CN101535800B - 用于无载体偏转电泳的设备及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于无载体偏转电泳的方法和设备，其中，将被检查的分离介质和样本沿电极方向以一系列反转总体流体流流过一对电极(24，26)之间的分离槽，从而将样本分离到将被收集到馏分中的区带中，用以分析或进一步处理。其他方面，该设备和方法能够允许粒子的高分辨率的分离，这可以在微型槽中以包括等电位聚焦、区带电泳、以及等速电泳的电泳模式执行。

Description

用于无载体偏转电泳的设备及方法
技术领域
本发明涉及无载体偏转电泳，包括用于执行该无载体偏转电泳的设备及方法。
背景技术
在过去30年间的文献中，已经描述了无载体偏转电泳的基础，特别是关于连续操作的过程。有时，用术语FFE(自由流电泳)或更普遍地用CFE(连续流电泳)来描述该过程。(K.Hanning：Carrier-free continuous electrophoresis and itsapplication.Anal.Chem.181，233(1961)；M.C.Roman and P.R.Brown：Anal.Chem.Free Flow Electrophoresis.66(N2)，86-94，(1994)；R.Braun，H.Wagner and G.Weber：Preparative Free FlowElectrophoresis--a powerful procedure for separating naturalsubstances，GIT Fachzeitschrift f ür das Laboratorium39(1995)，317-322)。
通常，FFE分离过程用于分离直到生物粒子的任意分子量的离子。此处，将被分离的样本自身是否带电、或是否通过离子的添加或吸附产生电荷是没有关系的。
无载体偏转电泳被传统地用于通常称作连续自由流电泳(CFFE)的连续过程中。在没有诸如凝胶的支持基质(基体，matrix)时使用的该方法能够对可溶和不溶成分进行分离、分馏、和可能的隔离。与其它能够隔离已分离的样本成分的方法相比，连续自由流电泳通常提供三个主要优点：(i)样本保持在液体介质中/在可以直接用于进一步处理的溶液中，(ii)可以连续地执行分离，并且每小时能够获得几百毫克或甚至一克之多的纯物质，以及(iii)分离是温和的，从而保持已分离成分的生物活性。
FFE的技术在复杂蛋白质的分离和分馏中尤其有用，因此适用于蛋白质组学(proteomics)的新兴领域，其在学术和医药研究以及一般的生物技术和临床诊断市场中日渐重要。例如，随着蛋白质组学研究的发展，改进蛋白质分离性能或分辨率的需求增加了，特别是在分辨率过程可靠性的方面。还需要一种通用的前端分离系统以及在后面的分析或进一步分离/分馏步骤之前出现的方法。
已经出现了FFE领域的改进。例如，通过稳定介质和逆流介质，连续偏转电泳(或连续自由流电泳)的过程已经得到了改进。例如，这在美国专利5,275,706中反映，其公开内容通过引证全部结合于此。根据该专利，将与大量(bulk)分离介质和在电极之间移动的样本的连续流方向相反的逆流介质引入分离空间中。两种介质(分离介质和逆流介质)一般都通过分馏出口释放或洗脱(elute)到微量滴定板中，这产生具有低空隙容积的分馏过程。另外，保留了分馏出口区域中的介质的层流(即，具有非常低的或不具有扰动)。
另外，在非连续或间隔过程中已经实现了自由流偏转电泳。例如，非连续偏转电泳的过程在美国专利6,328,868中示出，其公开内容通过引证结合于此。在该专利中，样本和分离介质都被引入电泳槽(chamber)中，然后使用诸如区带(zone)电泳、等速电泳、或等电位聚焦的电泳模式进行分离，最后通过分馏出口排出该槽。‘868专利的实施例描述了通过所施加的、致使发生电泳迁移但样本和介质不被流体地从入口端朝出口端驱使的有效电压，分离介质和样本将从槽的入口端朝出口端单向移动的运动。图1中示出‘868专利的实施例的实例。
可以在某些情况下使用FFE的以上两个实例(即，连续和非连续或间隔模式)，每个实验目标均具有导致某人更喜欢其中一种过程的因素和需求或特性(specifics)。这些因素包括将要被分离的样本的选择，包括所需或所期望的分离时间、样本尺寸、所期望的分离分辨率、槽尺寸等。这些和其他因素影响分离模式以及将使用的设备、具体方法、技术、和组分。给定了某情形和实验或分离目标，当两种操作模式(连续或非连续)对用户来说都可用时，一个或多个以上这些因素可以或不能影响选择哪种操作模式。应当注意，当使用自由流电泳时，与其他分离或分馏方法和技术相比，连续和非连续(或间隔)两种操作模式的每一种均具有很多优势。然而，总是需要进行改进。
很多公开物都描述了物理或电化学效应，其有助于在连续自由流偏转电泳中的分离期间分析物的所谓“带增宽”(J.A.Giannovario，R.Griffin，E.L.Gray：A mathematical model of free-flow electrophoresis.Journal Chromatography，153，329-352(1978)；F.G.Boese：Contribution toa mathematical theory of free flow electrophoresis，J.Chromat.483，145-170(1988)；K Hannig and H.G.Heidrich：Free-Flow Electrophoresis，1990 by GIT Verlag Darmstadt ISBN 3-921956-88-9)。
在连续FFE中固有的这些效应中最重要的是：
1.由于层流(laminar flow)分布导致的带增宽；
2.由于热对流导致的带增宽；
3.由于电渗透导致的带增宽；
4.由于电动效应导致的带增宽。
迄今所描述的所有电动效应的负面影响都能够通过使用具有适当的离子成分、具有足够高的离子强度的分离介质来最小化或消除，并且同时不过多地增加样本的浓度。
存在很多方法来最小化电渗透的负面影响，例如，通过选择适当的壁体材料(用塑料而不是玻璃或石英)，或最优选地通过向分离介质添加预防电渗透的表面活性的化学成分。这种方法在文献中称为“动态涂覆”。
通过安排并水平地而不是垂直地操作电泳槽，可以非常容易地降低热对流的负面影响。另外，通过适当冷却并在分离过程中将电泳槽保持在恒定温度，可以将热效应最小化。
只要选择足够长的、并也使得分析物(其在电泳槽间隙的中心以最高线速度传送)能够聚焦的分离时间，则对于连续等电位聚焦(IEF)来说，就观察不到层流分布的负面影响。
相反地，在电迁移过程的情况下，负面影响非常明显。靠近或在电泳槽的边界面迁移的分析物以比在电泳槽间隙中心的分析物长很多的时间穿过电泳槽，因此由于它们的停留时间更长导致了它们被明显更大程度地偏转。这种效应导致带增宽，可察觉为在电迁移方向的拖尾(tailing)。
假如在无载体电泳的边界条件下连续执行的电迁移过程，则对于低分子分析物来说，层流分布的负面影响不能避免。带增宽的绝对值随分析物的迁移距离的增加而增加。降低其迁移受使用粘度更大的分离介质影响的分析物的扩散速率也没有帮助，因为这放大了层流分布的不利的性质。
在生物粒子的分离的情况下，向电泳槽间隙中心提供数量更少的样本可以使分辨率得到改进，因为由于极低速的扩散，粒子在小于10分钟的保留(retention)时间期间不能进入到电泳槽壁的区域中。然而，只能够通过显著降低样本的提供率的方式来使层流分布的影响最小化(例如，样本流率仅为分离介质的流率的0.1％到0.5％)。
与本领域中已知的连续FFE操作模式相比，在US 6,328,868中描述的间隔FFE模式能够避免在电迁移过程中观察到的层流分布的负面影响。
然而，本领域仍然需要对自由流电泳方法进行进一步的改进。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种无载体偏转电泳的方法，其消除了连续自由流电泳分离一般所具有的层流分布的影响，以及还提高了分离质量和/或减少了周转(turn around)时间或减少了为获得电泳分离的高分辨率质量所需要的分馏时间。本发明的方法和装置可以用于制备分离和分析分离。
