CN101537185A - 一种肿瘤细胞主动靶向载药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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楼一层
颜香凤
虎征宇
杨翰
阮班昭
黄芬
易辉
周园
胡佳兴
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Abstract

一种肿瘤细胞主动靶向载药系统，其成分含量(重量)为：牛血清白蛋白100～200份，叶酸200～400份，25％戊二醛0.05～0.10份，乙醇0.005～0.01份，无水二甲基亚砜5～15份，二环己基碳二亚胺80～100份，N－羟基琥珀酰亚胺70～80份及三乙胺0.4～0.6份，无水丙酮100～200份，乙醚100～200份，聚丁二酸丁二醇酯50～100份。该载药系统包括叶酸活性酯、叶酸－牛血清白蛋白和胶体混悬液的制备步骤。该载药系统在杀伤高表达叶酸受体的肿瘤细胞的同时，对正常组织毒性小；且叶酸免疫原性低、易于修饰、易贮存，具有到达靶点时间短、血液清除速度快等优点；用于肿瘤化疗时具有明显优势。本发明还公开了肿细胞主动靶向载药系统的制备方法和应用。

Description

一种肿瘤细胞主动靶向载药系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药品领域，具体涉及一种肿瘤细胞主动靶向的载药系统、该载药系统的制备方法及该载药系统对抗肿瘤药物的开发应用。
背景技术
肿瘤(癌症)的发病率正在不断地上升，已成为严重危害人类健康的常见疾病。化疗作为肿瘤治疗的重要手段之一，在恶性肿瘤治疗过程中具有手术和放疗不能代替的地位。但现有的抗肿瘤药物选择性不高，既杀伤肿瘤细胞，也可能损害体内某些类型的正常细胞，因而在治疗中常出现较明显的毒性反应，影响疗效。化疗药物作为治疗肿瘤的有效制剂已被公认，但要能有效杀伤肿瘤细胞，必须使细胞内积聚的药物分子达到相当数量。研究表明即使是用最强的药物杀伤最敏感的肿瘤细胞，靶细胞内积聚的药物分子也应达到106个以上才能获得有效的杀伤。虽然提高剂量可以满足这一要求，但随着药物剂量的加大，在疗效提高的同时由于药物的无选择性而会引起严重的毒副作用。而药物的靶向治疗可解决这一难题。
近几十年来，癌症的靶向治疗技术研究已得到广泛重视。靶向治疗能在病灶部位保持相对较高的药物浓度，延长药物的作用时间，提高对肿瘤细胞的杀伤力，减轻药物的不良反应，从而减轻患者的痛苦。因此，将靶向制剂用于肿瘤化疗具有明显的优势。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种肿瘤细胞主动靶向的载药系统，该载药系统用于肿瘤化疗时具有明显的优势，其在杀伤高表达叶酸受体的肿瘤细胞的同时，对正常组织的毒性较低，且该载药系统制备方法简单，易于实施。
本发明按下述技术方案解决其技术问题：
本发明提供的肿瘤细胞主动靶向的载药系统，是一种以长春新碱作为活性药物，所需辅料药物牛血清白蛋白为载体材料，叶酸为靶头，利用叶酸对叶酸受体的特异性靶向作用，将纳米粒靶向到高度表达叶酸受体的肿瘤细胞，制备而成叶酸受体介导的肿瘤细胞主动靶向的载药系统。按重量份计，该载药系统的有效成分含量为长春新碱5～10份，所需其他制备材料：牛血清白蛋白100～200份，叶酸200～400份，25％戊二醛0.05～0.10份，乙醇0.005～0.01份，无水二甲基亚砜5～15份，二环己基碳二亚胺80～100份，N-羟基琥珀酰亚胺70～80份及三乙胺0.4～0.6份，无水丙酮100～200份，乙醚100～200份，聚丁二酸丁二醇酯50～100份。
本发明提供的肿瘤细胞主动靶向的载药系统，其制备方法包括以下步骤：
