CN101539511A - 测量纳米粒子体系光学特性参数的装置和方法 - Google Patents

Abstract

一种测量纳米粒子体系光学特性参数的装置和方法，主要包括测量纳米粒子体系反射率和透射率的改良单积分球测量装置，和结合反向倍加算法计算吸收系数和散射系数的办法。本发明的特点是：1)使用单积分球测量样品的反射率和透射率，积分球安置时光入射口和样品口的连线垂直于水平面，通过反射镜组调节光路切换测量模式；2)使用反向倍加算法由测量得出的反射率和透射率计算光学特性参数。本发明可以方便地得到纳米粒子体系的光学特性参数，尤其是细胞环境下纳米粒子体系的光学特性参数，不再因为样品的液态性质而产生性状改变的情况；可以分别计算出样品的吸收系数和散射系数。本方法的结构简单，简便快捷，精度高。

Description

测量纳米粒子体系光学特性参数的装置和方法

技术领域

本发明属于光学测量，特别是一种测量纳米粒子体系光学特性参数(主要是吸收系数、散射系数)的方法，该方法将传统的积分球技术进行改良，并结合反向倍加法(Inverse Adding-Doubling Method，简称为IAD)，使之能够精确测量易沉淀或分层的液态样品，特别是细胞环境下纳米粒子体系的吸收系数和散射系数，具有高精度、耗时短、简单高效的优点。

背景技术

随着纳米技术的不断发展，纳米粒子体系在细胞环境中的光学特性已经成为当前癌症成像和治疗研究的热点。细胞环境，包括单个细胞、细胞团聚、细胞溶液和生物组织。精确高效地测量细胞环境下纳米粒子体系的吸收系数和散射系数，对揭示细胞内部纳米粒子(单粒与团聚物)对激光能量转化的机制、光能量热能量分布以及细胞内微纳光热动力过程产生和演变的物理、化学机制都具有极其重要的意义。

N.W.S.Kam等人在文章“‘Carbon nanotubes as multifunctional biologicaltransporters and near-infrared agents for selective cancer celldestruction，’PNAS，vol.102，August 2005，p11600-11605”使用了一种方法(参见图1)，利用比尔定律(Beer’s law)

I＝I₀exp[-(μ_a+μ_s)d]                   (1)

测量细胞环境中纳米粒子的光学特性。其中，I₀和I分别是入射光强和出射光强，μ_a和μ_s分别是吸收系数和散射系数，d为光束在样品中传输的距离。在这个方案中，光束直接经过样品的吸收和散射后，在另一端被探测器接收。通过出射光强和入射光强的比值，就能计算出样品的光学特性。但是这种情况下，测量出的值只能是吸收系数与散射系数的和μ_a+μ_s，即消光系数，无法区分或者单独得到吸收系数和散射系数的值；并且由于探测器离样品较远，大量散射光散逸在探测器窗口之外的地方，造成能量损失，大大降低了测量的精确度。

另一方面，J.W.Pickering等人的文章“‘Double-integrating-sphere Systemfor Measuring the Optical Properties of Tissue，’J.Appl.Opt.，Vol.32，4，1993，p399-410.”中使用双积分球系统(参见图2)测量光学特性参数。但是在这种方法中，两个积分球中间的样品是竖直放置(纵向长度远大于横向长度)，样品为固态组织。而含有纳米粒子的细胞样品多处在悬浊液或者乳浊液状态下，所以使用上述文章中的双积分球系统将会导致样品沉淀或者分层，造成测量过程中样品光学特性参数的变化，影响最终测量结果的精确度；并且由于两个积分球之间的多重光交换和光逃逸，在使用相干光源(collimated irradiation)的情况下，双积分球技术测量误差要大于单积分球技术。

发明内容

本发明的目的是针对上述已有技术的在测量纳米粒子光学性质参数时不能区分吸收系数和散射系数的缺陷、因细胞环境下纳米粒子乳浊液或者悬浊液分层造成性状改变的缺陷、由于光逸散和光交换造成测量精度下降的缺陷，提供一种测定纳米粒子体系光学特性参数，尤其是细胞环境下纳米粒子体系光学特性参数的装置和方法。该装置和方法能够弥补上述已有技术的缺陷并且大大提高精确度、降低系统复杂度和节约测量时间。

本发明的技术解决方案如下：

一种测定纳米粒子体系光学特性参数的方法，主要是利用改进后的单积分球系统获取被测样品反射率和透射率，然后利用反向倍加法(Inverse Adding-DoublingMethod，简称为IAD)计算被测样品光学特性参数。

一种纳米粒子体系光学特性的测量装置，其特点在于该装置包括：

一个相干光源，沿该相干光源发出的相干光的前进方向依次设置光隔离器、斩波器、针孔光阑和第一反射镜，所述的第一反射镜的镜面与所述的相干光的光束成45°并具有绕其镜面的水平轴旋转的机构；

