CN101534952B - 微粉化方法 - Google Patents

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Abstract

用于将包含具有预定水平生物学活性的蛋白质的颗粒分散物微粉化的方法。方法包括在这样的研磨条件下将分散物引入涡流室研磨装置中，所述研磨条件导致蛋白质粉末具有5至100μm的颗粒大小分布和/或表现出蛋白质颗粒分散物比其最初大小降低30至400倍，并且保留了蛋白质的至少80％的预定水平生物学活性。研磨条件包括选自下列的一个或一个以上的参数：1和7巴之间的输入压力；0.2和5巴之间的喷射压力；0.1和5kg/小时之间的加载速率；和30和100m3/小时之间的气流。

Description

微粉化方法
技术领域
本发明涉及用于降低蛋白质粉末颗粒大小的方法。
技术背景
近些年，已经产生了制造具有受控的、窄的颗粒大小分布的微米和亚微米颗粒大小药用粉末分散物的需求。此类粉末的应用包括例如通过干粉吸入器递送的药用气雾剂(这提高水不溶性药物的生物利用度)和由浸有凝血因子冻干粉末的生物可降解复合基质构成的止血装置。将粉末研磨成微米和亚微米颗粒大小的过程称作微粉化。
在已知的微粉化方法当中有涉及高剪切率和高能量输入的方法，例如喷射研磨或粉碎系统、球磨研磨、高压匀浆和微流化。此类方法通常不适用于对热降解和/或物理降解敏感的生物分子。其它已知的温和方法包括喷雾干燥、重结晶、乳化溶剂提取和使用超临界流体的方法，如超临界溶液快速膨胀(RESS)。
用于研磨的涡旋室或涡流室也已知。例如，美国专利号4,502,641公开了喷射研磨原理与涡流室的组合。还已知研磨涡流室，其实现所谓的共振涡旋研磨。WO 94/08719公开了配以切向流体喷嘴的涡旋室研磨装置，其实现所谓的“共振涡流研磨”。
Beliavsky的美国专利号5,855,326公开了精细粉碎固体颗粒材料的涡旋研磨室，在具有基本上圆筒形状的外壳内形成具有两个端面和一个侧壁的室，室具有一个或一个以上的正切嘴用于向室内注射工作流体并且在室内产生涡流，所述室包含向其中引入待粉碎固体颗粒材料的装置、在一个或两个所述端面中提供的轴向排列排出通道、和一个或者一个以上机械元件形式的控制装置，当产生涡流时，所述机械元件适合与移动接近室内壁的板层相互作用，从而能够控制粉碎，美国专利号5,855,326的全部内容通过参考并入本文。在专利中使用砂粒例证了涡旋室运转。
Beliavsky的美国专利号6,789,756公开了用于研磨基本上为固体颗粒材料的改进的涡流研磨机，其包含一个或一个以上的工作室，美国专利号6,789,756的全部内容也通过参考并入本文。研磨机还包含一个或一个以上的工作流体入口和一个或一个以上的排出口。一个或一个以上的工作流体入口和一个或一个以上的排出口促进了一个或一个以上工作室内的涡流流动。还有一个或一个以上的进料入口提供固体材料以研磨，研磨的固体材料从一个或一个以上的排出口排出。此外，存在一个设备，用于在工作流体在一个或一个以上的工作室内流动过程中产生受控的摄动，由此改善固体材料在涡流流动中的研磨。
Hercules血纤蛋白羊毛状物是由非针织VicrylTM编织入针织氧化再生纤维素(ORC，InterceedTM)内的生物可降解复合基质构成的止血装置，通过悬浮于挥发性溶剂中使得基质内浸透血纤蛋白原和凝血酶的冻干粉末。
发明内容
本发明的目标是提供用于将蛋白质颗粒分散物微粉化至所确定颗粒大小分布而同时基本上保留了蛋白质活性的机械化方法。