(1)叶酸活性酯的制备：称取200～400份叶酸，溶于5～15份无水二甲基亚砜中，再加入80～100份二环己基碳二亚胺和70～80份N-羟基琥珀酰亚胺及0.4～0.6份三乙胺，28～30℃反应过夜，过滤除去反应副产物，减压蒸馏除去部分溶剂，在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30％丙酮的无水乙醚溶液中，得到黄色沉淀物，过滤，再经无水乙醚洗涤数遍后真空干燥，得到叶酸活性酯；
(2)叶酸-牛血清白蛋白的制备：先将牛血清白蛋白溶于定量pH为10～11的碳酸盐缓冲液中，加入适量叶酸活性酯的无水二甲基亚砜，室温搅拌，反应3～5小时后，将得到的产物过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱以pH为7～8的聚丁二酸丁二醇酯缓冲溶液进行洗涤，再按照0.5～2ml·min-1的流速分段收集流出液，前段淡黄色有乳光部份经冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白；
(3)胶体混悬液的制备：按重量份计，取制得的叶酸-牛血清白蛋白100～200份，溶于缓冲溶液中，加入长春新碱5～10份，高速搅拌，缓慢滴加无水乙醇；溶液浑浊后，继续缓慢滴加0.05～0.10份交联剂戊二醛溶液，搅拌固化，减压蒸馏除去乙醇，得到具有肿瘤细胞主动靶向的胶体混悬液，该胶体混悬液作为肿瘤细胞主动靶向的载药系统。
在制备叶酸活性酯过程中可采用以下的方法：称取300份叶酸，溶于10份无水二甲基亚砜中，再加入90份二环己基碳二亚胺和75份N-羟基琥珀酰亚胺及0.5份三乙胺，30℃反应过夜，过滤除去反应副产物，减压蒸馏除去部分溶剂，在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30％丙酮的无水乙醚溶液中，得到黄色沉淀物，过滤，无水乙醚洗涤数遍后真空干燥，得到叶酸活性酯。
在制备叶酸-牛血清白蛋白过程中可采用以下方法：将牛血清白蛋白100～200份溶于pH为10.5的碳酸盐缓冲液中，加入200～400份叶酸活性酯的无水二甲基亚砜，室温搅拌，反应数小时后，将得到的过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱以pH为7.4的聚丁二酸丁二醇酯缓冲溶液进行洗涤，再按照1ml·min-1的流速分段收集流出液，前段淡黄色有乳光部份经冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白。
本发明提供的肿瘤细胞主动靶向的载药系统，其用于以下方面：该载药系统对肿瘤细胞所具有的主动靶向作用，叶酸受体一般在正常组织中的表达高度保守，只在脉络丛、胎盘、肺、肠以及肾等一些正常上皮组织中有不同的表达，且仅分布于上皮细胞极化表面，不易接近血中的叶酸偶联物，细胞对药物的摄取则是通过肿瘤细胞表面丰富的叶酸受体介导产生的，因此通过载体结构修饰或识别，将药物定向运送至病变部位发挥药效而不损伤周围的正常细胞、组织和器官的体系。
本发明与现有技术相比具有以下的突出的效果：
1.可用于对抗肿瘤药物的开发利用。
2.与目前市面上用于肿瘤的药物具有以下的主要优势：
其一，通过牛血清白蛋白(BSA)载体材料进行结构修饰或识别作用，将药物定向运送至病变部位发挥药效而不损伤周围的正常细胞、组织和器官的体系。
其二，叶酸(FA)受体一般在正常组织中的表达高度保守，只在脉络丛、胎盘、肺、肠以及肾等一些正常上皮组织中有不同的表达，且仅分布于上皮细胞极化表面，不易接近血中的叶酸偶联物。
其三，以牛血清白蛋白为载体材料，具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点。
其四，以长春新碱(VCR)作为活性药物，长春新碱能抗癌，疗效比长春碱约高10倍，用于治疗急性淋巴细胞性白血病，疗效显著，对其他急性白血病、何杰金氏病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤和乳腺癌也有疗效。
