CN101528723A - 肾素抑制剂 - Google Patents

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CN101528723A CNA2007800391198A CN200780039119A CN101528723A CN 101528723 A CN101528723 A CN 101528723A CN A2007800391198 A CNA2007800391198 A CN A2007800391198A CN 200780039119 A CN200780039119 A CN 200780039119A CN 101528723 A CN101528723 A CN 101528723A
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Abstract

本发明涉及由右述结构式(I)表示的天冬氨酸蛋白酶抑制剂或其药学上可接受的盐。本发明还涉及含有结构式(I)的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的药物组合物。本发明还公开了拮抗需要的受试者中一种或多种天冬氨酸蛋白酶的方法，以及使用这些天冬氨酸蛋白酶抑制剂治疗受试者的天冬氨酸蛋白酶介导的疾病的方法。

Description

肾素抑制剂
相关申请
本申请要求享有2006年9月18日提交的美国临时申请60/845,291的优先权。上述申请的全部教导通过参考并入本文。
背景技术
天冬氨酸蛋白酶类，包括肾素、β-分泌酶(BACE)、HIV蛋白酶、HTLV蛋白酶和疟原虫天冬氨酸蛋白酶(Plasmepsin)I和II，与许多疾病状态有关。在高血压中，血管紧张素I水平升高，血管紧张素I是血管紧张素原的肾素催化裂解产物。广泛认为β淀粉样蛋白(BACE对淀粉样蛋白前体蛋白活性的产物)水平升高是造成阿尔茨海默氏病患者脑中存在淀粉样蛋白斑块的原因。HIV和HTLV病毒的病毒成熟依赖于它们各自的天冬氨酸蛋白酶。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)利用疟原虫天冬氨酸蛋白酶I和II来降解血红蛋白。
在肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)中，生物活性肽血管紧张素II(AngII)是通过两步机制产生的。高度特异性的天冬氨酸蛋白酶肾素将血管紧张素原裂解为血管紧张素I(AngI)，然后血管紧张素I进一步被特异性较低的血管紧张素转化酶(ACE)加工为AngII。已知AngII对至少两种被称为AT1和AT2的受体亚型产生作用。AT1似乎传递AngII的大部分的已知功能，而AT2的作用还不清楚。
RAAS的调节代表了心血管疾病治疗方面的主要进展(Zaman，M.A.等人Nature Reviews Drug Discovery 2002，1，621-636)。ACE抑制剂和AT1阻断剂已被公认为高血压的治疗药物(Waeber B.等人.，″Therenin-angiotensin system：role in experimental and human hypertension″，in Berkenhager W.H.，Reid J.L.(eds)：Hypertension，Amsterdam，E1sevier Science Publishing Co，1996，489-519；Weber M.A.，Am.J.Hypertens.，1992，5，247S)。另外，ACE抑制剂被用于肾保护(Rosenberg M.E.等人.，Kidney International，1994，45，403；Breyer J.A.等人.，Kidney International，1994，45，S156)、预防充血性心力衰竭(Vaughan D.E.等人.，Cardiovasc.Res.，1994，28，159；Fouad-Tarazi F.等人.，Am.J.Med.，1988，84(Suppl.3A)，83)和心肌梗塞(Pfeffer M.A.等人.，NEngl.J.Med.，1992，327，669)。
对肾素抑制剂开发的兴趣来自于肾素的特异性(Kleinert H.D.，Cardiovasc.Drugs，1995，9，645)。已知的肾素唯一的底物是血管紧张素原，它(在生理条件下)只能被肾素加工处理。相反，除了AngI之外，ACE也能裂解缓激肽，并能被糜蛋白酶(一种丝氨酸蛋白酶)绕过(Husain A.，J.Hypertens.，1993，11，1155)。因此，在患者中，ACE的抑制导致缓激肽累积，引起咳嗽(5-20％)和可能危及生命的血管神经性水肿(0.1-0.2％)(Israili Z.H.等人.，Annals of InternalMedicine，1992，117，234)。糜蛋白酶不被ACE抑制剂所抑制。因此，在接受ACE抑制剂治疗的患者中，AngII仍然可能形成。另一方面，AT1受体的阻断(例如，被氯沙坦阻断)将其他AT-受体亚型过度暴露于AngII，AT1受体的阻断明显增加了AngII的浓度。总之，肾素抑制剂不仅在安全性方面，而且更重要的是在阻断RAAS的功效方面，也预期优于ACE抑制剂和AT1阻断剂。
因为肾素抑制剂的拟肽(peptidomimetic)特征使其没有足够的口服活性(Kleinert H.D.，Cardiovasc.Drugs，1995，9，645)，因此，只有有限的使用肾素抑制剂的临床经验(Azizi M.等人.，J.Hypertens.，1994，12，419；Neutel J.M.等人.，Am.Heart，1991，122，1094)。由于这个问题以及制品的高成本，几种化合物的临床开发已经停止。好象只有一种化合物已进入临床试验(Rahuel J.等人.，Chem.Biol.，2000，7，493；Mealy N.E.，Drugs of the Future，2001，26，1139)。因此，还没有得到能大规模制备的新陈代谢稳定的、口服可生物利用的和充分可溶的肾素抑制剂。最近，描述了第一种非肽的肾素抑制剂，它显示出高体外活性(Oefner C.等人.，Chem.Biol.，1999，6，127；专利申请WO 97/09311；Maerki H.P.等人.，Il Farmaco，2001，56，21)。本发明涉及具有非肽性质和低分子量的肾素抑制剂的预料之外的鉴定。本申请描述了具有口服活性的肾素抑制剂，该肾素抑制剂除血压调节以外对有些适应症也是有效的，在这些适应症中，组织的肾素-糜蛋白酶系统可被激活，导致局部功能病理生理性地改变，例如肾、心脏和血管的重建、动脉粥样硬化症和再狭窄。
本文中引用的所有文献通过参考并入本文中。
发明内容
本发明的一个实施方案是一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂，它是由结构式(I)表示的化合物，或其药学上可接受的盐：
Figure A20078003911900101
其中：
R1是烷基、环烷基或环烷基烷基；
R2是H或烷基；
R3是F、Cl、Br、氰基、硝基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基或链烷磺酰基；和
n是0、1、2或3。
本发明的另一个实施方案是一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂，它是由结构式(II)表示的化合物，或其药学上可接受的盐：
Figure A20078003911900111
本发明的另一个实施方案是一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂，它是由结构式(IIa)表示的化合物，或其药学上可接受的盐：
Figure A20078003911900112
其中该化合物的光学纯度至少是90％。
本发明的另一个实施方案是一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体或稀释剂和此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂(例如结构式(I)、(II)、(IIa)表示的化合物或其药学上可接受的盐)。该药物组合物用于治疗，例如，用于抑制受试者的天冬氨酸蛋白酶介导的疾病。
本发明的另一个实施方案是拮抗需要所述处理的受试者中的一种或多种天冬氨酸蛋白酶的方法。该方法包括给受试者施用有效量的此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂(例如结构式(I)、(II)、(IIa)表示的化合物或其药学上可接受的盐)。
本发明的另外一个实施方案是治疗受试者的天冬氨酸蛋白酶介导的疾病的方法。该方法包括给受试者施用有效量的此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂(例如结构式(I)、(II)、(IIa)表示的化合物或其药学上可接受的盐)。
本发明的另外一个实施方案是此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂(例如结构式(I)、(II)、(IIa)表示的化合物或其药学上可接受的盐)在制备用于拮抗需要所述处理的受试者中的一种或多种蛋白酶的药物中的用途。
本发明的另外一个实施方案是此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂(例如结构式(I)、(II)、(IIa)表示的化合物或其药学上可接受的盐)在制备用于治疗患者的天冬氨酸蛋白酶介导的疾病的药物中的用途。
本发明的另外一个实施方案是此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂(例如结构式(I)、(II)、(IIa)表示的化合物或其药学上可接受的盐)的治疗用途，例如在治疗患者的天冬氨酸蛋白酶介导的疾病中的用途。结构式(I)的变量值如上所述。
本发明的另外一个实施方案是此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂(例如结构式(I)、(II)、(IIa)表示的化合物或其药学上可接受的盐)在治疗患有高血压、充血性心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化、心梗后心肌病、肾病、血管病和神经病、冠状血管疾病、手术后高血压、血管成形术后再狭窄、眼内压升高、青光眼、血管生长异常、醛固酮增多症、焦虑状态或认知障碍的患者中的用途，其中结构式(I)的变量值如上所述。
附图说明
图1显示化合物7的双羟萘酸盐的X-射线粉末衍射图。
图2是显示用1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg化合物7治疗的转基因大鼠的平均动脉血压变化的图。
具体实施方式
本发明涉及由结构式(I)表示的天冬氨酸蛋白酶抑制剂或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂由结构式(Ia)表示：
或其药学上可接受的盐。
结构式(I)和(Ia)中的变量的值和具体值如下定义：
R1是烷基、环烷基(例如，环丙基)或环烷基烷基(例如，环丙基(C1-C3)烷基)；更优选地，R1是(C1-C3)烷基；更优选地，R1是甲基；
R2是H或烷基；更优选地，R2是H或(C1-C3)烷基；更优选地，R2是H或甲基；
R3是F、Cl、Br、氰基、硝基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基或链烷磺酰基；更优选地，R3是F、Cl、Br、氰基、硝基、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷氧基或(C1-C3)链烷磺酰基；更优选地，R3是F、Cl或甲基；且
n是0、1、2或3；更优选地，n是0、1或2；更优选地，n是1或2。
在一个具体的实施方案中，天冬氨酸蛋白酶抑制剂由结构式(I)或(Ia)表示，其中R1是(C1-C3)烷基；R2是H或(C1-C3)烷基；R3是F、Cl、Br、氰基、硝基、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷氧基或(C1-C3)链烷磺酰基；且n是0、1、2或3。
在另一个具体实施方案中，天冬氨酸蛋白酶抑制剂由结构式(I)或(Ia)表示，其中R1是甲基，R2是H或甲基；其它变量的值和具体值如以上对于结构式(I)和(Ia)所定义的。在另一个具体实施方案中，R1是甲基；R2是H或甲基；R3是F、C1或甲基；其它变量的值和具体值如以上对于结构式(I)和(Ia)所定义的。
在另一个具体实施方案中，本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂是下列各种化合物或其对映异构体或非对映异构体之一。也包括所有下列各种化合物及其对映异构体和非对映异构体的药学上可接受的盐和溶剂合物(例如水合物)：
Figure A20078003911900141
Figure A20078003911900151
Figure A20078003911900161
本发明的另一个实施方案涉及用于合成此处公开的由结构式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)或(IIId)表示的天冬氨酸蛋白酶抑制剂及其盐(优选药学上可接受的盐)的中间体：
Figure A20078003911900162
在结构式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中，E是H或胺保护基。胺保护基包括本领域公知的氨基甲酸酯、酰胺和磺酰胺保护基(T.W.Greene和P.G.M.Wuts“Protective Groups in OrganicSynthesis”John Wiley&Sons，Inc.，New York 1999)，其完整教导引入本文作为参考。具体的胺保护基包括叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)和1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧羰基](Teoc)。更优选地，胺保护基是叔丁氧羰基(Boc)。R2的值和具体值如对于结构式(I)所述。
在一个具体实施方案中，中间体是以下化合物或其对映异构体或非对映异构体。也包括所有以下化合物的药学上可接受的盐：
  化合物编号   化合物名称
  IIIa-1   (S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯
  IIIa-2   (S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯
  III-1   1-氨基-3-(四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁基酯
  III-2   1-氨基-3-(四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁基酯
当任何变量(例如，R3)在化合物中出现一次以上时，其每一次出现时的定义与任何其它出现无关。例如，对于每次出现，R3独立地选自F、Cl、Br、氰基、硝基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基和链烷磺酰基。
当命名或者用结构表示本发明的“天冬氨酸蛋白酶抑制剂”时，它也包括其药学上可接受的盐。
单独的或作为另一基团(如环烷基烷基、烷氧基、卤代烷氧基、卤代烷基或烷氧基)的一部分的“烷基”是指饱和的脂族支链或直链一价或二价烃基团。烷基通常具有1至6个碳原子，一般为1-3个碳原子。因此，“(C1-C3)烷基”意思是线性或分支排列的具有1-3个碳原子的基团。“(C1-C3)烷基”包括甲基、乙基、丙基和异丙基。
单独的或作为另一基团(如环烷基烷基)的一部分的“环烷基”是指饱和的脂族环状一价烃基团。环烷基一般具有3-10个碳原子，并且是单环、二环或三环。三环环烷基可以是稠和的或桥连的。典型地，环烷基是(C3-C8)单环，更常见的是环丙基。
“环烷基烷基”是指用环烷基取代的烷基基团。
“卤代烷基”包括单卤代烷基、多卤代烷基和全卤代烷基，其中卤素独立地选自氟、氯和溴。
“烷氧基”是指通过氧连接原子连接的烷基基团。“(C1-C3)-烷氧基”包括甲氧基、乙氧基和丙氧基。
“卤代烷氧基”是通过氧连接体与另一部分连接的卤代烷基。
“链烷磺酰基”是通过
Figure A20078003911900181
连接基团连接的烷基。“(C1-C3)链烷磺酰基”包括甲磺酰基、乙磺酰基和丙磺酰基。
公开的某些天冬氨酸蛋白酶抑制剂可以以各种互变异构形式存在。本发明包括所有这些形式，包括在结构上未作描述的那些形式。
公开的某些天冬氨酸蛋白酶抑制剂可以以各种立体异构形式存在。立体异构体是仅在它们的空间排列上不同的化合物。对映异构体是其镜像不可重叠的成对的立体异构体，最通常是因为它们含有不对称取代的碳原子，该碳原子起手性中心的作用。“对映异构体”是指一对彼此为镜像并且不可重叠的分子之一。非对映异构体是不作为镜像相关的立体异构体，最通常是因为它们含有两个或更多个不对称取代的碳原子。“R”和“S”表示一个或多个手性碳原子周围的取代基的构型。当没有将手性中心定义为R或S并且手性中心处的构型未用其他手段定义时，可以存在任一构型，或者存在两种构型的混合物。
“外消旋体”或“外消旋混合物”是指等摩尔量的两种对映异构体的混合物，其中该混合物不表现出旋光性；即，它们不旋转偏振光的平面。
“R”和“S”表示相对于核心分子的构型。
Figure A20078003911900182
表示
Figure A20078003911900183
或“——”，其中所示的对映异构体(例如，或)的光学纯度至少为60％、70％、80％、90％、99％或99.9％。
公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂可以通过异构体特异的合成制备为单独的异构体或从异构体混合物中拆分(resolve)出来。常规拆分技术包括使用旋光性酸生成异构体对的每个异构体的游离碱的盐(然后分级结晶并再生游离碱)、使用旋光性胺生成异构体对的每个异构体的酸形式的盐(然后分级结晶并再生游离酸)、使用光学纯的酸、胺或醇生成异构体对的每个异构体的酯或酰胺(然后色谱分离并除去手性辅助剂)、或者使用各种公知的色谱方法拆分起始材料或终产物的异构体混合物。
当命名或者用结构表示公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的立体化学时，命名的或者表示的立体异构体相对于其它立体异构体的纯度至少为60％、70％、80％、90％、99％或99.9％重量。当命名或者用结构表示单一对映异构体时，表示或者命名的对映异构体的光学纯度至少为60％、70％、80％、90％、99％或99.9％。光学纯度的重量百分比是对映异构体的重量相对于对映异构体的重量加它的光学异构体的重量的比值。
当命名或者用结构表示公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂而不指明立体化学，并且该抑制剂具有至少一个手性中心时，应当理解该名称或结构包括不含相应的旋光异构体的抑制剂的一种对映异构体、抑制剂的消旋混合物以及相对于相应的旋光异构体富含一种对映异构体的混合物。
当命名或者用结构表示公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂而不指明立体化学，并且该抑制剂具有至少两个手性中心时，应当理解该名称或结构包括不含其它非对映异构体的一种非对映异构体、不含其它非对映异构体对的一对非对映异构体、非对映异构体的混合物、非对映异构体对的混合物、其中相对于其他非对映异构体富含一种非对映异构体的非对映异构体的混合物、以及相对于其他非对映异构体对富含一种非对映异构体对的非对映异构体对的混合物。
本发明包括天冬氨酸蛋白酶抑制剂化合物的药学上可接受的盐。例如，含有胺或其他碱性基团的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的酸式盐可以通过将该化合物与适当的有机酸或无机酸反应，产生药学上可接受的阴离子盐形式而制备。阴离子盐的例子包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、庚糖酸盐(glyceptate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰阿散酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、8-茶氯酸盐、甲苯磺酸盐和三乙碘化物盐。
含有羧酸或其它酸性官能团的天冬氨酸蛋白酶抑制剂化合物的盐可以通过与适当的碱反应而制备。这种药学上可接受的盐可以用提供药学上可接受的阳离子的碱制成，包括碱金属盐(特别是钠和钾盐)、碱土金属盐(特别是钙和镁盐)、铝盐和铵盐，以及由生理学上可接受的有机碱制成的盐，该有机碱如三甲胺、三乙胺、吗啉、吡啶、哌啶、甲基吡啶、二环己胺、N，N’-二苄基乙二胺、2-羟基乙胺、二-(2-羟基乙基)胺、三-(2-羟基乙基)胺、普鲁卡因、二苄基哌啶、脱氢枞胺、N，N’-二脱氢枞胺、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、三甲基吡啶、奎宁、喹啉和碱性氨基酸如赖氨酸和精氨酸。
根据本发明，也包括天冬氨酸蛋白酶抑制剂的化合物的药学上不可接受的盐及其合成中间体。这些盐(例如TFA盐)可以用于，例如，纯化和分离天冬氨酸蛋白酶抑制剂的化合物及其合成中间体。
当命名或者用结构表示公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂时，应当理解它也包括天冬氨酸蛋白酶抑制剂的溶剂合物(例如水合物)。“溶剂合物”是指结晶形式，其中在结晶过程中溶剂分子并入晶格中。溶剂合物可以包括水或非水溶剂，如乙醇、异丙醇、DMSO、乙酸、乙醇胺和EtOAc。其中并入晶格中的溶剂分子为水的溶剂合物通常被称为“水合物”。水合物包括化学计量的水合物以及含有不同量的水的组合物。
当命名或者用结构表示公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂时，应当理解该化合物或其药学上可接受的盐，包括其溶剂合物，可以以结晶形式、非结晶形式或其混合物的形式存在。天冬氨酸蛋白酶抑制剂或溶剂合物也可以表现为多晶型(即以不同晶型存在的能力)。这些不同的晶型一般被称为“多晶型物”。应当理解，当命名或者用结构表示时，公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂及其溶剂合物(例如水合物)也包括它们的所有多晶型物。多晶型物具有相同的化学组成，但是在结晶固体状态的填积、几何排列及其他描述性性质方面不同。因此，多晶型物可具有不同的物理性质，如形状、密度、硬度、可变形性、稳定性和溶出性质。多晶型物一般表现出不同的熔点、IR谱和X-射线粉末衍射谱，这些可以用于鉴定。本领域普通技术人员应当理解，例如，通过改变或调节在固化化合物中使用的条件，可以产生不同的多晶型物。例如，温度、压力或溶剂的改变可产生不同的多晶型物。另外，在特定条件下，一种多晶型物可以自发地转变为另外一种多晶型物。
在合成过程中可能必须和/或希望保护所关注的任何分子上的敏感的或反应性的基团。代表性的常规保护基在T.W.Greene和P.G.M.Wuts“Protective Groups in Organic Synthesis”John Wiley&Sons，Inc.，New York 1999中描述，其全部内容引入本文作为参考。可以利用本领域公知的方法添加和去除保护基。
本发明的化合物可用于缓解或治疗紊乱或疾病，对于该紊乱或疾病，降低天冬氨酸蛋白酶产物的水平在治疗疾病状态或治疗其中感染剂依赖于天冬氨酸蛋白酶活性的感染方面是有效的。在高血压中，血管紧张素I(血管紧张素原的肾素催化裂解的产物)的水平升高。因此，本发明的化合物可用于治疗高血压、心力衰竭如(急性和慢性)充血性心力衰竭；左心室功能障碍；心脏肥大；心脏纤维化；心肌病(例如，糖尿病性心肌病和梗塞后心肌病)；上心室性和室性心律失常；心房颤动；心房扑动；有害的血管重塑；心肌梗塞及其后遗症；动脉粥样硬化；狭心症(不稳定的或稳定的)；肾衰竭病症，如糖尿病肾病；肾小球肾炎；肾纤维化；硬皮病；肾小球硬化；微血管并发症，例如糖尿病视网膜病；肾血管性高血压；血管病；神经病；糖尿病导致的并发症，包括肾病、血管病、视网膜病和神经病；冠状血管疾病；蛋白尿；清蛋白尿；手术后高血压；代谢综合征；肥胖；血管成形术后再狭窄；眼病和相关异常，包括眼内压升高、视网膜病；血管生长异常和重塑；血管发生相关疾病，如年龄相关的新血管黄斑变性；醛固酮过多症；焦虑状态；和认知障碍(Fisher N.D.；Hollenberg N.K.Expert Opin.Investig.Drugs.2001，10，417-26)。
普遍认为β-淀粉状蛋白(良好表征的天冬氨酸蛋白酶β-分泌酶(BACE)活性对淀粉状蛋白前体蛋白的活性的产物)水平升高是阿尔茨海默氏病患者脑中淀粉状蛋白斑块发生和发展的原因。白色念珠菌分泌的天冬氨酸蛋白酶与其致病毒力有关(Naglik，J.R.；Challacombe，S.J.；Hube，B.Microbiology and Molecular BiologyReviews 2003，67，400-428)。病毒HIV和HTLV的病毒成熟依赖于它们各自的天冬氨酸蛋白酶。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)使用疟原虫天冬氨酸蛋白酶I和II降解血红蛋白。
可替代地或除了公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂以外，本发明的药物组合物还可以包含该化合物或盐的前药或药物活性代谢产物以及用于它的一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明包括治疗或缓解需要的受治疗者中天冬氨酸蛋白酶介导的疾病的治疗方法，该方法包括给需要的受治疗者施用有效量的此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
