CN109444246B - 一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置及方法，特点是：装置包括极性可反转的高压电源、气体进样装置、毛细管、第一样品瓶和第二样品瓶，第一样品瓶中设有一端插入盛放液中的金属电极，金属电极的另一端与极性可反转的高压电源电连接，毛细管的进样端插入第一样品瓶的盛放液中，出口端插入第二样品瓶的盛放液中，毛细管的两端之间与外部检测仪连接，第二样品瓶的盛放液通过导线接地，气体进样装置与第一样品瓶连通用于气压进样，气体进样装置与第一样品瓶之间设置有气压进样密封模块；优点是：基于电压极性转换，能够提升进样体积，浓缩效果好，分离窗长，提高瞬态毛细管等速电泳的分离和检测效果。
Description
技术领域
本发明涉及毛细管电泳领域，尤其涉及一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置及方法。
背景技术
毛细管电泳具有分离效率高、分离速度快、可分离同分异构体等优点，已被广泛应用于蛋白质组学、代谢组学、药物分析、食品检测等众多领域。
相比液相色谱，进样体积是限制毛细管电泳进一步广泛应用的主要原因之一。传统毛细管区带电泳的进样体积仅为毛细管柱体积的1％左右，按照典型的30微米内径、1米长的毛细管计算，样品的进样体积仅为7纳升。对样品进行预浓缩是提高毛细管电泳进样体积的有效方法，其中包括瞬态毛细管等速电泳(transient capillaryisotachophoresis)、场放大堆叠(field amplified stacking)、动态pH结(dynamic pHjunction)、大容量样品堆叠等方法(large volume sample stacking)。
其中，瞬态毛细管等速电泳是等速电泳和区带电泳的混合，样品溶液先由等速电泳进行预浓缩，再由区带电泳进行分离，因而可同时实现大进样体积的样品浓缩和分离。瞬态毛细管等速电泳可将进样体积由传统区带电泳1％的毛细管柱体积提高至30％，从而大幅提高毛细管电泳的检测灵敏度。
但是，瞬态毛细管等速电泳进样体积的进一步提升会造成分离和浓缩效果下降。瞬态毛细管等速电泳是在同一根毛细管上先浓缩后分离，增大进样体积使得剩余用来浓缩和分离的毛细管长度缩短；增大进样体积同时会延长样品浓缩时间，一方面使得样品无法完全浓缩，另一方面浓缩过程中样品区带向出口方向运动使得用以分离的毛细管长度进一步缩短。因此，进一步增大进样体积会造成瞬态毛细管等速电泳的分离窗口和峰容量减小、分辨率下降、浓缩效果变差的问题。由此，瞬态毛细管等速电泳进样体积极限被限制在30％左右的柱体积。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置及方法，能够进一步提升瞬态毛细管等速电泳进样体积，浓缩效果好，分离窗长，从而提高瞬态毛细管等速电泳的分离和检测性能。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置，包括：极性可反转的高压电源、气体进样装置、毛细管、第一样品瓶和第二样品瓶，所述的第一样品瓶中设有一端插入盛放液中的金属电极，所述的金属电极的另一端与所述的极性可反转的高压电源电连接，所述的毛细管的进样端插入所述的第一样品瓶的盛放液中，出口端插入所述的第二样品瓶的盛放液中，所述的毛细管的两端之间与外部检测仪连接，所述的第二样品瓶的盛放液通过导线接地，所述的气体进样装置与所述的第一样品瓶连通用于气压进样，所述的气体进样装置与所述的第一样品瓶之间设置有气压进样密封模块。
在一些实施方式中，所述的检测仪为紫外-可见光检测器。
在一些实施方式中，所述的气体进样装置与所述的气压进样密封模块之间设置有用于监测进样气压的数字气压计。由此能够控制进样的液体流速和进样体积。
在一些实施方式中，所述的气体进样装置通过导气管与所述的数字气压计、所述的气压进样密封模块依次连通，所述的极性可反转的高压电源通过高压导线与所述的金属电极连接，所述的气压进样密封模块为带有四个开口的密封件，所述的导气管插入所述的密封件的第一开口内，所述的第一样品瓶的瓶口与所述的密封件的第二开口连接，所述的高压导线穿过所述的密封件的第三开口，所述的毛细管的进样端穿过所述的密封件的第四开口。由此，气体进样装置通过导气管直接对气压进样密封模块内施加气压，从而进行电泳进样，整个装置保证了气体进样的气密性。