本发明提供用于将包含具有预定水平生物学活性的蛋白质的颗粒分散物微粉化的方法，方法包括在这样的研磨条件下将分散物引入涡流室研磨设备，所述研磨条件导致蛋白质粉末具有5至100μm的颗粒大小分布并且保留了蛋白质的至少80％的预定水平生物学活性，其中研磨条件包括选自下列的一个或一个以上的参数：1和7巴之间的输入压力；0.2和5巴之间的喷射压力；0.1和5kg/小时之间的加载速率；和30和100m3/小时之间的气流。
本发明方法有利地使得可以得到具有一致且受控颗粒大小分布的蛋白质粉末。
在本发明的一个实施方案中，首先产生最初蛋白质颗粒分散物的颗粒物，以具有裂缝或洞或者其它结构缺陷，这些裂缝或洞或者其它结构缺陷构成了可以在研磨过程中帮助颗粒破裂的弱点。在一个实施方案中，通过冷冻干燥方法如冻干法制备蛋白质颗粒分散物。冻干法代表性地通过冷冻干燥实现并且包括通过减压下升华从细胞悬浮物中去除水。从蛋白质材料中脱水的备选脱水方法在蛋白质粉末生产领域也是众所周知的并且可以使用。在进一步的实施方案中，在研磨前将冷冻干燥的分散物机械破碎。在更进一步的本发明实施方案中，分散物机械破碎至通过2mm SS筛的颗粒。
在本发明方法中处理的蛋白质具有生物学活性，即对人身体内一种或一种以上生理过程具有影响的活性。例如，蛋白质可以是酶并且相应的生物学活性将是酶的酶催化活性。可以在本发明中使用的蛋白质的非限定性实例包括凝血级联中的任何蛋白酶以及它们的蛋白酶底物；补体级联中的蛋白质以及它们的对等物；生长因子以及它们的受体；激素以及它们的受体；免疫球蛋白；合成代谢和分解代谢酶；催化下列生物化学反应的酶：磷酸化、脱磷酸化、羧化、退火、蛋白水解、转氨基作用、脱氨基作用、氧化作用、氢化作用、杂交、水解、异构化、反转、糖酵解、DNA和RNA聚合作用、酯化反应等。在一个实施方案中，蛋白质是凝血因子并且生物学活性是凝血活性。在另一个实施方案中，蛋白质是凝血酶或血纤蛋白原。蛋白质可以是一种或一种以上上述蛋白质的混合物。在本发明的一个实施方案中，蛋白质是Bac2。在本发明的另一个实施方案中，蛋白质是凝血酶。
蛋白质可以是合成的、天然存在的、通过转基因或重组方法制备的，包括处理的、变性的或者修饰的蛋白质。
生物学活性水平可以通过本领技术人员众所周知的标准生物学测定法预先确定。例如，如果蛋白质是酶，其生物学活性可以通过开展测定活性的一种或一种以上测定法确定。在特定实例中，为确定血纤蛋白原的凝血活性，可以使用Clauss测定法(向维持在37℃的适宜体积和稀释度的血纤蛋白原样品种加入人凝血酶溶液[大约20IU/ml并且包含至少1mmol/l的钙]；确定凝血时间并且对使用适当血纤蛋白原标准制作的校准曲线计算活性)，或者可凝血的血纤蛋白原可以通过测定280nm处的吸光度确定。在另一个特定实例中，凝血酶的凝血活性可以通过凝血方法确定(向适宜体积和稀释度中加入加热至30℃的血纤蛋白原溶液[1g/l凝血蛋白质]并且立即测定凝血时间。对使用凝血酶的参考制剂制作的校准曲线计算试验制剂的活性)。
在本发明中使用的涡流室研磨设备优选包含正切流体喷嘴并且使用压力梯度实行共振涡旋研磨。据信，涡流室内的快速气压变化造成颗粒沿其薄弱面崩解。在一个实施方案中，研磨设备是如美国专利号5,855,326中公开的设备。在另一个实施方案中，研磨设备是如美国专利号6,789,756中公开的设备。此类研磨设备的一个实例是以色列Yokneam的SuperFine有限公司制造的超细涡流研磨机TM(Super Fine Vortex MillTM)(SFVM)(图解示于图6中)。
研磨条件下可以包括一个或一个以上的下列参数：
(a)分散物进入磨的进入流压力(＝输入压力)-通常为1和7巴之间的输入压力，下限在1-3巴范围内(例如1、2或3巴)并且上限在4-7巴范围内(例如5、6或6.3巴)；