施用方法包括在治疗过程中在不同的时间或以组合形式同时施用有效量的本发明的化合物或组合物。本发明的方法包括所有已知的治疗性处理方案。
“有效量”是指在受治疗者中引发期望的生物学反应的药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)的量。这类反应包括被治疗的疾病或紊乱的症状的减轻。在这类治疗方法中，公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的有效量是大约0.01mg/kg/天至大约10mg/kg/天，优选大约0.5mg/kg/天至5mg/kg/天。
本发明包括公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂在制备用于治疗或缓解需要的受治疗者中天冬氨酸蛋白酶介导的慢性紊乱或疾病或感染的组合物中的用途，其中该组合物包含一种或多种公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂和任选的药学上可接受的载体的混合物。
“药学上可接受的载体”是指具有用于配制本发明组合物的足够的纯度和质量的化合物和组合物，并且当适当地给予动物或人时，不产生不良反应，用作药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)的载体。
“药学上可接受的稀释剂”是指具有用于配制本发明组合物的足够的纯度和质量的化合物和组合物，当适当施用于人或动物时，不产生不良反应，并且用作药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)的稀释剂。
“天冬氨酸蛋白酶介导的紊乱或疾病”包括与天冬氨酸蛋白酶表达升高或过量表达有关的紊乱或疾病以及伴随这类疾病的状况。
本发明的实施方案包括以联合疗法(参见美国专利5821232，美国专利6716575，美国专利5663158，或Fossa，A.A.；DePasquale，M.J.；Ringer，L.J.；Winslow，R.L.“Synergistic effect on reduction inblood pressure with coadministration of a renin inhibitor或anangiotensin-converting enzyme inhibitor with an angiotensin II receptorantagonist”Drug Development Research  1994，33(4)，422-8，上述文章和专利引入本文作为参考)施用此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，其联合一种或多种用于治疗高血压的其它药剂，包括α-阻断剂、β-阻断剂、钙通道阻断剂、利尿剂、促尿钠排泄药、促尿盐排泄药、中枢作用性抗高血压药、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、ACE和中性内肽酶(NEP)双重抑制剂、血管紧张素-受体阻断剂(ARB)、醛固酮合酶抑制剂、醛固酮-受体拮抗剂或内皮素受体拮抗剂。
α-阻断剂包括多沙唑嗪、哌唑嗪、坦洛新和特拉唑嗪。
用于联合疗法的β-阻断剂选自阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、醋丁洛尔(acetutolol)、艾司洛尔、塞利洛尔、托利洛尔(taliprolol)、醋丁洛尔(acebutolol)、氧烯洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、布拉洛尔、喷布洛尔、甲吲洛尔、卡替洛尔、纳多洛尔、卡维地洛、以及它们的药学上可接受的盐。
钙通道阻断剂包括二氢吡啶类(DHPs)和非二氢吡啶类。优选的DHP选自氨氯地平、非洛地平、ryosidine、伊拉地平、拉西地平、尼卡地平、硝苯地平、尼古地平、尼鲁地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平和尼伐地平，以及它们的药学上可接受的盐。非二氢吡啶类选自氟桂利嗪、普尼拉明、地尔硫卓、芬地林、戈洛帕米、米贝拉地尔、阿尼帕米、噻帕米和维拉帕米、以及它们的药学上可接受的盐。
利尿剂是，例如，噻嗪衍生物，选自阿米洛利、氯噻嗪、氢氯噻嗪、甲基氯噻嗪和氯噻酮(chlorothalidon)。
中枢作用性抗高血压药包括可乐定、胍那苄、胍法辛和甲基多巴。
ACE抑制剂包括阿拉普利、贝那普利、贝那普利拉、卡拖普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、莫替普利、培哚普利、喹那普利、喹那普利拉、雷米普利、雷米普利拉、螺普利、替莫普利、群多普利和佐芬普利。优选的ACE抑制剂是贝那普利、依那普利、赖诺普利和雷米普利。
ACE/NEP双重抑制剂是，例如奥马曲拉、法西多曲和法西多曲拉(fasidotrilat)。
优选的ARBs包括坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、他索沙坦、替米沙坦和缬沙坦。
优选的醛固酮合酶抑制剂是阿拉曲唑、法倔唑和依西美坦。
优选的醛固酮-受体拮杭剂是螺内酯和依普利酮。
优选的内皮素拮抗剂是，例如波生坦、恩拉生坦、阿曲生坦、达卢生坦、西他生坦和替唑生坦、以及它们的药学上可接受的盐。
本发明的实施方案包括以联合疗法施用此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂或其组合物，其联合一种或多种用于治疗AIDS的其它药剂，包括逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、其它HIV蛋白酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、侵入抑制剂(包括附着、共受体和融合抑制剂)、反义药物和免疫刺激剂。
优选的逆转录酶抑制剂是齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、替诺福韦和恩曲他滨。
优选的非核苷类逆转录酶抑制剂是奈韦拉平、地位韦啶和依法韦仑。
优选的HIV蛋白酶抑制剂是沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、氨普奈韦、洛匹那韦、阿扎那韦和膦沙那韦。
优选的HIV整合酶抑制剂是L-870、810和S-1360。
侵入抑制剂包括与CD4受体、CCR5受体或CXCR4受体结合的化合物。侵入抑制剂的具体例子包括恩夫韦地(gp41中HR2结构域的一种拟肽)和西夫韦肽(sifurvitide)。
一种优选的附着和融合抑制剂是恩夫韦地。
本发明的实施方案包括以联合疗法施用此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂或其组合物，其联合一种或多种用于治疗阿尔茨海默氏病的其它药剂，包括他克林、多奈哌齐、利凡斯的明、加兰他敏和美金刚。
本发明的实施方案包括以联合疗法施用此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂或其组合物，其联合一种或多种用于治疗疟疾的其它药剂，包括青蒿素、氯喹、卤泛群、羟氯喹、甲氟喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、奎宁和磺胺多辛。
联合疗法包括共同施用此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂和所述其它药剂、依次施用此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂和其它药剂、施用含有天冬氨酸蛋白酶抑制剂和其它药剂的组合物或同时施用单独的含有天冬氨酸蛋白酶抑制剂和其它药剂的组合物。
本发明还包括制备组合物的方法，该方法包括将一种或多种公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂与任选的药学上可接受的载体混合；并且包括由该方法得到的那些组合物，该方法包括常规制药技术。例如，此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂可以在配制前进行纳米研磨。此处公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂也可以通过研磨、微粉化或其它本领域所知的粒径缩小方法制备。这些方法包括但不限于美国专利4,826,689、5,145,684、5,298,262、5,302,401、5,336,507、5,340,564、5,346,702、5,352,459、5,354,560、5,384,124、5,429,824、5,503,723、5,510,118、5,518,187、5,518,738、5,534,270、5,536,508、5,552,160、5,560,931、5,560,932、5,565,188、5,569,448、5,571,536、5,573,783、5,580,579、5,585,108、5,587,143、5,591,456、5,622,938、5,662,883、5,665,331、5,718,919、5,747,001、PCT申请WO 93/25190、WO96/24336和WO 98/35666中所述的那些方法，这些文献均引入本文作为参考。本发明的药物组合物可以用本领域技术人员周知的技术和方法制备。Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCompany)中描述了本领域常用的一些方法，其完整内容引入本文作为参考。
本发明的组合物包括经眼、口、鼻、透皮、遮盖或不遮盖的局部、静脉内(弹丸注射和输注二者)、以及注射(腹膜内、皮下、肌内、肿瘤内或胃肠外)组合物。该组合物可以呈剂量单位，例如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、脂质体、离子交换树脂、无菌眼用溶液或眼递送装置(例如促进即时释放、定时释放或持续释放的接触镜等)、胃肠外溶液或悬浮液、定量气雾剂或液体喷雾剂、滴剂、安瓿、自动注射装置或栓剂；用于眼给药、口服、鼻内给药、舌下给药、胃肠外给药或直肠给药，或通过吸入或吹入给药。
适合于口服的本发明的组合物包括固体形式例如丸剂、片剂、胶囊、胶囊(各包括即时释放、定时释放和持续释放制剂)、颗粒剂和粉末剂；以及液体形式例如溶液、糖浆、酏剂、乳剂和悬浮液。适用于眼给药的剂型包括无菌溶液或眼递送装置。适用于胃肠外给药的剂型包括无菌溶液、乳剂和悬浮液。
含有本发明组合物的剂型含有有效量的提供治疗效果和/或预防效果必需的药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)。该组合物可含有大约5,000mg至大约0.5mg(优选地，大约1,000mg至大约0.5mg)的公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂或其盐形式，并且可以被构成适合于所选给药方式的任何形式。本发明组合物可以以适合每周一次或每月一次给药的形式施用。例如，药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)的不溶性盐可以适合提供用于肌肉内注射的贮库型制剂(例如癸酸盐)或者提供用于眼科给药的溶液。也可以采用每天给药或定期后给药，其中组合物可以每天施用大约1次至大约5次。
对于口服给药，该组合物优选为片剂或胶囊的形式，其含有，例如，1000至0.5毫克的药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)，更优选500mg至5mg。剂量将根据多种因素而变化，该因素与被治疗的特定患者(例如，年龄、体重、饮食和给药时间)、被治疗病症的严重程度、使用的化合物、给药方式和制剂的强度有关。
优选将口服组合物配制为均匀的组合物，其中药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)被均匀地分散在整个混合物中，其可以被容易地细分为含有等量的公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的剂量单位。优选地，通过将公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂与一种或多种任选存在的药物载体(例如淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、助流剂、粘合剂和崩解剂)、一种或多种任选存在的惰性药物赋形剂(例如水、二醇类、油类、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂和糖浆)、一种或多种任选存在的常规制片成分(例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙和各种胶中的任一种)和任选的稀释剂(例如水)混合，制备该组合物。
粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖类(例如，葡萄糖和β-乳糖)、玉米甜味剂以及天然的和合成的胶类(例如，阿拉伯胶和黄蓍胶)。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂和膨润土。
片剂和胶囊是有利的口服剂量单位形式。片剂可以使用标准技术进行糖包衣或薄膜包衣。片剂也可以被包衣或以其它方式被化合以提供延长的、控释治疗作用。该剂型可以包含内部剂量和外部剂量组分，其中外部组分为内部组分上的包封形式。该两种组分可进一步被阻止胃中的崩解(例如肠衣层)并允许内部组分完整进入十二指肠的层分开或被延迟或持续释放的层分开。可以使用各种各样的肠溶性和非肠溶性层或包衣材料(例如聚合酸、虫胶、乙酰醇和乙酸纤维素或其组合)。
还可以经由缓释组合物施用公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，其中该组合物包含公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂和生物可降解的缓释载体(例如，聚合载体)或药学上可接受的非生物可降解的缓释载体(例如，离子交换载体)。
生物可降解的和非生物可降解的缓释载体是本领域中熟知的。生物可降解的载体用于形成颗粒或基质，其保留药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)并缓慢地在适合的环境(例如，水性、酸性和碱性等)中降解/溶解以释放该药物。这类颗粒在体液中降解/溶解以释放其中的药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)。该颗粒优选是纳米颗粒(例如，直径为大约1至500nm，优选直径为大约50-200nm，最优选直径为大约100nm)。在制备缓释组合物的方法中，首先将缓释载体和公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂溶解或分散在有机溶剂中。将得到的混合物添加到含有任选的表面活性剂的水溶液中，以产生乳剂。然后从乳剂中蒸发该有机溶剂，以提供颗粒的胶体悬浮液，其中含有缓释载体和公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
可以掺入公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂用于口服或以液体形式通过注射给药，例如水溶液、适当调味的糖浆、水性或油性悬浮液、用例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油等食用油调味的乳剂，或以酏剂或类似的药物载体。适用于含水悬浮液的分散剂或悬浮剂包括合成的和天然的胶，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和明胶。在适当调味的悬浮剂或分散剂中的液体形式还可以包括合成的和天然的胶。对于胃肠外给药，无菌悬浮液和溶液是符合需要的。当需要静脉内给药时，使用通常含有适合的防腐剂的等渗制剂。
可以经由注射胃肠外施用公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂。胃肠外制剂可以由溶解在适合的惰性液体载体中或与其混合的药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)组成。可接受的液体载体通常包括水性溶剂和其它有助于溶解度或保存的任选成分。这类水性溶剂包括无菌水、林格溶液或等渗盐水溶液。其它任选的成分包括植物油(例如花生油、棉籽油和芝麻油)，以及有机溶剂(例如丙酮缩甘油(solketal)、甘油和甲酰)。可以将无菌、非挥发性油用作溶剂或悬浮剂。通过将药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)溶解或悬浮在液体载体中制备胃肠外制剂，从而最终剂量单位含有0.005％至10％重量的药物(即本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂)。其它添加剂包括防腐剂、等渗剂、增溶剂、稳定剂和疼痛减轻剂。可以制备可注射的悬浮液，在这种情况下可以使用适合的液体载体和悬浮剂等。
可以使用适合的鼻内载体，鼻内施用公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
还可以使用适合的局部透皮载体或透皮贴剂，局部施用公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
对于眼给药，组合物优选为眼科组合物的形式。眼科组合物优选地被配制成滴眼剂并填充在适合的容器中，以有利于对眼给药，例如配备有适合的吸移管的滴瓶。优选地，该组合物是无菌的和基于水的，使用纯化水。除了公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂以外，眼科组合物还可以包含一种或多种如下成分：a)表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯；b)增稠剂，例如纤维素、纤维素衍生物、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯基聚合物和聚乙烯基吡咯烷酮，典型地其浓度为大约0.05％至大约5.0％(wt/vol)；c)(除了将组合物贮藏在含有氮气并任选包含游离氧吸收剂例如Fe的容器中以外，或作为其可替代方案)，抗氧化剂，例如丁基化羟基茴香醚、抗坏血酸、硫代硫酸钠或丁基化羟基甲苯，其浓度为大约0.00005％至大约0.1％(wt/vol)；d)浓度为大约0.01％至0.5％(wt/vol)的乙醇；以及e)其它赋形剂，例如等渗剂、缓冲剂、防腐剂和/或pH控制剂。眼科组合物的pH理想地是在4至8的范围内。
参考实施例进一步说明本发明，该实施例是举例说明性的，而不是限制性的。
可以按照上述总合成方案合成本发明的代表性的化合物并在下面的实施例中说明。制备所述方案和实施例中使用的各种起始材料的方法完全在本领域技术人员的知识范围内。
以下缩写具有指定的含义：
Figure A20078003911900311
Figure A20078003911900321
Figure A20078003911900331
实施例1
总合成方案
本发明的化合物可以如下合成：将以下结构所表示的吡喃中间体
Figure A20078003911900332
与以下结构所表示的哌啶中间体相偶合
Figure A20078003911900341
描述为以下方案：
Figure A20078003911900342
由谷氨酸酯制备吡喃中间体
吡喃中间体可以利用以下合成方案由谷氨酸酯制备：
Figure A20078003911900351
由焦谷氨酸酯制备吡喃中间体
吡喃中间体也可以利用以下合成方案由焦谷氨酸酯制备：
Figure A20078003911900361
哌啶中间体的制备
哌啶中间体可以利用以下合成方案制备：
Figure A20078003911900371
可替代地，哌啶中间体也可以利用以下合成方案制备：
Figure A20078003911900381
在实施例2-11中提供了依照上述方案合成公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的具体条件。
实施例2
3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯
步骤1.(R)-哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯
向20L圆底烧瓶中置入(R)-哌啶-3-羧酸乙酯酒石酸盐(2.6kg，8.47mol，1eq)和CH2Cl2(14L)。于0℃，向上述溶液中添加TEA(2.137kg，21.17mol，2.5eq)，然后逐滴加入(Boc)2O(2.132kg，9.74mol，1.15eq)。将混合物于室温搅拌过夜。用饱和柠檬酸溶液(3×2.5L)、饱和NaHCO3溶液(3×2.5L)和盐水(2×2L)洗涤该混合物。有机相用Na2SO4干燥，过滤，蒸发滤液，得到无色油(2.2kg，收率100％)。
步骤2.(R)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-3-羧酸
在0-5℃下，向(R)-哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯(2.2kg，8.469mol，1eq)在5L MeOH中的溶液中加入LiOH(629.6g，15mol，1.77eq)在7.5L水中的溶液。添加后，在室温下搅拌混合物过夜。TLC显示起始材料被消耗。通过加入饱和柠檬酸溶液将体系的pH调节为7。大多数甲醇被除去。用柠檬酸将pH调节为4-5。混合物用5L CH2Cl2抽提3次，合并有机相并用Na2SO4干燥，蒸发，得到白色固体(1.775kg，92％)。
步骤3.(R)-3-(甲氧基(甲基)氨甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
向搅拌的(R)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-3-羧酸(233g，1.2mol)在THF(1.2L)中的溶液中添加羰二咪唑(230g，1.42mol)。将混合物在冰水浴下搅拌1小时。加入三乙胺(207mL，1.41mol)和N，O-二甲基羟胺盐酸盐(138g，1.42mol)在THF(900mL)中的混悬液。将反应混合物升温至室温并搅拌过夜。TLC表明反应完全。蒸发掉溶剂，将残余物溶解在CH2Cl2(1.2L)中，依次用0.5N盐酸溶液、饱和碳酸钠溶液和盐水洗涤、用无水硫酸钠干燥，蒸发，得到粗化合物(R)-3-(甲氧基(甲基)氨甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(250g，91％)，该化合物不经纯化直接用于下一步。1H NMR(400MHz，CDCl3)：4.05-4.19(m，2H)，3.72(s，3H)，3.17(s，3H)，2.75-2.85(m，2H)，2.65(t，1H)，1.90(d，1H)，1.60-1.78(m，2H)，1.44(s，9H)。
步骤4.(R)-3-(3-氯苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-78℃和氮气下，向1-溴-3-氯苯(54.3g，0.286mol)在无水THF(500mL)中的溶液中逐滴添加2.5M n-BuLi在己烷(114mL，0.286mol)中的溶液。在-78℃下搅拌1小时后，逐滴添加(R)-3-(甲氧基(甲基)氨甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(17.8g，65.3mmol)在无水THF(300mL)中的溶液。添加后，使混合物升温至室温并搅拌2小时。TLC显示反应完全。将混合物用饱和NH4Cl溶液(300mL)猝灭，并用乙酸乙酯萃取(3×200mL)。混合的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到粗产物(R)-3-(3-氯苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(92g，100％)，该产物不经纯化直接用于下一步。
步骤5.(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-15℃和氮气下，向(R)-3-(3-氯苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(92g，0.286mol)在无水THF(300mL)中的溶液中逐滴添加1MR-CBS-噁唑硼烷(oxazaborolidine)的甲苯溶液(45mL，45mmol，0.15eq)。在-15℃下搅拌1小时后，逐滴添加10M BH3的THF溶液(33mL，0.33mol，1.1eq)。添加后，将反应混合物在-15℃下搅拌2小时。TLC显示起始材料被消耗。在-15℃下小心地逐滴添加甲醇(200mL)。减压除去溶剂，残余物通过硅胶柱层析纯化，用AcOEt/己烷(1∶30→1∶15)洗脱，得到淡黄色油(82g，HPLC≥70％，比值≥3∶1)。将混合物溶解在乙酸乙酯中，直到醇恰好溶解(大约5mL/1g)，利用旋转蒸发器除去溶剂，直到出现少量晶体。让溶液缓慢冷却至室温，放置1-2小时。向上述溶液中加入己烷(大约300mL)，然后过滤，晶体用冷己烷洗涤，重结晶两次，得到3-((R)-(3-氯苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯，其为纯异构体(32.5g，ee.≥99％，两步的收率为35％)。
