CN101536739B - 一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法 - Google Patents
一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法，属于食品分析领域。该方法是称取一定质量的保健食品样品加入一定体积甲醇，超声10～20min，提取样品中去氢表雄酮，采用C18固相萃取柱对提取的样品进行处理，从而达到净化的目的。经过处理的样品适用于保健食品中去氢表雄酮高效液相、酶联免疫吸附法等检测的样品处理。本发明极大的降低了样品基质的干扰，使检测的灵敏度明显提高。
Description
技术领域
本发明属于食品分析领域，特别涉及一种保健食品中去氢表雄酮固相萃取的前处理方法及其应用。
背景技术
去氢表雄酮是人体肾上腺素一种，对于预防和治疗心血管疾病、增强免疫力等有一定效果，目前尚不准添加于保健食品中。
中华人民共和国国家标准规定了保健食品中去氢表雄酮的测定方法，其主要采用了简单提取方法后进行测定，但是保健食品的成分复杂，使用甲醇提取时会同时提取出许多干扰物质，从而严重影响检测的准确度与灵敏度。因此需要对样品进行净化处理。
净化样品常采用液液萃取、蛋白沉淀和固相萃取方法。
液液萃取，该法操作繁琐、费时，需要消耗大量的有机溶剂，导致成本高和对环境污染，并且常有乳化现象，使用这种净化方法费时费力，不能进行即时检测，已经逐步被其他一些提取方法所取代。
柱层析法，由于柱的装填是即用即填，所以不同人员装填的效果不同，对重现性有较大的影响，而且吸附剂颗粒较细，淋洗速度比较慢，因此商业上出现了固相萃取。
固相萃取(Solid Phase Extraction)是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术，由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来，主要通过固相填料对样品组分的选择性吸附及解吸过程，实现对样品的分离，纯化和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。固相萃取(SPE)较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的；也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。
相对传统的液液萃取，固相萃取的优点是：它集样品富集及精华与一身，提高检测灵敏度，比液液萃取更快，节省有机溶剂的用量，且重现性好，方法稳定。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明目的是提供一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法，并用于实际样品检测。
本发明通过保留其中被测物质去氢表雄酮，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法，包括如下步骤：
(1)保健食品中去氢表雄酮样品的提取：粉碎后的保健食品样品0.5～1g，加入5～10mL甲醇，超声10～20min，离心或者过滤，得到含有去氢表雄酮的样品提取液，蒸干，用体积百分比为20％～30％甲醇的ddH2O复溶，得到复溶后的样品提取液。
(2)保健食品中去氢表雄酮固相萃取的净化：将复溶后的样品提取液过C18固相萃取柱，将固相萃取柱活化、平衡后，上样，等样品提取液流出后，用体积百分比30％甲醇+体积百分比为1～2％氨水作为淋洗液淋洗，去除极性较大的基质；抽干SPE(固相萃取)柱后，加入体积百分比为90％甲醇洗脱目标物质去氢表雄酮，并将其定容到10mL，得到净化后样品溶液。
所述粉碎后的保健食品样品过80目筛。
净化后样品溶液的检测：可采用酶联免疫吸附法(ELISA)或高效液相色谱法(HPLC)进行检测。
所述酶联免疫吸附法：检测时将步骤(2)中净化后样品溶液稀释10倍，按照酶联免疫吸附法(ELISA)程序进行检测。采用包被抗原浓度为100ng/mL，酶标抗体稀释倍数为1/3000，在室温下竞争反应30min。洗板，显色10min，终止反应，测定A450吸光值。