(b)进料喷射器处的压力(＝喷射压力-在喷射器用于进料的情况下*)-通常在0.2和5巴之间。在本发明的一个实施方案中，喷射压力是2巴；
(c)加载速率-通常在0.1和5kg/小时之间，下限在0.1-2kg/小时范围内(例如0.2、0.4、0.6或1.6kg/小时)并且上限在3-5kg/小时范围内(例如2.4、2.8、3.0、3.7或4.2kg/小时)；和
(d)从流体注入管至排出管的气流(＝气流**)-通常在30和100m3/小时之间(例如35、40、50、58、60、69、70、80或90m3/小时)。
*分散物的进入流通常高，并且在研磨机内形成的真空将粉末吸入室内。由于本发明方法中的进入流相对低，不足以将粉末吸入室内并且因此常常需要进料喷射器。
**任何惰性气体可用于从流体注入管至排出管的气流(干燥空气、氩、氮等)。在下面的实施例中，使用空气。
在本发明的另一实施方案中，所得到的蛋白质粉末具有5至100μm的颗粒大小分布，下限为5、10、15或20μm并且上限为45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm。在进一步的实施方案中，至少90％的颗粒、更优选至少95％的颗粒、最优选至少97％的颗粒的大小在颗粒大小分布之内。在本发明的一个进一步的实施方案中，蛋白质粉末保留至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％的预定生物学活性。
在更进一步的实施方案中，微粉化导致蛋白质粉末大小比原始大小减小30至400倍。
技术人员容易地理解范围的公开。这意味着在该范围界限间的连续值和数字的公开，包括限定的数字和值。例如，如果给定的范围从1至7，这意味着至少1、2、3、4、5、6或7以及中间亚范围的所有组合，如1和2、1-3、1-4、1-5、1-6、或1-7以及2和3、2-4、2-5、2-6、或2-7等等。
上文或下文引用的所有申请、专利和公布的全部公开内容通过参考并入本文。
附图说明
为了理解本发明并且了解其在实践中如何实现，现仅通过非限定实例的方式参照附图描述优选的实施方案，其中：
图1显示手磨与SFVM的人血纤蛋白原2粉末大小分布谱的比较；
图2显示在不同研磨压力下研磨的人血纤蛋白原2的大小分布谱；
图3显示在不同研磨压力下研磨的凝血酶的大小分布谱；
图4显示使用同一标准操作参数在同一天研磨的两个批次(#4和#5)人血纤蛋白原2的颗粒分布谱；
图5显示使用同一标准操作参数在同一天相继研磨的两个批次(#6和#7)人血纤蛋白原2的颗粒分布；和
图6显示SFVM的剖视图。
具体实施方式
本发明的示例性实施方案将针对以色列Yokneam的Super Fine有限公司生产的SFVM描述。然而，需要理解的是，可以根据本发明使用其它类型研磨机器实现本发明。
I.材料
生物制品
所有批次的人血纤蛋白原2和凝血酶生物制品在以色列Tel Hashomer的PFI冻干。人血纤蛋白原2(有时也称作BAC2)是浓缩的、病毒灭活的人血浆冷沉淀物(冷沉淀物代表性地如EP 534,178中所述制备)，其主要由血纤蛋白原(大约85％)组成并且是纤维蛋白溶酶原耗竭的(纤维蛋白溶酶原的去除代表性地如EP 1,390,485中所述开展)并且未加入抗血纤蛋白溶解剂。生物制品作为冻干块抵达，冻干块在用铝箔袋和厚聚乙烯袋双层包裹的LyoGuard
Figure G2007800410729D00061
塑料盘中。双层包裹的盘子保持在2-8℃直到研磨。
运载体
氢氟碳化合物(HFE)-7000用作生物制品的运载体。然而，生物材料可以悬于任何适宜的溶剂中，并且HFE仅为一个非限定性实例。