步骤6.(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(氰基甲氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在0℃下向(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(32.5g，0.1mol)的溶液中加入NaH(12g，0.3mol)。将混合物在室温搅拌1小时。将混合物冷却至-40℃，然后逐滴加入溴乙腈(35.7g，0.3mol)。于-20℃再搅拌混合物0.5小时。HPLC显示反应约30％完成。NaH和溴乙腈的添加重复两次以上。HPLC显示反应约60％完成。反应用饱和NH4Cl猝灭。混合物用CH2Cl2萃取。有机相用Na2SO4干燥，浓缩，得到棕色油状粗产物(36.8g)，该产物不经纯化用于下一步。
步骤7.(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(氰基甲氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(36.8g，0.10mol)溶解在无水THF(350mL)中，在回流和氮气氛下加热溶液。逐滴添加BH3.Me2S(30mL，0.30mol)的THF溶液，在回流下持续搅拌过夜。让得到的溶液冷却至室温。通过小心地逐滴加入MeOH直到气泡形成停止而猝灭反应。溶液蒸发后，获得粗产物(70g)，该产物不经纯化用于下一步。
步骤8.(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
向(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(70g，粗产物，0.1mol)和DMAP(1.83g，15mmol，0.15eq)在无水CH2Cl2(150mL)中的溶液中添加Et3N(12.1g，15.8mL，120mmol)。利用冰水浴将获得的混合物冷却至0～5℃，逐滴加入氯甲酸甲酯(11.28g，120mmol，1.2eq)在无水CH2Cl2(100mL)中的溶液。添加后，于0～5℃搅拌反应混合物3小时。TLC显示起始材料消失。加水(80mL)。水层用CH2Cl2(3×100mL)抽提，合并的有机层用10％柠檬酸(2×150mL)和盐水(100mL)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，浓缩为粗产物，通过制备型HPLC纯化，得到(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)-甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(10.7g，三步的总收率为25％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：1.12-1.40(m，4H)，1.43(s，9H)，1.64(m，2H)，2.82(m，2H)，3.25(m，2H)，3.61(s，3H)，3.74(m，1H)，4.05(m，1H)，4.16(m，1H)，7.22(m，1H)，7.32(m，3H)。
步骤9.2-((R)-(3-氯苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯
将(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)-乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(10.7g，25mmol)溶解在20％(V/V)TFA/CH2Cl2溶液(150mL)中。将反应混合物于室温搅拌1小时。TLC显示反应完成。逐滴加入饱和碳酸氢钠溶液调节为pH 8-9。得到的混合物用CH2Cl2(3×200mL)抽提，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩，得到2-((R)-(3-氯苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(11.2g，100％)，该产物不经纯化直接用于下一步。
可替代地，可以通过以下程序制备(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯：
Figure A20078003911900431
步骤1.(R)-3-(甲氧基(甲基)氨甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-1-(叔丁氧基羰基)哌啶-3-羧酸(25g，0.11mol，1.0当量)、N，O-二甲基羟胺盐酸盐(10.5g，0.14mol，1.25当量)和EDCI·HCl(26.3g，0.14mol，1.25当量)和二异丙基乙胺(48mL，0.28mol，2.5当量)溶解于二氯甲烷(400mL)中并在室温下搅拌过夜。用EtOAc稀释反应混合物，用5％HCl水溶液(2X 150mL)、饱和NaHCO3水溶液(150mL)、盐水(100mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。浓缩产生(R)-3-(甲氧基(甲基)氨甲酰)哌啶-1-羧酸叔丁酯(24.42g，82％)，其为澄清的油。粗产物不经进一步纯化用于下一步。MS ESI+ve m/z 295(M+Na)。1H NMR(CDCl3)δ4.19-4.00(m，2H)，3.77(m，3H)，3.12(s，3H)，2.79(m，2H)，2.64(m，1H)，1.89(m，1H)，1.71-1.52(m，2H)，1.51-1.33(m，10H)。
步骤2.(R)-3-(3-氯苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-78℃和氮气下向1-溴-3-氯苯(100g，0.52mol)在无水THF(550mL)中的溶液中逐滴添加2.5M n-BuLi在己烷中的溶液(210mL，0.52mol)。于-78℃搅拌1小时后，逐滴添加(R)-3-(甲氧基(甲基)氨甲酰)哌啶-1-羧酸叔丁酯(120g，0.44mol)在无水THF(500mL)中的溶液。添加后，使反应混合物升温至室温并搅拌2小时。用饱和NH4Cl溶液(500mL)猝灭混合物，用EtOAc(3×400mL)抽提。合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到粗3-(3-氯苯甲酰基)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯(178g)，其不经纯化直接用于下一步。
步骤3.(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-15℃和氮气下向(R)-3-(3-氯苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(178g，0.55mol)在无水THF(600mL)中的溶液中逐滴添加1MR-CBS-噁唑硼烷在甲苯中的溶液(82mL，82mmol，0.15当量)。于-15℃搅拌1小时后，逐滴添加10M BH3在THF中的溶液(60mL，0.60mol，1.1当量)。添加后，在-15℃下搅拌反应混合物2小时。在-15℃下小心地逐滴添加甲醇(400mL)。减压除去溶剂，通过硅胶柱层析纯化残余物，用AcOEt/己烷(1∶30→1∶15)洗脱，得到浅黄色油(95g，HPLC纯度≥70％，异构体比例≥3∶1)。将混合物溶解在EtOAc中直到醇恰好溶解(约5mL/1g)，在旋转蒸发器上除去溶剂，直到出现少量晶体。让溶液缓慢冷却至室温并放置1-2小时。向上述溶液中添加己烷(约300mL)然后过滤，用冷己烷洗涤晶体，从AcOEt-己烷中重结晶两次，得到纯的异构体(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(20g，ee≥99％)。
步骤4.(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在0-5℃下向NaH(7.44g，161mmol)在无水DMF(50mL)中的悬浮液中逐滴添加(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(17.45g，54mmol)在无水DMF(100mL)中的溶液，将反应混合物在室温下搅拌1小时。在0-5℃下向上述混合物中逐滴添加溴乙酸乙酯(17.82g，11.87mL，107mmol)在无水DMF(100mL)中的溶液。添加后，在室温下搅拌反应混合物2-3小时。将反应混合物倾入饱和NH4Cl水溶液中，添加EtOAc(1000mL)。用水(3×200mL)和盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶层析纯化残余物，得到(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(14g，64％收率)。
步骤5.(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-羟基乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在使温度低于40℃的同时向(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(14g，34mmol)在MeOH(200mL)中的溶液中分次添加NaBH4(10.35g，272mmol)。添加后，在室温下搅拌混合物2-3小时。在真空中除去溶剂，得到残余物，将其在水和EtOAc之间分配。用H2O和盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥，蒸发，得到粗3-((R)-(3-氯苯基)(2-羟基乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯(12.50g)，其不经纯化用于下一步。
步骤6.(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲基磺酰氧基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-5-0℃下向(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-羟基乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(12.50g，34mmol)在无水CH2Cl2(150mL)中的溶液中添加Et3N(13.74g，18.3mL，136mmol，4当量)。然后在相同温度下逐滴添加MsCl(7.75g，5.16mL，68mmol，2当量)在无水CH2Cl2(50mL)中的溶液。添加后，使其逐渐升温至室温。反应完成后加水(100mL)。水层用CH2Cl2(3×80mL)萃取，合并的有机层用10％柠檬酸、饱和NaHCO3和盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲基磺酰氧基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(15g)，其不经纯化用于下一步。
步骤7.(R)-3-((R)-(2-叠氮基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲基磺酰氧基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(15g，34mmol)溶解于无水DMF(150mL)中，添加固体NaN3(6.7g，102mmol，3当量)，并将反应混合物加热至80℃过夜。使反应混合物冷却至室温，然后添加EtOAc(500mL)，用水(3×100mL)和盐水(2×80mL)洗涤有机相，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到粗(R)-3-((R)-(2-叠氮基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(13.3g)，其不经纯化用于下一步。
步骤8.(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-3-((R)-(2-叠氮基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(13.3g，33.8mmol)溶解在THF/H2O(20∶1，180mL/9mL)中，分次添加三苯基膦(36.0g，135mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜。减压除去溶剂，得到残余物，经硅胶层析纯化，得到(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(10.4g，纯度：HPLC＝75％)。
步骤9.(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
向(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(7.7g，21mmol，HPLC＝75％)和DMAP(1.27g，10mmol，0.5当量)在无水CH2Cl2(120mL)中的溶液中添加Et3N(6.38g，8.45mL，63mmol)。将得到的混合物在冰水浴中冷却至0-5℃，逐滴添加氯甲酸甲酯(8.1mL，104.5mmol，5当量)在无水CH2Cl2(50mL)中的溶液。添加后，于0-5℃搅拌反应混合物1-2小时。用水(80mL)猝灭反应。用CH2Cl2(3×50mL)萃取水层，用10％柠檬酸(2×80mL)和盐水洗涤合并的有机层，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩为粗产物，通过制备HPLC纯化，得到(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(4.4g，HPLC≥98％，五步的总收率为41％)。
以下化合物按照与以上所述类似的程序制备：
1)(R)-3-((R)-(3，5-二氟苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯，在步骤2中使用(3，5-二氟苯基)锂。
可替代地，(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯可以通过以下程序制备：
Figure A20078003911900471
步骤1：(R)-3-((R)-(2-氨基-2-氧代乙氧基)(3-氯苯基)甲基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯的制备
将(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)甲基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(0.971g，2.36mmol)溶解在7M NH3/MeOH(20mL)中，并在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂，得到(R)-3-((R)-(2-氨基-2-氧代乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(902mg，100％)，其不经纯化用于下一步。MS ESI+ve m/z 383(M+H)+。
步骤2：(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯的制备
在超过10分钟的时间里向0℃的(R)-3-((R)-(2-氨基-2-氧代乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(902mg，2.36mmol)在无水甲苯(30mL)中的溶液中缓慢添加
Figure A20078003911900472
(甲苯中的65％溶液，1.4mL，7.07mmol)。添加后，在室温下搅拌溶液过夜。使反应冷却至0℃，并用Na2SO4·10H2O猝灭。将得到的混合物搅拌2-3小时，通过
Figure A20078003911900473
过滤，并用THF(200mL)洗涤。将滤液干燥并浓缩，得到粗产物(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(776mg，89％)。MS ESI+ve m/z 369(M+H)+。
可替代地，也可以通过以下程序制备(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯苯基)甲基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯：
Figure A20078003911900481
向(1.00g，3.07mmol)(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(98∶2的非对映体比)在10ml(10vol)PhCF3的溶液中依次添加8.1ml(50eq)50％重量的NaOH水溶液、四丁基硫酸氢铵(0.261g，0.25eq)和盐酸氯乙胺(1.068g，3eq)，并在50℃搅拌20小时。HPLC分析显示88％的转化率，含有少量的杂质和大约9％的起始醇。让反应物冷却至室温，分离各层。需要添加10倍体积的水来确保干净地分离各层。保留有机层并用10倍体积的盐水漂洗。保留有机层并在真空下浓缩。得到的残余油溶解在10倍体积的叔丁基甲基醚(TBME)中，此时加入10倍体积的20％重量的柠檬酸水溶液。(注意：酒石酸也可以，诸如HCl、草酸、TsOH等酸导致NBoc脱保护)。HPLC分析显示所需的胺已经被干净地提取到水层中，而不需要的起始醇保留在有机层中；弃去TBME层。水层用5倍体积的TBME漂洗一次，以确保除去不需要的起始醇。弃去有机TBME层。通过添加2倍体积的50％重量的NaOH水溶液使水层的pH为大约13，此时添加10倍体积的DCM(二氯甲烷)。所需的产物被干净地提取到DCM中。有机提取物用10倍体积的盐水漂洗(HPLC未见纯化)，用NaSO4干燥，浓缩，得到750mg(66％收率，97％纯度)的所需产物(通过HPLC/MS和NMR证实)。
可替代地，(R)-3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯也可以通过以下方法制备：
Figure A20078003911900491
实施例3
(R)-3-((R)-(5-氟-2-甲基苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
Figure A20078003911900492
步骤1.(R)-3-(5-氟-2-甲基苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-78℃和氮气下向2-溴-4-氟-1-甲基苯(10.6g，0.056mol)在无水THF(150mL)中的溶液中逐滴添加2.5Mn-BuLi在己烷中的溶液(22mL，0.056mol)。在-78℃下搅拌1小时后，逐滴添加(R)-3-(甲氧基(甲基)氨甲酰)哌啶-1-羧酸叔丁酯(10g，0.037mol)在无水THF(120mL)中的溶液。添加后，使反应混合物升温至室温并搅拌2小时。用饱和NH4Cl(100mL)溶液猝灭混合物，用EtOAc(3×80mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到粗(R)-3-(5-氟-2-甲基苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(10.5g，收率88％)，其不经纯化用于下一步。
步骤2.(R)-3-((R)-(5-氟-2-甲基苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-15℃和氮气下向(R)-3-(5-氟-2-甲基苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(10.5g，0.0336mol)在无水THF(150mL)中的溶液中逐滴添加1M R-CBS-噁唑硼烷在甲苯中的溶液(3mL，3mmol，0.09当量)。在-15℃下搅拌1小时后，逐滴添加10M BH3在THF中的溶液(17mL，0.0336mol，1当量)。添加后，在-15℃下搅拌反应混合物2小时。在-15℃下小心逐滴添加甲醇(80mL)。减压除去溶剂，通过硅胶柱层析纯化残余物，用AcOEt/己烷(1∶30→1∶15)洗脱，得到浅黄色油(95g，HPLC≥70％，比例≥3∶1)。将混合物溶解在最小体积的EtOAc中，在旋转蒸发器上除去溶剂直到出现晶体。使溶液冷却至室温并放置1-2小时。向溶液中添加己烷然后过滤，用冷己烷洗涤晶体，并额外重结晶两次，得到纯的异构体(R)-3-((R)-(5-氟-2-甲基苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.2g，ee≥99％)。1H NMR(CDCl3)δ7.1(m，2H)，6.85(m，1H)，4.7(m，1H)，2.3(s，3H)，1.45(s，9H)，1.25(m，4H)。
步骤3.(R)-3-((R)-(氰基甲氧基)(5-氟-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在0℃下向(R)-3-((R)-(5-氟-2-甲基苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.2g，0.0037mol)在MeCN(20mL)中的溶液中添加NaH(0.27g，0.011mol)。将混合物搅拌1小时，随后冷却至-40℃，并分次添加溴乙腈(1.3g，0.011mol)。在-20℃下搅拌混合物0.5小时。用H2O猝灭反应。用CH2Cl2萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，浓缩，得到目标分子(R)-3-((R)-(氰基甲氧基)(5-氟-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.2g，90％)。
步骤4.(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(5-氟-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-3-((R)-(氰基甲氧基)(5-氟-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.8g，0.005mol)在无水THF(20ml)中的溶液在氮气下加热至回流。逐滴添加BH3.Me2S在THF中的溶液，并在回流下继续搅拌过夜。当得到的溶液冷却至室温时，逐滴添加MeOH以猝灭反应。在溶液蒸发后，通过柱层析纯化粗产物，得到(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(5-氟-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.2g，收率66％)。
步骤5.(R)-3-((R)-(5-氟-2-甲基苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
向(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(5-氟-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.1g，8.5mmol)和DMAP(0.54g)在干CH2Cl2(45mL)中的溶液中添加Et3N(2.58g，3.6mL)。使得到的混合物在冰水浴中冷却至0-5℃，逐滴添加氯甲酸甲酯(4.0g，43mmol，5当量)在干CH2Cl2(50mL)中的溶液。添加后，将反应混合物在0-5℃下搅拌1-2小时。用水(50mL)猝灭反应。用CH2Cl2(3×30mL)萃取水层，用10％柠檬酸(2×50mL)和盐水洗涤合并的有机层，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩为粗产物，通过制备HPLC纯化，得到(R)-3-((R)-(5-氟-2-甲基苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(400mg，HPLC≥98％)。1H NMR(CDCl3))δ7.2(m，1H)，7.1(m，1H)，6.9(m，1H)，4.4(m，1H)，4.1(m，1H)，3.7(m，1H)，3.6(s，3H)，3.2(m，2H)，2.9(m，2H)，2.3(s，3H)，1.75(m，1H)，1.6(m，1H)，1.4(s，9H)，1.25(m，2H)。
实施例4
(R)-3-((R)-(3-氯-5-氟苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
Figure A20078003911900521
步骤1.(R)-3-(3-氯-5-氟苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在用N2冲洗的2L三颈烧瓶中，将Mg(26.5g，1.1mol)加温至50℃，逐滴添加1-溴-3-氯-5-氟苯(157g，0.75mol)在无水THF(1L)中的溶液，然后将混合物在室温下搅拌2小时。在-78℃和氮气下向3-(甲氧基(甲基)氨甲酰)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯(120g，0.441mol)在无水THF(1.1L)中的溶液中逐滴添加上述格氏试剂。使反应混合物升温至室温并搅拌2小时。用饱和NH4Cl溶液(500mL)猝灭混合物，用EtOAc(3×400mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到(R)-3-(3-氯-5-氟苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(163g)，其不进行进一步纯化直接使用。