所述高效液相色谱法：将步骤(2)中净化后样品溶液过0.45μm滤膜直接上机检测。采用紫外检测器，其检测波长为215nm，流动相为体积比为甲醇∶水＝70∶30，流速为1.0mL/min。
检测结果用回收率来评价，回收率在80％～120％表明检测结果准确，样品前处理方法可靠、实用。
所述保健食品中去氢表雄酮的前处理方法应用于检测食品中去氢表雄酮。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和积极效果：
1、本发明极大的降低了样品基质的干扰，在使用ELISA检测时，使用较低的稀释倍数便可实现检测，使用HPLC时，检测样品的基线平稳，出现的杂峰明显减少，因此检测的灵敏度明显提高。
2、本发明与液液萃取相比，减少了有机溶剂的用量，同时也减少了萃取过程中去氢表雄酮样品的损失，使回收率更高，结果更可靠。
3、本发明的方法不但适用于去氢表雄酮含量的高效液相法，也使用于ELISA检测痕量分析，具有重要应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种保健食品中去氢表雄酮样品的前处理方法，包括如下步骤：
(1)保健食品中去氢表雄酮样品的提取：取过80目筛粉碎后的减肥茶样品1g于具塞容器中，加入10mL甲醇，置于KES-1000超声波清洗机上，超声20min，3000r/min离心3min，取上清液，反复提取三次，合并上清液，得到含有去氢表雄酮的样品提取液，40℃旋转蒸干，得到蒸干的样品，备用。
(2)保健食品中去氢表雄酮固相萃取的净化：将蒸干的样品使用5mL的体积百分比20％甲醇的ddH2O溶解，得到复溶后的样品提取液；按照下面的程序过C18固相萃取柱进行固相萃取，具体方法为：
(a)活化：加入5mL甲醇，使甲醇在柱子静置2min，打开阀门，使甲醇自然流出；
(b)平衡：先加入5mL ddH2O，使其自然流出，当剩余1mm时，再加入5mL ddH2O继续平衡一次；
(c)上样：将复溶后的样品提取液加入到SPE柱中，使其慢慢流下，控制其流速＜1mL/min；
(d)淋洗：淋洗液为体积百分比30％的甲醇+体积百分比2％的NH3.H2O，进行淋洗，所有的液体都流出且需要将柱子里残留的溶液一并抽干；
(e)洗脱：使用体积百分比90％的甲醇将目标物完全洗脱下来，并收集洗脱液；
(f)蒸干：定容到10mL，得到净化后样品溶液。
(3)净化后样品的检测：定容到10mL的净化后样品溶液经固相萃取后经ELISA检测，其检测条件为：采用包被抗原浓度为100ng/mL，酶标抗体稀释倍数为1/3000，在室温下竞争反应30min，洗板，显色10min，终止反应，测定A450吸光值。
按照直接竞争ELISA方法，对净化后样品溶液进行ELISA检测，检测得到的回收率在81％～115％之间，其平均变异系数为7.25％。
表1经固相萃取后添加回收结果(ELISA)
由此可知，两个样品回收率都在80～120％之间，且方法的变异系数＜15％，因此该检测方法准确可靠，该样品前处理方法极大的消除了基质干扰，使检测结果更可靠。
实施例2
一种保健食品中去氢表雄酮样品的前处理方法，包括如下步骤：
(1)保健食品中去氢表雄酮样品的提取：取过80目筛粉碎后的减肥茶样品1g于具塞容器中，加入5mL甲醇，置于KES-1000超声波清洗机上，超声10min，3000r/min离心3min，取上清液，反复提取三次，合并上清液，得到含有去氢表雄酮的样品提取液，40℃旋转蒸干，得到蒸干的样品，备用。
(2)保健食品中去氢表雄酮固相萃取的净化：将蒸干的样品使用5 mL的体积百分比30％甲醇的ddH2O溶解，得到复溶后的样品提取液，按照下面的程序过C18固相萃取柱进行固相萃取，具体方法为：
(a)活化：加入5mL甲醇，使甲醇在柱子静置2min，打开阀门，使甲醇自然流出；
(b)平衡：先加入5mL ddH2O，使其自然流出，当剩余1mm时，再加入5mL ddH2O继续平衡一次；
(c)上样：将复溶后的样品提取液加入到SPE柱中，使其慢慢流下，控制其流速＜1mL/min；
(d)淋洗：淋洗液为体积百分比30％的甲醇+体积百分比2％NH3.H2O，进行淋洗，所有的液体都流出，且需要将柱子里残留的溶液一并抽干；
(e)洗脱：使用体积百分比90％的甲醇将目标物完全洗脱下来，并收集洗脱液；
(f)蒸干：定容到10mL，得到净化后样品溶液。
(3)净化后样品的检测：定容到10mL的净化后样品溶液经固相萃取后经HPLC检测，检测条件为：采用紫外检测器，其检测波长为215nm，流动相为甲醇∶水(体积比)＝70∶30，流速为1.0mL/min。