II.方法
生物制品在LyoGuard
Figure G2007800410729D00062
中冻干。所有LyoGuards充有1.5升人血纤蛋白原2或凝血酶。干燥的冻干制品转移至用铝箔包裹的测试设备中。在测试地点，打开箔包并且通过用铲刮压2mm SS筛将块第一次机械性破碎，然后粗颗粒粉末经由传送器进入SFVM。在加载制品之前预置喷射器和磨机的压力，并且在运转过程中微调至所期望压力。通过预先称重等分式样的制品维持加载速率；仔细定时加载每一等分式样。粉末收集于连接至旋风分离器SS漏斗末端的玻璃瓶中。
开展下列试验以确定生物学活性和物理参数：
1.水含量-卡尔-费休(Karl-Fisher)滴定法
2.颗粒大小分布-颗粒大小分布可以用Beckman Coulter LS 13 320测量，其使用光散射原理，可以测定液体形式或者干粉形式的颗粒大小分布。在分散于HFE7000中的粉末中开展的库乐尔特颗粒计数允许测定0.375μm-2000μm范围的颗粒大小。
3.血纤蛋白原凝血活性-Clauss测定法[上述]。
4.通过280nm处的吸光度测定凝血血纤蛋白原-为了定量测定凝血血纤蛋白原，所测试样品与凝血酶混合并且形成凝块。钠-EDTA用作反应辅因子(Ca++)的螯合剂并且抑制FXIII被凝血酶活化成FXIIIa(血浆转谷氨酰胺酶)，由此阻止非凝血蛋白质与血纤蛋白间γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸桥的形成。不与血纤蛋白网络交联的这些非凝血蛋白质通过首先在滤纸上干燥凝块，然后用盐水连续洗涤而去除。随后，凝块溶解于尿素/NaOH溶液中并且通过在280nm处(在减少320nm处光散射之后)针对已知内标测定对可凝血血纤蛋白原定量。
5.对于血纤蛋白原和凝血酶冻干和/或研磨样品中总蛋白质测定、可凝血血纤蛋白原测定、通过Clauss法对血纤蛋白原测定以及通过凝血时间对凝血酶效力的测定，粉末应再悬浮于适宜缓冲溶液中。
6.通过凝血方法[上述]测定凝血酶活性。
III.结果
SFVM利用涡流室内的快速气压变化以沿着材料颗粒的结构弱点将材料颗粒断裂，并且由此产生超细粉末。本质上，研磨机已经被设计成能够使用相对低能量提供高效的、节能的细磨粉末，即研磨一千克粉末所消耗的能量远远低于通过常规喷射研磨机或者机械(叶片研磨或球研磨)研磨相同数量粉末达到相同颗粒大小所使用的能量(见表1)。
表1：喷射研磨机和SFVM间的比较(注意能量消耗之间的不同)
  研磨机   所期望的气流(m3/分钟)   压降(巴)   进料速率(Kg/小时)   Kwt x小时/kg.   Kcal/kg
  喷射研磨机   2.84   7   20   2.360   2029
  超细涡流研磨机   1.3   4   25.6   0.483   415
SFVM的设计允许通过变动下列参数灵活调整颗粒大小和大小分布：
施加于主研磨室入口的的压力即输入压力的增加将增加施加于每单位粉末的能量，因此增加颗粒崩解，这会导致减小颗粒大小和缩小分布。然而高能量会导致最终研磨产物的生物学活性降低。
存在控制制剂向研磨机加载速率的两个附加参数：
(1)制剂倾入研磨机接收漏斗的速率，
(2)喷射压力。
高加载速率将降低每千克制剂的能量，因此颗粒所吸收的能量将较低，导致较少数量的颗粒崩解，将产生较大的颗粒。在大多数下列试验中，喷射压力恒定地设定至2巴，在任何所研究的进料速率下这足以推动制剂进入涡流室。然而，对于上述规则有一个例外，当主输入压力高时(＞3巴)，注入主SFVM内的气体产生真空，将大的冻干粉末颗粒吸入研磨机内。因此当在低于3巴下工作时需要辅助的注射入口。