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于分离粒子的方法，其中，该方法包括在电泳槽中布置分离介质和样本，电泳槽具有顶板、底板和多个之间布置有分离空间的彼此大体上平行的电极，以及用于在电极之间输送分离介质和样本粒子的流体移位系统，在电极之间施加能够通过电泳来操纵粒子的电压，以及其中，将至少一部分分离介质和样本朝大体上平行于电极方向的第一方向移位，然后接下来在大体上与第一方向相反的第二方向上移位。
在某些实施例中，用于分离粒子的该方法包括在电泳槽中布置分离介质和样本，电泳槽具有顶板、底板、第一槽端、第二槽端、以及多个之间布置有分离空间的彼此大体上平行的电极，电极朝每个端纵向延伸，以及用于在第一和第二槽端之间输送分离介质的流体移位系统，在电极之间施加能够有效地电泳地操纵粒子的电压，将至少一部分分离介质和样本朝第一槽端移位，将至少一部分分离介质和样本朝第二槽端(即，总体流(bulk flow)的逆向)移位，以及可选地，将至少一部分分离介质和样本朝第一槽端移位，例如，用以通过一个或多个位于与入口相反的槽端的出口来排出或洗脱至少一部分样本和/或分离介质。在本发明上下文中的“大体上平行”意味着至少分离介质(例如，水)中的不带电粒子的总体流方向基本上平行于延长的电极。然而，本领域的技术人员会理解，电泳槽内的带电物质(即，分离介质中的样本或离子)可以同时也被电极之间的电场偏转，从而朝阴极或阳极以及同时平行于电极朝电泳槽的入口或出口端移动。下面会更详细地描述在FFE设备内粒子在分离期间的运动。
与其他分离技术相比，本发明在电泳分离的质量和长期稳定性方面提供了明显的改善，并且改进了实现电泳分离的高分辨率的速度。另外，本发明的方法还提高了在用于电泳分离的FFE装置的设计方面的灵活性。此处披露的实施例可以适用于大多数一般已经使用上述和本领域普遍已知的连续或静态间隔自由流电泳应用(包括区带电泳、等电位聚焦和等速电泳)而执行的分离协议。
一般地，在电泳槽中的分离区域中存在化学和物理的不连续性，其是与介质的迁移边界相邻的区域中的液体扰动的公知来源，然而非迁移边界(如稳定介质和分离介质之间的边界)仅在分离过程过载的情况下产生扰动(由于高场强或由于大电流)。已经发现，迁移边界处的扰动可以同时通过剪力(shear force)而大大降低，剪力由分离介质在分离单元内相对于大体上固定的电泳槽壁向前和向后的线性运动的矢量产生。在分离单元内相对于大体上固定的电泳槽壁向前和向后的来回循环在这里称作循环自由流电泳，或可选地，循环间隔自由流电泳。
出于本发明的目的，循环FFE包括至少一个完整循环(即，将分离介质和样本朝FFE设备的相反端远离样本和介质入口地移动，然后在第二(一般为相反的)方向上，即朝FFE设备的入口端移动样本和分离介质。除了期间实现了样本粒子的电泳分离的循环之外，循环FFE还可以包括其中方向又朝FFE的出口端改变以洗脱样本和总体分离介质的阶段。类似地，当出口位于设备的入口处或在设备的入口附近时，一个完整循环的特征在于流方向的一个逆转，即，将分离介质和样本朝FFE设备的第一方向移动，然后将样本和分离介质在第二(一般为相反的)方向上朝入口移动，在这种情况下也朝FFE设备的出口端移动。下面会进一步描述，上述的循环可以重复多次，或只执行一次。优选地，通过一个或多个出口来排出/洗脱样本和总体分离介质来实现该方法。
在优选实施例中，循环数大于1，诸如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个循环，并且选择循环数以在样本或至少其一部分被收集在FFE设备的出口端处之前实现样本的充分分离。本领域的技术人员应当理解，来回地移位样本和总体分离介质的循环数取决于多种因素，包括样本大小、分离质量、样本的电泳迁移率等等。
此处使用的电泳迁移率(EM)意味着水性介质中的阴离子和阳离子在给定了场强的电场中每个时间单位的迁移速率。电泳迁移率u可以由以下计算：
u＝s/H×t
其中，s表示迁移的距离(m)，H表示电场强度(V/m)，t表示时间(秒)。
结合自由流电泳的任意已知的分离模式，例如，等速电泳(ITP)、区带电泳(ZE)以及等电位聚焦(IEF)，使用根据本发明的实施例的新方法和设备来实现改善的分离质量。具体地，实验表明，在循环FF-等速电泳和循环FF-区带电泳(对于ZE，见图5和图6)的情况下，循环间隔FFE的优点是最有价值和惊人的。
如上所述，Weber的美国专利6,328,868描述了一种用于以普通间隔方式在电极之间执行无基质(无基体，matrix-free)或无溶液电泳的方法。在‘868发明中描述的间隔方式大体上在一个方向上引入和洗脱样本和分离介质。与传统的(凝胶和无基质)其中样本通过毛细管在与电场相同的方向上移动的毛细管电泳不一样，这个方向与延长的电极的方向共享。图1中示出图示‘868发明的一个示例性实施例的5个阶段(阶段0到阶段4)的实例，分别由图1a-1e表示。如图1a所示，阶段0包括利用打开流(flow on)和关闭电压(voltage off)来将样本和分离介质引到电泳槽中。如图1b所示，阶段1维持关闭电压而停止样本和分离介质的总体流(停止流(flowoff))。如图1c所示，阶段2维持关闭总体流，但是在电极之间施加导致发生电泳分离的电压。如图1d所示，阶段3关闭电压但迫使样本和分离介质的总体流朝向与分离介质被引入的入口相反的出口。最后，如图1e所示，阶段4关闭总体流体流和电压。如果需要，可以重复阶段0-4。
在‘868发明的情况下，只有当关闭电压或至少当电压对于电泳迁移无效，即，当样本的任一部分没有经受有效的电泳场强时，才发生由电极之间的电泳槽中的一些其他的流体移位元件或泵导致的样本的移位或加速。另外，在‘868发明中，总体样本和介质的绝对移位仅在起始于样本入口终止于样本出口的方向上发生。在本发明中，‘868发明的方法及设备的这两个特性和其他元件得到了改进。
通过很多实验已经观察到了根据本发明实施例的以循环间隔模式的新FFE-过程的很多优点。
首先，因为样本和分离介质在电泳分离阶段期间是运动的，所以可以施加更高的场强。由于更高的场强，新循环间隔FFE-过程会提供增强的性能，其可以用于在与Weber的US 6,328,868中描述的方法一般所具有的处理时间相同的持续时间内更好地识别分析物。可选地，与连续或标准间隔自由流电泳方法相比，新方法提供了相同的分析物识别质量，但是却可以在更短的处理时间中执行。后者的优点可以允许不同分离的更高的处理量，这可以应用于例如在临床蛋白质组学中使用的电泳过程。
其次，所有的传统连续FFE分离技术和协议可以更容易地在循环间隔自由流电泳过程中使用。
第三，根据本发明实施例的方法和设备由于总体样本流的周期性反转而允许延长槽中的样本的电泳分离的持续时间。例如，由泵控制的具有最小总体样本和分离介质流率的连续自由流电泳机器具有最小的运行持续时间，其是粘度、泵流率、槽的形状、以及从入口到出口的长度的函数。与连续自由流电泳方法不一样，根据本发明实施例的循环间隔方法具有相同的最小流率、粘度、槽的形状、以及反转流体流的能力，该方法可以延长在样本入口和出口之间的运行持续时间。这提供了延长分离时间的可能，这(例如)在FF-等电位聚焦的情况下尤其强大和有用。因为循环间隔模式中的样本可以在向前和向后方向上被重复移动，所以电极之间的样本的有效运行长度可以被无限地延长。已分离粒子的延长的运行时间或延长的运行距离会导致分析物的更好的聚焦，尤其是对于具有相对低的电泳迁移率的那些来说。
第四，新的循环间隔自由流电泳过程可以在具有许多不同选择的几何配置和截面的分离槽中使用。因此这能够允许对于怎样在小型电泳槽中实现FFE的灵活性，取决于介于一对或多对电极之间的用于洗脱的样本出口的所需数目，可以改变小型电泳槽的形状和大小。另外，可以控制或设计电极的长度，使得样本和分离介质的量可以被调整以考虑(account for)需要被分馏和/或检测的样本大小或样本和分析物浓度。