3.制备方法简单：不需要特殊设备，用常规设备和工艺就能够生产。易于实施。
4.本发明以蛋白质荧光探针FITC(Fluorescein isothiocyanate，异硫氰基荧光素)为基础，采用经典方法对牛血清白蛋白进行FITC标记，采用荧光分析法研究人子宫颈癌HeLa细胞、人结肠癌CaCo-2细胞及猴肾细胞COS-1对各型牛血清白蛋白纳米粒的摄取情况，实验表明FA-BSA-NP被不同细胞摄取情况却明显不同，Hela细胞荧光强度强于CaCo-2细胞的荧光强度，这两种细胞的强度又都极强于COS-1细胞，这就说明FA-BSA-NP对肿瘤细胞具有主动靶向性，而且是通过肿瘤细胞表面的叶酸受体介导产生靶向性。
总之，本发明提供的肿瘤细胞主动靶向的载药系统可用于对抗肿瘤药物的开发利用，该载药系统在杀伤高表达叶酸受体的肿瘤细胞的同时，对正常组织的毒性较低。且叶酸免疫原性低、易于修饰、体积小、易穿透肿瘤、化学和生物稳定性高、成本低、易贮存，具有到达靶点时间短、血液清除速度快、穿透能力强、几乎无人体免疫反应发生等优点，用于肿瘤化疗时具有明显的优势。
附图说明
图1为VCR溶液对各型细胞的抑制情况的曲线图。
图2为VCR-BSA-NP对各型细胞的抑制情况的曲线图。
图3为VCR-FA-BSA-NP对各型细胞的抑制情况的曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
一.肿瘤细胞主动靶向的载药系统
按重量份计，该载药系统的有效成分含量为：长春新碱5～10份。
按重量份计，该载药系统的各成分含量为：牛血清白蛋白100～200份，叶酸200～400份，25％戊二醛0.05～0.10份，乙醇0.005～0.01份，无水二甲基亚砜5～15份，二环己基碳二亚胺80～100份，N-羟基琥珀酰亚胺70～80份及三乙胺0.4～0.6份，无水丙酮100～200份，乙醚100～200份，聚丁二酸丁二醇酯50～100份。
实施例1.肿瘤细胞主动靶向的载药系统
按重量份计，该载药系统的成份及有效成分的含量为：长春新碱5份，牛血清白蛋白100份，叶酸200份，25％戊二醛0.05份，乙醇0.005份，无水二甲基亚砜5份，二环己基碳二亚胺80份，N-羟基琥珀酰亚胺70份及三乙胺0.4份，无水丙酮100份，乙醚100份，聚丁二酸丁二醇酯50份。
实施例2.肿瘤细胞主动靶向的载药系统
按重量份计，该载药系统的成份及有效成分的含量为：长春新碱10份，牛血清白蛋白200份，叶酸400份，25％戊二醛0.1份，乙醇0.01份，无水二甲基亚砜15份，二环己基碳二亚胺100份，N-羟基琥珀酰亚胺70份及三乙胺0.6份，无水丙酮200份，乙醚200份，聚丁二酸丁二醇酯100份。
实施例3.肿瘤细胞主动靶向的载药系统
按重量份计，该载药系统的成份及有效成分的含量为：长春新碱0份，牛血清白蛋白150份，叶酸300份，25％戊二醛0.07份，乙醇0.007份，无水二甲基亚砜10份，二环己基碳二亚胺90份，N-羟基琥珀酰亚胺70份及三乙胺0.5份，无水丙酮150份，乙醚150份，聚丁二酸丁二醇酯75份。
经检测，上述实施例提供的载药系统均符合说明书要求，其中实例2效果比较好。
二.细胞主动靶向的胶体混悬液的制备