一个球心位于所述的相干光前进的延长线上的积分球，而且该积分球的入射口和样品口在竖直方向，以保证待测样品放置时水平方向尺度远远大于竖直方向尺度，在该积分球的水平赤道线上设置光电探测器；将待测样品置放在位于所述的样品口下方的样品平台上，该样品平台及其升降系统之间用螺丝固定，由升降系统提举样品平台将所述的待测样品贴合于所述的积分球的样品口上；

由第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜、第四反射镜和第五反射镜组成反射镜光路调节机构，在所述的第一反射镜的反射光的竖直向上方向是第二反射镜，第一反射镜和第二反射镜平行放置，第二反射镜再将光束反射沿水平方向到达第三反射镜，第二反射镜和第三反射镜夹角为90°，第三反射镜位于积分球的正上方；光束被第三反射镜反射竖直向下经所述的入射口进入积分球；将第一反射镜绕镜面的水平轴旋转90°后，这时光束经第一反射镜反射后竖直向下到达第四反射镜，第四反射镜和旋转后的第一反射镜平行放置；第四反射镜再将光束反射沿水平方向到达第五反射镜，第五反射镜和第四反射镜的夹角90°，第五反射镜位于积分球的正下方，光束被第五反射镜反射竖直向上经所述的样品口进入积分球；

所述的探测器的输出端接数字锁相放大器的一个输入端；

同步信号发生器的一个输出端接所述的斩波器，另一个输出端接所述的数字锁相放大器的另一输入端，为锁相放大器提供参考信号；

光束在积分球中被漫反射，最终被所述的光电探测器收集。

利用上述的测量装置测量细胞环境下纳米粒子体系光学特性的方法，包括以下步骤：

①测量参考信号：

在保证激光功率P恒定不变的情况下，利用一块已知漫反射率的标准漫反射板放置在样品平台上，旋转升降系统的旋钮，提升样品平台，使标准漫反射板紧密贴合到积分球的样品口，打开相干光源，相干激光通过光隔离器、斩波器和针孔光阑后被整形成直径为1mm的准直光束，该光束通过所述的反射镜光路调节机构从积分球的光入射口进入积分球并垂直入射到所述的标准漫反射板上，记录“相干光-反射模式”下的数字锁相放大器的电压数值；接着从样品平台上撤下标准漫反射板，记录下此时数字锁相放大器上的电压数值，两者的差值记做参考信号V_ref；

②标定积分球的几何参数b₁、b₂：

对于单积分球有积分球方程组(参见：J.W.Pickering，et al.“Twointegrating sphere with an intervening scattering sample，”J.Opt.Soc.Am.A，9，1992，621-631)

$\left\{\begin{array}{c}{V}_1\%=\frac{b_{1}f{R}_{\mathrm{cd}}}{1-b_2{R}_d}\\ V_2\%=\frac{b_{1}f{T}_{\mathrm{cd}}}{1-b_2{R}_d}\\ {V_1}^{\′}\%=\frac{b_1(1-\frac{s}{A}{R}_d)}{1-b_2{R}_d}\end{array}\right.$

式中：R_cd和T_cd分别是待测样品对相干光的漫反射率、漫透射率，R_d是对漫射光的反射率，A是球内表面总面积，s是样品口面积，f是球实际内壁面积占球内表面总面积的比例，它们都是积分球的尺寸参数，由积分球的生产厂家给出；b₁、b₂是积分球的几何参数；相对信号V₁％、V₂％和V₁′％分别是相干光-反射模式、相干光-透射模式和漫射光-反射模式三种模式下测得的电压信号值V₁、V₂、V₁′与参考信号V_ref的比值，其中我们称相干光束从积分球的入射口正入射至样品上的情况为“相干光-反射模式”，相应地我们把相干光束正入射到样品上透射后才进入积分球的情况称为“相干光-透射模式”，把相干光束从入射口进入积分球照射在积分球内壁上(相当于在球内有一个漫射光源)产生漫射光再照射样品的情况称为“漫射光-反射模式”。

根据上述积分球方程组，当样品口为空，即R_d＝0时，有b₁＝V₁′％。也就是说，样品口为空时漫射光-反射模式下测得的相对电压信号就是b₁的值；同理，设样品口放置标准漫反射板时漫射光-反射模式下测得的相对电压信号为V₁′％，将其与b₁还有积分球的尺寸参数一起代入积分球方程组的第三个方程，即可求得b₂的值；

具体标定步骤：微微调整第三反射镜与水平面的夹角，使光束直接照射在积分球内壁上，即样品口为空时的漫射光-反射模式，记下数字锁相放大器上此时显示的电压值；为了去除背景信号的影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，记下数字锁相放大器上此时显示的电压值，两次电压的差值记为V₁′，根据积分球方程组中第三个方程，有

$b_1=\frac{{V_1}^{\′}}{V_{\mathrm{ref}}}$

再将标准漫反射板放置在样品口，也就是样品口放置为标准漫反射板时的漫射光-反射模式，记下数字锁相放大器上的电压值；同样为了去除背景信号的影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，记下数字锁相放大器上此时显示的电压值，两次电压的差值记为V₁″，若标准漫反射板的反射率为R_d ^s，根据积分球方程组中第三个方程，有：