研磨参数的影响
在非受控温度或湿度下，使用在40℃的露点下的压缩空气开展这些实验。
将人血纤蛋白原2和凝血酶粉末在铝箔包裹的LyoGuards中船运至试验地点。使用大的铲将冻干块破碎成通过2mm SS筛的小的颗粒。50克的每一样品加载在SFVM漏斗上。在低的空气压力下，将辅助的压力表加至漏斗口，因为漏斗口处的吸力太低以至于不能维持恒定加载。
1.研磨参数对人血纤蛋白原2的影响
表2显示冻干人血纤蛋白原2在不同空气压力和不同加载速率下研磨所得到的结果。
表2不同空气压力下研磨冻干人血纤蛋白原2
Figure G2007800410729D00081
*ND＝未做
**使用干燥至40℃露点的空气的气流。
所有颗粒大小分布曲线(见图1)表现为双相峰曲线，小峰在0.5至1μm处，主峰在10-30μm附近。从表2可以注意到，只有试验2中运行编号1和2具有与手磨人血纤蛋白原2相似的大小分布(参见表2和图1)。此外，如表3所示(试验编号2，运行编号1和2)，当主参数设定成2巴的压力和3至4.2Kg/小时的加载速率时，通过Clauss法或者可凝血血纤蛋白原(A280)法测定均达到了最高的血纤蛋白原回收。
表3：不同研磨条件对人血纤蛋白原水含量和血纤蛋白原活性的影响
Figure G2007800410729D00091
*通过A280nm方法测定的可凝血血纤蛋白原。
2.研磨参数对凝血酶粉末的影响
如先前使用常规喷射研磨机的试验所发现，凝血酶活性对机械剪切相对不敏感，因此发现凝血酶对使用SFVM时的研磨参数不敏感。因此，主要目标是找到使得凝血酶颗粒大小分布与人血纤蛋白原2的颗粒大小分布相似的条件。还考虑得到与手磨凝血酶相似的颗粒大小分布的条件。在早期试验过程中，很明显凝血酶粉末是高吸湿性的。凝血酶细磨粉末具有吸收水分的极高倾向。因此，颗粒大小越小，凝血酶粉末水含量增加越快。所有上述情况支持设计一种将取得大颗粒大小凝血酶的方法。然而，这种颗粒大小不应超过人血纤蛋白原2的颗粒大小，以使得两种制剂在HFE-7000中具有相同的悬浮特性。
表4：研磨参数对凝血酶颗粒大小分布的影响
运行编号   研磨机上的压力(巴)   喷射器上的压力*(巴)  加载速率(kg/小时)  D(50)，μm   D(90)，μm   气流，m3/小时
  4   6   N.A.  2.7  6.1   12.8   90
  5   2   N.A.  1.6  10.7   29.7   40
*未使用喷射器。
从表4中可以注意到，使用低压力得到的凝血酶大小分布表明产生大的颗粒大小和与人血纤蛋白原2(见图1)极其相似的大小分布。
从该阶段开始，使用SFVM样机1对人血纤蛋白原2和凝血酶进行的常规大规模研磨均使用相同的参数：2巴的主研磨入口压力、2巴的喷射器压力和2kg/小时的加载速率。
在实际的生产厂使用氮气对样机重新进行再检验并且在层流罩中操作。
3.人血纤蛋白原2的研磨试验
在人血纤蛋白原2研磨过程中，层流罩下的湿度为22％，温度为22℃。全部生产过程在无菌条件下进行，加载速率固定为2kg/小时并且喷射器压力设定为2巴。研磨的人血纤蛋白原2于2-8℃储存于玻璃容器中直至试验。
研磨两个批次：批次#1在2巴下研磨，研磨前的最初活性为0.30-0.31mg血纤蛋白原/mg固体(血纤蛋白原已经通过Clauss法测定)，批次#2，在1巴和3巴的压力下进行研磨试验，估计最初活性为0.35mg/mg(血纤蛋白原/固体)。
一旦粉末破碎至2mm颗粒，平均水含量为9.31±0.59％(在批次#1中测定)。结果总结于表5中。
表5：在生产地点使用氮气研磨压力对所研磨人血纤蛋白原2的 可凝血血纤蛋白原(通过Clauss法)和颗粒大小分布的影响
