的改进方法进行玉米(Zea mays)的转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，只有特定的基因型易于进行转化和再生。近交系A188(University ofMinnesota)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但也可成功地使用其他基因型。在授粉后大约11天(DAP)当未成熟的胚的长度为大约1至1.2mm时，从玉米植物收获穗子。将未成熟的胚与包含表达载体的根癌农杆菌共培养，通过器官发生重获转基因植物。将切离的胚培养在愈伤组织诱导培养基上，然后培养在包含选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用不同的选择标记)的玉米再生培养基上。在光照的情况下在25℃下孵育培养皿2至3周，或直至芽产生。将绿色的芽从各胚胎转移至玉米生根培养基，在25℃下孵育2-3周，直至根产生。然后将生根的芽移植至温室土壤中。从展示对选择剂具有抗性的且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

小麦转化

使用由Ishida等人(1996)Nature Biotech14(6)：745-50描述的方法进行小麦的转化。通常将栽培品种Bobwhite(可从CIMMYT，Mexico获得)用于转化。将未成熟的胚与包含表达载体的根癌农杆菌共培养，通过器官发生重获转基因植物。在与农杆菌孵育后，将胚在愈伤组织诱导培养基上进行体外培养，然后在包含选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用不同的选择标记)的再生培养基上进行培养。在光照的情况下在25℃下孵育培养皿2至3周，或直至芽产生。将绿色的芽从各胚转移至生根培养基，在25℃下孵育2-3周，直至根产生。将生根的芽移植至温室土壤中。从展示对选择剂具有抗性的且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

大豆转化

按照Texas A&M专利US 5,164,310中描述的方法的改进方法转化大豆。几种商品化大豆品种易于通过该方法进行转化。通常将栽培品种Jack(可从Illinois Seed foundation获得)用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗切取下胚轴、胚根和一片子叶。让上胚轴和剩下的子叶进一步生长产生腋节(axillary node)。切取这些腋节，将其与包含表达载体的根癌农杆菌一起孵育。在共培养处理后，洗涤外植体，然后转移至选择培养基。切取再生的芽，将其置于芽伸长培养基上。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基上直至根产生。将生根的芽转移至温室的土壤中。从展示对选择剂具有抗性的且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

油菜(rapeseed)/芸苔(Canola)的转化

5-6日龄的幼苗的子叶柄和下胚轴用作组织培养的外植体，按照Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)对其进行转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但也可使用其他品种。对Canola种子进行表面消毒以进行体外播种。从体外幼苗切取具有附着的子叶的子叶柄外植体，然后通过将子叶柄外植体的切口末端浸入细菌悬浮液中接种农杆菌(包含表达载体)。然后将外植体在23℃、16小时光照下，在包含3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％ Phytagar的MSBAP-3培养基上培养2天。在与农杆菌共培养2天后，将子叶柄外植体转移至包含3mg/l BAP、头孢氨噻肟、羧苄青霉素或替卡西林-克拉维酸(timentin)(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7天，然后在具有头孢氨噻肟(cefotaxime)、羧苄青霉素或替卡西林-克拉维酸和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直至芽再生。当芽的长度为5-10mm时，将其切离，然后转移至芽伸长培养基(MSBAP-0.5，包含0.5mg/l BAP)。将长度大约2cm的芽转移至生根培养基(MS0)以进行根诱导。将生根的芽移植至温室的土壤中。从展示对选择剂具有抗性的且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

紫苜蓿的转化

使用(McKersie等人，1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法转化紫苜蓿(Medicago sativa)的再生克隆。紫苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因而需要再生的植物。已描述了用于获得再生植物的方法。例如，这些再生植物可选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或由Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)描述的任何其他商业紫苜蓿品种。可选择地，已选择RA3品种(University of Wisconsin)用于组织培养(Walker等人，1978Am J Bot65：654-659)。将子叶柄外植体与包含表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等人，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培养。将外植体在黑暗中在包含288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K₂SO₄和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培养3天。在一半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤外植体，然后将其种在不含乙酰丁香酮但具有适宜的选择剂和适宜的抗生素(以抑制农杆菌的生长)的相同SH诱导培养基上。在几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、无抗生素但含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后在一半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发体细胞胚。将生根的幼苗移植入花盆和生长在温室中。从展示对选择剂具有抗性的且包含单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