步骤2.(R)-3-((R)-(3-氯-5-氟苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将10M在THF中的H3B.S2Me(47.7mL，0.477mol)和1M在甲苯中的R-CBS-噁唑硼烷(72mL，0.072mol)的混合物溶解于100mL无水THF中并冷却至-15℃。向上述溶液中逐滴添加在400mL无水THF中的3-(3-氯-5-氟苯甲酰基)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯，并于-15℃搅拌2小时。用甲醇(500mL)猝灭反应。减压除去溶剂，通过柱层析纯化残余物。用EtOAc/己烷将产物重结晶三次，得到(R)-3-((R)-(3-氯-5-氟苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(55g，0.156mol)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.10(s，1H)，7.04-6.90(dd，2H)，4.46-4.30(d，1H)，4.05-2.40(m，5H)，1.74(s，1H)，1.60(s，1H)，1.53-1.31(m，11H)，1.30-1.14(m，1H)。
步骤3.(R)-3-((R)-(3-氯-5-氟苯基)(氰基甲氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-3-((R)-(3-氯-5-氟苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(55g，0.156mol)在乙腈(1.2L)中的溶液冷却至0℃，分次添加NaH(19.2g，0.48mol，60％，在油中)，然后在室温下搅拌混合物1小时。将混合物冷却至-20℃并逐滴添加溴乙腈(57.7g，0.48mol)。0.5小时后，添加额外的NaH(19.2g，0.48mol，60％，在油中)和溴乙腈(57.7g，0.48mol)。TLC显示80％的起始材料反应。用饱和NH4Cl溶液(200mL)猝灭反应，加水(1L)。减压除去乙腈，添加CH2Cl2(1L)，用CH2Cl2(3×500mL)反萃取水层，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到粗(R)-3-((R)-(3-氯-5-氟苯基)(氰基甲氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(90g)，其不经纯化用于下一步。
步骤4.(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯-5-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在N2保护下将(R)-3-((R)-(3-氯-5-氟苯基)(氰基甲氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(90g)在无水THF(1.3L)中的溶液加热至回流，随后逐滴添加10M在THF中的H3B.SMe2(70mL，0.7mol)。将混合物回流搅拌过夜。用MeOH(500mL)猝灭反应，并在真空中除去溶剂，通过柱层析纯化残余物，得到(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯-5-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(24g，0.062mol)。
步骤5.(R)-3-((R)-(3-氯-5-氟苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氯-5-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(24g，0.062mol)在无水CH2Cl2(300mL)中的溶液和Et3N(31.4g，43mL)在冰水浴中冷却至0℃，逐滴添加氯甲酸甲酯(11.8g，0.124mol)在无水CH2Cl2(100mL)中的溶液。添加后，将反应混合物在0-5℃下搅拌1-2小时。加水(200mL)猝灭反应。用CH2Cl2(3×100mL)萃取水层，用10％柠檬酸(2×80mL)和盐水洗涤合并的有机层，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到粗产物，其通过柱层析纯化，得到(R)-3-((R)-(3-氯-5-氟苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(19g，0.043mol)。1H NMR(CD3OD)δ7.17(s，1H)，7.16-7.08(m，1H)，7.07-7.00(m，1H)，4.20-4.00(m，2H)，3.90-3.78(d，1H)，3.61(s，3H)，3.28-3.20(m，2H)，2.92-2.68(dd，2H)，1.52-1.74(m，2H)，1.42(s，9H)，1.35-1.10(m，3H)。
实施例5
(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羰酸叔丁酯
Figure A20078003911900541
步骤1.(R)-3-(3-氟苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在氮气和室温下将1-溴-3-氟-苯(57.7g，0.33mol)在无水THF(480mL)中的溶液逐滴添加到Mg(10.6g，0.44mol)上。将混合物在50-60℃下搅拌1小时。得到的格氏试剂用于下一步。在-78℃和氮气下将格氏试剂逐滴添加到(R)-3-(甲氧基(甲基)氨甲酰)哌啶-1-羧酸叔丁酯(60g，0.22mol)在无水THF(600mL)中的溶液中。添加后，在室温下搅拌混合物1.5小时。用饱和NH4Cl溶液(300mL)猝灭混合物，用EtOAc(3×200mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到粗(R)-3-(3-氟苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(67.5g，100％)，其不经纯化直接用于下一步。
步骤2.(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-15℃和氮气下，向1M R-CBS-噁唑硼烷甲苯溶液(33mL，33mmol，0.15当量)和10M BH3的THF溶液(22mL，0.22mol，1.0当量)的溶液中逐滴添加(R)-3-(3-氟苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(67.5g，0.22mol)在无水THF(300mL)中的溶液。添加后，反应混合物在室温下搅拌1小时。在0℃下小心逐滴添加甲醇(200mL)。减压除去溶剂，得到粗产物。将粗产物溶解在EtOAc中直到醇恰好溶解(大约5mL/1g)，在旋转蒸发器上除去溶剂，直到出现少量晶体。在搅拌下向上述溶液中添加石油醚(大约300mL)，在室温下搅拌2小时，然后过滤，用石油醚洗涤晶体并重结晶，得到纯的(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(26g，39％)。
步骤3.(R)-3-((R)-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在0-5℃下向NaH(4.8g，120mmol)在THF(400mL)中的悬浮液中逐滴添加(R)-3-((R)-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(30.9g，100mmol)在无水THF(100mL)中的溶液，将反应混合物在室温下搅拌1小时。向上述混合物中逐滴添加溴乙酸乙酯(20.04g，13.40mL，120mmol)在无水THF(100mL)中的溶液，将反应液加热至回流3-5小时。将反应混合物倾入饱和NH4Cl水溶液中，然后用EtOAc(3×100mL)萃取。有机层用水(3×100mL)和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到粗(R)-3-((R)-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(29.88g 76％)，其不经纯化用于下一步。
步骤4.(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(2-羟基乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在使温度低于40℃的同时，向(R)-3-((R)-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(29.88g，75.9mmol)在MeOH(300mL)中的溶液中分次添加NaBH4(23g，605.2mmol)。添加后，在室温下搅拌混合物2-3小时。在真空中除去溶剂，得到残余物，将其在水和EtOAc之间分配。用H2O和盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶层析纯化残余物，得到(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(2-羟基乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11g，41％)。
步骤5.(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(2-(甲基磺酰氧基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-5-0℃下向(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(2-羟基乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11g，31.16mmol)在无水CH2Cl2(140mL)中的溶液中添加Et3N(12.60g，16.68mL，124.65mmol，4当量)。然后在相同温度下逐滴添加MsCl(7.1g，4.72mL，62.32mmol，2当量)在无水CH2Cl2(40mL)中的溶液。添加后，使其逐渐升温至室温。加水(100mL)。用CH2Cl2(3×80mL)萃取水层，用10％柠檬酸、饱和NaHCO3和盐水洗涤合并的有机层，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到3-((R)-(3-氟苯基)(2-(甲基磺酰氧基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯(13.8g)，其不经纯化用于下一步。
步骤6.(R)-3-((R)-(2-叠氮基乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(2-(甲基磺酰氧基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(13.8g，32mmol)溶解于无水DMF(150mL)中，添加固体NaN3(6.1g，96mmol，3当量)，将反应混合物加热至80℃过夜。使反应混合物冷却至室温，然后添加EtOAc(500mL)，用水(3×100mL)和盐水(2×80mL)洗涤有机相，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到粗(R)-3-((R)-(2-叠氮基乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(12g)，其不经进一步纯化用于下一步。
步骤7.(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在H2下搅拌(R)-3-((R)-(2-叠氮基乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(12g，31.75mmol)和Pd(OH)2/C(1.2g)在MeOH(240ml)中的悬浮液1小时。使混合物过滤并减压蒸发，得到所需的(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(10g)。
步骤8.(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
向(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(3-氟苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(10g，28.41mmol)和DMAP(1.8g，14.21mmol，0.5当量)在无水CH2Cl2(150mL)中的溶液中添加Et3N(8.62g，11.42mL，85.23mmol)。将得到的混合物在冰水浴中冷却至0-5℃，逐滴添加氯甲酸甲酯(10.95mL，142.05mmol，5当量)在无水CH2Cl2(60mL)中的溶液。添加后，将反应混合物在0-5℃下搅拌1-2小时。加水(80mL)以猝灭反应。用CH2Cl2(3×50mL)萃取水层，用10％柠檬酸(2×80mL)和盐水洗涤合并的有机层，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩为粗产物，其通过硅胶纯化，得到(R)-3-((R)-(3-氟苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11.3g，97％)。
实施例6
(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羰酸叔丁酯
步骤1.5-氯-2-甲基苯胺
向2L烧瓶中装以4-氯-1-甲基-2-硝基苯(60g，0.35mol)在MeOH(1L)中的溶液，添加阮内镍，三次将烧瓶中的空气替换为H2，在室温下搅拌混合物3小时。过滤溶液并浓缩。将残余物溶解在CH2Cl2(500mL)中，用盐水洗涤溶液，用Na2SO4干燥。除去溶剂，得到5-氯-2-甲基苯胺(50g，0.35mol)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.02-6.93(d，2H)，6.70-6.60(d，2H)，3.67(s，2H)，2.14(s，3H)。
步骤2.2-溴-4-氯-1-甲苯
将5-氯-2-甲基苯胺(50g，0.355mol)溶解在HBr溶液(1.5M，100mL)并冷却至0℃，逐滴添加NaNO2(27.6g，0.4mol)在水(200mL)中的溶液。添加后，将混合物搅拌1小时。在另外一个烧瓶中，将CuBr(30g，0.21mol)添加到HBr溶液(1.5M，30mL)中并加热至60℃，然后将混合物加至上述溶液中。将混合物加热至回流1小时，然后冷却至室温。用水(500mL)猝灭反应，用CH2Cl2萃取水层3次，用Na2SO4干燥，除去溶剂，通过柱层析纯化，得到2-溴-4-氯-1-甲基苯(53g，0.26mol)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.53(s，1H)，7.20-7.10(m，2H)，2.36(s，3H)。
步骤3.(R)-3-(5-氯-2-甲基苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-78℃和氮气下向2-溴-4-氯-1-甲基苯(53g，0.26mol)在无水THF(600mL)中的溶液中逐滴添加2.5M n-BuLi在己烷中的溶液(103mL，0.26mol)。于-78℃搅拌1小时后，逐滴添加3-(甲氧基(甲基)氨甲酰)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯(67g，0.246mol)在无水THF(300mL)中的溶液。添加后，使反应混合物升温至室温并搅拌2小时。用饱和NH4Cl溶液(500mL)猝灭混合物，用EtOAc(3×400mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到粗(R)-3-(5-氯-2-甲基苯甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(86g)，其在不经纯化直接用于下一步。
步骤4.(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将10M在THF中的BH3.Me2S(25.4mL，0.254mol)和1M在甲苯中的R-CBS-噁唑硼烷(38mL，0.038mol)的混合物溶解于100mL无水THF中，并冷却至-15℃。向上述溶液中逐滴添加在200mL无水THF中的3-(5-氯-2-甲基苯甲酰基)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯，并在-15℃下搅拌2小时。用甲醇(300mL)猝灭反应。减压除去溶剂，通过柱层析纯化残余物，得到(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(32g)，其含有30％的异构体。
步骤5.(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-25℃下向NaH(5.64g，0.141mol)在DMF(70mL)和THF(70mL)混合溶剂中的悬浮液中逐滴添加(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(16g，47mmol)在无水THF(100mL)中的溶液，将反应混合物在室温下搅拌1小时。在-10--5℃下向上述混合物中逐滴添加溴乙酸乙酯(15.6g，94mmol)在无水THF(70mL)中的溶液。添加后，在室温下搅拌反应混合物2-3小时。用饱和NH4Cl溶液(100mL)猝灭反应，添加EtOAc(500mL)。有机层用水(5×50mL)和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过柱层析纯化残余物，得到(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(8g，18.8mmol)。
步骤6.(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-羟基乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在保持温度低于40℃的同时，向(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(8g，18.8mmol)在MeOH(300mL)中的溶液中分次添加NaBH4(5.6g，0.15mol)。添加后，将混合物搅拌过夜。在真空中除去溶剂，得到残余物，使其在水和EtOAc之间分配。用H2O和盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥，蒸发，得到粗(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-羟基乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(7g)，其不经纯化用于下一步。
步骤7.(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-(甲基磺酰氧基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在-5-0℃下向(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-羟基乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(7g，18.3mmol)在无水CH2Cl2(100mL)中的溶液中添加Et3N(54g，10mL，0.73mmol)。然后在相同温度下逐滴添加MsCl(4.2g，36.5mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中的溶液。添加后，使其逐渐升温至室温。用10％柠檬酸溶液(30mL)、NaHCO3和盐水洗涤反应混合物，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-(甲基磺酰氧基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(8.4g)，其不经纯化用于下一步。
步骤8.(R)-3-((R)-(2-叠氮基乙氧基)(5-氯-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-(甲基磺酰氧基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(8.4g，18.3mmol)溶解在无水DMF(150mL)中，添加固体NaN3(3.56g，54.8mmoL)，将反应混合物加热至60℃过夜。让反应混合物冷却至室温并用EtOAc(500mL)稀释，用水(5×50mL)和盐水(100mL)洗涤有机相，用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到(R)-3-((R)-(2-叠氮基乙氧基)(5-氯-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(7g)。
步骤9.(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(5-氯-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
将(R)-3-((R)-(2-叠氮基乙氧基)(5-氯-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(7g，17.1mmoL)溶解在EtOAc(300mL)中，添加0.8gPd(OH)2，并将瓶中的空气替换为H2三次，在室温下搅拌反应液3小时。过滤溶液并浓缩，得到(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(5-氯-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(6.2g)，其不经进一步纯化用于下一步。
步骤10.(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
向(R)-3-((R)-(2-氨基乙氧基)(5-氯-2-甲基苯基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(6.2g，16.2mmol)和DMAP(0.2g，1.62mmol)在无水CH2Cl2(70mL)中的溶液中添加Et3N(8g，81mmol)。将得到的混合物在冰水浴中冷却至0-5℃，逐滴添加氯甲酸甲酯(3.1g，32.4mmol)在无水CH2Cl2(30mL)中的溶液。添加后，在0-5℃下搅拌反应混合物1-2小时。用水猝灭反应。用CH2Cl2(3×30mL)萃取水层，用盐水洗涤合并的有机层，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到粗产物，其首先通过柱层析纯化，然后通过制备HPLC纯化，得到(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.5g)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ7.30(s，1H)，7.20-7.10(d，2H)，4.81(s，1H)，4.46-4.30(d，1H)，4.29-4.15(d，1H)，3.95-3.83(d，1H)，3.62(s，3H)，3.30(s，4H)，2.90-2.65(dd，2H)，2.30(s，3H)，1.70(s，1H)，1.59(s，1H)，1.41(s，9H)，1.35-1.20(m，3H)。
实施例7
2，2-二甲基-4-(((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)甲基)噁唑烷
步骤1.(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酸
将Et3N(303g，3mol)逐滴添加到圆底烧瓶中搅拌的Boc2O(261.6g，1.2mol)和2-氨基-戊二酸5-甲酯(161g，1mol)在水(800ml)和二噁烷(800ml)中的溶液中。18小时后用石油醚(2×1000ml)萃取溶液，在冰上冷却水相，通过缓慢添加10％柠檬酸溶液小心酸化至pH 3。然后将尿烷萃取到EtOAc(3×1000ml)中，用盐水洗涤合并的萃取物，然后干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，得到(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酸(238g，91.2％)，其不经进一步纯化即使用。