研磨压力(巴)   Clauss法(mg/mg固体)   颗粒大小(D50)(μm)   颗粒大小(D90)(μm)
 1   0.36   20.4   39.1
 2(n＝5的平均值)   0.30±0.01   16.6±1.0   38.4±1.7
 3   0.32   10.4   28.1
研磨后，水含量明显较低(6.66±0.57％)，表明研磨过程也干燥粉末。颗粒分布谱随着压力明显改变(见表5-颗粒大小D50，和图2)，然而，在1巴下研磨仍然产生类似于手研磨的窄的分布曲线(比较图1和2)。此外，如可以在表5中注意到，压力在1和3巴之间时，通过Clauss法测定的可凝血血纤蛋白原没有明显改变。
4.凝血酶研磨试验
在凝血酶研磨过程中，层流下的湿度和温度分别为26％和21℃。所有的生产过程在无菌条件下进行。2mm颗粒的进料速率固定为2kg/小时并且喷射器压力设定为2巴。所研磨的凝血酶于2-8℃储存于玻璃容器中直至试验。
研磨两个批次：批次#3用于在2巴下研磨。其研磨前的最初凝血酶活性为25.85±0.21IU/mg固体。在2mm的破碎颗粒中测得的平均水含量是6.08±0.42％。批次#2用于在1巴和4巴压力下的研磨试验。一旦使用干氮气将粉末研磨后，不管压力如何，水含量降低。结果表明，直到4巴的压力没有改变凝血酶活性。
表6：在生产地点氮研磨压力对所研磨凝血酶的凝血酶活性 和颗粒大小分布的影响
  研磨压力(巴)   水含量(％)  颗粒大小(D50)(μm)  颗粒大小(D90)(μm)   凝血酶活性(IU/mg)
  1   4.35  13.0  33.6   19.7
  2平均值(n＝6) 4.19+0.62 10.4±1.4 17.5±3.0 24.6+1.9
  4   4.07  9.2  15.6   20.3
还应当注意到，压力从2巴增加至4巴仅轻微影响颗粒大小分布(见表6和图3)。
5.使用几个批次的人血纤蛋白原2试验研磨过程的可重复性
先前的试验涉及在保持相同的主入口压力、喷射压力和加载速率的同时不间断地连续用LyoGuard
Figure G2007800410729D00111
盘向SFVM补料。可以想象，保持相同的研磨条件将产生可比性的产物，即具有相同湿度、大小分布和凝血特性的粉末。对分别各接受几次研磨试验的两个批次人血纤蛋白原2的比较验证这一观点。
来自两个批次人血纤蛋白原2的七个LyoGuard
Figure G2007800410729D00112
盘分别在SFVM中研磨。研磨层流罩内的相对湿度为33％并且室温为22℃。
预研磨的冻干块的水含量相似，批次#4和#5分别为5.48％和5.45％。冻干块的总蛋白质几乎相同：在批次#4和#5中分别为0.69和0.68mg蛋白质/mg冻干固体。可凝血血纤蛋白原数值也非常相似，在批次#4和#5中通过可凝血血纤蛋白原测定法(A280nm)的测定值分别为0.41和0.42mg/mg固体，通过Clauss测定法测定的值分别为0.35和0.32mg/mg固体。在研磨后，血纤蛋白原仅少量减少，在批次#4和#5中，通过A280nm测定的减少均为6％(减少至0.39mg/mg固体)，通过Clauss法测定的减少分别为20％和6％(分别减少至0.28和0.30mg/mg固体)(表7和图4)。在两个批次中均未观察到湿度或总蛋白质含量变化(表7)。
表7：在同一天和相同研磨条件下相继研磨的两个批次(#4和#5) 人血纤蛋白原2的可重复性
批次#   水含量(％)   总蛋白质(mg/mg固体)   可凝血血纤蛋白原(mg/mg固体)   血纤蛋白原Clauss法(mg/mg固体)   颗粒大小(D50/D90)(μm)