称取200-400份叶酸，溶于5-15份无水二甲基亚砜(DMSO)中，再加入80-100份二环己基碳二亚胺(DCC)和70-80份N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及0.4-0.6份三乙胺，30℃反应过夜，过滤除去反应副产物，减压蒸馏除去部分溶剂，在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30％丙酮的无水乙醚溶液中，得到黄色沉淀物，过滤，无水乙醚洗涤数遍后真空干燥，得到叶酸活性酯，将BSA溶于定量pH＝10-11的碳酸盐缓冲液中，加入适量叶酸活性酯的无水DMSO，室温搅拌，反应数小时即得。将反应液过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱，以pH＝7-8的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)缓冲液为洗脱液，0.5-2ml·min-1的流速分段收集流出液，前段淡黄色有乳光部份即为FA-BSA。冷冻干燥得到FA-BSA，取制得FA-BSA适量，溶于缓冲溶液中，加入长春新碱，高速搅拌，缓慢滴加无水乙醇。溶液浑浊后，继续缓慢滴加适量交联剂戊二醛溶液，搅拌固化，减压蒸馏除去乙醇，即得到具有肿瘤细胞主动靶向的胶体混悬液。此载药系统对肿瘤细胞具有主动靶向作用，细胞对它的摄取是通过肿瘤细胞表面丰富的叶酸受体介导产生的，而且由于受体-配体结合存在竞争性抑制作用，叶酸受体的牛血清白蛋白纳米粒的主动靶向性可以被游离叶酸显著抑制甚至完全被阻断从而回归到牛血清白蛋白纳米的状况。
实施例1.
称取300份叶酸，溶于10份无水二甲基亚砜(DMSO)中，再加入90份二环己基碳二亚胺(DCC)和75份N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及0.5份三乙胺，30C反应过夜，过滤除去反应副产物，减压蒸馏除去部分溶剂，在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30％丙酮的无水乙醚溶液中，得到黄色沉淀物，过滤，无水乙醚洗涤数遍后真空干燥，得到叶酸活性酯，将BSA溶于定量pH＝10.5的碳酸盐缓冲液中，加入适量叶酸活性酯的无水DMSO，室温搅拌，反应数小时即得。将反应液过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱，以pH＝7.5的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)缓冲液为洗脱液，1·min-1的流速分段收集流出液，前段淡黄色有乳光部份即为FA-BSA。冷冻干燥得到FA-BSA，取制得FA-BSA适量，溶于缓冲溶液中，加入长春新碱，高速搅拌，缓慢滴加无水乙醇。溶液浑浊后，继续缓慢滴加适量交联剂戊二醛溶液，搅拌固化，减压蒸馏除去乙醇，即得到具有肿瘤细胞主动靶向的胶体混悬液。
实施例2.
称取350份叶酸，溶于15份无水二甲基亚砜(DMSO)中，再加入95份二环己基碳二亚胺(DCC)和78份N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及0.6份三乙胺，30℃反应过夜，过滤除去反应副产物，减压蒸馏除去部分溶剂，在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30％丙酮的无水乙醚溶液中，得到黄色沉淀物，过滤，无水乙醚洗涤数遍后真空干燥，得到叶酸活性酯，将BSA溶于定量pH＝10.8的碳酸盐缓冲液中，加入适量叶酸活性酯的无水DMSO，室温搅拌，反应数小时即得。将反应液过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱，以pH＝8的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)缓冲液为洗脱液，1.5·min-1的流速分段收集流出液，前段淡黄色有乳光部份即为FA-BSA。冷冻干燥得到FA-BSA，取制得FA-BSA适量，溶于缓冲溶液中，加入长春新碱，高速搅拌，缓慢滴加无水乙醇。溶液浑浊后，继续缓慢滴加适量交联剂戊二醛溶液，搅拌固化，减压蒸馏除去乙醇，即得到具有肿瘤细胞主动靶向的胶体混悬液。
实施例3.