步骤2.(S)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-羟基戊酸甲酯
在-10℃下向搅拌的(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酸(35.2g，0.135mol)在THF(500mL)中的溶液中添加N-甲基吗啉(15mL，0.135mol)，随后添加氯甲酸乙酯(14.72g，0.135mol)。10分钟后一次性加入NaBH4(15.37g，0.405mol)。然后在0℃下在超过20分钟的时间里向混合物中逐滴添加MeOH(1200mL)。将溶液额外搅拌20分钟，然后用1M KHSO4中和。除去有机溶剂，用EtOAc(3×500ml)萃取水层。依次用1M KHSO4(300mL)、H2O(300mL)、5％NaHCO3水溶液(300mL)洗涤合并的有机相，并干燥(Na2SO4)。蒸发溶剂，得到残余物，其通过柱层析纯化，得到所需的(S)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-羟基戊酸甲酯(24g，72％)。
步骤3.(S)-4-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
将(S)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-羟基戊酸甲酯(24g，97.2mmol)和异丙基甲酯(88.8g，854.6mmol)溶解在丙酮(2000mL)中，并在室温下添加BF3·Et2O(0.82mL，5.84mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。通过添加Et3N(11.6mL)猝灭反应。用饱和NaHCO3水溶液(200mL)洗涤反应溶液并蒸发，获得作为油的(S)-4-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(25.1g，90％)，其不经进一步纯化用于下一步。
步骤4.(S)-3-(3-(叔丁氧基羰基)-2，2-二甲基噁唑烷-4-基)丙酸
将氢氧化钠水溶液(195mL，4.0M，在H2O中，0.261mol，3.0当量)加至(S)-4-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(25.1g，0.087mol)的溶液中，得到的混浊反应混合物在23℃下搅拌3.5小时。将混合物减压浓缩至大约50mL体积，然后在0.5MHCl (360ml)和EtOAc(2×360ml)之间分配。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。减压浓缩滤液，得到(S)-3-(3-(叔丁氧基羰基)-2，2-二甲基噁唑烷-4-基)丙酸(21.6g，91％)，其不经进一步纯化而使用。
步骤5.(S)-2，2-二甲基-4-(3-((R)-4-甲基-2-氧代噁唑烷-3-基)-3-氧代丙基)噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
向2000mL烧瓶中装以(S)-3-(3-(叔丁氧基羰基)-2，2-二甲基噁唑烷-4-基)丙酸(21.6g，79mm0l)和750mL无水THF。使溶液冷却至0℃，然后相继加入三乙胺(23.94g，237mmol，3.0当量)和新戊酰氯(9.76mL，79mmol，1.0当量)。在0℃下搅拌溶液4小时。之后添加(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮(13.26g，75.2mmol，0.95当量)和干燥的LiCl(3.68g，86.4mmol，1.1当量)，并搅拌反应液13小时，同时升温至环境温度。之后添加560mL 0.5M HCl，将混合物转移到分液漏斗中并分离各层。水层用EtOAc萃取(3×370mL)，合并的有机层用10％K2CO3(2×370mL)和盐水(2×370mL)洗涤，然后用Na2SO4干燥，并蒸发。粗物质通过急骤层析纯化，用己烷中的0-29％EtOAc洗脱。得到26.3g(81％)(S)-2，2-二甲基-4-(3-((R)-4-甲基-2-氧代噁唑烷-3-基)-3-氧代丙基)噁唑烷-3-羧酸叔丁酯，其为澄清浆液。
步骤6.(S)-4-((R)-5-叔丁氧基-2-((R)-4-甲基-2-氧代噁唑烷-3-羰基)-5-氧代戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
在0℃下，将1.0M TiCl4的CH2Cl2溶液(8.55mL，0.7当量)添加到CH2Cl2(100mL)中，然后加入1.0M TiCl(Oi-Pr)3的己烷溶液(4.28mL，0.35当量)，并搅拌5分钟，加入DIPEA(2.87mL，1.35当量)并搅拌15分钟。加入(S)-2，2-二甲基-4-(3-((R)-4-甲基-2-氧代噁唑烷-3-基)-3-氧代丙基)噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(5.28g，12.22mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。在0℃下搅拌反应混合物1小时。向该溶液中添加丙烯酸叔丁酯(2.22mL，1.25当量)，搅拌该混合物48小时，同时升温至室温。浓缩混合物，在EtOAc(300mL)和1％HCl溶液(100mL)之间分配。有机层有饱和NaHCO3溶液(60mL)、盐水(60mL)洗涤，用Na2SO4干燥。过滤和浓缩后，通过ISCO(120g柱，己烷中的0～35％EtOAc梯度)纯化残余物，得到4.12g(60％)(S)-4-((R)-5-叔丁氧基-2-((R)-4-甲基-2-氧代噁唑烷-3-羰基)-5-氧代戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯，为淡黄色固体。MS ESI+ve m/z 583(M+Na)。
步骤7.(S)-4-((R)-5-叔丁氧基-2-(羟基甲基)-5-氧代戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
将(S)-4-((R)-5-叔丁氧基-2-((R)-4-甲基-2-氧代噁唑烷-3-羰基)-5-氧代戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(4.12g，7.36mmol)溶解在4∶1的THF和甲醇(200mL)中并冷却至0℃。缓慢加入硼氢化钠(557mg，2当量)。10分钟后使混合物缓慢升温至室温。将混合物在室温下搅拌2小时。浓缩混合物，再溶解于EtOAc(300mL)中，用1％HCl溶液(100mL)、盐水(60mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤和浓缩后，通过ISCO(40g柱，己烷中的10-65％EtOAc梯度，利用茚三酮染色的核实TLC)纯化残余物，得到2.86g(S)-4-((R)-5-叔丁氧基-2-(羟基甲基)-5-氧代戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯，其为白色固体。MS ESI+m/v 410(M+Na)。
步骤8.(S)-4-((R)-5-叔丁氧基-5-氧代-2-(甲苯磺酰基氧基甲基)戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
向(S)-4-((R)-5-叔丁氧基-2-(羟基甲基)-5-氧代戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(244mg，0.63mmol)在无水DCM(6mL)中的溶液中添加吡啶(2mL)和催化量的DMAP，使溶液冷却至0℃。加入对甲苯磺酸氯(360mg，1.88mmol)并在室温下搅拌过夜。用EtOAc(40mL)稀释反应混合物，用1N HCl(2×，50ml+20ml)洗涤，随后用H2O、NaHCO3水溶液、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并过滤。蒸发溶剂后，用硅胶柱纯化残余物，用己烷中的0-20％EtOAc洗脱，得到(S)-4-((R)-5-叔丁氧基-5-氧代-2-(甲苯磺酰基氧基甲基)戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(317mg，收率93％)。
步骤9.(S)-4-((R)-5-羟基-2-(甲苯磺酰基氧基甲基)戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
在-78℃和N2下向(S)-4-((R)-5-叔丁氧基-5-氧代-2-(甲苯磺酰基氧基甲基)戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(317mg，0.58mmol)在无水DCM(8mL)中的溶液中逐滴添加DiBAlH(1M，在己烷中，1.75mL，1.75mmol)。添加后，再搅拌反应混合物30分钟。用MeOH(2mL)猝灭反应，随后使用50％罗谢尔盐水溶液，并搅拌2小时。得到的溶液用DCM(3×20mL)萃取，浓缩合并的有机相，溶解在THF/MeOH(10mL，4/1，v/v)中，冷却至0℃，加入NaBH4(11mg，0.29mmol)，并在该温度下搅拌30分钟。用NH4Cl水溶液猝灭反应，然后用EtOAc(3×20mL)萃取，合并的有机相用H2O、盐水洗涤，并用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得到粗产物(S)-4-((R)-5-羟基-2-(甲苯磺酰基氧基甲基)戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(255mg，92％)。其在不进一步纯化的情况下使用。
步骤10.(S)-2，2-二甲基-4-(((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)甲基)噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
在0℃和N2下向(S)-4-((R)-5-羟基-2-(甲苯磺酰基氧基甲基)戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(254mg，0.54mmol)在无水DMF(8mL)中的溶液中添加NaH(43mg，1.08mmol)。在该温度下搅拌1小时后，用NH4Cl水溶液猝灭反应，然后蒸发至干。将残余物溶解在EtOAc和H2O中，分离的水相用EtOAc萃取。合并的有机相用H2O、盐水洗涤，并用Na2SO4干燥，过滤，并蒸发。用硅胶柱纯化残余物，得到(S)-2，2-二甲基-4-(((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)甲基)噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(136mg，84％)。
实施例8
2，2-二甲基-4-(((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)甲基)噁唑烷
Figure A20078003911900671
步骤1.(2S，4R)-4-烯丙基-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-乙酯
向HMDS在无水THF(200mL)中的溶液中逐滴添加2.5M在己烷中的n-BuLi(130mL)，并将混合物在-78℃下搅拌1小时。向于-78℃搅拌的(S)-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-乙酯(80g，0.311mol)在无水THF(1600mL)中的溶液中添加在THF中的二(三甲基甲硅烷基)氨基锂。在-78℃下搅拌反应混合物1小时后，添加在THF(200mL)中的3-溴丙烯(38.47g，0.318mol)，并继续搅拌2小时。在-78℃下用饱和氯化铵溶液(600mL)猝灭反应混合物，用EtOAc(3×500mL)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干。通过柱层析分离粗产物，得到(2S，4R)-4-烯丙基-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-乙酯(15g，16％)。
步骤2.(2S，4R)-1-羟基-4-(羟基甲基)庚-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯
向(2S，4R)-4-烯丙基-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-乙酯(30g，0.1mol)在MeOH/H2O(700/70mL)中的溶液中添加NaBH4(25g，0.66mol)，在室温下搅拌得到的混合物1小时，并用饱和NH4Cl水溶液(300mL)猝灭。在真空下除去有机溶剂，用EtOAc(3×250mL)萃取。合并的有机相用盐水洗涤(250mL)并用无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到粗(2S，4R)-1-羟基-4-(羟基甲基)庚-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯(22g，85％)。其不经进一步纯化用于下一步。
步骤3.(S)-4-((R)-2-(羟基甲基)戊-4-烯基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
向(2S，4R)-1-羟基-4-(羟基甲基)庚-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯(6.8g，26.2mmol)在丙酮(150mL)中的溶液中添加PTSA(0.45g，2.62mmol)。使反应混合物冷却至-20℃，然后加入2，2-二甲氧基丙烷(4.1g，39.4mmol)。搅拌得到的混合物，并使其升温至室温1小时。然后添加TEA(0.5mL)并再搅拌5分钟。减压除去溶剂。将残余物溶解在Et2O(300mL)中，依次用1N HCl(80mL)、饱和NaHCO3水溶液(80mL)、盐水(80mL)洗涤，并干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到粗(S)-4-((R)-2-(羟基甲基)戊-4-烯基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(7.5g，96％)。它在不进一步纯化的情况下使用。
步骤4.(S)-4-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)戊-4-烯基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
向(S)-4-((R)-2-(羟基甲基)戊-4-烯基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(11.5g，38.4mmol)、咪唑(7.84g，115.2mmol)和DMAP(234mg，1.92mmol)在CH2Cl2(200mL)中的溶液中逐滴添加TBSCl(8.68g，57.6mmol)在CH2Cl2(100mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。用水(100mL)洗涤反应液并用CH2Cl2(3×100mL)萃取水层，合并的有机层用盐水(70mL)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到粗产物，其通过柱层析纯化，得到(S)-4-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)戊-4-烯基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(9g，57％)。
步骤5.(S)-4-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-5-羟基戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
将(S)-4-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)戊-4-烯基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(26g，63mmol)在THF(200mL)中的溶液在冰浴中冷却，随后逐滴添加10M BH3.SMe2(6.3mL)。搅拌5小时后，小心添加10％NaOH溶液(32mL)，随后是30％H2O2(32mL)。将反应混合物在室温下搅拌6小时。用二乙醚(500mL)稀释反应混合物，并用二乙醚(3×250mL)萃取水层。合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到粗产物，其通过柱层析纯化，得到(S)-4-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-5-羟基戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(19.6g，72％)。
步骤6.(S)-4-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-5-(甲基磺酰氧基)戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
在0-5℃下向(S)-4-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-5-羟基戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(32g，74.2mmol)和Et3N(22.5g，226mmol)在CH2Cl2(400mL)中的溶液中添加MsCl(10.1g，89mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。添加后，使反应混合物升温至室温并搅拌1小时。用水(200mL)洗涤反应液并用CH2Cl2(3×150mL)萃取水层。合并的有机层用10％柠檬酸(60mL)、饱和NaHCO3(60mL)和盐水(100mL)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到(S)-4-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-5-(甲基磺酰氧基)戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(37.7g，100％)，其不进行纯化用于下一步。
步骤7.(S)-2，2-二甲基-4-(((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)甲基)噁唑烷-3-羧酸叔丁酯
向(S)-4-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-5-(甲基磺酰氧基)戊基)-2，2-二甲基噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(37.7g，74.2mmol)在THF(1000mL)中的溶液中分次添加四乙基氟化铵水水合物(41g，185.5mmol)。在回流下搅拌反应混合物过夜。将混合物用EtOAc(1000mL)稀释，用水(300mL)和盐水(500mL)洗涤。有机相用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到粗产物，其通过柱层析纯化，得到(S)-2，2-二甲基-4-(((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)甲基)噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(12.0g，54％)。
实施例9
(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯
Figure A20078003911900701
步骤1.(S)-1-羟基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯的制备
向(S)-2，2-二甲基-4-(((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)甲基)噁唑烷-3-羧酸叔丁酯(643mg，2.15mmol)在MeOH(10mL)中的溶液中添加p-TSA(37mg，0.22mmol)，然后在室温下搅拌溶液12小时。添加TEA(2mL)随后添加Boc2O(46mg，0.21mmol)。添加后，将溶液再搅拌30分钟。减压除去有机溶剂，得到粗产物(S)-1-羟基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯。它在不进一步纯化的情况下用于下一步。MS ESI+ve m/z 260(M+1)。
步骤2.(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基4-甲苯磺酸酯的制备
将上述粗产物(S)-1-羟基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯溶解在无水DCM(22mL)。向该溶液中添加吡啶(2mL)和TsCl(1.230g，6.45mmol)。室温下搅拌4小时后，添加另外一批吡啶(3mL)和TsCl(0.700g，3.67mmol)并再搅拌12小时。用EtOAc(80mL)稀释反应混合物，用1N HCl(75mL)洗涤，随后用H2O(2×30mL)、饱和NaHCO3水溶液、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩。得到的浆液在硅胶上通过急骤层析纯化(用梯度体系洗脱：在己烷中的0-35％EtOAc)，得到(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基4-甲苯磺酸酯，670mg，两步的收率为75％。MS ESI+ve m/z 436(M+Na)。
步骤3.(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯
将(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基4-甲苯磺酸酯(132mg，0.32mmol)和NaN3(62mg，0.95mmol)在无水DMF中的溶液在N2气氛下加热至80℃1.5小时，冷却至室温，并用EtOAc稀释，用H2O(3×20mL)洗涤，随后用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。得到的浆液在硅胶上通过急骤层析纯化(用梯度体系洗脱：在己烷中的0-30％EtOAc)，得到(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯58mg，收率为64％。MS ESI+ve m/z 307(M+Na)。
步骤4：(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯
(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(146mg，0.51mmol)的氢化在40psi H2下在MeOH(10mL)、10％Pd/C(25mg)中进行2小时。过滤后，获得114mg(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯，收率为86％。MS ESI+ve m/z 259(M+H)。
实施例10
(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯
Figure A20078003911900721
步骤1.(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯
在-78℃下向(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(30mg，0.11mmol)在无水THF(4mL)中的溶液中添加1.0M LHMDS在THF中的溶液(253μL，0.25mmol)，然后在该温度下搅拌30分钟。向该混合物中加入MeI(125μL，0.22mmol)，然后升温至0℃，在冰箱中放置12小时。用饱和NH4Cl水溶液猝灭反应混合物，用EtOAc(30mL)萃取，分离的有机相用H2O(2×10mL)、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并过滤。浓缩滤液，得到的浆液在硅胶上通过急骤层析纯化(用梯度体系洗脱：在己烷中的0-30％EtOAc)，得到(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯31mg，收率为100％。MS ESI+ve m/z 321(M+Na)。
步骤2.(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯
(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸酯(62mg，0.51mmol)的氢化在40psi H2下在EtOAc(20mL)、10％Pd/C(15mg)中进行2小时。过滤后获得52mg(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯，收率为91％。MS ESI+vem/z 273(M+H)。