根据本发明实施例的新循环间隔FFE模式可以用于至今为止自由流电泳分离技术不能实现的特定应用。例如，电泳迁移速度非常低的蛋白质异构体的分离和隔离就很难实现。使用这里描述的方法，(例如)这些异构体的隔离可以通过使用这里披露的循环间隔自由流电泳模式来实现，这在以前通过使用现有技术的连续FFE-过程是不能实现的。另外，使用本发明的新循环间隔FFE模式，已经成功地实现了采用多种不同样本的很多其他分离问题。
下面的描述和所附的图举例说明了本发明的几个实施例。
附图说明
图1描述用于执行现有技术的间隔自由流电泳的步骤；
图2描述用于执行本发明的实施例的步骤；
图3描述适于执行根据本发明实施例的自由流电泳的FFE设备；
图4a和图4b描述适于执行根据本发明实施例的自由流电泳的另一装置(setup)实施例；
图5图示现有技术的连续FFE的执行结果；
图6图示根据本发明实施例的循环FFE的执行结果；
图7示出本发明实施例的区带电泳模式的阴离子和阳离子迁移；
图8示出本发明实施例的等电位聚焦模式的不同等电位点(PI)的粒子的迁移；
图9描述本发明实施例的不同分布，其中，图9A、图9B、和图9C分别描述电压、介质流速、以及介质移位；
图10描述本发明的另一实施例的不同分布，其中，图10A、图10B、和图10C分别描述电压、介质流速、以及介质移位；
图11描述本发明的又一实施例的不同分布，其中，图11A、图11B、和图11C分别描述电压、介质流速、以及介质移位。
具体实施方式
在下面非限制性的实例中将进一步说明本发明及其优点。在附图中，贯穿不同图的相同参考字符大体上指相同的部分。而且，附图并不一定成比例，而是着重于说明本发明的原理。
在图2(具体为图2a-2e)中反映了本发明的总体方法，而在图3、图4、图7a和图8a中共同描述了执行本发明一般所需的元件。图3和图4图示地反映了包括电泳槽12、以及涉及和/或连接到电泳槽12的元件的电泳设备10的两个实施例，而图7a和图8a具体地反映了电泳槽12、以及在电泳槽12中图示表示的粒子的电泳行为。
可以执行本发明的各方面的设备10包括下面元件的全部或部分：
电泳槽12，
分离介质入口36，
样本入口38，
电极(阴极24和阳极26)，
电源(未示出)，
第一流体移位系统60，
第二流体移位系统61，
控制器，用于控制电源和/或流体移位系统。
另外，一般需要下面的元件来优化本发明实施例的控制、灵活性、和性能：
阴极介质170，
阳极介质172，
电极/介质隔离物或阻隔物，
槽隔离物22，
温度控制器174，
冷却元件178，
样本出口52。
下面将具体描述以上部件以及怎样将它们联系为一个系统，但是首先将参照图2来说明本发明实施例的总体方法。
在图2a中示出的初始状态中，阶段0开始于样本和分离介质被引入电泳槽的分离空间中。在电极之间不施加电压，或可选地，施加无效电压。在阶段0中，存在对于成功发生电泳迁移来说无效的环境。这可以是由于在电极之间的零电泳场强或无效量的电泳场强，或者可选地是由于快速地将样本和分离介质引入槽中从而没有提供对于发生有效的电泳迁移来说足够的停留时间。
图2b中示出的阶段1开始于不按照特定顺序在前向和反转运动的循环中反转合成的样本和分离介质的流率。优选地，在阶段1部分期间，电泳场不导致发生电泳迁移。感兴趣的样本粒子的移位一般小于电极的长度。在电极之间增加或施加电压以产生对于发生电泳迁移来说有效的场强。虽然分离实验中使用的具体场强将取决于多种因素，但是施加的场强一般大约在250V/cm的范围中。在给定FFE设备中选择用于循环FFE操作的最佳电压在本领域技术人员的技能范围之内。
图2c示出了接下来的阶段2和阶段3。由于在电极之间施加的电压，有效电泳场使得粒子发生电泳迁移。应当注意，在阶段2和阶段3中，因为样本和分离介质的移位充分地使感兴趣的样本粒子保持在电极的长度之内，所以感兴趣的样本粒子总在之间，经受电极之间的电泳场。
应当注意，在阶段2和阶段3期间，样本电泳迁移的能力取决于用户所采用的电泳过程的类型(即，等速电泳、等电位聚焦、或区带电泳)、以及分离介质中的样本的电泳迁移率(其受所选的分离介质的特性以及电流在电极之间流动的能力的很大影响)。还应当注意，阶段2和阶段3仅在电泳迁移期间的样本和分离介质的流的方向上不同，因此能够以相似或不同的流特性重复多次。一个实例将是在阶段2期间以某平均流体速度来移动样本和分离介质，而在阶段3期间，以阶段2中的平均流体速度的分数或倍数来向后移动它们。
当不再执行阶段2和阶段3时，就可发生图2d中示出的阶段4。基本上，阶段4涉及使将被洗脱的样本朝样本出口移动。虽然在图2、图7a和图8a中样本出口布置在电泳槽的相反侧，但是在其他实施例中，样本出口可以在与样本入口和分离介质入口相同的一侧。
在图2d中，阶段4基本上涉及在向样本出口洗脱期间，最小的样本电泳迁移，优选地没有样本的电泳迁移。这可以通过降低或去除电极之间的电压以降低或消除电极之间的电场来实现。可选地，这可以通过以平均流体速度快速迫使样本和分离介质向样本出口移动来实现，其使到达样本出口之前的持续时间和电泳场对于粒子或样本的迁移的影响最小化。应当认识到，通过在与电泳槽12电泳分离的样本的洗脱或提取期间不施加电压，阶段4最容易执行。应当理解，对于区带电泳FFE或等速电泳FFE应用来说，以上尤其有用。然而，当执行处于等电位聚焦模式(IEF)的FFE时，去除或降低电压并不重要，因为粒子在电极之间的其最终位置处的总电荷或净表面电荷为零，结果是在电场的连续施加下观察不到进一步的迁移。
图2d中示出的阶段4描述了样本和分离介质的洗脱，因此允许对已洗脱样本进行进一步分析或处理。图2e中示出的阶段5在其他实施例中可以与阶段4(图2d)同时发生或在阶段4停止之后发生，因此允许对其他样本或电泳环境发生进一步的电泳分离。图2描述了本发明的实施例的基本原理，本发明的其他方面会在整个申请中示出。
最后，如图2e所示地执行阶段5，基本上是图2a示出的阶段0的重复。任选地，如果用户仅需要一个电泳过程，则可以避免或舍弃图2e。可选地，只要阻止新样本与已通过之前的运行所分离的样本混合，就可以将阶段5和阶段4结合。
如图9、图10和图11所示，对应于经受了如图2反映的实施例的各步骤或阶段0到阶段4的样本，可能存在不同的电压、粒子流速度、以及粒子移位分布。对于图9到图11，Y方向可对应于从入口端壁朝出口端壁的方向。图9到图11在很多方面都相似，除了介质流速度的加速和减速之外。在图9b中，很明显，可以通过施加发生电泳迁移所需的电压、同时样本前向移动(在此情况下，沿Y方向)来执行本发明的方法，而在图10b中，在施加电泳迁移所需的电压之前，停止样本。在图11中，样本和分离介质流的反转是瞬时的(例如，当使用蠕动泵时，其中，泵的方向改变得非常快，见图11b)，虽然当然是期望更慢更温和反转的流以避免任何影响分离质量的扰动。
应当注意，虽然图9至图11是本发明的某些实施例的代表，但是很多其他电压、介质和样本流率、以及样本移位的条件都是可以的，这能够被本领域的技术人员所理解。另外，本发明的其他实施例能够达到的循环数可以改变，或增加或减少，因此能够为用户提供以操作的循环模式来执行自由流电泳的灵活性。
图2概述了本发明实施例的总体模式，图2c概述了本发明实施例的总体电泳分离步骤，应当注意，可以采用三个主要电泳过程(即，等速电泳、区带电泳、以及等电位聚焦)中的每一个作为电泳分离步骤。这在图7a和图8a中分别对于区带电泳和等电位聚焦进行了更详细的图示。
在连续操作期间，由于层流截面，发生了带增宽，这导致分析物在电场中更长的停留时间，因此在电泳槽壁区域中产生更强的横向迁移。这引发与由扩散所致的带增宽重叠的其他镰刀状带增宽。
与以上相反，在其中电场作用于分析物的循环间隔操作期间，带增宽仅仅由扩散导致，因此低于在连续操作的情况。较低的带增宽导致较高的分辨率。换句话说，以循环间隔操作的分辨率优于以连续操作(CFFE)的分辨率。因此，与连续自由流电泳相比，循环间隔自由流电泳产生了增强的分离分辨率。而且，当与静态间隔自由流电泳相比，循环间隔操作可以达到相同的或更好的分辨率等级，但是是以更短的时间范围。这是由于与其中电迁移静态发生(流关闭)的现有技术的间隔FFE相比，如果样本和分离介质是运动的，可以施加更高的场强。