称取400份叶酸，溶于10份无水二甲基亚砜(DMSO)中，再加入100份二环己基碳二亚胺(DCC)和80份N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及0.6份三乙胺，30℃反应过夜，过滤除去反应副产物，减压蒸馏除去部分溶剂，在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30％丙酮的无水乙醚溶液中，得到黄色沉淀物，过滤，无水乙醚洗涤数遍后真空干燥，得到叶酸活性酯，将BSA溶于定量pH＝11的碳酸盐缓冲液中，加入适量叶酸活性酯的无水DMSO，室温搅拌，反应数小时即得。将反应液过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱，以pH＝7.5的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)缓冲液为洗脱液，2·min-1的流速分段收集流出液，前段淡黄色有乳光部份即为FA-BSA。冷冻干燥得到FA-BSA，取制得FA-BSA适量，溶于缓冲溶液中，加入长春新碱，高速搅拌，缓慢滴加无水乙醇。溶液浑浊后，继续缓慢滴加适量交联剂戊二醛溶液，搅拌固化，减压蒸馏除去乙醇，即得到具有肿瘤细胞主动靶向的胶体混悬液。
上述三个实施例提供的胶体混悬液，经检测，均可以作为所述的肿瘤细胞主动靶向的载药系统，其中实施例2效果比较好。
三.肿瘤细胞主动靶向的载药系统的应用
实施例1.用于人子宫颈癌的治疗，根据荧光分析法显示此载药系统有极强的主动靶向性，对普通健康细胞影响较小(见图1)。
实施例2.用于人结肠癌的治疗，根据荧光分析法显示此载药系统有极强的主动靶向性，对普通健康细胞影响较小(见图2和图3)。
由图2可知，不管HeLa细胞、CaCo-2细胞还是COS-1细胞对各型VCR的敏感性均不同。游离VCR药物对细胞作用强弱主要与细胞本身的通透性等性质相关，因此如图1所示，VCR溶液对肿瘤细胞的毒性较正常细胞的毒性稍强。VCR-BSA-NP的细胞毒性对各种细胞也有差异。而从图3可以看出，FA的引入使得VCR-BSA-NP对肿瘤细胞的毒性明显增强，并且Hela细胞的药敏性比Caco-2细胞的药敏性强，这正与Hela细胞和CaCo-2细胞在细胞膜表面叶酸受体表达的数量情况一致。
附表
(2)各型不同细胞对同种药剂的药敏性比较
Figure A20091006184000091
表2 VCR-BSA-NP对各型细胞的抑制情况
Figure A20091006184000092
表3 VCR-FA-BSA-NP对各型细胞的抑制情况
Figure A20091006184000093

Claims (9)

1.一种肿瘤细胞主动靶向的载药系统，其特征是一种以长春新碱作为活性药物，所需辅料药物牛血清白蛋白为载体材料，叶酸为靶头，利用叶酸对叶酸受体的特异性靶向作用，将纳米粒靶向到高度表达叶酸受体的肿瘤细胞，制备而成叶酸受体介导的肿瘤细胞主动靶向的载药系统；
按重量份计，该载药系统的有效成分含量为：长春新碱5～10份，
按重量份计，该载药系统的所需其它成分为：牛血清白蛋白100～200份，叶酸200～400份，25％戊二醛0.05～0.10份，乙醇0.005～0.01份，无水二甲基亚砜5～15份，二环己基碳二亚胺80～100份，N-羟基琥珀酰亚胺70～80份及三乙胺0.4～0.6份，无水丙酮100～200份，乙醚100～200份，聚丁二酸丁二醇酯50～100份。
2.根据权利要求1所述的载药系统，其特征是按重量份计，该载药系统的成分及有效成分含量为：长春新碱5份，牛血清白蛋白100份，叶酸200份，25％戊二醛0.05份，乙醇0.005份，无水二甲基亚砜5份，二环己基碳二亚胺80份，N-羟基琥珀酰亚胺70份及三乙胺0.4份，无水丙酮10份，乙醚100份，聚丁二酸丁二醇酯50份。
3.根据权利要求1所述的载药系统，其特征是按重量份计，该载药系统的成分及有效成分含量为：长春新碱5份，牛血清白蛋白200份，叶酸400份，25％戊二醛0.10份，乙醇0.01份，无水二甲基亚砜15份，二环己基碳二亚胺100份，N-羟基琥珀酰亚胺80份及三乙胺0.6份，无水丙酮200份，乙醚200份，聚丁二酸丁二醇酯100份。