替代程序I：
可替代地，(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯可以通过以下程序制备：
Figure A20078003911900731
步骤1.5-氯-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊酰胺
在室温下向磁力搅拌的(1S，2S)-假麻黄碱(60g，363.1mmol)在THF(600mL)中的溶液中一次性加入三乙胺(65.4mL，472mmol)。将获得的白色悬浮液冷却至0℃。在超过45分钟的时间里用加液漏斗向混合物中逐滴加入5-氯戊酰氯(49mL，381mmol)的THF(130mL)溶液。然后于0℃搅拌混合物30分钟。加H2O(40mL)，将得到的混合物浓缩至原体积的大约10％。得到的溶液在H2O/EtOAc之间分配，分离各层。水层用EtOAc(600mL)萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液、盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到作为浅黄色油的粗产物。通过急骤层析(ISCO；3×330g柱；CH2Cl2至5％MeOH/CH2Cl2)纯化粗酰胺，得到作为澄清、粘稠的油的产物。残余的MeOH通过与甲苯(3×100mL)共沸除去，产生5-氯-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊酰胺(96.2g，339mmol，93％)。LCMS(m/z＝266.0)
步骤2.(R)-2-(3-氯丙基)-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊-4-烯酰胺
Figure A20078003911900741
在室温下向磁力搅拌的LiCl(83g，1.96mol)在THF(700mL)中的悬浮液中一次性添加二异丙胺(104mL，736mmol)。使用加液漏斗在超过30分钟的时间里逐滴加入nBuLi(2.5M在己烷中，281mL，703mmol)。将浅黄色混合物于-78℃搅拌20分钟，然后升温至0℃保持15分钟。然后将混合物冷却至-78℃，使用加液漏斗在超过30分钟的时间里逐滴加入5-氯-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊酰胺(92.8g，327mmol)在THF(330mL)中的溶液。于-78℃搅拌混合物1小时，然后升温至0℃保持25分钟。然后通过注射器在超过2分钟的时间里缓慢添加烯丙基溴(41.5mL，490mmol)，然后让反应液升温至室温。在室温下搅拌反应液50分钟，通过LC/MS判断反应是否完成。将混合物冷却至0℃，加入饱和NaHCO3水溶液(400mL)和H2O(200mL)。加入EtOAc。分离各相，水相用EtOAc(共1500mL)抽提。合并的有机层用1N HCl(4×150mL)、盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到(R)-2-(3-氯丙基)-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊-4-烯酰胺，其为橙色油(101.2g，312mmol，95％)。粗产物不进行进一步纯化继续使用。LC/MS(m/z＝306.0)。
步骤3.(R)-2-(3-氯丙基)戊-4-烯-1-醇
Figure A20078003911900742
将磁力搅拌的二异丙胺(184mL，1.29mol)的THF(600mL)溶液冷却至-78℃。使用加液漏斗在超过35分钟的时间里逐滴加入nBuLi(2.5M，在己烷中，482mL，1.21mol)。将混浊混合物于-78℃搅拌15分钟，然后升温至0℃保持15分钟，在此期间溶液变为澄清和淡黄色。分四等份间隔一分钟加入硼烷-氨(90％，42g，1.24mol)。(注意：剧烈释放气体)。让混浊混合物升温至室温保持20分钟，然后再冷却至0℃。使用加液漏斗在超过10分钟的时间里逐滴加入(R)-2-(3-氯丙基)-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊-4-烯酰胺(100.2g，309mmol)在THF(300mL)中的溶液。让反应液升温至室温，并搅拌2.5小时。将反应液冷却至-10℃，用HCl(3M，1500mL)猝灭。分离各相，水相用Et2O(共2000mL)萃取。合并的有机层用3N HCl、盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，减压浓缩，得到作为黄色油的粗产物。粗产物通过急骤层析(ISCO；330g柱；己烷至30％EtOAc/己烷)纯化，得到(R)-2-(3-氯丙基)戊-4-烯-1-醇，其为澄清、粘稠的油(32.6g，200mmol，65％)；1H NMR(400MHz.CDCl3)δ5.82(m，1H)，5.07(m，2H)，3.78(m，1H)，3.58(d，J＝8.0Hz，2H)，3.54(t，J＝8Hz，2H)，2.14(m，2H)，1.85(m，2H)，1.64(m，1H)，1.49(m，1H)。
步骤4.(R)-3-烯丙基-四氢-2H-吡喃
Figure A20078003911900751
将DMF(350mL)加入到含有NaH(60％w/w，15g，0.376mmol)和磁力搅拌棒的圆底烧瓶中。在冰浴中将悬浮液冷却至5-10℃，搅拌5分钟。通过加液漏斗在超过25分钟的时间里逐滴加入(R)-2-(3-氯丙基)戊-4-烯-1-醇(30.6g，188mmol)的DMF(350mL)溶液。注意：释放气体并放热。将得到的膏状混悬液搅拌30分钟。让反应液升温至室温，将得到的浅褐色混悬液搅拌2小时，此时通过TLC判断反应是否完成。将反应混合物冷却至0℃，通过加入H2O(250mL)和HCl(3N，250mL)猝灭。分离各相，水相用石油醚(4×250mL)萃取。合并的有机层用H2O、盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到作为黄色油的粗产物。粗产物通过急骤层析(ISCO；120g柱；己烷至30％EtOAc/己烷)纯化，得到作为澄清的油的(R)-3-烯丙基-四氢-2H-吡喃(19.8g，157mmol，83％)；1H NMR(400MHz.CDCl3)δ5.72-5.82(m，1H)，5.00-5.06(m，2H)，3.86-3.91(m，2H)，3.37(m，1H)，3.08(t，J＝12Hz，1H)，1.85-1.98(m，3H)，1.59-1.69(m，3H)，1.15-1.21(m，1H)。
步骤5.(R)-2-(四氢-2H-吡喃-3-基)乙醛
Figure A20078003911900761
在室温下向磁力搅拌的(R)-3-烯丙基-四氢-2H-吡喃(18.7g，148mmol)的乙腈(740mL)溶液中一次性加入RuCl3·2H2O(1.43g，5.92mmol)。将得到的暗褐色溶液在室温下搅拌5分钟，然后一次性加入NaIO4(69g，326mmol)。分小份以5分钟的间隔加H2O(10×8mL)。在室温下搅拌反应物30分钟，此时通过TLC判断反应是否完成。加入饱和Na2S2O3(250mL)水溶液和H2O(1000mL)猝灭反应混合物。分离各相，水相用Et2O(4×400mL)萃取。合并的有机层用H2O、盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，并减压浓缩，得到作为黄色油的粗产物。粗产物通过急骤层析(ISCO；120g柱；己烷至40％EtOAc/己烷)纯化，得到作为黄色油的(R)-2-(四氢-2H-吡喃-3-基)乙醛(14.3g，111mmol，60％)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.78(t，J＝2，1H)，3.84-3.88(m，2H)，3.40-3.47(m，1H)，3.17(dd，J＝11.2，8.8Hz，1H)，2.31-2.41(m，2H)，2.21-2.28(m，1H)，1.88-1.93(m，1H)，1.61-1.72(m，2H)，1.29-1.33(m，1H)。
步骤6.(R，E)-N-(2-(四氢-2H-吡喃-3-基)亚乙基)甲胺
Figure A20078003911900762
在室温下向磁力搅拌的(R)-2-(四氢-2H-吡喃-3-基)乙醛(11g，85.8mmol)的Et2O(215mL)溶液中添加MeNH2(2M，在THF中，215mL，429.2mmol)和分子筛(
Figure A20078003911900771
粉末的、活化的，21.5g)。将反应物在室温下搅拌1小时。然后过滤得到的混合物，减压浓缩，得到(R，E)-N-(2-(四氢-2H-吡喃-3-基)亚乙基)甲胺，其为黄色的油(11.3g，80mmol，93％)。粗产物不进一步纯化继续使用。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.67(m，1H)，3.86-3.91(m，2H)，3.36-3.43(m，1H)，3.29(s，3H)，3.13(dd，J＝11.0，9.8Hz，1H)，1.95-2.14(m，2H)，1.86-1.91(m，2H)，1.62-1.68(m，2H)，1.21-1.30(m，1H)。
步骤7.(S)-1-氰基-2-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)乙基(甲基)-氨基甲酸叔丁酯
Figure A20078003911900772
向2L的圆底烧瓶中装入甲苯(400mL)、磁力搅拌棒、(R，E)-N-(2-(四氢-2H-吡喃-3-基)亚乙基)甲胺(11.3g，80.1mmol)和3-{(E)-[((1R，2R)-2-{[({(1S)-1-[(二甲基氨基)羰基]-2，2-二甲基丙基}氨基)硫代甲酰]氨基}环己基)亚氨基]甲基}-5-(1，1-二甲基乙基)-4-羟基苯基2，2-二甲基丙酸酯(J.Am.Chem.Soc.，2002，124，10012-10014)(0.9g，1.6mmol)。将混合物冷却至-78℃，利用加液漏斗在超过15分钟的时间里逐滴加入三甲基硅烷腈(21.4mL，16o.2mmol)。然后在超过10分钟的时间里逐滴加入异丙醇(12.3mL，160.2mmol)。将反应液于-78℃搅拌3小时，然后升温至室温，并搅拌1小时。然后加入二(1，1-二甲基乙基)二碳酸酯(35.0g，160.2mmol)，将得到的混合物于室温搅拌1小时。添加饱和NaHCO3水溶液(400mL)和EtOAc(300mL)猝灭反应。分离各层，水层用EtOAc(100mL)洗涤。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，得到粗产物。将粗产物分成两份，每份通过急骤层析纯化(ISCO；120g柱；0％-10％EtOAc/己烷30min，然后10％EtOAc/己烷47min，然后10％-20％EtOAc/己烷2min，然后20％EtOAc/己烷11min)。合并纯化的两批，得到(S)-1-氰基-2-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)乙基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(18.9g，70mmol，86％)，其为橙色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.00(brs，1H)，3.83-3.90(m，2H)，3.42-3.48(m，1H)，3.19(dd，J＝11.3，8.6，1H)，2.92(s，3H)，1.85-1.95(m，1H)，1.60-1.82(m，5H)，1.50(s，9H)，1.28-1.33(m，1H)。
步骤8.(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯
Figure A20078003911900781
将(S)-1-氰基-2-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)乙基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(397mg，α-氨基立构中心处的非对映异构体的4∶1混合物)溶解在4M NH3的MeOH溶液(15mL)中，使其通过线内氢化装置(H-Cube)上的阮内镍柱(
Figure A20078003911900782
50mm)，设置如下：环境温度(14℃)，流速为1.0mL/min，H2压力为30atm。将溶液再循环，使产物溶液回到装置内。30分钟后，TLC分析(1∶9MeOH/CH2Cl2，KMnO4染色)显示起始材料完全转化。60分钟的总反应时间后，蒸发溶液，得到371mg(92％)(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯，其为澄清、玫瑰色的油。LC-MS(ELSD)m/e 273.6(M+H)+。
备选方案II：
可替代地，(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯也可以通过以下程序制备：
Figure A20078003911900791
步骤1.(3R，7aS)-6-(3-氯丙基)-5-氧-3-苯基-六氢吡咯并[1，2-c]噁唑-6-羧酸甲酯
在装备有热电偶、顶置式搅拌器、回流浓缩器和进氮口的1-L 3-颈烧瓶中，将缩醛胺(3R，7aS)-3-苯基-二氢吡咯并[1，2-c]噁唑-5(1H，3H，6H)-酮(35.77g，0.176mol，1.0当量，粗产物，[J.Org.Chem.1986，51，3140])溶解在100mL THF中，将混合物冷却至-10℃(冰/丙酮浴)。通过滴液漏斗在超过1小时的时间里添加NaNTMS2(2.0M，193.6mL，0.387mol，2.2当量)溶液，同时保持内部温度为-5至0℃。搅拌暗橙-棕色反应混合物30分钟。通过注射泵在超过1小时的时间里添加氯甲酸甲酯(17.5g，14.3mL，0.185mol，1.05当量)在9mLTHF中的溶液。添加完成后，于0℃搅拌混合物1小时，然后通过LC/MS采样。显示在1.28分钟时起始酰胺约90％转化为β-二羰基中间体。在超过大约10分钟的时间里添加第二部分氯甲酸甲酯溶液(1.75g，1.43mL，0.0185mol，在1.8mL THF中)，于0℃再搅拌混合物1小时。之后起始酰胺被消耗。添加1-溴-3-氯丙烷(69.3mL，111g，0.704mol，4.0当量)，将混合物加热至回流17小时。之后LC/MS显示形成所需的烷基化化合物。让混合物冷却至环境温度，加入0.5M HCl猝灭。观察到约5℃放热。将混合物转移到含有100mL EtOAc的分液漏斗中，分离各层。有机层用盐水洗涤并蒸发。粗(3R，7aS)-6-(3-氯丙基)-5-氧-3-苯基-六氢吡咯并[1，2-c]噁唑-6-羧酸甲酯(62.05g，混有Cl(CH2)3Br)不经进一步纯化用于下一步。
步骤2.(3R，7aS)-6-(3-氯丙基)-5-氧-3-苯基-六氢吡咯并[1，2-c]噁唑-6-羧酸
将(3R，7aS)-6-(3-氯丙基)-5-氧-3-苯基-六氢吡咯并[1，2-c]噁唑-6-羧酸甲酯(36.90g)溶解在300mL THF中，并将混合物冷却至0℃。将LiOH.H2O(22.97g，0.548mol，5.0当量)的水溶液(273mL，2.0M)冷却至约5℃，并加至THF溶液中。于10℃搅拌混合物，通过LC/MS监测水解的进展。3小时后甲酯被完全消耗。添加EtOAc(100mL)，并且添加浓HCL直到pH＜2。将混合物转移到分液漏斗中，分离各层。水层用100mL EtOAc萃取，合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并蒸发。真空除去残余的溶剂后，分离出(3R，7aS)-6-(3-氯丙基)-5-氧-3-苯基-六氢吡咯并[1，2-c]噁唑-6-羧酸，其为棕褐色固体(32.65g，92％收率)。
步骤3.(3R，6R，7aS)-6-(3-氯丙基)-3-苯基-二氢吡咯并[1，2-c]噁唑-5(1H，3H，6H)-酮
将(3R，7aS)-6-(3-氯丙基)-5-氧-3-苯基-六氢吡咯并[1，2-c]噁唑-6-羧酸(32.65g，0.101mol)在300mL无水甲苯中制成浆液。使混合物温度在超过约1小时的时间里升至120℃，并保持在120℃2小时。此后，LC/MS分析显示形成所需的酰胺。让混合物冷却至环境温度，并转移到分液漏斗中。混合物用100mL半饱和的NaHCO3溶液和盐水洗涤。在此过程中，在界面处形成一些不溶性物质。弃去该物质。将甲苯溶液与5g活性炭(Norit，中性)一起搅拌1小时，然后通过Celite垫过滤并蒸发。将琥珀色浆液置于真空管线上过夜。得到26.7g(94％收率)(3R，6R，7aS)-6-(3-氯丙基)-3-苯基-二氢吡咯并[1，2-c]噁唑-5(1H，3H，6H)-酮。
步骤4.(3R，5S)-3-(3-氯丙基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-酮
将(3R，6R，7aS)-6-(3-氯丙基)-3-苯基-二氢吡咯并[1，2-c]噁唑-5(1H，3H，6H)-酮(13.6g，47.9mmol，1.0当量)溶解在THF(100mL)：甲酸(85％，62.5mL)：H2O(31mL)的混合物中，将溶液加热至40℃保持3.5小时。此后，材料被消耗，需要的醇混杂有不同量的甲酸酯。用旋转蒸发器蒸发该溶液，保持浴温低于25℃。向残余物中添加1.9MLiOH溶液，直到pH＞12，搅拌混合物20分钟。此后未观察到甲酸酯。添加EtOAc(250mL)，将混合物转移到分液漏斗中。分离各层，水层用4×50mL EtOAc萃取。合并的萃取物用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。向残余物中添加己烷(约200mL)，将双相混合物加热至约40℃。倾析除去己烷，重复该程序两次。将得到的浆液置于真空管线上固化，得到(3R，5S)-3-(3-氯丙基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-酮，其为灰白色固体(7.51g 82％收率)。通过用NaCl饱和化上述水溶液并用4×50mL CH2Cl2萃取，可以获得另外0.80g物质。
步骤5.((2S，4R)-4-(3-氯丙基)-5-氧代吡咯烷-2-基)甲基4-硝基苯磺酸酯
将(3R，5S)-3-(3-氯丙基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-2-酮(8.31g，43.4mmol，1.0当量)、对硝基苯磺酰氯(10.57g，47.7mmol，1.1当量)和DMAP(0.53g，4.4mmol，0.1当量)添加到500mL圆底烧瓶中，并在氮气下溶解在THF(100mL)中。通过注射器加入三乙胺(8.77g，12.1mL，86.7mmol，2.0当量)，将得到的溶液于环境温度下搅拌17小时。此后，通过LC/MS分析观察到所需对硝基苯磺酸酯(nosylate)的完全形成。用50mL EtOAc稀释该混合物，添加100mL 1.0M HCl猝灭胺。分离各层，有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。浅黄色固体用乙醚洗涤，在真空中除去残余的溶剂。得到14.02g(86％收率)((2S，4R)-4-(3-氯丙基)-5-氧代吡咯烷-2-基)甲基4-硝基苯磺酸酯。
步骤6.(3R，5S)-5-(叠氮基甲基)-3-(3-氯丙基)吡咯烷-2-酮
将((2S，4R)-4-(3-氯丙基)-5-氧代吡咯烷-2-基)甲基4-硝基苯磺酸酯(18.05g，45.2mmol)和NaN3(3.23g，49.7mmol，1.1当量)在100mLDMF中搅拌19小时。此后，形成白色固体，LC/MS分析显示形成所需的叠氮化物。真空下除去DMF，将残余物在EtOAc/H2O(100+100mL)之间分配。将混合物转移到分液漏斗中，分离各层。水层用100mL额外的EtOAc萃取，合并的有机萃取物用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。分离到(3R，5S)-5-(叠氮基甲基)-3-(3-氯丙基)吡咯烷-2-酮，其为浅黄色浆液(9.08g，94％收率)。
步骤7.(3R，5S)-5-(叠氮基甲基)-3-(3-氯丙基)-2-氧代吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
将(3R，5S)-5-(叠氮基甲基)-3-(3-氯丙基)吡咯烷-2-酮(9.08g，41.9mmol，1.0当量)、Boc-酐(11.43g，52.4mmol，1.25当量)和DMAP(1.28g，10.4mmol，0.25当量)溶解在乙腈(100mL)中，在环境温度下搅拌混合物3小时。此后形成所需的氨基甲酸酯。蒸发溶液，并通过二氧化硅上的急骤层析纯化产物，用0-27％EtOAc的己烷溶液洗脱。得到10.1g(67％收率)(3R，5S)-5-(叠氮基甲基)-3-(3-氯丙基)-2-氧代吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，其为无色浆液。
步骤8.(2S，4R)-1-叠氮基-7-氯-4-(羟基甲基)庚-2-基氨基甲酸叔丁酯
将(3R，5S)-5-(叠氮基甲基)-3-(3-氯丙基)-2-氧代吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(10.11g，31.9mmol，10.当量)溶解在200mL MeOH中。以一定的速度以每份大约1g分次添加固体NaBH4，以保持反应温度为大约27℃。只在前面的添加物完全溶解后才加入后面的NaBH4部分。在超过3小时的时间里加入大约3g NaBH4(约80mmol，2.5当量)后，LC/MS分析显示＞95％转化为所需的醇。通过冷却混合物至0℃并小心添加1.0M HCl直到H2释放停止，来猝灭残余的氢化物试剂。在真空中除去甲醇，混合物用约200mL EtOAc稀释。将混合物转移到分液漏斗中，分离各层。水层用额外的EtOAc萃取，合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，通过二氧化硅垫过滤并蒸发。得到约10g(2S，4R)-1-叠氮基-7-氯-4-(羟基甲基)庚-2-基氨基甲酸叔丁酯，其被处理为可以不经进一步纯化而在下一步中使用的足够的纯度。
步骤9.(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯
将(2S，4R)-1-叠氮基-7-氯-4-(羟基甲基)庚-2-基氨基甲酸叔丁酯(1.59g，4.97mmol，1.0当量)溶解在15mL DMF中，使溶液冷却至0℃。通过注射器以一定的速率添加NaNTMS2溶液(1.0M，14.9mmol，3.0当量)，使得内部反应温度保持低于5℃。搅拌2小时后，LC/MS分析显示形成环化产物。添加硫酸二甲酯(940mg，0.71mL，7.5mmol，1.5当量)，在升温至环境温度的同时搅拌反应混合物过夜。LC/MS分析显示形成所需的甲基化氨基甲酸酯。通过添加10％K2CO3溶液(约30mL)猝灭反应，搅拌混合物0.5小时。在真空下除去挥发性物质，将残余物在EtOAc/水之间分配。分离各层，有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。产物通过二氧化硅(40g)上的急骤层析纯化，用0-7％EtOAc的己烷溶液洗脱。得到1.21g(82％收率)所需的(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯，其为无色液体。
步骤10.(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯
将(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(2.1g，7.04mmol，1.0当量)和Pd/C(10％，约200mg)加至烧瓶中。添加THF(30mL)，烧瓶配有与氢气球连接的进气口。将烧瓶抽空，从气球回充氢气。重复两次，将反应混合物在环境温度下搅拌17小时。LC/MS分析显示完全转化为所需的胺。通过Celite垫过滤除去催化剂，蒸发混合物。得到1.82g(94％)(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯。
替代程序III：
可替代地，(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯也可以通过以下程序制备：
Figure A20078003911900841
替代程序IV：
可替代地，(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯也可以通过以下方法制备，其中在一系列氢化步骤中可以使用手性氢化催化剂，以提供富含对映体的中间体：
Figure A20078003911900851
例如，二氢吡喃-烯-胺氢化形成二氢吡喃-胺可以在甲醇中完成，反应条件为25℃，使用大约88-110psi的氢压，使用1-2mol％由[Rh(nbd)2]BF4和SL-M004-1(SL-M004-1：(αR，αR)-2，2′-双(α-N，N-二甲基-氨基苯基甲基)-(S，S)-1，1′-双[二(3，5-二甲基-4-甲氧基苯基)膦基]二茂铁，获自Solvias，Inc.Fort Lee，NJ)产生的催化剂。二氢吡喃-胺氢化形成四氢吡喃-胺可以在50℃，使用大约80巴的氢压和4mo1％催化剂完成，该催化剂载有由[Rh(COD)2]O3SCF3和SL-A109-2(溶剂：THF)或[Rh(nbd)2]BF4和SL-A109-2(溶剂：甲醇)(SL-A109-2：(S)-(6，6′-二甲氧基联苯基-2，2′-二基)-双[双(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基苯基)膦]，获自Solvias，Inc.Fort Lee，NJ)产生的催化剂。