$b_2=\frac{\frac{{V_1}^{\′\′}}{V_{\mathrm{ref}}}-b_1+R_d^s\frac{s}{A}{b}_1}{R_d^s\frac{{V_1}^{\′\′}}{V_{\mathrm{ref}}}}$

重复上面的过程三次，得到三组数据，将测量结果和积分球的尺寸数据代入上述公式，计算后取平均值即为定标积分球的几何参数；

③将待测样品放置于样品平台上，由升降系统提升使之贴合于样品口，此时积分球测量处于漫射光-反射模式下，数字锁相放大器上显示电压信号V₁′；为消除背景信号影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，从数字锁相放大器记下此时的电压值V_1b′，则相对电压信号

${V_1}^{\′}\%=\frac{{V_1}^{\′}-{V_{1b}}^{\′}}{V_{\mathrm{ref}}}$

微微调整第三反射镜，使它与水平面的夹角回到45°，此时光束经过入射口进入积分球后正入射在待测样品上，积分球测量处于相干光-反射模式下，测得电压信号V₁，同样为了消除背景信号影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，从数字锁相放大器记下此时的电压值V_1b，相对电压信号为：

$V_1\%=\frac{V_1-V_{1b}}{V_{\mathrm{ref}}}$

将第一反射镜绕镜面的水平轴旋转90度，积分球测量变为相干光-透射模式，光束依次经第一反射镜、第四反射镜、第五反射镜和待测样品，透射入积分球，测得电压信号V₂，同样有背景信号V_2b，相对电压信号为：

$V_2\%=\frac{V_2-V_{2b}}{V_{\mathrm{ref}}}$

将上述数据和积分球的几何参数、尺寸参数代入方程组计算，得到待测样品的漫反射率透射率R_cd、漫透射率T_cd和对漫射光的反射率R_d；

④根据所得到的被测样品反射率和透射率数据，使用反向倍加法计算待测样品的吸收系数、散射系数：

首先把根据经验预估的一组光学特性参数(α，τ，g)和测量值(R_cd，T_cd，R_d)一起作为起始输入值，其中g是各向异性因子，而反照率α、光学深度τ与吸收系数μ_a、散射系数μ_s和待测样品的厚度d满足如下关系：

$\mathrm{\α}=\frac{{\mathrm{\μ}}_s}{{\mathrm{\μ}}_a+{\mathrm{\μ}}_s},$ τ＝d(μ_a+μ_s)

通过起始输入值和倍加法计算出相应反射率和透射率(R′_cd，T′_cd，R′_d)，将之与实际测量得到的反射率和透射率进行比较，继而修正得到新的一组光学特性参数；不断重复这个过程，直到找到的光学特性参数能够吻合实际测量到的待测样品光传输情况；

在反射率和透射率被计算时，定义一个步长M(α，τ，g)来表征计算值与测量值的差距：

$M(\mathrm{\α},\mathrm{\τ},g)=\frac{R_{\mathrm{calc}}-R_{\mathrm{meas}}}{R_{\mathrm{meas}}+{10}^{-6}}+\frac{T_{\mathrm{calc}}-T_{\mathrm{meas}}}{T_{\mathrm{meas}}+{10}^{-6}}$

其中：R_calc和T_calc是计算值，R_meas和T_meas是测量值，10^-6是为了防止分母为0的情况，所谓“找到的光学特性参数能够吻合实际测量到的样品光传输情况”即指步长M(α，τ，g)≤10^-6时的情况，这时候自动停止运算，我们认为此时输出的光学特性参数(α，τ，g)就是待测样品的光学特性；

⑤再利用上述公式 $\mathrm{\α}=\frac{{\mathrm{\μ}}_s}{{\mathrm{\μ}}_a+{\mathrm{\μ}}_s},$ τ＝d(μ_a+μ_s)，由所述的反照率α、光学深度τ，计算待测样品的吸收系数μ_a、散射系数μ_s。

本发明的技术效果

1、可以方便地得到纳米粒子体系的光学特性参数，尤其是细胞环境下纳米粒子体系的光学特性参数，能避免因为样品的液态性质而产生性状改变影响测量结果的情况发生；

2、可以分别计算出样品的吸收系数和散射系数，而不仅仅是得到消光系数(吸收系数和散射系数之和)。这样有利于研究细胞内部纳米粒子(单粒与团聚物)对激光能量转化的机制、光能量热能量分布以及细胞内微纳光热动力过程产生和演变的物理、化学机制；

3、本发明装置的结构简单，方法更为简便快捷，测算出的数据精度更高。

附图说明

图1是N.W.S.Kam等人文章中使用方案的示意图。

图2是J.W.Pickering等人文章中使用的双积分球测量方法示意图。

图3是本发明装置实施例的结构框图。

图4是本发明实施例的积分球、样品平台和升降台装置剖面图。

图5是样品平台的俯视图。

图6是积分球相干光-反射模式的示意图。

图7是积分球相干光-透射模式的示意图。

图8是积分球漫射光-反射模式的示意图。

图9是IAD算法流程图。

图中：1-光源  2-放置被测样品的容器  3-光电探测器  4-双积分球中的反射球  5-双积分球中的透射球  6-样品  7-光电探测器、8-光电探测器  9-光电探测器  10-半导体激光器  11-光隔离器  12-斩波器  13-针孔光阑  14-第一反射镜  15-第二反射镜  16-第三反射镜  17-第四反射镜  18-第五反射镜  19-积分球  20-待测样品  21-探测器和前置放大器  22-入射口  23-样品口  24-数字锁相放大器  25-斩波器的电流驱动器  26-升降台  27-样品平台  28-连接升降台和样品平台的固定螺丝的滑槽  29-样品载玻片的方形载台30-方形卡槽  31-入射相干光光束