棉花转化

根据US 5,159,135中所述的方法利用根癌农杆菌转化棉花。棉花种子在3％次氯酸钠溶液中进行为期20分钟的表面消毒，并以含500μg/ml头孢氨噻肟的蒸馏水洗涤。然后将种子转移至含50μg/ml苯菌灵(benomyl)的SH培养基中进行萌发。移取4-6日龄幼苗的下胚轴，切成0.5cm的碎片，置于0.8％琼脂上。利用农杆菌悬浮液(大约10⁸细胞/ml，由转化了目的基因和合适选择标记的过夜培养物稀释而来)来接种下胚轴外植体。室温光照培养3天后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l Gelrite)，其含Murashige和Skoog盐，含B5维生素(Gamborg等，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))、0.1mg/l 2，4-D、0.1mg/l6-糠基氨基嘌呤(6-furfurylaminopurine)和750μg/ml MgCL₂，并含有50-100μg/ml头孢氨噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素以杀死残留细菌。两到三个月后分离单细胞系(每四到六周进行一次传代培养)，并进一步在选择培养基上培养，进行组织扩增(30℃，16hr光周期)。转化的组织随后在非选择培养基上进一步培养，为期2-3个月，以得到体细胞胚。将长相健康、至少4mm长的胚转移至带有细蛭石的SH培养基的管中，所述培养基中补加有0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠基氨基嘌呤和赤霉酸。胚于30℃培养，光周期为16hr，将处于2-3叶期的小植物转移到带有蛭石和养分的盆中。植物变硬，随后移至温室进一步培养。

实施例9：表型评估方法

9.1 评估设置

产生了大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。6个事件得以保留，这些事件中T1代发生转基因存在/缺乏的3:1分离。通过监测可视标记的表达，在这些事件中各选出大约10个含转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)，以及大约10个缺少转基因的T1幼苗(无效合子)。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28℃，夜间22℃，相对湿度70％。

按照T1代相同的评估方法但是每个事件评估更多个体，对4至6个T1事件的T2代进行进一步的评估。从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色素)。

干旱筛选

在正常条件下在花盆土中培养来自T2种子的植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到限制灌溉的“干燥”区域。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如针对正常条件下的生长所详述的那样，记录生长和产率参数。

氮利用效率筛选

在除营养液以外正常的条件下在花盆土中培养来自T2种子的稻植物。从植物移植到成熟一直用特定的营养液对花盆进行浇灌，所述营养液的氮(N)含量降低，通常低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如针对正常条件下的生长所详述的那样，记录生长和产率参数。

9.2 统计分析：F检验

利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行总体评估。对用本发明基因转化的所有事件的所有植株测量到的所有参数进行F检验。进行F检验以在所有转化事件上检查基因的效应，并检验基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”(global gene effect)。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。显著性F检验值指示存在基因效应，这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。

由于进行了具有重叠事件的两个实验，因此进行组合分析。这可用于检查两个实验中效应的一致性，并且如果情况果真如此，其可用于将来自两个实验的证据集合起来以增加结论的可信度。使用的方法是考虑到数据的多层结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方法。通过比较似然比检测与卡方分布来获得P值。

9.3 测量的参数

生物量相关参数测量

从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色素)。

植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数数码图像上区别于背景的来自于地上植物部分的像素的总数而确定。此值为同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值(physical surface value)。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。所述地上面积为在植物达到其最大叶生物量的时间点测量的面积。

种子相关参数测量

收获成熟的主圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子数。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳来测量种子总产率。通过计数从植物收获的谷壳数来测量每株植物的种子总数。根据计数的饱满种子数及其总重量外推得出千粒重(TKW)。收获指数(HI)在本发明中定义为种子总产率和地上面积(mm²)之间的比值再乘以因子10⁶。每个圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟的主圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种子(或小花)总数的比例(以％表示)。