按照HPLC检测程序，对净化后样品溶液进行HPLC检测，检测得到的回收率在93.31％～102％之间，其平均变异系数为7.8％。
表2经固相萃取后添加回收结果(HPLC)
由此可知，样品回收率都在93.31～102.5％之间，且方法的变异系数＜10％，因此该检测方法准确可靠，该样品前处理方法极大的消除了基质干扰，使检测结果更可靠。
实施例3
一种保健食品中去氢表雄酮样品的前处理方法，包括如下步骤：
(1)保健食品中去氢表雄酮样品的提取：取过80目筛粉碎后的减肥茶样品0.5g于具塞容器中，加入8mL甲醇，置于KES-1000超声波清洗机上，超声15min，过滤，取上清液，反复过滤三次，合并上清液，得到含有去氢表雄酮的样品提取液，40℃旋转蒸干，得到蒸干的样品，备用。
(2)保健食品中去氢表雄酮固相萃取的净化：将蒸干的样品使用5mL的体积百分比25％甲醇的ddH2O溶解，得到复溶后的样品提取液，按照下面的程序过C18固相萃取柱进行固相萃取，具体方法为：
(a)活化：加入5mL甲醇，使甲醇在柱子静置2min，打开阀门，使甲醇自然流出；
(b)平衡：先加入5mL ddH2O，使其自然流出，当剩余1mm时，再加入5mL ddH2O继续平衡一次；
(c)上样：将复溶后的样品提取液加入到SPE柱中，使其慢慢流下，控制其流速＜1mL/min；
(d)淋洗：淋洗液为体积百分比30％的甲醇+体积百分比1％NH3.H2O，进行淋洗，所有的液体都流出，且需要将柱子里残留的溶液一并抽干；
(e)洗脱：使用体积百分比90％的甲醇将目标物完全洗脱下来，并收集洗脱液；
(f)蒸干：定容到10mL，得到净化后样品溶液。
(3)净化后样品的检测：定容到10mL的净化后样品溶液经固相萃取后经HPLC检测，检测条件为：采用紫外检测器，其检测波长为215nm，流动相为甲醇∶水＝70∶30，流速为1.0mL/min。
按照HPLC检测程序，对净化后样品溶液进行HPLC检测，检测得到的回收率在97.40％～100.24％之间，其平均变异系数为4.21％。
表2经固相萃取后添加回收结果(HPLC)
由此可知，样品回收率都在97.40％～100.24％之间，且方法的变异系数＜10％，因此该检测方法准确可靠，该样品前处理方法极大的消除了基质干扰，使检测结果更可靠。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)保健食品中去氢表雄酮样品的提取：粉碎后的保健食品样品0.5～1g，加入5～10mL甲醇，超声10～20min，离心或者过滤，得到含有去氢表雄酮的样品提取液，蒸干，用体积百分比为20％～30％甲醇的ddH2O复溶，得到复溶后的样品提取液；
(2)保健食品中去氢表雄酮固相萃取的净化：将复溶后的样品提取液过C18固相萃取柱，将固相萃取柱活化、平衡后，上样，等样品提取液流出后，用体积百分比30％甲醇+体积百分比为1～2％氨水作为淋洗液淋洗固相萃取柱；抽干固相萃取柱后，加入体积百分比为90％甲醇洗脱去氢表雄酮，并将其定容到10mL，得到净化后样品溶液。
2.根据权利要求1所述的一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法，其特征在于：所述粉碎后的保健食品样品过80目筛。
3.根据权利要求1所述的一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法，其特征在于：所述步骤(2)中净化后样品溶液采用酶联免疫吸附法或高效液相色谱法进行检测。
4.根据权利要求3所述的一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法，其特征在于：所述酶联免疫吸附法是将步骤(2)中净化后样品溶液稀释10倍，按照酶联免疫吸附法程序进行检测。
5.根据权利要求3所述的一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法，其特征在于：所述高效液相色谱法是将步骤(2)中净化后样品溶液过0.45μm滤膜直接上机检测。
6.权利要求1～5任一项所述的一种保健食品中去氢表雄酮的前处理方法应用于检测保健食品中去氢表雄酮。
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