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。

先请参阅图3和图4，由图可见，本发明纳米粒子体系光学特性的测量装置，该装置包括：

一个相干光源10，沿该相干光源10发出的相干光的前进方向依次设置光隔离器11、斩波器12、针孔光阑13和第一反射镜14，所述的第一反射镜14的镜面与所述的相干光的光束成45°并具有绕其镜面的水平轴旋转的机构；

一个球心位于所述的相干光前进的延长线上的积分球19，而且该积分球19的入射口22和样品口23在竖直方向，以保证待测样品20放置时水平方向尺度远远大于竖直方向尺度，在该积分球19的水平赤道线上设置光电探测器21；将待测样品20置放在位于所述的样品口23下方的样品平台27上，该样品平台27及其升降系统26之间用螺丝固定，由升降系统26提举样品平台27将所述的待测样品20贴合于所述的积分球19的样品口23上；

由第一反射镜14、第二反射镜15、第三反射镜16、第四反射镜17和第五反射镜18组成反射镜光路调节机构，在所述的第一反射镜14的反射光的竖直向上方向是第二反射镜15，第二反射镜15和第一反射镜14平行放置；第二反射镜15再将光束反射沿水平方向到达第三反射镜16，第二反射镜15和第三反射镜16夹角为90°，第三反射镜16位于积分球19的正上方，光束被第三反射镜16反射竖直向下经所述的入射口22进入积分球19；将第一反射镜14绕镜面的水平轴旋转90°后，这时光束经第一反射镜14反射后竖直向下到达第四反射镜17，第四反射镜17和旋转后的第一反射镜14平行放置；第四反射镜17再将光束反射沿水平方向到达第五反射镜18，第五反射镜18和第四反射镜17的夹角90°，第五反射镜18位于积分球19的正下方，光束被第五反射镜(18)反射竖直向上经所述的样品口23进入积分球19；

所述的探测器21的输出端接数字锁相放大器24的一个输入端；

同步信号发生器25的一个输出端接所述的斩波器12，另一个输出端接所述的数字锁相放大器24的另一输入端，为锁相放大器24提供参考信号；

光束在积分球19中被漫反射，最终被所述的光电探测器21收集。

本实施例中：

1、装置的相干光源10为半导体激光器；

2、光隔离器11的作用相当于一个光学二极管，它允许线性偏振光沿一个方向传播，却阻挡反方向的光线传播。这样就避免了由于器件反射所造成的光强不稳。斩波器12的作用是调制信号频率，并和电流驱动器25一起为后面的数字锁相放大器24提供参考信号。针孔光阑13将激光整形为1mm的水平光束。

3、该系统中积分球19的放置与普通积分球系统的安放不同：普通积分球的样品口和光入射口连线与水平面平行，而本发明中积分球19的入射口22和样品口23在竖直方向，以保证样品放置时水平方向尺度远远大于竖直方向尺度，这样就解决了样品沉淀分层因而改变光学特性的问题。相应的待测样品20放置方式也做了如下改进：样品放置在样品平台27(参见图5)上由升降系统26提升贴合到积分球19的样品口23。光能量在积分球19中被漫反射，最终被位于积分球水平赤道线上的光电探测器21收集，光电探测器21将信号通过前置放大器二级放大后传递到数字锁相放大器24。

利用上述的测量装置测量纳米粒子体系光学特性的方法，包括以下步骤：

①测量参考信号：

在保证激光功率P恒定不变的情况下，利用一块已知漫反射率的标准漫反射板放置在样品平台27上，使标准漫反射板紧密贴合到积分球的样品口23，打开相干光源10，相干激光通过光隔离器11、斩波器12和针孔光阑13后被整形成直径为1mm的准直光束，该光束通过所述的反射镜光路调节机构从积分球19的入射口22进入积分球19并垂直入射到所述的标准漫反射板上，记录此时数字锁相放大器24的电压数值；接着从样品平台27上撤下标准漫反射板，记录下此时数字锁相放大器24上的电压数值，两者的差值记做参考信号V_ref；

②标定积分球19的几何参数b₁、b₂：

②标定积分球的几何参数b₁、b₂。标定原理如下：

根据积分球原理有积分球方程组(2)(参见：J.W.Pickering，et al.“Twointegrating sphere with an intervening scattering sample，”J.Opt.Soc.Am.A，9，1992，621-631)