  4   6.48   0.67   0.39   0.28   15.0/35.9
  4   4.51   0.68   0.39   0.28   17.8/38.6
  平均值   5.50   0.68   0.39   0.28   16.4*/37.3**
  SD   1.39   0.01   0.00   0.00   2.0/1.9
  5   6.83   0.67   0.39   0.32   20.4/41.8
  5   4.98   0.67   0.4   0.3   19.3/39.5
  5   5.25   0.67   0.38   0.29   16.8/39.0
  5   5.42   0.69   0.4   0.29   21.4/44.2
  5   6.19   0.67   0.39   0.3   17.4/41.3
  平均值   5.73   0.67   0.39   0.30   19.1*/41.2**
  SD   0.68   0.01   0.01   0.01   1.9/2.1
*对D50的学生T检验-p＝0.16
**对D90的学生T检验-p＝0.07
虽然通过曲线D50/D90所描述的平均颗粒分布不相同，分别为16.4对19.1μm和37.3对41.2，但是这些差异没有显著的统计学意义(见表7和图4)。
将来自两个批次人血纤蛋白原(#6和#7)的六个LyoGuard
Figure G2007800410729D00121
盘相继研磨以再次评价可重复性(图5和表8)。研磨层流罩内的相对湿度和室温分别为18％和17℃。
冻干块的总蛋白质几乎相同，在批次#6和#7中分别是0.65和0.69mg蛋白质/mg冻干固体。可凝血血纤蛋白原基本相同，在批次#6和#7中分别是0.39和0.4mg/mg固体。在两个批次中，通过Clauss动力学方法测定的血纤蛋白原浓度存在小的差别，分别为0.47和0.42。此种差异在用Clauss测定法测定高浓缩血纤蛋白原溶液内的血纤蛋白原时很常见。然而，通过Clauss方法得到的血纤蛋白原读数超过可凝血蛋白质(A280)非常罕见。在研磨之后，在批次#6和#7中，可凝血血纤蛋白原(A280nm)没有变化，通过Clauss方法测定的血纤蛋白原仅少量降低，减少分别为约11％和5％。
并且，在任一批次中没有观察到水含量或总蛋白质的改变。即便在两个批次中，两个D50/D90的平均值不相同，在批次#6和#7中分别为17.9和18.9μm以及41.5和42.3μm，但是大小分布结果在统计学上是相同的，P＞95％(见表8和图5)。
表8：在同一天和相同研磨条件下相继研磨的两个批次(批次#6和#7)人血纤蛋白原2的可重复性
批次 水含量 总蛋白质   可凝血血纤蛋白原   血纤蛋白原Clauss法 颗粒大小
# (％) (mg/mg固体) (mg/mg固体) (mg/mg固体)   D50/D90(μm)
  6   3.80   0.65   0.39   0.44   18.7/42.1
  6   3.30   0.67   0.39   0.40   17.0/40.9
  平均值   3.55   0.66   0.39   0.42   17.9/41.5
  SD   0.35   0.01   0.00   0.03   1.2/0.9
  7   3.70   0.70   0.40   0.41   18.7/40.5
  7   3.80   0.69   0.39   0.41   17.6/38.5