在一些实施方式中，所述的导气管与所述的密封件的第一开口之间、所述的高压导线与所述的密封件的第三开口之间、所述的毛细管与所述的密封件的第四开口之间均设置有密封接头，所述的第一样品瓶的瓶口与所述的密封件的第二开口之间设置有密封螺纹。由此具有较优的结构，进一步保证气体进样的气密性。
一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法，包括：
通过极性反转的方法，将样品离子以毛细管等速电泳的方式在毛细管中进行往返运动并浓缩。
在一些实施方式中，具体包括以下步骤：
①在第一样品瓶中装入背景电解液，连接好装置，启动气体进样装置，将第一样品瓶中的背景电解液由气体压力进样装载至毛细管内，并使背景电解液充满毛细管；
②更换装有样品溶液的第一样品瓶，将样品溶液由气体压力进样装载至毛细管内；
③更换回装有背景电解液的第一样品瓶，并通过数字气压计将气压置零，使得毛细管内液体流速为零；
④将极性可反转的高压电源开启，通过金属电极对毛细管内的样品溶液施加直流高压，样品离子开始以等速电泳的方式在毛细管中浓缩；
⑤在等速电泳方式过渡至区带电泳方式之前，对极性可反转的高压电源进行电压极性转换，使得样品离子以等速电泳方式在毛细管中往返运动并浓缩；其中，电压极性转换需保持偶数次反转，以确保样品离子朝毛细管的出口端方向运动；
⑥完成浓缩后，保持电压极性恒定并使样品离子以区带电泳方式向毛细管的出口端方向运动，最终由检测仪获得样品信号。
在一些实施方式中，所述的步骤⑤中对极性可反转的高压电源进行电压极性转换，使得样品离子以等速电泳方式在毛细管中往返运动并浓缩，具体包括：控制最后一次反转电压极性发生在样品区带靠近毛细管的进样端处，且最后一次反转电压极性的时刻在样品区带由等速电泳转换成区带电泳的时刻附近。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过极性转换的方法，一方面使得样品离子以等速电泳方式在毛细管中往返运动并浓缩，由此增大用以样品浓缩的毛细管的长度，增大进样体积，提高检测灵敏度；另一方面本发明能使浓缩后的样品离子在毛细管的进样端附近以区带电泳方式分离，而非常规的在毛细管中后段才开始分离，因此使得用以分离的毛细管长度增加，从而能够增大分离窗长，提高分离峰容量，整体上能够提高瞬态毛细管等速电泳的检测和分离效果。
本发明能够解决瞬态毛细管等速电泳的进样体积由一定柱体积(30％左右)进一步提升时引起的分离和浓缩效果下降的问题，这正是现有技术中一直难以解决和突破的，而本发明方法能将进样体积提升至70％左右的柱体积，同时保持甚至提高其分离、检测性能。
附图说明
图1为本发明一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置一实施方式的结构示意图；
图2为一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法的实施过程示意图；
图3为图2的实施过程中极性转换后样品浓缩过程示意图；
图4为实施例四中2种标准肽混合样品在70％进样体积下，采用A)传统的瞬态毛细管等速电泳与B)本发明基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳的实验结果对比图；
图5为实施例四中6种标准肽混合样品在50％进样体积下，采用A)传统的瞬态毛细管等速电泳与B)本发明基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳的实验结果对比图。
其中，极性可反转的高压电源1，气体进样装置2，毛细管3，第一样品瓶4，第二样品瓶5，金属电极6，检测仪7，金属导线8，气压进样密封模块9，数字气压计10，导气管11，高压导线12，第一开口13，第二开口14，第三开口15，第四开口16，密封接头17。
具体实施方式
以下结合附图对本发明一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置及方法作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。
实施例一