$\left\{\begin{array}{c}{V}_1\%=\frac{b_{1}f{R}_{\mathrm{cd}}}{1-b_2{R}_d}\\ V_2\%=\frac{b_{1}f{T}_{\mathrm{cd}}}{1-b_2{R}_d}\\ {V_1}^{\′}\%=\frac{b_1(1-\frac{s}{A}{R}_d)}{1-b_2{R}_d}\end{array}\right.---\left(2\right)$

式中：R_cd和T_cd分别是待测样品20对相干光的漫反射率、漫透射率，R_d是对漫射光的反射率，A是球内表面总面积，s是样品口面积，f是球实际内壁面积占球内表面总面积的比例，它们都是积分球的尺寸参数，由积分球的生产厂家给出；b₁、b₂是积分球的几何参数；相对信号V₁％、V₂％和V₁′％分别是相干光-反射模式、相干光-透射模式和漫射光-反射模式三种模式下测得的电压信号值V₁、V₂、V₁′与参考信号V_ref的比值；

具体标定步骤如下：微微调整第三反射镜16与水平面的夹角，使光束直接照射在积分球内壁上，记下数字锁相放大器上此时显示的电压值；为了去除背景信号的影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，记下数字锁相放大器上此时显示的电压值，两次电压的差值记为V₁′，根据积分球方程组中第三个方程，有

$b_1=\frac{{V_1}^{\′}}{V_{\mathrm{ref}}}---\left(3\right)$

再将标准漫反射板放置在样品口23，记下数字锁相放大器上的电压值；同样为了去除背景信号的影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，记下数字锁相放大器上此时显示的电压值，两次电压的差值记为V₁″，若标准漫反射板的反射率为R_d ^s，根据积分球方程组中第三个方程，有：

$b_2=\frac{\frac{{V_1}^{\′\′}}{V_{\mathrm{ref}}}-b_1+R_d^s\frac{s}{A}{b}_1}{R_d^s\frac{{V_1}^{\′\′}}{V_{\mathrm{ref}}}}---\left(4\right)$

重复上面的过程三次，得到三组数据，将测量结果和积分球的尺寸数据代入上述公式，计算后取平均值即为定标积分球的几何参数；

③将待测样品20放置于样品平台27上，由升降系统26提升使之贴合于样品口23，此时数字锁相放大器24上显示电压信号V₁′；为消除背景信号影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，从数字锁相放大器24记下此时的电压值V_1b′。则相对电压信号

${V_1}^{\′}\%=\frac{{V_1}^{\′}-{V_{1b}}^{\′}}{V_{\mathrm{ref}}}---\left(5\right)$

微微调整第三反射镜16，使它与水平面的夹角回到45°，此时光束经过入射口22进入积分球19后正入射在待测样品20上，测得电压信号V₁，同样为了消除背景信号影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，从数字锁相放大器24记下此时的电压值V_1b，相对电压信号为：

$V_1\%=\frac{V_1-V_{1b}}{V_{\mathrm{ref}}}---\left(6\right)$

将第一反射镜14绕镜面的水平轴旋转90度，光束依次经第一反射镜14、第四反射镜17、第五反射镜18和待测样品20，透射入积分球19，测得电压信号V₂，同样有背景信号V_2b，相对电压信号为：

$V_2\%=\frac{V_2-V_{2b}}{V_{\mathrm{ref}}}---\left(7\right)$

将上述数据和积分球19的几何参数、尺寸参数代入积分球方程组计算，得到待测样品20的漫反射率透射率R_cd、漫透射率T_cd和对漫射光的反射率R_d；

④根据所得到的被测样品反射率和透射率数据，使用反向倍加法计算待测样品20的吸收系数和散射系数：

根据所得到的被测样品反射率和透射率数据，使用S.Prahl的IAD算法(参见“S.A.Prahl，M.J.C.van Gemert，and A.J.Welch，‘Determining theoptical properties of turbid media using the adding-doubling method，’Appl.Opt.32，1993，p559-568)计算得出样品的各个光学特性参数(吸收系数、散射系数、各向异性因子)。通过反射率和透射率计算光学特性参数的常用方法除了IAD法外还有蒙特卡洛算法，但是相比蒙特卡洛算法，IAD算法更加快速便捷，精度也能达到实验的要求。

反向倍加法IAD算法的原理：

反向倍加法IAD是关于传输方程的一种数学解法。“反向”这个词的意思是，根据光学特性计算反射率和透射率的普通过程的逆过程。“倍加”这个词来自于vande Hulst和Plass等用来解层状模型(a slab geometry)下辐射传输方程的一种技术。倍加方法(Adding-doubling Method，简称AD方法)假定片状生物组织的某一层在某个角度上的入射光的反射和传播已知。那么对于厚度为已知生物组织的两倍，且特性相同的层状生物组织，就可以把它分为相同的两层，然后再把每层组织的反射和传播分量相加。这样，对于一块任意厚度的层状生物组织的反射和传播计算，就可以先通过已知特性算得一薄层的反射和传播，然后根据倍加方法获得。也就是说，通过成倍增加初始薄层的吸收和单个散射直到所需要的厚度为止。对于特性不同的生物组织层，如果把倍加方法扩展为叠加方法，那么具有不同光学特性的样品也可以模仿上面的方法。AD方法的具体算法参见“van de Hulst，‘MultipleLight Scattering，’New York：Academic Press，1980”。