实施例10：转基因植物的表型评估结果

表达用于实施本发明方法的核酸序列(pGOS::CRCr)的转基因稻植物的评估结果示于表F。也显示了转基因植物和相应无效合子之间的百分比差异，F检验的P值低于0.05。

与对照植物(在此例中为无效合子)相比，表达用于实施本发明方法的核酸序列的转基因植物的种子总产率、饱满种子数、种子饱满率和收获指数均显著增加(表F)。

表F：表达用于实施本发明方法的核酸序列的转基因稻植物的评估结果

 

性状	T1代增加％
		种子总产率	41
饱满种子数	35
		饱满率	37
收获指数	42
		千粒重	4

6个T1事件进一步在T2代中进行了测试。与对照植物相比，转基因植物的种子总产率、饱满种子数和收获指数均显著增加(组合分析的P值小于0.05)(表G)。

表G：表达用于实施本发明方法的核酸序列的T2转基因稻植物的评估结果

 

性状	T2代增加％
		种子总产率	24
饱满种子数	16

 

收获指数	6
		千粒重	3

同样，在表达处于HMGB1启动子控制之下的CRC编码核酸的转基因植物中，观察到了种子产率的增加(特别是千粒重，增加4.8％，P值小于5％)。

实施例11：在重度干旱胁迫条件下生长的转基因植物的表型评估结果

经如上所述对种子进行分析，本发明人发现用pGOS2::CRCr基因构建体转化、并在重度干旱胁迫条件下生长的植物，与缺乏CRC转基因、在相同条件下生长的植物相比，种子产率更高，其表现为种子总重量(增加5％以上)；饱满种子数增加(增加5％以上)；饱满率更高(增加5％以上)；且收获指数增加(增加5％以上)。这些增加具有显著意义(P值<0.0001)。实施例12：在限氮胁迫条件下生长的转基因植物的表型评估结果

用pGOS2::CRCr基因构建体转化并在限氮条件下生长的植物，与缺乏CRC转基因、在相同条件下生长的植物相比，具有增强的营养摄取效率(测量为更高的种子产率，如种子总重量，饱满种子数，更高的饱满率和/或增加的收获指数)。

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司

<120>产率相关性状增强的植物及使用来自YABBY蛋白家族的共有序列制备其的方法

<130>PF58575

<150>EP 06124181.6

<151>2006-11-16

<150>US 60/866，611

<151>2006-11-21

<150>EP 07116518.7

<151>2007-09-14

<150>US 60/975，848

<151>2007-09-28

<160>60

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>934

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

<210>2

<211>181

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>2

<210>3

<211>828

<212>DNA

<213>无油樟(Amborella trichopoda)

<400>3

<210>4

<211>196

<212>PRT

<213>无油樟

<400>4

<210>5

<211>732

<212>DNA

<213>金鱼草(Antirrhinum majus)

<400>5

<210>6

<211>165

<212>PRT

<213>金鱼草

<400>6

<210>7

<211>525

<212>DNA

<213>美丽耧斗菜(Aquilegia Formosa)

<400>7

<210>8

<211>174

<212>PRT

<213>美丽耧斗菜

<400>8

<210>9

<211>561

<212>DNA

<213>Capparis flexuosa

<400>9

<210>10

<211>186

<212>PRT

<213>(Capparis flexuosa

<400>10

<210>11

<211>840

<212>DNA

<213>甜橙(Citrus sinensis)

<400>11

<210>12

<211>171

<212>PRT

<213>甜橙

<400>12

<210>13

<211>558

<212>DNA

<213>(Cleome sparsifolia

<400>13

<210>14

<211>185

<212>PRT

<213>(Cleome sparsifolia

<400>14

<210>15

<211>502

<212>DNA

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400>15

<210>16

<211>166

<212>PRT

<213>陆地棉

<400>16

<210>17

<211>514

<212>DNA

<213>陆地棉

<400>17

<210>18

<211>170

<212>PRT

<213>陆地棉

<400>18

<210>19

<211>746

<212>DNA

<213>Hedyotis centranthoides

<400>19

<210>20

<211>190

<212>PRT

<213>Hedyotis centranthoides

<400>20

<210>21

<211>1102

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>21

<210>22

<211>231

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>22

<210>23

<211>567

<212>DNA

<213>Lepidium africanum

<400>23

<210>24

<211>188

<212>PRT

<213>Lepidium africanum

<400>24

<210>25

<211>540

<212>DNA

<213>番柿(Solanum lycopersicum)