在本发明的其他实施例中，该方法可以与自由流电泳过程和装置的其他变化相结合。例如，可以使用多个装置或装备，它们被并联或串联安排，如对Weber的共同未决申请US2004/045826中所描述的。在这种结合中，也可以以如此处描述的循环间隔、静态间隔模式或连续模式来执行其他电泳过程。通过选择合适的操作模式(循环间隔、间隔或连续)和分离模式(ZE、IEF和/或ITP)，可以实现多种不同粒子的有力分离。
如图3、图4、图7a和图8a所示，可以执行本发明多方面的电泳设备10包括电泳槽12，其由地板(floor)或底板16、盖或顶板14、以及端壁18、20和侧壁56、58所限定。端壁18、20和侧壁56、58优选地形成基本为矩形的电泳槽12结构，其介于并支持相对的、平行的顶板和底板(14和16)。
位于电极空间(即，阴极空间28和阳极空间30)中的多个电极安排为靠近并平行于电泳槽12中的第一和第二侧壁(56和58)，从而使得这些电极大体上彼此平行。虽然并不是必须要求电极严格地彼此平行，但是延长的电极的严格平行是优选的，用以在电泳槽12中的分离空间中提供均匀电场。通常，阳极26布置在阳极空间30中，阴极24布置在阴极空间28中。电极(24和26)一般通过电极隔离物32与电泳槽12分离，电极隔离物32维持阻隔以防止已电泳分离的粒子在操作期间到达、污染、或干扰电极。一般地，电极隔离物32构造为膜电极隔离物48的形式，其基本上是防止水动力流导致的介质交换的过滤膜。这些膜一般非常靠近电极，但是为了清晰起见，图中示出了与电极隔离的膜。上面的更详细的描述可在图7a和图8a找到。图3和图4所示的截面图描述了在与电极共享的方向上(基本上垂直于顶板14和底板16以及下面描述的分离介质入口36附近的入口端壁18)切割电泳槽12的截面。
分离空间或区带34一般限定或划界为这样的空间：在电极空间(28和30)和顶板及底板(14和16)之间，但不包括电极隔离物32。分离空间34的侧面与当连接到电源(未示出)时就产生电场的阳极26和阴极24相接。电场的方向优选地为基本平行于顶板和底板(14和16)，还优选为基本垂直于电泳槽12中的总体分离介质的移位方向。
优选地，至少当电压施加给电极时，顶板和底板(14和16)相对于电极和彼此是固定的，从而使得由移位流和电场产生的力仅作用于分离介质中的样本和离子。
一般地，电源是具有AC到DC变换器的直流(DC)电源，以普通受控方式在电极之间提供电流。另外，可存在用以控制阴极24和阳极26之间的电流的流动的控制器。
电极(阴极24和阳极26)一般由诸如不易在电场中氧化的铂的金属组成。可选地，盐或缓冲溶液持续地洗涤电极(24和26)以去除工艺期间产生的电解产物。此处的溶液或介质通常指阴极介质170和阳极介质172。
电泳槽12的底板16和顶板14可以独立地由玻璃(优选为聚合物包覆的玻璃)，或诸如PVC、聚碳酸酯、树脂玻璃(plexiglas)、多卤烃的合适的塑料，或有机玻璃(
Figure G2007800320949D00181
)(主要由甲基丙烯酸甲酯聚合物组成的丙烯酸树脂)制成。
顶板和底板(14和16)一般通过用作密封垫或封条的槽隔离物22(未示出)相分离。通常槽隔离物22限定电泳槽12中的分离空间34。分离空间34(板之间的空间)的厚度通常具有大约0.01到大约1.5mm的厚度，优选为大约0.05到大约1mm，最优选为约0.1-0.5mm。应当理解，分离空间的厚度取决于很多因素，包括电泳槽12的尺寸和将被分离或检测的样本体积，本领域的技术人员可以进行相应的调整。
根据本发明实施例的设备10包括有助于将样本和分离介质引入电泳槽12中以及从电泳槽12中提取样本和分离介质的元件。构成电泳槽12的下端壁的是，例如，多个分离介质入口36，其通常具有端口(未示出)，端口由如分离介质入口管74的管道(诸如挠性TEFLON管)连接。管以流体传输来供应流体移位系统60的通道(例如，诸如蠕动泵的多通道泵)。分离介质入口通常共线地安排在电泳槽12的下端，并且相对于相应出口是等距的，如图7a和图8a所示。图7a和图8a以及图3和图4中图示出了样本入口管72，其用于将样本和相关介质以及缓冲物引入和洗脱或排到电泳槽12中或从电泳槽12引出、和洗脱或排出。分离介质入口36被提供有分离介质，电极入口(40和44)流体地连接到电极空间(28和30)，并且被提供有阳极26和阴极24的电极稳定介质。包含分析物的样本通过样本入口38注入到分离空间34中的预定位置。其中，多个分离能够同时执行，并且在一对或多对电极或传导壁之间彼此并行，可以考虑同时使用多个样本入口38以将正确的样本或多个样本引入分离空间34中。在这种情况下，如上述的包括多个分离介质入口的实施例，多个样本入口也布置为共线并相对于出口端等距。
可选地，分离介质入口36和样本入口38可以合并。在该实施例中，可以通过分离入口引入样本，例如通过管74的在电泳槽12外部的部分的入口端来注入样本。
根据本发明实施例的设备10可以包括三个流体移位系统。第一流体移位系统控制样本和分离介质在分离空间34中的移位，下面会详细描述。一般地，第一流体移位系统是多通道蠕动泵，但是可以采取足以以受控方式在分离空间34中移位流体的其他形式的泵。
第二流体移位系统用于两个目的，即将样本引入分离空间34中，以及将分离介质引入分离空间34中和在分离空间34中移位分离介质。第二流体移位系统包括两个多通道蠕动泵，一个用于将样本引入分离空间34中，一个用于引入和移位分离介质和样本。然而，可以使一个多通道蠕动泵执行两个任务。优选使用多通道蠕动泵，但第二流体移位系统可以采取足以以受控方式在分离空间34中移位流体的其他形式的泵。
第二流体移位系统还可以执行将逆流介质引入分离空间34中以及在分离空间34内移位逆流介质的任务，这将在下面详述。然而，还可以考虑使用其他多通道泵来实现此目的。
最后，可以使用第三流体移位系统(未示出)以在电极空间中循环(circulate)电极介质。
流体移位系统以受控方式与不同类型的介质相互作用。控制器(图中未示出)一般用于管理流率和上述流体的压力，以执行用户选择的所需要的分离或分馏协议。
在能够执行图3所示的发明的设备的实施例中，使用了两个流体移位系统60和61或泵。第一流体移位系统60用于在电极之间沿电极方向提供样本和分离介质的总体流体移位。第二流体移位系统61用于或一起或分离地将样本和分离介质引入分离空间34中，以及用于在分离空间34中初始地移位二者。在优选实施例中，第二流体移位系统61包括两个流体移位单元，一个用于将样本引入分离空间中，一个用于引导和移位分离介质。该第二流体移位系统61还用于在电泳分离之后通过样本出口52从分离空间34去除或洗脱样本。分离阀可以用于按照本发明实施例的计划的操作所期望地来允许或防止通过样本入口38将样本引入分离空间中。
入口端循环管道86和出口端循环管道88可操作地连接到第一流体移位系统60，并且还流体地连接到电泳槽12的分离空间34。它们的使用涉及分离介质和样本沿电极的方向来回地循环，而不是将分离和样本介质引入分离空间34中。
第一流体移位系统60在样本和分离介质已经被引入分离空间34中之后提供用于控制它们的总体流体流的移位力或压力。例如，一旦分离空间34以及入口和出口循环管充满介质或缓冲溶液时，第一流体移位系统60(在这种情况下，为蠕动泵)的操作将样本和分离介质朝电泳槽12的一端传送，而反转第一流体移位系统60的操作使得样本和分离介质朝电泳槽12的另一端移动。理想地，第一流体移位系统60的操作在样本到达分离空间34的任一端之前被反转。更理想地，第一流体移位系统60的操作会保证样本不离开分离空间34在电极之间的部分。
第二流体移位系统61(例如，以两个蠕动泵的形式)通过样本入口管72连接到样本入口38。还连接到第二流体移位系统61的是分离介质入口管74，其流体地连接到分离介质入口36。第二流体移位系统61控制将样本和分离介质输送到分离空间34中，以及控制将已从电泳槽12中分馏的样本提取到单个的收集器皿(well)、容器或腔体82中，例如微量滴定板(microtiter plate)80中。