IAD算法在实现时(参见图9)，首先把根据经验预估的一组光学特性参数(α，τ，g)和测量值(R_cd，T_cd，R_d)一起作为起始输入值，其中g是各向异性因子，而反照率α、光学深度τ与吸收系数μ_a、散射系数μ_s还有样品厚度d满足如下关系：

$\mathrm{\α}=\frac{{\mathrm{\μ}}_s}{{\mathrm{\μ}}_a+{\mathrm{\μ}}_s},$ τ＝d(μ_a+μ_s)                     (8)

通过起始输入值和倍加法计算出相应反射率和透射率(R′_cd，T′_cd，R′_d)，将之与实际测量得到的反射率和透射率进行比较，继而修正得到新的一组光学特性参数。不断重复这个过程，直到找到的光学特性参数能够吻合实际测量到的样品光传输情况。在反射率和透射率被计算时，定义一个步长M(α，τ，g)来表征计算值与测量值的差距：

$M(\mathrm{\α},\mathrm{\τ},g)=\frac{R_{\mathrm{calc}}-R_{\mathrm{meas}}}{R_{\mathrm{meas}}+{10}^{-6}}+\frac{T_{\mathrm{calc}}-T_{\mathrm{meas}}}{T_{\mathrm{meas}}+{10}^{-6}}---\left(9\right)$

其中R_calc和T_calc是计算值，R_meas和T_meas是测量值，10^-6是为了防止分母为0的情况(反射率或者透射率可能为0)。所谓“找到的光学特性参数能够吻合实际测量到的样品光传输情况”即指步长M(α，τ，g)≤10^-6时的情况，这时候自动停止运算，我们认为此时输出的光学特性参数(α，τ，g)就是样品的光学特性。再由反照率α、光学深度τ我们就可得到吸收系数μ_a、散射系数μ_s。具体流程如图9所示。

1)半导体激光器(10)，激光波长设为780nm；2)沿光束前进方向设有法拉第旋光器作为光隔离器(11)、斩波器(12)还有针孔(13)，光束通过针孔(13)后被被整形为直径1mm的准直光束；

本实例所用样品为吞噬有多壁碳纳米管(mutiple-wall carbon nanotubes，简称MWNTs)的梨形四膜虫，样品的处理步骤如下：

首先，对MWNTs进行纯化和切割。MWNTs从深圳纳米港有限公司购得，纯度为95％产长度为几十微米。将MWNTs与60％的硝酸溶液一起在60摄氏度恒温磁力搅拌下回流36小时，经过离心(4000rpm)和清洗去除多余硝酸(PH值5~6)后，将所得产物在50摄氏度下真空干燥12小时，获得提纯后的MWNTs。将纯化后的MWNTs放进50mg/ml的2-amino-ethylene-1，1-bisphosphonic acid溶液中(AEDP溶液)，经过超声波振荡(20kHz，300W，cup-horn)5小时后，完成切割和功能化的过程。这里选择AEDP溶液是为了避免对超声波装置的化学腐蚀。而后将获得的混合物经过离心(4000rpm)去除不溶的杂质。将这时的悬浊液用蒸馏水按体积比1∶10的比例稀释，再通过120小时的透析(使用16kDa的透析管)去除未反应的AEDP和其他杂质。这样制得的母液中MWNTs的平均长度在600nm左右，并且在纯水溶液中稳定。

在摄取MWNTs之前，把处在指数生长期的梨形四膜虫(购买于中科院水生生物研究所)从培养基中提取出来分置入培养瓶内，加入培养基重新培养至每毫升细胞悬浮液中含有2.2×10³个细胞。而后小心地在1毫升细胞悬浮液中混入上面所述中制备的MWNTs母液，在26摄氏度的恒温摇床中进行培养，即形成待测样品。可以根据不同的需要改变混合液中MWNTs的质量浓度。样品的处理配置工作在实验测量开始前完成。

3、此时积分球测量处于漫射光-反射模式下，数字锁相放大器上显示电压信号V₁′；为消除背景信号影响，用黑色障碍物(黑色纸张)阻挡光束进入积分球，从数字锁相放大器记下此时的电压值V_1b′。则相对电压信号

${V_1}^{\′}\%=\frac{{V_1}^{\′}-{V_{1b}}^{\′}}{V_{\mathrm{ref}}}$

调节图3中第三反射镜16，使光束经过入射口进入积分球后正入射在样品上，此时积分球测量处于相干光-反射模式下，测得电压信号V₁，同样为了消除背景信号影响，有电压值V_1b，相对电压信号