<400>25

<210>26

<211>151

<212>PRT

<213>番柿

<400>26

<210>27

<211>562

<212>DNA

<213>番柿

<400>27

<210>28

<211>158

<212>PRT

<213>番柿

<400>28

<210>29

<211>546

<212>DNA

<213>烟草(Nicotiana tabacum)

<400>29

<210>30

<211>181

<212>PRT

<213>烟草

<400>30

<210>31

<211>546

<212>DNA

<213>烟草

<400>31

<210>32

<211>181

<212>PRT

<213>烟草

<400>32

<210>33

<211>765

<212>DNA

<213>金鱼草

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(609)..(609)

<223>n是a，c，g，或t

<400>33

<210>34

<211>235

<212>PRT

<213>金鱼草

<220>

<221>UNSURE

<222>(191)..(191)

<223>Xaa可以是任何天然氨基酸

<400>34

<210>35

<211>1019

<212>DNA

<213>白睡莲(Nymphaea alba)

<400>35

<210>36

<211>202

<212>PRT

<213>白睡莲

<400>36

<210>37

<211>1037

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>37

<210>38

<211>194

<212>PRT

<213>稻

<400>38

<210>39

<211>489

<212>DNA

<213>碧冬茄(Petunia x hybrida)

<400>39

<210>40

<211>162

<212>PRT

<213>碧冬茄

<400>40

<210>41

<211>1105

<212>DNA

<213>普通小麦(Triticum aestivum)

<400>41

<210>42

<211>199

<212>PRT

<213>普通小麦

<400>42

<210>43

<211>1001

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>43

<210>44

<211>205

<212>PRT

<213>玉蜀黍

<400>44

<210>45

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序1

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Gly″/替换＝″Asp″

<220>

<221>变体

<222>(2)..(2)

<223>/替换＝″Arg″/替换＝″His″

<220>

<221>变体

<222>(3)..(3)

<223>/替换＝″Leu″

<220>

<221>变体

<222>(4)..(4)

<223>/替换＝″Gly″/替换＝″Tyr″

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Tyr″/替换＝″Cys″

<220>

<221>变体

<222>(7)..(7)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(9)..(9)

<223>/替换＝″Ser″/替换＝″Asn″/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(10)..(10)

<223>/替换＝″Ile″/替换＝″Tyr″

<220>

<221>变体

<222>(11)..(11)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(12)..(12)

<223>/替换＝″Ala″/替换＝″Asp″/替换＝″Asn″/替换＝″Ser″

<220>

<221>变体

<222>(14)..(14)

<223>/替换＝″Val″/替换＝″Leu″

<220>

<221>变体

<222>(16)..(16)

<223>/替换＝″Ala″/替换＝″Ser″

<220>

<221>变体

<222>(18)..(18)

<223>/替换＝″Gly″

<220>

<221>变体

<222>(19)..(19)

<223>/替换＝″Ile″

<400>45

<210>46

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序2

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Ala″/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(3)..(3)

<223>/替换＝″Ala″/替换＝″Pro″

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Gln″/替换＝″Lys″

<220>

<221>变体

<222>(10)..(10)

<223>/替换＝″Gly″/替换＝″Ser″/替换＝″Asn″

<400>46

<210>47

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序3

<400>47

<210>48

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序4

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Glu″

<400>48

<210>49

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序5

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(6)..(6)

<223>/替换＝″Lys″

<220>

<221>变体

<222>(7)..(7)

<223>/替换＝″His″

<220>

<221>变体

<222>(9)..(9)

<223>/替换＝″Thr″/替换＝″Leu″

<400>49

<210>50

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序6

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(2)..(2)

<223>/替换＝″Lys″/替换＝″Asp″

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Lys″/替换＝″Gln″

<220>

<221>变体

<222>(7)..(7)

<223>/替换＝″Ile″

<220>

<221>变体

<222>(8)..(8)