实施例11
(S)-2-(3-氯丙基)戊-4-烯-1-醇
Figure A20078003911900852
步骤1.5-氯-N-((1R，2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊酰胺
Figure A20078003911900853
按照实施例10a步骤1所述的方法，由5-氯戊酰氯(7.8mL，60.4mmol)和(1R，2R)-假麻黄碱(9.9g，60.4mmol)制备5-氯-N-((1R，2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊酰胺。
步骤2.(S)-2-(3-氯丙基)-N-((1R，2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊-4-烯酰胺
按照实施例10a步骤2所述的方法，由5-氯-N-((1R，2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊酰胺(17.7g，60.2mmol)制备(S)-2-(3-氯丙基)-N-((1R，2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊-4-烯酰胺。
步骤3.(S)-2-(3-氯丙基)戊-4-烯-1-醇
Figure A20078003911900862
按照实施例10a步骤3所述的方法，由(S)-2-(3-氯丙基)-N-((1R，2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基戊-4-烯酰胺(18.2g，56.2mmol)制备(S)-2-(3-氯丙基)戊-4-烯-1-醇。
实施例12
(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(乙基)氨基甲酸叔丁酯
Figure A20078003911900863
步骤1.(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(乙基)氨基甲酸叔丁酯
向0℃的粗(2S，4R)-1-叠氮基-7-氯-4-(羟基甲基)庚-2-基氨基甲酸叔丁酯(3.20g，10.0mmol)在无水DMF(50mL)中的溶液中添加NaH(60％，在矿物油中，2.0g，50.0mmol)，5分钟后升温至室温，再搅拌1.5小时。添加碘乙烷(4.68g，2.4mL，30.0mmol)，室温下搅拌过夜。于0℃用饱和NH4Cl水溶液猝灭反应，用EA(70mL)萃取，分离的有机相相继用H2O(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩得到油，利用硅胶急骤层析将其纯化并用乙酸乙酯/己烷(0-20％)洗脱，得到1.8g(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(乙基)氨基甲酸叔丁酯。MS ESI+ve m/z：313(M+H)+。
步骤2.(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(乙基)氨基甲酸叔丁酯
利用与实施例10e步骤10所述相似的程序，利用(S)-1-叠氮基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(乙基)氨基甲酸叔丁酯制备(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(乙基)氨基甲酸叔丁酯。
实施例13
2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(3-氯苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物1)
Figure A20078003911900871
步骤1.2-((R)-(3-氯苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯.TFA盐
将3-((R)-(3-氯苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸(R)-叔丁酯(2.247g，5.26mmol)在DCM/TFA混合溶剂(24mL，3∶1，v/v)中的溶液在室温下搅拌30分钟。在真空中除去溶剂，以定量收率产生2-((R)-(3-氯苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸酯的TFA盐。MS ESI+ve m/z 327(M+H)。
步骤2.(S)-2-(N-(叔丁氧基羰基)氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨基甲酸(4-硝基苯基)酯
向(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(20.8mg，0.081mmol)在无水DCM(9mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(17.1mg，0.085mmol)，随后添加TEA(12.2mg，17μL，0.12mmol)。将得到的溶液在室温下搅拌5分钟(通过LC-MS监测)并稀释至12mL。一份氨基甲酸酯混合溶液(2mL)不进行纯化用于下一步骤。
步骤3.2-((R)-((R)-1-((S)-2-(Boc-氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(3-氯苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸酯
向(S)-2-(N-(叔丁氧基羰基)氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨基甲酸(4-硝基苯基)酯溶液(2mL，0.013mmol)中添加2-((R)-(3-氯苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸酯的TFA盐(7.0mg，0.016mmol)，随后添加过量的TEA(0.3mL)。将混合物搅拌30分钟，然后在真空中除去溶剂。得到的油经制备HPLC纯化，得到2-((R)-((R)-1-((S)-2-(Boc-氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(3-氯苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯5mg，收率63％。MS ESI+ve m/z 611(M+H)。
步骤4.2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(3-氯苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯TFA盐
将2-((R)-((R)-1-((S)-2-(Boc-氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(3-氯苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸酯(5mg，0.008mmol)溶解在DCM/TFA(3/1mL)中。将溶液搅拌30分钟并浓缩。粗混合物经制备HPLC纯化，得到2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(3-氯苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸酯TFA盐2.8mg，收率54％。1H NMR(CD3OD)δ7.36-7.32(m，3H)，7.23(d，J＝7.6Hz，1H)，4.20(br d，J＝13.6Hz，1H)，4.04(d，J＝8.8Hz，1H)，3.89-3.78(m，3H)，3.64(s，3H)，3.48-3.42(m，2H)，3.37(m，1H)，3.28-3.24(m，5H)，3.15(dd，J＝10.8，9.2Hz，1H)，2.92(m，2H)，1.97(m，1H)，1.78(m，2H)，1.68-1.54(m，4H)，1.45-1.07(m，5H)。MSESI+ve m/z 511(M+H)。
下列化合物按照与以上所述类似的程序制备并以它们的TFA盐的形式分离：
1)2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(3-氟苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物2)，在步骤2中使用2-((R)-(3-氟苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯的三氟乙酸盐。
2)2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(3-氯-5-氟苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物3)，在步骤2中使用2-((R)-(3-氯-5-氟苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯的三氟乙酸盐。
3)2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(3，5-二氟苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物4)，在步骤2中使用2-((R)-(3，5-二氟苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯的三氟乙酸盐。
4)2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(5-氯-2-甲基苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物5)，在步骤2中使用2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯的三氟乙酸盐。
5)2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)(5-氟-2-甲基苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物6)，在步骤2中使用2-((R)-(5-氟-2-甲基苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯的三氟乙酸盐。
6)2-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物7)，在步骤1中使用(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯。
7)2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物8)，在步骤1中使用(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯，在步骤2中使用2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯的三氟乙酸盐。
8)2-((R)-(3-氯-5-氟苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物9)
9)2-((R)-(3，5-二氟苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物10)
10)2-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(乙基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物13)
11)2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(乙基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物12)
可替代地，2-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物7)也可以通过以下方法制备(使用类似于实施例14所述的步骤)，并且作为TFA盐分离：
Figure A20078003911900911
实施例14
2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(化合物11)
Figure A20078003911900912
步骤1.2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯
将(R)-3-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)(2-(甲氧基羰基氨基)乙氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.0g，2.27mmol)溶解在20％(V/V)TFA/CH2Cl2溶液(20mL)中。将反应混合物在室温下搅拌2小时，TLC显示起始材料消失，逐滴加入饱和碳酸氢钠溶液，以调节pH＝7-8。得到的混合物用CH2Cl2(3×30mL)萃取，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩，得到2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(780mg，100％)。
步骤2.2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(Boc-甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯
向50mL烧瓶中装入溶解在无水CH2Cl2中的甲基叔丁基(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸酯(60mg，0.22mmol)。于0℃向溶液中添加CDI(36mg，0.22mmol)和DIEA(142mg，1.1mmol)，搅拌1小时。添加2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯三氟乙酸盐(75mg，0.22mmol)并搅拌过夜。浓缩混合物，得到粗产物。残余物通过层析法纯化，得到产物(60mg，43％)。
步骤3.2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯
向25mL  烧瓶中装入2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(Boc-甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(60mg，0.094mmol)。添加20％TFA/CH2Cl2溶液(8mL)，于0℃搅拌0.5小时。浓缩混合物得到残余物，通过制备型HPLC纯化，得到所需产物2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯(4.35mg，9％)，为其TFA盐。1H-NMR(MeOD)：1.25(m，2H)，1.35-1.50(m，4H)，1.60-1.80(m，3H)，1.95(m，2H)，2.35(s，3H)，2.75(s，3H)，3.65(s，3H)，3.85(m，4H)，4.45(d，1H)，7.15(m，2H)，7.30(s，1H)。
下面是本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的实例。当在化合物名称中未定义手性中心处的立体化学时，表示制备的样品含有该中心处的异构体的混合物。
  化合物编号   化合物名称   LC-MSa(3min)tR(min)   实测质量   选择的1H NMRb
  1   2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)(3-氯苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.29   511(M+)   7.36-7.32(m，3H)，7.23(d，J＝7.6Hz，1H)，4.20(br d，J＝13.6Hz，1H)，4.04(d，J＝8.8Hz，1H)，3.89-3.78(m，3H)，3.64(s，3H)，3.48-3.42(m，2H)，3.37(m，1H)，3.28-3.24(m，5H)，3.15(dd，J＝10.8，9.2Hz，1H)，2.92(m，2H)，1.97(m，1H)，1.78(m，2H)，1.68-1.54(m，4H)，1.45-1.07(m，5H)
  2   2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)(3-氟苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.22   495(M+1)   7.39(m，1H)，7.12(d，J＝7.6Hz，1H)，7.09-7.04(m，2H)，7.23(d，J＝7.6Hz，1H)，4.21(br d，J＝14.0Hz，1H)，4.07(d，J＝8.8Hz，1H)，3.90-3.79(m，3H)，3.65(s，3H)，3.49-3.43(m，2H)，3.39-3.37(m，2H)，3.28-3.25(m，4H)，3.16(dd，J＝10.8，10.0Hz，1H)，2.94(m，2H)，1.98(m，1H)，1.79(m，2H)，1.68-1.53(m，4H)，1.46-1.07(m，5H)
  3   2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)(3-氯-5-氟苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.32   529(M+)   7.19(s，1H)，7.16(m，1H)，7.23(d，J＝8.8Hz，1H)，4.19(br d，J＝14.4Hz，1H)，4.07(d，J＝8.8Hz，1H)，3.89-3.79(m，3H)，3.64(s，3H)，3.48-3.42(m，2H)，3.40-3.34(m，2H)，3.30-3.24(m，4H)，3.19(dd，J＝11.2，9.2Hz，1H)，2.91(m，2H)，1.97(m，1H)，1.75(m，2H)，1.70-1.52(m，4H)，1.45-1.17(m，5H)
  4   2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)(3，5-二氟苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.25   513(M+1)   6.96-6.91(m，3H)，4.19(br d，J＝13.6Hz，1H)，4.09(d，J＝8.8Hz，1H)，3.89-3.79(m，3H)，3.65(s，3H)，3.49-3.43(m，2H)，3.39-3.37(m，2H)，3.30-3.25(m，4H)，3.16(dd，J＝10.8，10.0Hz，1H)，2.92(m，2H)，1.97(m，1H)，1.77(m，2H)，1.68-1.53(m，4H)，1.45-1.09(m，5H)
  5   2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-(R))-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)(5-氯-2-甲基苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.34   525(M+)   7.32(s，1H)，7.21-7.15(m，2H)，4.34(d，J＝8.8Hz，1H)，4.29(br d，J＝14.4Hz，1H)，3.87(m，3H)，3.64(s，3H)，3.48-3.42(m，2H)，3.38-3.34(m，2H)，3.30-3.24(m，4H)，3.19(dd，J＝10.8，9.6Hz，1H)，2.87(m，2H)，2.34(s，3H)，1.98(m，1H)，1.79(m，2H)，1.71-1.53(m，4H)，1.45-1.24(m，5H)
  6   2-((R)-((R)-1-((S)-2-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)(5-氟-2-甲基苯基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.28   509(M+1)   7.20(dd，J＝6.8，2.4Hz，1H)，7.14(m，1H)，6.97(dd，J＝10.0，8.4Hz，1H)，4.41(d，J＝8.8Hz，1H)，4.16(br d，J＝12.4Hz，1H)，3.87(m，2H)，3.77(br d，J＝12.8Hz，1H)，3.45(m，2H)，3.35(m，1H)，3.48-3.42(m，2H)，3.38-3.34(m，2H)，3.29-3.26(m，4H)，3.16(dd，J＝11.2，9.6Hz，1H)，3.00(m，2H)，2.34(s，3H)，1.97(m，1H)，1.86(m，1H)，1.71(m，1H)，1.66(m，3H)，1.56(m，1H)，1.45-1.21(m，5H)
  7   2-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.3   525(M+)   7.37-7.29(m，3H)，7.21(d，J＝6.8Hz，1H)，4.20(br d，J＝12.4Hz，1H)，4.02(d，J＝9.2Hz，1H)，3.87-3.78(m，3H)，3.62(s，3H)，3.57(d，J＝15.2Hz，1H)，3.44(dd，J＝11.2，3.6Hz，1H)，3.28-3.22(m，6H)，3.15(td，J＝10.8，9.6Hz，1H)，2.89(m，2H)，2.75(s，3H)，1.97(m，1H)，1.77(m，2H)，1.65-1.17(m，9H)
      8   2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.34   539(M+)   7.30(d，J＝2.4Hz，1H)，7.19-7.13(m，2H)，4.33-4.27(m，2H)，3.87-3.84(m，3H)，3.62(s，3H)，3.57(d，J＝13.2Hz，1H)，3.44(td，J＝10.8，3.2Hz，1H)，3.29-3.21(m，6H)，3.15(dd，J＝11.2，9.6Hz，1H)，2.85(m，2H)，2.74(s，3H)，2.32(s，3H)，1.98(m，1H)，1.76(m，2H)，1.65-1.21(m，9H)
  9   2-((R)-(3-氯-5-氟苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.35   543(M+H)   7.17-7.14(m，2H)，7.03(d，J＝8.8Hz，1H)，4.19(br d，J＝12.0Hz，1H)，4.05(d，J＝8.4Hz，1H)，3.87-3.78(m，3H)，3.62(s，3H)，3.57(d，J＝14.4Hz，1H)，3.44(td，J＝10.8，3.6Hz，1H)，3.32-3.26(m，6H)，3.15(dd，J＝11.2，9.6Hz，1H)，2.88(m，2H)，2.74(s，3H)，1.97(m，1H)，1.78-1.19(m，11H)
  10   2-((R)-(3，5-二氟苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.26   527(M+H)   6.93-6.86(m，3H)，4.19(br d，J＝13.2Hz，1H)，4.05(d，J＝8.4Hz，1H)，3.85(br d，J＝11.6Hz，2H)，3.79(br d，J＝14.0Hz，1H)，3.62(s，3H)，3.56(d，J＝13.2Hz，1H)，3.43(td，J＝11.2，3.2Hz，1H)，3.34-3.23(m，6H)，3.15(dd，J＝11.2，9.6Hz，1H)，2.88(m，2H)，2.74(s，3H)，1.97(m，1H)，1.78-1.17(m，11H)
  11   2-((S)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.795   539.1，561.0   1.93(m，2H)，2.32(s，3H)，2.72(s，3H)，2.85(m，2H)，3.66(s，3H)，3.85(m，4H)，4.43(d，1H)，7.16(m，2H)，7.32(s，1H)c
  12   2-((R)-(5-氯-2-甲基苯基)((R)-1-((S)-2-(乙基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.4  552(M+H)   7.30(d，J＝2.0，1H)，7.19-7.14(m，2H)，4.33-4.28(m，2H)，3.88-384(m，3H)，3.62(s，3H)，3.58(d，J＝13.2Hz，1H)，3.44(td，J＝10.8，3.2Hz，1H)，3.35-3.10(m，9H)，2.86(m，2H)，2.32(s，3H)，1.97(m，1H)，1.79-1.22(m，8H)，1.32(t，J＝7.2Hz，3H).