$V_1\%=\frac{V_1-V_{1b}}{V_{\mathrm{ref}}}$

将图3中第一反射镜14绕镜面的水平轴旋转90度，积分球测量变为相干光-透射模式，测得电压信号V₂，同样有背景信号V_2b，相对电压信号

$V_2\%=\frac{V_2-V_{2b}}{V_{\mathrm{ref}}}$

将上述数据和积分球的几何参数、尺寸参数代入方程组(2)，计算即可得到样品的反射率和透射率(R_cd，T_cd，R_d)。

4、把测量值(R_cd，T_cd，R_d)和根据经验预估的一组光学特性参数(α′，τ′，g′)一起作为起始输入值，输入到S.Prahl的IAD程序，用IAD算法计算出被测样品的光学特性参数(α，τ，g)，IAD算法的流程图见图9。再根据反照率α、光学深度τ与吸收系数μ_a、散射系数μ_s还有样品厚度d的如下关系：

$\mathrm{\α}=\frac{{\mathrm{\μ}}_s}{{\mathrm{\μ}}_a+{\mathrm{\μ}}_s},$ τ＝d(μ_a+μ_s)

计算出被测样品的吸收系数和散射系数。

综合以上步骤，我们最终完成了纳米粒子体系光学特性参数的测量，分别得到了被测样品的吸收系数和散射系数，测量过程中被测样品未因为重力作用发生沉淀分层现象，因为只用到一个积分球，所以测量精度相比其他技术更高，测量速度也更快。

Claims (2)

1、一种纳米粒子体系光学特性的测量装置，其特征在于该装置包括：

一个相干光源(10)，沿该相干光源(10)发出的相干光的前进方向依次设置光隔离器(11)、斩波器(12)、针孔光阑(13)和第一反射镜(14)，所述的第一反射镜(14)的镜面与所述的相干光的光束成45°并具有绕其镜面的水平轴旋转的机构；

一个球心位于所述的相干光前进的延长线上的积分球(19)，而且该积分球(19)的入射口(22)和样品口(23)在竖直方向，以保证待测样品(20)放置时水平方向尺度远远大于竖直方向尺度，在该积分球(19)的水平赤道线上设置光电探测器(21)；将待测样品(20)置放在位于所述的样品口(23)下方的样品平台(27)上，该样品平台(27)及其升降系统(26)之间用螺丝固定，由升降系统(26)提举样品平台(27)将所述的待测样品(20)贴合于所述的积分球(19)的样品口(23)上；

由第一反射镜(14)、第二反射镜(15)、第三反射镜(16)、第四反射镜(17)和第五反射镜(18)组成反射镜光路调节机构，在所述的第一反射镜(14)的反射光的竖直向上方向是第二反射镜(15)，第二反射镜(15)和第一反射镜(14)平行放置；第二反射镜(15)再将光束反射沿水平方向到达第三反射镜(16)，第二反射镜(15)和第三反射镜(16)夹角为90°，第三反射镜(16)位于积分球(19)的正上方，光束被第三反射镜(16)反射竖直向下经所述的入射口(22)进入积分球(19)；将第一反射镜(14)绕镜面的水平轴旋转90°后，这时光束经第一反射镜(14)反射后竖直向下到达第四反射镜(17)，第四反射镜(17)和旋转后的第一反射镜(14)平行放置；第四反射镜(17)再将光束反射沿水平方向到达第五反射镜(18)，第五反射镜(18)和第四反射镜(17)的夹角90°，第五反射镜(18)位于积分球(19)的正下方，光束被第五反射镜(18)反射竖直向上经所述的样品口(23)进入积分球(19)；

所述的探测器(21)的输出端接数字锁相放大器(24)的一个输入端；

同步信号发生器(25)的一个输出端接所述的斩波器(12)，另一个输出端接所述的数字锁相放大器(24)的另一输入端，为锁相放大器(24)提供参考信号；

光束在积分球(19)中被漫反射，最终被所述的光电探测器(21)收集。

2、一种利用权利要求1所述的测量装置测量纳米粒子体系光学特性的方法，其特征在于包括以下步骤：

①测量参考信号：

在保证激光功率P恒定不变的情况下，利用一块已知漫反射率的标准漫反射板放置在样品平台(27)上，使标准漫反射板紧密贴合到积分球的样品口(23)，打开相干光源(10)，相干激光通过光隔离器(11)、斩波器(12)和针孔光阑(13)后被整形成直径为1mm的准直光束，该光束通过所述的反射镜光路调节机构从积分球(19)的入射口(22)进入积分球(19)并垂直入射到所述的标准漫反射板上，记录此时数字锁相放大器(24)的电压数值；接着从样品平台(27)上撤下标准漫反射板，记录下此时数字锁相放大器(24)上的电压数值，两者的差值记做参考信号V_ref；

②标定积分球(19)的几何参数b₁、b₂：

根据积分球方程组

$\left\{\begin{array}{c}{V}_1\%=\frac{b_{1}f{R}_{\mathrm{cd}}}{1-b_2{R}_d}\\ V_2\%=\frac{b_{1}f{T}_{\mathrm{cd}}}{1-b_2{R}_d}\\ {V_1}^{\′}\%=\frac{b_1(1-\frac{s}{A}{R}_d)}{1-b_2{R}_d}\end{array}\right.$