<223>/替换-″Glu″

<220>

<221>变体

<222>(9)..(9)

<223>/替换＝″Ile″/替换＝″Ser″/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(10)..(10)

<223>/替换＝″Glu″/替换＝″Met″/替换＝″Ser″/替换＝″Ala″

     /替换＝″Gly″

<220>

<221>变体

<222>(11)..(11)

<223>/替换＝″Tyr″/替换＝″Glu″/替换＝″Lys″

<400>50

<210>51

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序7

<220>

<221>变体

<222>(2)..(2)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(3)..(3)

<223>/替换＝″Gln″

<220>

<221>变体

<222>(7)..(7)

<223>/替换＝″Ala″/替换＝″Thr″/替换＝″Ser″/替换＝″Met″

<220>

<221>变体

<222>(14)..(14)

<223>/替换＝″Lys″/替换＝″Arg″

<400>51

<210>52

<211>2193

<212>DNA

<213>稻

<400>52

<210>53

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物：prm9238

<400>53

<210>54

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物：prm9239

<400>54

<210>55

<211>2794

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>表达盒

<400>55

<210>56

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序1

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Gly″/替换＝″Asp″

<220>

<221>变体

<222>(2)..(2)

<223>/替换＝″Arg″/替换＝″His″

<220>

<221>变体

<222>(3)..(3)

<223>/替换＝″Leu″

<220>

<221>变体

<222>(4)..(4)

<223>/替换＝″Gly″/替换＝″Tyr″

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Tyr″/替换＝″Cys″

<220>

<221>变体

<222>(7)..(7)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(9)..(9)

<223>/替换＝″Ser″/替换＝″Asn″/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(10)..(10)

<223>/替换＝″Ile″/替换＝″Tyr″

<220>

<221>变体

<222>(11)..(11)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(12)..(12)

<223>/替换＝″Ala″/替换＝″Asp″/替换＝″Gln″/替换＝″Asn″

     /替换＝″Ser″

<220>

<221>变体

<222>(14)..(14)

<223>/替换＝″Val″/替换＝″Leu″

<220>

<221>变体

<222>(16)..(16)

<223>/替换＝″Ala″/替换＝″Ser″

<220>

<221>变体

<222>(18)..(18)

<223>/替换＝″Asn″/替换＝″Gly″

<220>

<221>变体

<222>(19)..(19)

<223>/替换＝″Ile″

<400>56

<210>57

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序2

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Ala″，/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(3)..(3)

<223>/替换＝″Ala″/替换＝″Pro″

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Gln″/替换＝″Lys″

<220>

<221>变体

<222>(8)..(8)

<223>/替换＝″Cys″

<220>

<221>变体

<222>(10)..(10)

<223>/替换＝″Gly″/替换＝″Ser″/替换＝″Asn″

<400>57

<210>58

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序4

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Asp″/替换＝″Glu″

<400>58

<210>59

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基序5

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(6)..(6)

<223>/替换＝″Lys″

<220>

<221>变体

<222>(7)..(7)

<223>/替换＝″His″

<220>

<221>变体

<222>(9)..(9)

<223>/替换＝″Thr″/替换＝″Val″/替换＝″Leu″

<400>59

<210>60

<211>1130

<212>DNA

<213>稻

<400>60

Claims (27)

1.增强植物的产率相关性状的方法，包括调节植物中CRC相关蛋白质编码核酸的表达，其中所述CRC相关蛋白质的序列包含YABBY结构域，具有至少一个如下基序：基序1(SEQ ID NO：56)、基序2(SEQ ID NO：57)、基序5(SEQ ID NO：59)、基序6(SEQ ID NO：50)、基序7(SEQ ID NO：51)。

2.根据权利要求1的方法，其中所述CRC相关多肽编码核酸为表A所示任一SEQ ID NO核酸或其部分，或为能够与表A所示任一SEQ IDNO核酸杂交的序列。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述核酸序列编码表A所示任一SEQ ID NO的直系同源物或旁系同源物。

4.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中通过T-DNA激活标签、TILLING、定点诱变、定向进化或同源重组中任何一种或多种方法来实现所述表达的调节。