应当注意，理想地，当第二流体移位系统61在运行时，第一流体移位系统60不在运行中，反之亦然。
在运行方面，图3反映的实施例按照如下操作。第二流体移位系统61使得样本被引入分离空间34中以及分离介质被引入分离空间34中，以及使得样本和分离介质进一步都进入到移位空间34的中央区域。优选地，在此阶段期间不发生电泳迁移。接下来，通过使流体经过入口端循环管道86和出口端循环管道88发生移位，第一流体移位系统60沿电极的方向来回地移动样本和分离介质。在该运动或循环部分期间，电流在电极之间流动，从而导致或允许电泳迁移。在充分的循环和电泳迁移之后，第一流体移位系统60优选地不再使用或被关闭，而第二流体移位系统61导致另外的分离介质被引入分离空间中，从而使已分离的样本通过样本出口从分离空间移位并优选地进入诸如在微量滴定板中发现的收集容器。在该洗脱阶段也可以将另外的样本引入分离空间中。
同样，可以通过逆流入口54将逆流介质引入出口端壁20中，其中，样本出口52一般介于样本介质入口38和逆流入口54之间。在洗脱阶段或步骤期间，期望关闭高电压或至少不会导致电泳迁移，特别是对于ITP和ZE操作模式。出于显而易见的原因，当以IEF模式执行分离时，没有必要关闭电压(见以下)。应当注意，在该实施例中所涉及的入口、出口、或管道的阀可以有助于上述的处理步骤。
在能够执行本发明的设备的另一实施例中，一个流体移位系统62用于控制流体的运动以便以循环间隔方式执行电泳分离。流体移位系统62的第一个泵通过样本入口管72连接到样本入口38。流体移位系统62的第二个泵连接到分离介质入口管74，其流体地连接到分离介质入口36。流体移位系统62控制样本和分离介质到分离空间34中的输送，以及在样本和分离介质已经被引入分离空间34中后通过提供用于控制它们的总体流体流的移位力或压力来控制流体的运动。例如，一旦分离空间34以及入口和出口循环管充满介质或缓冲溶液时，流体移位系统62(在这种情况下，为蠕动泵)的操作将样本和分离介质朝电泳槽12的一端输送，而反转流体移位系统62的操作使得样本和分离介质朝电泳槽12的另一端移动。理想地，流体移位系统62的操作会在样本到达分离空间34的任一端之前被反转。更理想地，流体移位系统62的操作会保证样本不离开分离空间34在电极之间的部分。
在电泳分离发生之后，通过使由逆流入口54和分离介质入口36引入的介质的体积流量的每一个保持为零或为正，使得进入分离空间34和从分离空间34出来的样本的净流量保持恒定，其中，当两种流的和为正时，已分馏的样本能够通过样本出口52、通过出口管76洗脱，并优选地进入单个的收集容器或设置在例如，微量滴定板80中的腔体82。
可选地，流体移位系统62的第二个泵还可以连接到逆流管78，其通过逆流入口54流体地连接进入分离空间34。
除了分离介质入口管74，分离阀可以用于按照本发明实施例的计划的操作所需来允许或防止样本通过样本入口38引入分离空间34中。
图4a和图4b中示出的实施例按照以下操作。流体移位系统62使得样本和分离介质引入分离空间34中。在优选实施例中，流体移位系统62包括两个流体移位系统，一个用于将样本引入分离空间中，一个用于引入和移位分离介质。优选地，在此阶段期间不发生电泳迁移。接下来，流体移位系统62沿电极的方向来回地移动样本和分离介质。这样执行使得流体移位系统62的操作致使分离介质和样本向前和向后移动，在循环运动中朝向并远离入口端壁18。在图4a和图4b中示出的实施例的变形中，逆流管78和分离介质入口管74同流体移位系统62一起导致了在逆流入口54和分离介质入口36之间的压力差。
在运动或循环部分期间，在电极之间流动的电流导致或允许电泳迁移。在充分的循环、电泳迁移或两者之后，流体移位系统62用于通过样本出口52洗脱已从分离空间34中分离的样本，并优选地进入诸如在微量滴定板80中发现的收集容器或腔体82。在该洗脱阶段也可以将其他样本引入分离空间中。同样，可以引导出口端壁20附近的逆流介质，其中，样本出口52一般介于样本介质入口38和逆流入口54之间。在洗脱阶段或步骤期间，期望关闭高电压或至少不会在这点导致电泳迁移。应当注意，在该实施例和其他实施例中涉及的入口、出口、或管道的阀可以有助于上述的处理步骤。
在样本流的循环期间，无论如何都要防止样本或介质进入到样本出口以及防止空气进入到任意入口管，这非常重要。例如，在图4a和图4b中示出的实施例中，期望通过关闭阀门使样本出口抵抗或防止样本或介质在样本流的循环期间进入到出口，通过相对于分离空间34升高出口管76来致使在出口中形成压头(pressure head)，或收缩出口管来使得对于分离介质进入出口管76比进入逆流管78、样本入口管72、或分离介质管74的流体阻力更大。本领域的技术人员会理解实现同样目的的其他方法。
根据本发明实施例的设备10可进一步包括馏分收集器(fractioncollector)出口或样本出口52和出口管76。在多数操作情况下，通常在根据至少一个上述电泳模式的电泳分离之后，已分离的馏分，即，感兴趣的分析物，通过以直线布置并邻近出口端壁20(通常与相邻于分离介质入口36的入口端壁18相反)的空间上不同的样本出口52被收集。分析物或馏分通过出口管76或管道被引入任意适合类型的单个收集容器，优选为微量滴定板80中的腔体82或器皿(见图3和图4)。在收集容器中，分析物同分离介质(以及，可选地，逆流介质)一起被收集。一排收集出口的每个样本出口52之间的距离一般应该尽可能小以提供合适的分馏/分离。从收集出口的中心测量的每个样本出口52之间的距离通常约为0.1mm到约2mm，更一般约为0.3mm到约1.5mm，并且几乎总是取决于出口管76的最大直径。开口之间具有最小可能距离的一系列管开口被称作分馏装置，这些并列布置的出口管的数量范围是在2和最大1000之间，优选地在30和200之间，更优选为20和100之间。这些出口的数量、形状和位置可以以不同模式修改以特意地分馏或隔离根据分离梯度分离的样本的特定部分。
所选择的样本组分或所收集的馏分可以用于分析或制备的目的。可选地，馏分可以直接或间接地引入相同的或可选地远程的电泳装置中以执行另外的处理。这可以在执行粗分馏之后接着执行细分馏(更高的分辨率)的情况下、或者在一个或多个电泳模式中(ZE、IEF、ITP、或它们的组合)发生。
没有通过收集出口(所需的样本通过其被收回)收集的无关(extraneous)样本组分或通过不同的收集出口收集的无关样本组分也可以被丢弃。
在本发明的不同实施例中，已分离的样本可以在分馏步骤期间被有意地稀释，或可选地，可以通过使用逆流处理从槽中提取。在逆流处理中，可以通过一般与洗脱期间的样本的总体流方向相反的逆流入口54引导逆流介质176，用于从分离空间34中选择性地提取分离空间34中的样本和分离介质。样本和分离介质在提取或样本出口52处与逆流介质结合，从而被从中提取。逆流用于通过允许调整和控制在收集出口处的流及压力条件来提高分离的分辨率，从而保持对于所需馏分到达期望的样本出口52并通过所期望的样本出口52被提取的控制。逆流处理的细节在Weber的US5,275,706中披露。鉴于上述优点，一般优选使用逆流，尽管在某些情形下，例如由于固有的稀释效应并不期望有这种逆流。
除了上述在图4a和图4b中所示的使用逆流之外，可以在样本洗脱期间在根据本发明实施例的电泳槽12中使用逆流技术。例如，在图7a和图8a中，在洗脱步骤期间，其中，样本在电泳槽12中已经通过逆流管78经历了朝向并通过逆流入口54的电泳迁移，可以引入逆流介质。在与从电泳槽12洗脱样本和分离介质的方向相反的方向上引入逆流介质。逆流通过允许调整和控制在样本出口52处的流及压力条件来增强分离，并减少在洗脱期间可能影响样本分辨率的任何空隙的出现。至于如何使用逆流的细节，还可以参考US5,275,706，其全部内容通过引证结合于此。
逆流介质，如果使用的话，一般被选择为能够修改或超越(surpass)在样本出口52附近的分离介质的缓冲能力，因此可以是具有诸如粘度和密度的相同物理性质而传导性和/或PH值和/或它们的化学成分不同的材料。一般的逆流和分离介质选自同组介质，因而可以包含诸如尿素、甘油、碳水化合物的成分及相似的化合物。