式中：R_cd和T_cd分别是待测样品(20)对相干光的漫反射率、漫透射率，R_d是对漫射光的反射率，A是球内表面总面积，s是样品口面积，f是球实际内壁面积占球内表面总面积的比例，它们都是积分球的尺寸参数，由积分球的生产厂家给出；b₁、b₂是积分球的几何参数；相对信号V₁％、V₂％和V₁′％分别是相干光-反射模式、相干光-透射模式和漫射光-反射模式三种模式下测得的电压信号值V₁、V₂、V₁′与参考信号V_ref的比值；

具体标定步骤如下：微微调整第三反射镜(16)与水平面的夹角，使光束直接照射在积分球内壁上，记下数字锁相放大器上此时显示的电压值；为了去除背景信号的影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，记下数字锁相放大器上此时显示的电压值，两次电压的差值记为V₁′，根据积分球方程组中第三个方程，有

$b_1=\frac{{V_1}^{\′}}{V_{\mathrm{ref}}}$

再将标准漫反射板放置在样品口(23)，记下数字锁相放大器上的电压值；同样为了去除背景信号的影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，记下数字锁相放大器上此时显示的电压值，两次电压的差值记为V₁″，若标准漫反射板的反射率为R_d ^s，根据积分球方程组中第三个方程，有：

$b_2=\frac{\frac{{V_1}^{\′\′}}{V_{\mathrm{ref}}}-b_1+R_d^s\frac{s}{A}{b}_1}{R_d^s\frac{{V_1}^{\′\′}}{V_{\mathrm{ref}}}}$

重复上面的过程三次，得到三组数据，将测量结果和积分球的尺寸数据代入上述公式，计算后取平均值即为定标积分球的几何参数；

③将待测样品(20)放置于样品平台(27)上，由升降系统(26)提升使之贴合于样品口(23)，此时数字锁相放大器(24)上显示电压信号V₁′；为消除背景信号影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，从数字锁相放大器(24)记下此时的电压值V_1b′。则相对电压信号

${V_1}^{\′}\%=\frac{{V_1}^{\′}-{V_{1b}}^{\′}}{V_{\mathrm{ref}}}$

微微调整第三反射镜(16)，使它与水平面的夹角回到45°，此时光束经过入射口(22)进入积分球(19)后正入射在待测样品(20)上，测得电压信号V₁，同样为了消除背景信号影响，用黑色障碍物阻挡光束进入积分球，从数字锁相放大器(24)记下此时的电压值V_1b，相对电压信号为：

$V_1\%=\frac{V_1-V_{1b}}{V_{\mathrm{ref}}}$

将第一反射镜(14)绕镜面的水平轴旋转90度，光束依次经第一反射镜(14)、第四反射镜(17)、第五反射镜(18)和待测样品(20)，透射入积分球(19)，测得电压信号V₂，同样有背景信号V_2b，相对电压信号为：

$V_2\%=\frac{V_2-V_{2b}}{V_{\mathrm{ref}}}$

将上述数据和积分球(19)的几何参数、尺寸参数代入积分球方程组计算，得到待测样品(20)的漫反射率透射率R_cd、漫透射率T_cd和对漫射光的反射率R_d；

④根据所得到的被测样品反射率和透射率数据，使用反向倍加法计算待测样品(20)的吸收系数和散射系数：

首先把根据经验预估的一组光学特性参数(α，τ，g)和测量值(R_cd，T_cd，R_d)一起作为起始输入值，其中g是各向异性因子，而反照率α、光学深度τ与吸收系数μ_a、散射系数μ_s和待测样品(20)的厚度d满足如下关系：

$\mathrm{\α}=\frac{{\mathrm{\μ}}_s}{{\mathrm{\μ}}_a+{\mathrm{\μ}}_s},$ τ＝d(μ_a+μ_s)

通过起始输入值和倍加法计算出相应反射率和透射率(R′_cd，T′_cd，R′_d)，将之与实际测量得到的反射率和透射率进行比较，继而修正得到新的一组光学特性参数；不断重复这个过程，直到找到的光学特性参数能够吻合实际测量到的待测样品光传输情况；

在反射率和透射率被计算时，定义一个步长M(α，τ，g)来表征计算值与测量值的差距：

$M(\mathrm{\α},\mathrm{\τ},g)=\frac{R_{\mathrm{calc}}-R_{\mathrm{meas}}}{R_{\mathrm{meas}}+{10}^{-6}}+\frac{T_{\mathrm{calc}}-T_{\mathrm{meas}}}{T_{\mathrm{meas}}+{10}^{-6}}$

其中：R_calc和T_calc是计算值，R_meas和T_meas是测量值，10^-6是为了防止分母为0的情况，所谓“找到的光学特性参数能够吻合实际测量到的样品光传输情况”即指步长M(α，τ，g)≤10^-6时的情况，这时候自动停止运算，我们认为此时输出的光学特性参数(α，τ，g)就是待测样品的光学特性；

⑤再利用下列公式 $\mathrm{\α}=\frac{{\mathrm{\μ}}_s}{{\mathrm{\μ}}_a+{\mathrm{\μ}}_s},$ τ＝d(μ_a+μ_s)，由所述的反照率α、光学深度τ，计算待测样品(20)的吸收系数μ_a、散射系数μ_s。

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