一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置，包括：极性可反转的高压电源1、气体进样装置2、毛细管3、第一样品瓶4和第二样品瓶5。第一样品瓶4中设有一端插入盛放液中的金属电极6，金属电极6的另一端与极性可反转的高压电源1电连接，用以实现电泳用的高压的加载及提供极性可反转的直流高压。毛细管3的进样端插入第一样品瓶4的盛放液中，出口端插入第二样品瓶5的盛放液中，毛细管3的两端之间与外部检测仪7连接，第二样品瓶5的盛放液通过金属导线8接地，用以闭环电泳的电流回路。气体进样装置2与第一样品瓶4连通用于气压进样，气体进样装置2与第一样品瓶4之间设置有气压进样密封模块9，用以保证气体进样的气密性。
实施例二
如图1所示，一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置，其余结构与实施例一相同，其不同之处在于：本实施例中，检测仪7为紫外-可见光检测器，毛细管3的出口端经紫外-可见光检测器后插入装有背景电解液的第二样品瓶5中，在其他实施例中可选用其他检测仪，并对结构做适应性更改。
本实施例中，气体进样装置2与气压进样密封模块9之间设置有用于监测进样气压的数字气压计10，由此能够控制进样的液体流速和进样体积。
本实施例中，气体进样装置2通过导气管11与数字气压计10、气压进样密封模块9依次连通，极性可反转的高压电源1通过高压导线12与金属电极6连接，气压进样密封模块9为带有四个开口的密封件，导气管11插入密封件的第一开口13内，第一样品瓶4的瓶口与密封件的第二开口14连接，高压导线12穿过密封件的第三开口15，毛细管3的进样端穿过密封件的第四开口16，由此，气体进样装置2通过导气管11直接对气压进样密封模块9内施加气压，从而进行电泳进样，整个装置保证了气体进样的气密性。
本实施例中，导气管11与密封件的第一开口13之间、高压导线12与密封件的第三开口15之间、毛细管3与密封件的第四开口16之间均设置有密封接头17，第一样品瓶4的瓶口与密封件的第二开口14之间设置有密封螺纹，由此具有较优的结构，进一步保证气体进样的气密性。
本实施例中，金属电极6选用铂金电极，具有耐腐蚀，寿命长的优点。
实施例三
本发明的一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法，包括：
通过极性反转的方法，将样品离子以毛细管等速电泳的方式在毛细管中进行往返运动并浓缩。
本实施例中，具体包括以下步骤：
①在第一样品瓶中装入背景电解液，连接好装置，启动气体进样装置，将第一样品瓶中的背景电解液由气体压力进样装载至毛细管内，并使背景电解液充满毛细管；
②更换装有样品溶液的第一样品瓶，将样品溶液由气体压力进样装载至毛细管内，通过控制气体进样装置的进样时间可以对样品溶液的进样体积进行控制；
③更换回装有背景电解液的第一样品瓶，并通过数字气压计将气压置零，使得毛细管内液体流速为零；
④将极性可反转的高压电源开启，通过金属电极对毛细管内的样品溶液施加直流高压，样品离子开始以瞬态等速电泳的方式在毛细管中浓缩；
⑤在等速电泳方式过渡至区带电泳方式之前，根据样品离子的不同选择合适的时刻，对极性可反转的高压电源进行电压极性转换，使得样品离子以等速电泳方式在毛细管中往返运动并浓缩；其中，电压极性转换需保持偶数次反转，以确保样品离子朝毛细管的出口端方向运动；偶数次反转电压极性具体是指一正一负/一负一正两次或如此重复切换电压极性；
⑥完成浓缩后，保持电压极性恒定并使样品离子向毛细管的出口端方向运动，最终由检测仪获得样品信号。
本实施例中，极性可反转的高压电源施加的直流高压大小为10～30千伏特。
本实施例中，步骤⑤中根据样品离子的不同选择合适的时刻，对极性可反转的高压电源进行电压极性转换，使得样品离子以等速电泳方式在毛细管中往返运动并浓缩具体包括：控制最后一次反转电压极性发生在样品区带靠近毛细管的进样端处，且最后一次反转电压极性的时刻在样品区带由等速电泳转换成区带电泳的时刻附近，由此在进行后续区带电泳分离时，用以分离的毛细管达到最长，分离窗长最大，分离效果最优。
如图2所示，描述了基于极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法的实施过程。其中，BGE表示背景电解液，S表示样品溶液，LE表示前导电解液，TE表示尾随电解液。根据瞬态毛细管等速电泳原理，T1时刻上电后样品离子(阳离子)在电场作用下向右运动，并基于前导电解液(LE)离子、样品(S)离子、尾随电解液(TE)离子的离子淌度差异形成非均匀强度的电场分布，造成样品以等速电泳方式浓缩，样品被浓缩的同时，由于背景电解液区带与样品区带之间形成的非稳定移动界面，造成背景电解液离子与部分样品离子混合；T2时刻电压极性反转，样品离子向左运动并浓缩，T3、T4......如此反复循环转换电压极性，直至TN时刻，背景电解液与样品完全混合，样品区带中由背景电解液离子承载电流，样品离子在背景电解液离子决定的均匀电场作用下开始以区带电泳方式分离。