分离介质的流率与逆流介质的流率的有用比例约为1∶10到约10∶1，更一般约为1∶3到约3∶1。分离介质和逆流介质的实际流率取决于多种考虑，包括设备10的几何尺寸、使用的特定分离模式(其可以在所需的传输时间内变化)、将被分离的样本、使用的分离介质和逆流介质或为获得分析物的最佳分离所使用的介质。因此进入系统的所有介质(稳定和逆流)的一般流率范围可以是从0.3mL/小时到3000mL/小时，这取决于环境和电泳槽的几何形状。然而，样本和分离介质的线速度一般在0.01mm/秒和50mm/秒之间，优选为在0.1mm/秒和10mm/秒之间。
在本发明的实施例中，温度控制也是有用的。当电流经过电解溶液时，根据已知的可能影响粘度和/或流过槽的流体的焦耳热现象，传导介质的温度增加，从而导致流体扰动。为减少由这种热导致的、影响流动介质的层流分布的扰动，一般期望将焦耳热驱散到周围环境中。对于本领域的技术人员来说，多种实际实现所期望的冷却的方法是显而易见的。例如，可以使用冷却元件178(未示出)来实现这个效果。电泳槽12可以安排为其底板16在金属支持物上，其包含有与冷却元件178连接的流体流通道。冷却元件178可以是温度控制装置174，诸如Peltier或热电(TE)模块。用于测量和控制电泳槽12的温度的热电闭环控制系统有助于将分离空间34保持为所期望的温度。有用的温度范围约是从2℃到约35℃，更一般是从约5℃到室温(约20℃-25℃)。
在本发明的实施例中，其中，膜电极隔离物48将阴极和阳极空间(28和30)与分离空间34隔离，可以通过使用泵而使阴极介质170和阳极介质172(一起称作电极介质)以高流率流通来清洁电极空间(28和30)。电极介质可以以连续的方式被冷却并被重新引入电极空间(28或30)中。图7a和图8a中反映了怎样冷却电极介质，其中，阴极介质进入阴极介质入口44中并通过阴极介质出口46排出。在阴极介质或阳极介质重新进入电泳槽12之前，它们可以经受诸如传热元件的冷却元件，其在重新引入之前将热能从阳极和阴极介质去除。
具体地，如在图7a和图8a中反映的，阳极介质172进入阳极介质入口40并通过阳极介质出口42排出。在其中电极隔离物32是诸如膜电极隔离物48的物理阻隔物的实施例中，阴极和阳极介质(170和172)的流率可以与总体样本和分离介质的流率不同。
很明显，存在其他的冷却电极介质的适合的方法，因而本领域的技术人员可以应用这些适合的方法。
上述的用于电源和流体控制的控制器可以作为一个单元，或可选地作为独立单元。每一个都可以由彼此独立的用户控制。设置在控制器中处理的协议的参数，诸如电泳模式、循环数、一个循环的停留时间等，这优选地通过提供用于输入参数值的图形用户接口的软件程序来完成。
因此，在另一方面，本发明涉及在计算机可读介质上存储的计算机可执行软件代码，其中，该代码适于实现电泳槽12中的粒子的分离，其中，电泳槽具有顶板、底板、以及之间具有分离空间的大体上平行于彼此的多个电极，以及一个或多个用于在电极之间输送分离介质的流体移位系统，其中，软件包括能够在电极之间选择和施加有效地通过电泳来操纵粒子的电压的代码、能够朝平行于电极方向的第一方向来移动至少一部分分离介质和样本的代码、以及能够朝与第一方向相反的第二方向来移动至少一部分分离介质和样本的代码；以及能够朝第一方向移动至少一部分分离介质和样本的代码。换句话说，软件程序支持用户选择对于计划的分离过程来说合适的参数值，包括电压、电流、分离介质的流率、样本、以及可选的逆流介质与循环数。这一般通过向用户提供待填写的表格来实现，表格使其布局(例如，显示的信息和输入字段)适合于迄今为止输入的参数值，即，所选的电泳模式等。另外，软件程序可以检验所输入的参数值并通知用户参数值不正确或超范围。而且，软件程序可以通过自动提供参数值来支持用户，其中参数值可来源于已经建立的参数值，例如，在已经输入了循环数和每次循环的停留时间之后总的停留时间。
理想地，在层流条件下所有通过分离空间34的介质流都如此完成。如图3、图4、图7a和图8a所示，对于本发明的多个实施例，当用样本或分离介质填充电泳槽12时，来自各个入口(36和38)的流的方向由箭头示出。
可以采用不同的电泳模式来影响粒子迁移，例如，基于粒子的等电位点(即，两性粒子的等电位聚焦(IEF))，或可选地基于粒子净电荷(即，具有不同的或变化的净电荷的粒子的区带电泳(ZE))。当介于领先(leader)(快速移动)和末尾(慢速移动)缓冲系统(即，阴性粒子或阳性粒子的等速电泳(ITP))之间时，还可以基于粒子的电泳迁移率来分离粒子。
在第一模式的电泳分离中，执行区带电泳(ZE)FFE分离技术。区带电泳基于将被分离的粒子的电泳迁移率值和所使用的分离介质的电泳迁移率值之间的差值。FFE区带电泳可以基于不同尺寸和/或形式和/或净表面电荷来隔离分析物和粒子。
当在分离期间必须对分离介质提出具体要求时，ZE FFE方法尤其适于分离“敏感的”生物粒子和复合物。当在分离之后必须保持粒子的生物功能和完整性时一般是这种情况。在这些情况中的特殊要求是，例如，对于分离介质的非常严格的PH范围、良好的分离介质缓冲能力、所使用的缓冲物质的生理适应性、以及各种“关键的”阳离子和阴离子的最小含量等。
图7b示出了具有平坦的PH分布134的区带电泳设备10。分离介质以层流方式在两个电极之间流动，如图2c的阶段2和阶段3所示的。将被分离的具有三组粒子(90a、104a、和118a)的样本通过样本入口38被引入分离介质中并由分离介质的层流进行传输。在图2c中反映的步骤的阶段2和阶段3期间三组粒子被分离，从而允许迁移并以在分离介质中的电极之间所产生的电场而导致的PH梯度收集在不同馏分中，如图2d所示。具体地，图7a中反映第一粒子90a、第二粒子104a、以及第三粒子118a的路径。每个粒子(90a、104a、118a)在电泳迁移的阶段2和阶段3内沿着特定路径或运动。粒子具有净电荷，其在允许在分离介质内发生电泳迁移的条件下影响它们在分离空间内的运动。第三粒子118a具有轻微的正的净电荷，因此在区带电泳条件下，朝阴极轻微地偏转，而分离介质的总体流体流影响第三粒子118a相对于槽的入口端和出口端的净粒子运动。另一方面，第二粒子104a具有相对强的正电荷，因此，在区带电泳条件下运动的路径期间，大大地向着阴极偏转，而分离介质的总体流体流影响第二粒子104a相对于槽的入口端和出口端的净粒子运动。另一方面，第一粒子90a具有相对强的负电荷，因此在区带电泳条件下的运动路径期间，大大地朝阳极偏转，而分离介质的总体流体流影响第一粒子90a相对于槽的入口端和出口端的净粒子运动。应当注意，图7a反映了区带电泳(ZE)分离，其中，粒子在出现电泳场时会继续朝具有与每个单个粒子的净电荷相反的电荷的电极迁移。如果发生更多的向前和向后运动的循环，或如果允许发生周期或持续时间更长的电泳迁移，粒子会继续迁移，直到它们到达电极或诸如膜电极隔离物48的一些其他电极隔离物32或可选的为诸如高传率导壁或缓冲物(buffer)的非膜电极隔离物50。在第一、第二、及第三粒子(90a、104a、118a)的所有情况中，在图7a中反映的第四路径由洗脱步骤表示，其中，电泳迁移不是非常有影响或甚至不作为每个粒子的净方向的分量(component)存在。
图7a示出这种ZE设备，其中，基于样本的电荷来分离样本，并在较小的程度上基于它们的形状和尺寸来分离样本。如图7b所示，在两个电极之间的分离介质的电传导分布136包括阴极空间28和阳极空间30中的高传导区138，两个高传导区都在电极附近。这些在图7b中示为高传导区138，而分离介质表示为低传导区140。在全部分离介质中PH值相同。分别在阴极和阳极介质缓冲液170和172之间的分离介质中产生平坦的PH分布134。而在阴极和阳极介质缓冲液内存在高PH区144，阴极和阳极介质之间存在低PH区。