  7   3.70   0.69   0.40   0.40   19.4/46.7
  7   3.70   0.68   0.40   0.38   19.9/43.4
  平均值   3.73   0.69   0.40   0.40   18.9/42.3
  SD   0.05   0.01   0.01   0.01   1.0/3.6

Claims (17)

1.用于将包含具有预定水平生物学活性的蛋白质的颗粒分散物或蛋白质颗粒分散物微粉化的方法，该方法包括：
将分散物引入涡流室研磨设备；及
在研磨条件下研磨分散物，所述研磨条件包括选自下列参数组成的群组的一个或多个参数：1～4巴的输入压力、0.2～5巴的喷射压力、0.1～5kg/小时的加载速率和30～100m3/小时的气流，
从而得到保留至少80％的预定水平生物学活性且具有5～100μm的颗粒大小分布的蛋白质粉末，或者得到表现出分散物中的颗粒大小是其最初大小的1/20至1/400的蛋白质粉末。
2.如权利要求1的方法，其中分散物中的颗粒具有裂缝或洞。
3.如权利要求1或2的方法，其中分散物通过冷冻干燥方法制备。
4.如权利要求1或2的方法，进一步包括在研磨前机械地破碎分散物。
5.如权利要求1或2的方法，其中蛋白质是酶并且生物学活性是其酶活性。
6.如权利要求1或2的方法，其中蛋白质是凝血因子并且生物学活性是其凝血活性。
7.如权利要求6的方法，其中所述凝血因子是凝血酶或血纤蛋白原。
8.如权利要求1或2的方法，其中涡流室研磨设备包含正切流体喷嘴并且使用压力梯度实现共振涡旋研磨。
9.如权利要求8的方法，其中压力梯度是Super Fine VortexMillTM(SFVM)。
10.如权利要求1或2的方法，其中颗粒大小分布为10～100μm，或者为10～60μm。
11.如权利要求1或2的方法，其中研磨后的颗粒至少有90％在所述颗粒大小分布内。
12.用于蛋白质颗粒分散物微粉化的方法，其中蛋白质具有预定水平生物学活性，该方法包括：
将分散物引入涡流室研磨设备；及
在研磨条件下研磨分散物，所述研磨条件包括：2巴的输入压力，2巴的喷射压力，2～5kg/小时，约1.6、2、2.7、3或4.2kg/小时的加载速率和30～100m3/小时的气流，
从而得到具有10～60μm的颗粒大小分布并保留至少90％的预定水平生物学活性的蛋白质粉末。
13.如权利要求12的方法，其中涡流室研磨设备是Super Fine VortexMillTM(SFVM)。
14.用于蛋白质颗粒分散物微粉化的方法，其中蛋白质具有预定水平的生物学活性，该方法包括：
将分散物引入涡流室研磨设备；及
在研磨条件下研磨分散物，所述研磨条件包括：2巴的输入压力，2巴的喷射压力，2～5kg/小时，约1.6、2、2.7、3或4.2kg/小时的加载速率和30～100m3/小时的气流，
从而得到表现出蛋白质颗粒分散物的颗粒大小是其最初大小的1/20至1/400并且保留至少90％预定水平生物活性的蛋白质粉末。
15.如权利要求14的方法，其中涡流室研磨设备是Super Fine VortexMillTM(SFVM)。
16.用于将包括血纤蛋白原的颗粒分散物或包括凝血酶的颗粒分散物微粉化的方法，该方法包括：
将分散物引入涡流室研磨设备；及
在研磨条件下研磨分散物，所述研磨条件包括：1～4巴的输入压力、0.1～5kg/小时的加载速率、30～100m3/小时的气流，可选择地，还包括2巴的喷射压力。
17.如权利要求16的方法，其中研磨条件包括2巴的喷射压力。
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