4.根据权利要求1所述的载药系统，其特征是按重量份计，该载药系统的成分及有效成分含量为：长春新碱7份，牛血清白蛋白150份，叶酸300份，25％戊二醛0.07份，乙醇0.07份，无水二甲基亚砜10份，二环己基碳二亚胺90份，N-羟基琥珀酰亚胺75份及三乙胺0.5份，无水丙酮150份，乙醚150份，聚丁二酸丁二醇酯75份。
5.一种肿瘤细胞主动靶向的载药系统的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)叶酸活性酯的制备：称取200～400份叶酸，溶于5～15份无水二甲基亚砜中，再加入80～100份二环己基碳二亚胺和70～80份N-羟基琥珀酰亚胺及0.4～0.6份三乙胺，28～30℃反应过夜，过滤除去反应副产物，减压蒸馏除去部分溶剂，在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30％丙酮的无水乙醚溶液中，得到黄色沉淀物，过滤，再经无水乙醚洗涤数遍后真空干燥，得到叶酸活性酯；
(2)叶酸-牛血清白蛋白的制备：先将牛血清白蛋白溶于定量pH为10～11的碳酸盐缓冲液中，加入适量叶酸活性酯的无水二甲基亚砜，室温搅拌，反应3～5小时后，将得到的产物过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱以pH为7～8的聚丁二酸丁二醇酯缓冲溶液进行洗涤，再按照0.5～2ml·min-1的流速分段收集流出液，前段淡黄色有乳光部份经冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白；
(3)胶体混悬液的制备：按重量份计，取制得的叶酸-牛血清白蛋白100～200份，溶于缓冲溶液中，加入长春新碱5～10份，高速搅拌，缓慢滴加无水乙醇；溶液浑浊后，继续缓慢滴加0.05～0.10份交联剂戊二醛溶液，搅拌固化，减压蒸馏除去乙醇，得到具有肿瘤细胞主动靶向的胶体混悬液，该胶体混悬液作为肿瘤细胞主动靶向的载药系统。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是采用以下方法制备叶酸活性酯：称取300份叶酸，溶于10份无水二甲基亚砜中，再加入90份二环己基碳二亚胺和75份N-羟基琥珀酰亚胺及0.5份三乙胺，30℃反应过夜，过滤除去反应副产物，减压蒸馏除去部分溶剂，在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30％丙酮的无水乙醚溶液中，得到黄色沉淀物，过滤，无水乙醚洗涤数遍后真空干燥，得到叶酸活性酯。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于采用以下方法制备叶酸-牛血清白蛋白：将牛血清白蛋白100～200份溶于pH为10.5的碳酸盐缓冲液中，加入200～400份叶酸活性酯的无水二甲基亚砜，室温搅拌，反应数小时后，将得到的过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱以pH为7.4的聚丁二酸丁二醇酯缓冲溶液进行洗涤，再按照1ml·min-1的流速分段收集流出液，前段淡黄色有乳光部份经冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白。
8.一种基于权利要求1至4中任一权利要求所述载药系统的应用，其特征在于：该载药系统用于肿瘤化疗，其在杀伤高表达叶酸受体的肿瘤细胞的同时，对正常组织的毒性较低。
9.根据权利要求8所述的的应用，其特征在于：该载药系统对肿瘤细胞所具有的主动靶向作用，叶酸受体一般在正常组织中的表达高度保守，只在脉络丛、胎盘、肺、肠以及肾等一些正常上皮组织中有不同的表达，且仅分布于上皮细胞极化表面，不易接近血中的叶酸偶联物，细胞对药物的摄取则是通过肿瘤细胞表面丰富的叶酸受体介导产生的，因此通过载体结构修饰或识别，将药物定向运送至病变部位发挥药效而不损伤周围的正常细胞、组织和器官的体系。
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