在第二模式的电泳分离中，分离基于将被分离的粒子的不同pl值，该pl值等于周围环境、非同质(non-homogenous)介质(粒子相对于它呈现中性)的PH值。基于不同等电位点的粒子的FFE允许其pl值只具有最小差异的分析物或粒子被隔离。这称作在自由流电泳(FFE)执行的等电位聚焦(IEF)。在等电位点pl处(即，在分离介质中的显示PH值的点，在该点处，对于给定的粒子，例如蛋白质分子，正电荷和负电荷的数量相等)，该粒子的总电荷或净表面电荷为零。设备的分离介质中固有的聚焦效应导致从pl扩散开的粒子自动接收(正的或负的)净表面电荷并再次被电场以pl的方向传输。
由于在分析物或分离介质的具有离子分子(优选为一价离子)的粒子之间的电荷转移(即，电的相互作用)，可以预期，pl值有较大变化，因此由粒子和离子分子组成的复合物可与其余的样本种类快速并总体分离。循环等电位聚焦技术通常特别适于生物聚合物及生物粒子的制备隔离，生物聚合物及生物粒子的生物功能或完整性一定在分离介质中所选择的PH梯度范围之内。通过添加“渗透膨胀剂(osmotic expander)”，可以保证保持理想的渗透压。例如，通过添加不带电的物质(例如，蔗糖或甘露醇等，作为非离子渗透膨胀剂)和/或盐(例如，作为离子渗透膨胀剂的NaCI)，对于给定的细胞类型可以达到最佳的渗透压(即，isomolal条件)(例如，对于哺乳动物细胞为250-310毫渗透压摩尔(mosmol))。
图8b示出具有线性PH分布梯度142的IEF电泳设备10。分离介质在两个电极之间以层的方式流动，如图2c的阶段2和阶段3所示。将被分离的具有三组粒子(90b、104b及118b)的样本通过样本入口38引入分离介质中并由分离介质的层流传输。三组粒子在图2c中的步骤的阶段2和阶段3期间分离，因而允许聚焦并以由分离介质中的电极之间产生的电场所致的PH梯度收集在不同的馏分中，如阶段4或图2d所示。具体地，图8a中反映了第一粒子90b、第二粒子104b、及第三粒子118b的路径。每个粒子(90b、104b、118b)在电泳迁移的阶段2和阶段3内都沿着特定路径或运动。粒子具有pl，其在允许在IEF分离介质中发生电泳迁移的条件下影响它们在分离空间中的运动。第三粒子118b的pl稍微高于在其原始位置附近的介质的pl，因此在IEF电泳条件下的运动路径中，稍微朝阴极偏转，而分离介质的总体流体流影响第三粒子118相对于槽的入口端和出口端的净粒子运动。另一方面，第二粒子104b的pl比其原始位置附近的介质的pl高得多，因而在IEF电泳条件下的运动路径中，极大地朝阴极偏转，而分离介质的总体流体流影响第二粒子104b相对于槽的入口端和出口端的净粒子运动。另一方面，第一粒子90b的pl比其原始位置附近的介质的pl低得多，因而在IEF电泳条件下的运动路径中，极大地朝阳极偏转，而分离介质的总体流体流影响第一粒子90b相对于槽的入口端和出口端的净粒子运动。应当注意，图8a反映了IEF分离，其中，粒子从没有达到它们的pl。如果发生更多的向前和向后循环，或如果允许发生周期或持续时间更长的电泳迁移，则粒子会最终到达它们的pl并只经历如样本和分离介质的总体流体流会经历的向前及向后运动。在第一、第二、及第三粒子(90b、104b、118b)的所有情况中，在图8a中反映的第四路径由洗脱步骤表示，其中，电泳迁移不是非常有影响或甚至不作为每个粒子的净方向的分量存在。
图8b示出在电极附近的阴极空间28和阳极空间30中具有高的电传导性的、两个电极之间的分离介质的电传导分布136。这些在图8b中表示为高传导区138，而分离介质表示为低传导区140。分别在阴极和阳极介质缓冲液170和172之间的分离介质中产生PH分布梯度142。
另外，根据本发明实施例的设备10可以以等速电泳模式(ITP)实现。ITP FFE分离技术基于将被分离的粒子的电泳迁移率值的不同。与ZE FFE相比，分离在非同质分离介质中实现并由于固有的“聚焦效应”提供更好的溶出度(dissolution)。当在ITP期间单粒子从粒子(例如，蛋白质)的分离带扩散时，这些粒子进入具有变化的电场强度的介质，导致粒子加速或减速。固有的聚焦效应意味着移动更慢或更快的粒子找到它们再次进入主馏分的途径。虽然没有如以上图示出区带和IEF电泳技术，但本发明在以ITP操作模式使用时显示了极大的价值和结果。
本领域的技术人员会理解，可以将这些分离技术(IEF和ZEFFE或IEF和ITP)进行各种组合。例如，可以在FFE设备的电泳槽内同时使用不同的分离介质，从而同时使用不同的分离参数。
在本发明的其他实施例中，考虑在一单对电极之间的分离空间34内的多个分离子空间中执行循环间隔模式。相邻子空间之间的低迁移率边界(具有高传导性)由布置在子空间之间的阴极稳定介质和阳极稳定介质的相邻的流限定。所有介质一般经由诸如多通道蠕动泵的泵通过它们各自的入口被引入。至于该方法的细节，参考国际申请号PCT/US06/016175，其全部内容通过引证结合于此。
优选地，分离介质是无基质水性介质。缓冲成分的选择取决于应用模式(ZE、IEF、或ITP)和样本的属性或分离问题。合适的缓冲系统一般在本领域中已知，并且在某些情况下可在市场上获得(例如，从BD GmbH、Planegg、德国)。用于执行本发明实施例的优选缓冲系统是，例如，在共同未决申请US2004/101973、临时提交的申请USSN 60/885,792、及USSN 60/945,246中所描述的，其全部内容通过引证结合于此。对于此处描述的循环间隔FFE来说，特别优选的是包括一个缓冲酸和一个缓冲碱的简单缓冲系统，特别是如果以ZE或平坦梯度IEF模式执行分离时。
在本发明的一些实施例中，一般是水性的阳极稳定介质(例如)可以包括选自由葡萄糖酸、葡萄糖糖醛酸、乙酰水杨酸、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、以及两性离子缓冲液(也称作Goods缓冲液-见Good等，Biochemistry 5,467(1966))构成的组的酸。在本发明的一些实施例中，一般是水性的阴极稳定介质可以包括选自由N-甲基-D-氨基葡萄糖(N-methyl-D-glucosamine)、三异丙醇氨和2-[二(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1，3-二醇(BISTRIS)(即，2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propane-1，3-diol(BISTRIS))构成的组的碱。
改善电泳分离的一种可能是使样本移动并介于阳极和阴极之间的时间周期最大化。为实现此目的，可以调整平均流体速度、持续时间、以及介质和样本的总体流的移位距离，以使应用的电泳性能最大化。在一些情况下，例如，停留时间可能是主要考虑因素，因此可以调整循环数及时间、距离、和分离介质的总体流的线性粒子速度，以最优化输出和性能。在其他应用中，由于层流分布导致的带增宽可能利于控制。控制系统参数的灵活性允许用户基于他或她正在使用的应用类型来使输出和分流质量最大化。根据本发明的循环间隔方法提供了在单个电泳槽12内执行任意的FFE-分离技术的可能。而且，当与连续自由流电泳机器所要求的槽尺寸相比，甚至在延长的电泳次数的情况下，槽甚至可以具有更小的尺寸。
如上所述，本发明尤其适于，但不限于以下物质的分析和制备分离：离子，肽(peptides)，生物聚合物，诸如泡囊(vesicles)、细胞膜、细胞器、病毒等的生物粒子，以及合成聚合物以及通常可以被电泳场影响的任意粒子。
对于本领域的技术人员来说，在不背离由所附权利要求限定的本发明的思想和范围的情况下，可以对此处所描述的实施例进行多种修改和更改。

Claims (42)

1.一种用于分离粒子的方法，包括：
在电泳槽中布置分离介质和样本，所述电泳槽具有顶板、底板和多个电极，其中所述多个电极彼此大体上平行且之间布置有分离空间，并且布置用于在所述电极之间输送分离介质的流体移位系统；
在所述电极之间施加能够通过电泳来操纵粒子的电压；
将至少一部分所述分离介质和样本朝大体上平行于所述电极的方向的第一方向移位；
将至少一部分所述分离介质和样本沿着大体上与所述第一方向相反的第二方向移位；