本发明一种基于极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法可行的关键在于极性反转后样品离子仍然能以等速电泳方式浓缩。图2中T2时刻样品未完成浓缩，样品区带可分为未浓缩区带和浓缩区带两部分，其放大图如图3中所示。极性反转后，未浓缩区带会按等速电泳的方式继续浓缩。对于浓缩区带，用μ表示离子淌度，尾随电解液离子、样品离子、前导电解液离子的离子淌度关系为μTE<μS<μLE，根据Kohlrausch调节方程，用σ表示电导率，尾随电解液离子、样品离子、前导电解液离子的电导率关系为σTE<σS<σLE，根据欧姆定律j＝σE，在电流密度j恒定条件下，尾随电解液离子、样品离子、前导电解液离子的电场强度E分布为ETE>ES>ELE，根据离子电泳速度v满足v＝μE，对于前导电解液离子，其在尾随电解液区带中的运动速度vLEinTE、其在样品区带中的运动速度vLEinS、其在前导电解液区带中的运动速度vLEinLE满足vLEinTE>vLEinS>vLEinLE，因此前导电解液离子会加速穿过样品区带和尾随电解液区带而不会形成浓缩，即尾随电解液区带与样品区带之间，样品区带与前导电解液区带之间的界面均为非稳定移动界面。同样，样品离子也会加速穿过尾随电解液区带，最终完成等速电泳的重构。综上所述，对于未完成浓缩的样品，极性反转后样品离子仍然能够以等速电泳方式进行浓缩。
加载一定的气压，使得装有背景电解液的第一样品瓶中的背景电解液在气压作用下充满毛细管，然后更换装有样品溶液的第一样品瓶装载样品，再换回背景电解液的第一样品瓶，并迅速将气压至零，使得毛细管内液体流速为零，完成样品加载。第二样品瓶中装载与第一样品瓶同样的背景电解液。极性可反转的高压电源通过插入第一样品瓶中的金属电极对毛细管内样品施加高压，样品在毛细管内开始以等速电泳方式浓缩；在样品于等速电泳方式过渡至区带电泳方式之前，选择合适的时刻多次反转电压极性，使得样品离子以等速电泳方式在毛细管中往返运动并浓缩，最后由紫外-可见光检测器获得样品信号。
实施例四
采用本发明一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置及方法与采用传统的瞬态毛细管等速电泳方法对样品进行对比实验，以说明本发明的可行性和有效性，但不作为对本发明的限定。
样品制备：背景电解液由0.1摩尔/升的醋酸与甲醇以9:1的体积比混合而成；前导电解液由醋酸将25毫摩尔的醋酸铵溶液调成pH值等于4配置而成；样品溶液由2毫摩尔/升的单独标准肽溶液，包括肯普肽(kemptide)、缓激肽(bradykinin)、I型血管紧张素(angiotensin I)、肾素基质(renin substrate)、神经降压素(neurotensin)、II型血管紧张素(angiotensin II)，混合后由前导电解液稀释成2微摩尔/升的样品溶液。
实验装置及参数：毛细管选用美国亚利桑那州凤凰城的Polymicro Technologies的熔融石英毛细管，外径为360微米、内径为30微米、长度为50厘米；极性可反转的高压电源采用美国斯派曼(Spellman)公司CZE1000R型号的高压电源；紫外-可见光检测器采用捷克ECOM公司的ECD2600型号的紫外-可见光检测器，并将检测端定在离毛细管的进样端42厘米处。施加的高压电固定为10千伏特。紫外光波长选用214纳米。
电压极性反转时刻选取：施加正极性高压电8分钟后，关闭高压电源，将高压电源由正极性切换为负极性，在8.5分钟时启动高压电源；在14分钟后关闭高压电源，将高压电源由负极性切换回正极性，在14.5分钟时启动高压电源，并一直保持至紫外-可见光检测器记录到完整的分离峰信号。