5.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中通过在植物中引入和表达CRC相关蛋白质编码核酸来实现所述表达的调节，且其中所述CRC相关蛋白质的序列包含YABBY结构域，具有至少一个如下基序：基序1(SEQID NO：56)、基序2(SEQ ID NO：57)、基序5(SEQ ID NO：59)、基序6(SEQID NO：50)、基序7(SEQ ID NO：51)。

6.根据权利要求1到5中任一项的方法，其中在非胁迫条件下获得所述增强的产率相关性状。

7.根据权利要求1到5中任一项的方法，其中在非生物胁迫条件下、优选在干旱胁迫条件下获得所述增强的产率相关性状。

8.根据权利要求1到7中任一项的方法，其中所述增强的产率相关性状是增加的种子产率。

9.根据权利要求5到8中任一项的方法，其中所述核酸有效连接于组成型启动子，优选GOS2启动子或HMGP启动子。

10.根据权利要求1到9中任一项的方法，其中所述CRC相关蛋白质编码核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，还优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。

11.可根据权利要求1到10中任一项的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分含有编码CRC相关蛋白质的重组核酸。

12.构建体，含有：

(a)编码CRC相关蛋白质的核酸，其中所述CRC相关蛋白质的氨基酸序列包含YABBY结构域，具有至少一个如下基序：基序1(SEQ ID NO：56)、基序2(SEQ ID NO：57)、基序5(SEQ ID NO：59)、基序6(SEQ ID NO：50)、基序7(SEQ ID NO：51)；

(b)能够驱动(a)中核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的

(c)转录终止序列。

13.根据权利要求12的构建体，其中所述一个或多个控制序列至少为组成型启动子，优选GOS2启动子或HMGP启动子。

14.根据权利要求12或13的构建体在制备，相对于对照植物，产率相关性状增强、特别是种子产率增加的植物中的用途。

15.根据权利要求12或13的构建体在制备干旱胁迫耐受性增加的植物中的用途。

16.由根据权利要求12或13的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

17.产生相对于对照植物具有增强的产率相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括：

(i)在植物中引入和表达CRC相关蛋白质编码核酸，其中所述CRC相关蛋白质的氨基酸序列包含YABBY结构域，具有至少一个如下基序：基序1(SEQ ID NO：56)、基序2(SEQ ID NO：57)、基序5(SEQ ID NO：59)、基序6(SEQ ID NO：50)、基序7(SEQ ID NO：51)；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

18.相对于合适的对照植物具有增加的产率的转基因植物或源自所述转基因植物的植物细胞，其中所述产率增加因CRC相关蛋白质编码核酸的表达增加而产生，其中所述CRC相关蛋白质的氨基酸序列包含YABBY结构域，具有至少一个如下基序：基序1(SEQ ID NO：56)、基序2(SEQ IDNO：57)、基序5(SEQ ID NO：59)、基序6(SEQ ID NO：50)、基序7(SEQID NO：51)。

19.根据权利要求11、16或18的转基因植物或源自所述转基因植物的植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱和燕麦。

20.根据权利要求11、16、18或19中任一项的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为种子。

21.源自根据权利要求19的植物和/或根据权利要求20的植物可收获部分的产品。

22.CRC相关蛋白质编码核酸在增强植物的产率相关性状中的用途，其中所述CRC相关蛋白质的氨基酸序列包含YABBY结构域，具有至少一个如下基序：基序1(SEQ ID NO：56)、基序2(SEQ ID NO：57)、基序5(SEQ ID NO：59)、基序6(SEQ ID NO：50)、基序7(SEQ ID NO：51)。

23.根据权利要求22的用途，其中所述增强的产率相关性状是相对于对照植物增加的种子产率。

24.CRC相关多肽编码核酸在增加植物相对于对照植物的干旱胁迫耐受性的方法中的用途。

25.根据权利要求24的用途，其中所述干旱胁迫耐受性增加引起种子产率增加。

26.如SEQ ID NO：55所示的核酸在增加植物相对于对照植物的非生物胁迫耐受性中的用途。

27.根据权利要求26的用途，其中所述非生物胁迫耐受性引起种子产率增加。

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