其中，将至少一部分所述分离介质和样本朝第一方向移位以及将至少一部分所述分离介质和样本沿着第二方向移位是以循环方式执行的。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括通过一个或多个出口从所述电泳槽洗脱所述分离介质和样本的步骤。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，至少一部分所述分离介质和所述样本从所述分离空间洗脱进诸如微量滴定板中的容器或器皿的单个收集腔体中。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，通过沿着与所述第一方向或所述第二方向一致的方向移位所述分离介质和样本，将至少一部分所述分离介质和样本朝出口洗脱。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，在从所述电泳槽洗脱所述分离介质和样本之前，所述方法包括去除在所述电极之间能够通过电泳操纵粒子的所述电压。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述电极之间施加电压启动选自由等电位聚焦、等速电泳、以及区带电泳构成的组的电泳分离模式。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，当施加所述电压时，所述顶板和底板相对于所述电极以及相对彼此是固定的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述顶板和底板之间的所述分离空间包括约0.01mm至约1.5mm的厚度。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述顶板和底板之间的所述分离空间包括约0.05mm至约1mm的厚度。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述顶板和底板之间的所述分离空间包括约0.1mm至约0.5mm的厚度。
11.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：调节所述电泳槽的温度，以将温度保持在约2℃至约35℃。
12.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：调节所述电泳槽的温度，以将温度保持在约5℃至约20℃。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，一个循环包括：
将所述分离介质和样本朝大体上平行于所述电极的方向的第一方向移位，以及
将所述分离介质和样本沿着大体上与所述第一方向相反的第二方向移位；
以及其中，循环数大于1。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，一个循环包括：
将所述分离介质和样本朝大体上平行于所述电极的方向的第一方向移位，以及
将所述分离介质和样本沿着大体上与所述第一方向相反的第二方向移位；
以及其中，循环数为从2至大约10个循环。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，选择所述循环数以实现所述样本的充分分离。
16.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：将逆流介质引入和移位到所述分离空间中。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述电场的方向基本上垂直于所述分离介质的移位方向。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述电场的方向基本上平行于所述顶板和所述底板。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述电泳槽内，在所述阳极和所述分离介质之间布置阳极稳定介质，以及其中，在所述阴极和所述分离介质之间布置阴极稳定介质。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分离介质是包括至少一种缓冲酸和一种缓冲碱的无基质水性介质。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，多个样本布置在所述电泳槽中并同时通过电泳进行分离。
22.一种用于分离粒子的设备，包括：
电泳槽，具有顶板、底板和多个电极，其中所述多个电极彼此大体上平行且之间布置有分离空间；
流体移位系统，配置为在所述电极之间引入分离介质以及引入样本；以及
第二流体移位系统，配置为在第一方向和第二方向之间循环地移位所述分离介质和样本，其中所述第一方向大体上平行于所述电极的方向，所述第二方向大体上与所述第一方向相反。
23.一种用于分离粒子的设备，包括：
电泳槽，具有顶板、底板和多个电极，其中所述多个电极彼此大体上平行且之间布置有分离空间，
流体移位系统，配置为在所述电极之间引入分离介质和样本，并且还配置为在第一方向和第二方向之间循环地移位所述分离介质和样本，其中所述第一方向大体上平行于所述电极的方向，所述第二方向大体上与所述第一方向相反。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的设备，其中，所述顶板和底板相对于所述电极以及相对彼此是固定的。
25.根据权利要求23所述的设备，其中，在所述顶板和底板之间的分离空间包括约0.01mm至约1.5mm的厚度。
26.根据权利要求23所述的设备，其中，在所述顶板和底板之间的分离空间包括约0.05mm至约1mm的厚度。
27.根据权利要求23所述的设备，其中，在所述顶板和底板之间的分离空间包括约0.1mm至约0.5mm的厚度。
28.根据权利要求23所述的设备，其中，所述流体移位系统包括多通道泵。
29.根据权利要求23所述的设备，其中，所述流体移位系统包括蠕动泵。
30.根据权利要求23所述的设备，其中，所述流体移位系统还用于去除从所述分离空间分离之后的样本。
31.根据权利要求22和权利要求24至30中任一项权利要求所述的设备，其中，所述第二流体移位系统包括多通道泵。
32.根据权利要求22所述的设备，其中，所述第二流体移位系统包括蠕动泵。
33.根据权利要求31所述的设备，其中，两个所述流体移位系统都由单个多通道介质泵提供。
34.根据权利要求31所述的设备，其中，两个所述流体移位系统都由蠕动泵提供。
35.根据权利要求23所述的设备，还包括配置为控制所述流体移位系统的控制器。
36.根据权利要求23所述的设备，还包括配置为控制所述电极之间的电流的流动的控制器。
37.根据权利要求23所述的设备，还包括配置为将所述电极与所述分离空间相隔离的电极隔离物。
38.根据权利要求23所述的设备，还包括冷却元件和温度控制器，所述温度控制器配置为通过所述冷却元件来控制所述槽的温度。
39.根据权利要求23所述的设备，还包括：馏分收集器出口，配置为将已分离的所述样本的馏分从所述分离空间移位到单个收集腔体中。
40.根据权利要求23所述的设备，还包括：馏分收集器出口，配置为将已分离的所述样本的馏分从所述分离空间移位到微量滴定板中的容器或器皿中。
41.根据权利要求23所述的设备，还包括：流体移位系统，配置为使电极介质在电极空间内流通。
42.一种用于分离粒子的方法，包括：
在电泳槽中布置分离介质和样本，所述电泳槽具有顶板、底板、第一槽端、第二槽端、以及多个电极，其中所述多个电极彼此大体上平行且之间布置有分离空间，所述电极沿纵向朝每个所述槽端延伸，并且布置用于在所述第一和第二槽端之间输送分离介质的流体移位系统；
在所述电极之间施加能够通过电泳来操纵粒子的电压；
将至少一部分所述分离介质和样本朝所述第一槽端移位；以及
将至少一部分所述分离介质和样本朝所述第二槽端移位；以及
将至少一部分所述分离介质和样本朝所述第一槽端移位。
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