结果分析：如图4所示，为2种标准肽混合样品在70％进样体积下，采用本发明方法与采用传统的瞬态毛细管等速电泳方法的实验结果对比图。用2微摩尔/升的2个标准肽，为I型血管紧张素(angiotensin I)和神经降压素(neurotensin)的混合溶液作为样品，其中进样体积为70％的毛细管柱体积。100％的毛细管柱体积定义为从进样端至检测端42厘米长的毛细管体积。图4A)为应用传统瞬态毛细管等速电泳方法的紫外-可见光检测器的记录结果，横坐标为时间轴，纵坐标为紫外光吸收量，显示结果表明2个标准肽的峰完全重叠在一起，无法分离；图4B)为应用本发明的基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法的实验结果，可见2个标准肽的完全分离的分离峰。上述实验结果表明，基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法的分离效果要优于传统瞬态毛细管等速电泳方法。
如图5所示，为6种标准肽混合样品在50％进样体积下，采用本发明方法与采用传统的瞬态毛细管等速电泳方法的实验结果对比图。用2微摩尔/升的上述6个标准肽的混合溶液作为样品，进样体积为50％的柱体积。图5A)为应用传统瞬态毛细管等速电泳方法的紫外-可见光检测器的记录结果，如图显示只有1个标准肽与其他5个标准肽部分分离，其他5个标准肽的峰则完全重叠在一起，无法分离；图5B)为应用本发明的基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法的实验结果，可见6个标准肽的分离峰。上述实验结果同样表明，基于电压极性反转的瞬态毛细管等速电泳方法的分离效果要优于传统瞬态毛细管等速电泳方法。
本发明一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳装置及方法，通过极性转换，一方面使得样品离子以等速电泳方式在毛细管中往返运动并浓缩，由此增大用以样品浓缩的毛细管的长度，增大进样体积，提高检测灵敏度；另一方面本发明能使浓缩后的样品离子在毛细管的进样端附近以区带电泳方式分离，而非常规的在毛细管中后段才开始分离，因此使得用以分离的毛细管长度增加，从而能够增大分离窗长，提高分离峰容量，整体上能够提高瞬态毛细管等速电泳的检测和分离效果。
本发明能够解决瞬态毛细管等速电泳的进样体积由一定柱体积(30％左右)进一步提升时引起的分离和浓缩效果下降的问题，这正是现有技术中一直难以解决和突破的，而本发明方法能将进样体积提升至70％左右的柱体积，同时保持甚至提高其分离、检测性能。
值得注意的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非因此限定本发明的专利保护范围，本发明还可以对上述各种零部件的构造进行材料和结构的改进，或者是采用技术等同物进行替换。故凡运用本发明的说明书及图示内容所作的等效结构变化，或直接或间接运用于其他相关技术领域均同理皆包含于本发明所涵盖的范围内。
Claims (2)
1.一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法，其特征在于，包括：
通过极性反转的方法，将样品离子以毛细管等速电泳的方式在毛细管中进行往返运动并浓缩，具体包括以下步骤：
①在第一样品瓶中装入背景电解液，连接好装置，启动气体进样装置，将第一样品瓶中的背景电解液由气体压力进样装载至毛细管内，并使背景电解液充满毛细管；
②更换装有样品溶液的第一样品瓶，将样品溶液由气体压力进样装载至毛细管内；
③更换回装有背景电解液的第一样品瓶，并通过数字气压计将气压置零，使得毛细管内液体流速为零；
④将极性可反转的高压电源开启，通过金属电极对毛细管内的样品溶液施加直流高压，样品离子开始以等速电泳的方式在毛细管中浓缩；
⑤在等速电泳方式过渡至区带电泳方式之前，对极性可反转的高压电源进行电压极性转换，使得样品离子以等速电泳方式在毛细管中往返运动并浓缩；其中，电压极性转换需保持偶数次反转，以确保样品离子朝毛细管的出口端方向运动；
⑥完成浓缩后，保持电压极性恒定并使样品离子以区带电泳方式向毛细管的出口端方向运动，最终由检测仪获得样品信号。
2.根据权利要求1所述的一种基于电压极性转换的瞬态毛细管等速电泳方法，其特征在于，所述的步骤⑤中对极性可反转的高压电源进行电压极性转换，使得样品离子以等速电泳方式在毛细管中往返运动并浓缩，具体包括：控制最后一次反转电压极性发生在样品区带靠近毛细管的进样端处，且最后一次反转电压极性的时刻在样品区带由等速电泳转换成区带电泳的时刻附近。
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