  13   2-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(乙基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯   1.36  539(M+H)   7.37-7.30(m，3H)，7.22(d，J＝7.2Hz，1H)，4.21(br d，J＝12.4Hz，1H)，4.02(d，J＝9.2Hz，1H)，3.87-3.79(m，3H)，3.62(s，3H)，3.58(d，J＝14.4Hz，1H)，3.44(td，J＝10.8，3.2Hz，1H)，3.34-3.11(m，9H)，2.90(m，2H)，1.98(m，1H)，1.78-1.15(m，8H)，1.33(t，J＝7.2Hz，3H).
a.LC-MS(3min)法
柱：Chromolith SpeedRod，RP-18e，50×4.6mm；流动相：A：0.01％TFA/水，B：0.01％TFA/CH3CN；流速：1mL/min；梯度：
 时间(min)   A％   B％
 0.0   90   10
 2.0   10   90
 2.4   10   90
 2.5   90   10
 3.0   90   10
b.d4-MeOH用作1H NMR溶剂。
c.MeOD用作1H NMR溶剂。
实施例15
2∶1的2-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)-乙基氨基甲酸甲酯双羟萘酸盐
步骤1.
向2-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)-乙基氨基甲酸甲酯(8.27g，15.7mmol)在IPA(50mL)中的溶液中加入双羟萘酸(3.12g，7.85mmol)。将得到的混合物于40℃加热过夜，冷却至室温，并搅拌10小时，得到黄色混悬液。过滤出固体，用IPA(100mL)洗涤，真空下干燥，得到粗的2∶1的2-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)乙基氨基甲酸甲酯双羟萘酸盐(10.9g，96％)。
步骤2.
将上述双羟萘酸盐(7.44g)在乙醇(74mL)中回流，直到溶解。热过滤得到的溶液，缓慢冷却至室温，搅拌过夜。过滤出固体，用乙醇(25mL)洗涤，得到0.5当量的双羟萘酸盐，其为浅黄色晶体(5.52g，74％)；m.p.：155.5-156.5℃。
步骤3.
重结晶的双羟萘酸盐晶体(7.85g)在乙醇(70mL)中回流，直到溶解，热过滤，冷却至室温，并搅拌过夜。过滤出固体，用乙醇(20mL)洗涤，得到浅黄色微晶体(6.99g，89％)。
实施例16
2∶12-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)-乙基氨基甲酸甲酯双羟萘酸盐
将从实施例15步骤3获得的重结晶的双羟萘酸盐晶体(0.19g)在甲醇(5mL)中60℃加热，直到完全溶解。然后让溶液冷却至室温，用2∶1的2-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)-乙基氨基甲酸甲酯双羟萘酸盐晶体(～5mg)种晶。将得到的混合物在室温下搅拌48小时以上。过滤出固体，真空下干燥，得到浅黄色微晶体(53.0mg，28％)。
X-射线粉末衍射
通过实施例15中所述的程序获得的2∶12-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)-乙基氨基甲酸甲酯双羟萘酸盐，用以下方法测定其X-射线粉末衍射图谱：
用以下参数扫描样品：
扫描范围：2-40度2-theta
发电机功率：40kV，40mA
辐射源：Cu Ka
扫描类型：连续
每步时间：10秒
步长：每步0.017度2-theta
样品旋转：1s旋转时间
入射束光学：0.04弧度索拉狭缝，0.25度发散狭缝，10mm射束掩模，0.5度防散射狭缝
衍射束光学：固定狭缝(X′celerator模块)，0.04弧度索拉狭缝
检测器类型：Philips X′Celerator RTMS(Real Time Multi Strip)
图1中显示了一批2∶12-((R)-(3-氯苯基)((R)-1-((S)-2-(甲基氨基)-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙基氨甲酰基)哌啶-3-基)甲氧基)-乙基氨基甲酸甲酯双羟萘酸盐的X-射线粉末衍射。
实施例17
体外活性研究
公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂具有酶抑制性质。尤其是，它们抑制天然酶肾素的作用。后者从肾脏进入血液中，在血液中它发挥裂解血管紧张素原的作用，释放十肽血管紧张素I，血管紧张素I然后在血液、肺、肾和其它器官中被血管紧张素转化酶裂解，形成八肽血管紧张素II。该八肽既通过与其受体结合引起动脉血管收缩直接升高血压，又通过从肾上腺释放钠离子保留性激素醛固酮间接升高血压，伴随着细胞外液容量增加。该增加可归因于血管紧张素II的作用。肾素的酶活性的抑制剂使得血管紧张素I的形成减少。结果，产生较少量的血管紧张素II。该活性肽激素的浓度降低是肾素抑制剂降血压作用的直接原因。
通过测量内部猝灭的肽底物的荧光增加的试验，在实验上证实了肾素抑制剂在体外的作用。该肽的序列对应于人血管紧张素原的序列。使用了下面的试验方案。所有反应都在平底白色不透明的微量滴定板中进行。将一份4μL的溶于192μL测定缓冲液(50mM BES，150mM NaCl，0.25mg/mL牛血清白蛋白，pH7.0)中的400μM肾素底物(DABCYL-γ-Abu-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Thr-EDANS)添加到4μL以不同浓度溶于DMSO中的试验化合物中，终浓度为10μM至1nM。接下来，添加100μL溶于测定缓冲液中的胰蛋白酶激活的重组人肾素(最终酶浓度为0.2-2nM)，并通过吸移混合溶液。使用Perkin-Elmer Fusion平板读数器，在室温测量495nm(在340nm激发)处的荧光增加历时60-360分钟。然后测定作为时间函数的荧光增加曲线的线性部分的斜率，并将该斜率用于计算相对于未受抑制的对照的抑制百分比。然后将抑制百分比值作为抑制剂浓度的函数作图，并从该数据与四参数方程式的拟合中测定IC50。IC50被定义为相对于不含抑制剂的对照样品，使产物形成减少50％的特定抑制剂的浓度。在体外系统中，公开的天冬氨酸蛋白酶抑制剂在大约5×10-5 M至大约10-12M的最小浓度下表现出抑制活性。特定的天冬氨酸蛋白酶抑制剂在大约10-7M至大约10-12M的最小浓度下表现出抑制活性。(Wang G.T.等人.Anal.Biochem.1993，210，351；Nakamura，N.等人.J.Biochem.(Tokyo)1991，109，741；Murakami，K.等人.Anal Biochem.1981，110，232)。
通过在存在所述化合物的情况下观察到的血浆肾素活性(PRA)水平的降低，在实验上证实了人血浆中肾素抑制剂的体外作用。孵育混合物包含在最终体积为250μL的95.5mM N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸，pH 7.0，5mM EDTA，0.1mM硫酸新霉素，1mg/mL叠氮化钠，1mM苯甲磺酰氟，2％DMSO和87.3％的用EDTA稳定的合并混合性别人血浆中。对于具有低PRA(小于1ng/ml/hr)的血浆批次，添加约2pM的重组人肾素以达到3-4ng/ml/hr的PRA。在37C进行血浆中内源性血管紧张素原的裂解90分钟，并使用DioSorin PRA试剂盒，通过竞争性放射免疫测定法，测定产物血管紧张素I。然后用含有2％DMSO的未受抑制的孵育物和含有2μM异戊酰-Phe-Nle-Sta-Ala-Sta-OH的完全抑制的对照得到每个抑制剂浓度的抑制百分比，并将剂量-反应数据拟合于四参数模型，从该模型中测定被定义为发生50％抑制时的抑制剂浓度的IC50值。
对化合物1-12进行了体外酶活性研究，数据显示在表1中。
  化合物编号   IC50   PRA
  1   ***   ***
  2   ***   **
  3   ***   ***
  4   ***   ***
  5   ****   ****
  6   ***   *
  7   ****   ***
  8   ****   ***
  9   ****   ***
  10   ***   ***
  11   ***   ***
  12   ***   nt
表1.天冬氨酸蛋白酶抑制剂的体外IC50和PRA数据
*表示低于50nM；**表示低于20nM；***表示低于10nM；****表示低于1nM；nt：未检测。
实施例18
体内活性研究
在钠缺失的、血压正常的食蟹猴中在体外评价了肾素抑制剂的心脏和系统血液动力学功效。在自由运动、有意识的动物中，通过遥测术监测动脉血压。
食蟹猴(预言性的实例)：在研究中使用六只未接受过试验的雄性食蟹猴，体重为2.5至3.5kg。在实验前至少4周，用盐酸氯胺酮(15mg/kg，肌肉内)和盐酸赛拉嗪(0.7mg/kg，肌肉内)将猴麻醉，并将发射器(型号#TL 11M2-D70-PCT，Data Sciences，St.Paul，MN)植入其腹腔。将压力导管经由股动脉插到下腹部主动脉中。将双电位导联以导联II结构放置。在恒定的温度(19-25℃)、湿度(＞40％)和光照条件(12小时光暗循环)下圈养动物，每天进食一次并允许其自由获得水。通过在实验前7天喂以低钠饮食(0.026％，ExpandedPrimate Diet 829552MP-VENaCl(P)，Special Diet Services，Ltd.，UK)，使动物消耗钠，并在给予试验化合物前-40小时和-16小时时，给予呋塞米(3mg/kg，肌内，Aventis Pharmaceuticals)。
对于口服给药，将肾素抑制剂配制在0.5％甲基纤维素中，剂量水平为10和30mg/kg(5mL/kg)，通过婴儿喂养管进行。对于静脉内给药，将硅橡胶导管经由股静脉插到后腔静脉中。将导管经由系绳和旋转接头与递送泵连接。通过连续输注(1.67mL/kg/h)或通过弹丸注射(2分钟内3.33mL/kg)给予试验化合物(剂量水平为0.1-10mg/kg，以5％右旋糖配制)。
使用DataquestTM A.R.T.(Advanced Research Technology)软件，分别在500Hz和50Hz连续记录动脉血压(收缩压、舒张压和平均血压)和体温。由位相性血压描记法获得心率。在记录期间，将猴置于没有人的单独房间中，以避免继发于应激的血压变化。将所有数据表示为平均值±SEM。考虑剂量和时间因素，与载体组对比，通过ANOVA评价肾素抑制剂对血压的作用。
双转基因大鼠：还在双转基因大鼠体内评价了肾素抑制剂的功效，该双转基因大鼠被工程改造为表达人肾素和人血管紧张素原(Bohlender J，Fukamizu A，Lippoldt A，Nomura T，Dietz R，Menard J，Murakami K，Luff FC，Ganten D.High human renin hypertension intransgenic rats.Hypertension 1997，29，428-434)。按照以下步骤测定了化合物7的体内活性。
在6周龄双转基因大鼠(dTGRs)中进行实验。该模型在以前已经详细描述。简言之，用于产生转基因动物的人肾素构建体组成整个基因组人肾素基因(10个外显子和9个内含子)，具有3.0kB的5′-启动子区域和1.2kB的3′额外序列。人血管紧张素原构建体组成整个人血管紧张素原基因(5个外显子和4个内含子)，具有1.3kB的5′-侧翼序列和2.4kB 3′-侧翼序列。大鼠购自RCC Ltd(Füllinsdorf，瑞士)。在4周龄时手术植入无线遥测发射器。该遥测系统提供24小时收缩动脉压、平均动脉压、舒张动脉压(分别为SAP、MAP、DAP)和心率(HR)的记录。在第42天开始，将动物转移到遥测笼中。获得24小时遥测读数。然后在随后的连续4天(第43-46天)经口对大鼠给药。连续监测大鼠并允许它们自由获得标准的0.3％-钠鼠粮和饮用水。
化合物7在转基因大鼠体内的活性在图2中显示。如图2所示，化合物7在3-10mg/kg剂量时表现出显著的降低转基因大鼠血压的效果。
尽管本发明已经参照具体实施方案进行了具体表述和描述，但本领域技术人员应当理解，在不背离所附权利要求书包括的发明范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

Claims (25)

1.由以下结构式表示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure A2007800391190002C1
其中：
R1是烷基、环烷基或环烷基烷基；
R2是H或烷基；
R3是F、Cl、Br、氰基、硝基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基或链烷磺酰基；且
n是0、1、2或3。
2.如权利要求1所述的化合物，其中：
R1是(C1-C3)烷基；
R2是H或(C1-C3)烷基；
R3是F、Cl、Br、氰基、硝基、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷氧基或(C1-C3)链烷磺酰基；且
n是0、1、2或3。
3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
Figure A2007800391190002C2
其中：
R1是(C1-C3)烷基；
R2是H或(C1-C3)烷基；
R3是F、Cl、Br、氰基、硝基、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷氧基或(C1-C3)链烷磺酰基；且
n是0、1、2或3。
4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中R1是甲基。
5.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R2是H或甲基。
6.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中R3是F、Cl或甲基。
7.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中n是1或2。
8.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由选自下组的结构式表示：
Figure A2007800391190003C1
Figure A2007800391190004C1
9.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由选自下组的结构式表示：
Figure A2007800391190004C2
Figure A2007800391190005C1
10.由以下结构式表示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure A2007800391190005C2
11.由以下结构式表示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure A2007800391190005C3
其中所述化合物的光学纯度至少为90％。
12.一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体或稀释剂和如权利要求1-11中任一项所述的化合物。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其还含有α-阻断剂、β-阻断剂、钙通道阻断剂、利尿剂、促尿钠排泄药、促尿盐排泄药、中枢作用性抗高血压药、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素转化酶和中性内肽酶双重抑制剂、血管紧张素-受体阻断剂、双重血管紧张素-受体阻断剂和内皮素受体拮抗剂、醛固酮合酶抑制剂、醛固酮-受体拮抗剂或内皮素受体拮抗剂。
14.一种拮抗需要的受试者中的一种或多种天冬氨酸蛋白酶的方法，包括给该受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所述的化合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述天冬氨酸蛋白酶是肾素。
16.一种治疗受试者的天冬氨酸蛋白酶介导的疾病的方法，包括给该受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所述的化合物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述疾病是高血压、充血性心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化、梗塞后心肌病、肾病、血管病和神经病、冠状血管疾病、手术后高血压、血管成形术后再狭窄；眼内压升高、青光眼、血管生长异常、醛固酮过多症、焦虑状态或认知障碍。
18.如权利要求16所述的方法，进一步包括施用一种或多种额外的药物，该药物选自：α-阻断剂、β-阻断剂、钙通道阻断剂、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素转化酶和中性内肽酶双重抑制剂、血管紧张素-受体阻断剂、双重血管紧张素-受体阻断剂和内皮素受体拮抗剂、醛固酮合酶抑制剂、醛固酮-受体拮抗剂和内皮素受体拮抗剂。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述天冬氨酸蛋白酶是β-分泌酶。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述天冬氨酸蛋白酶是疟原虫天冬氨酸蛋白酶。
21.如权利要求16所述的方法，其中所述天冬氨酸蛋白酶是HIV蛋白酶。
22.由选自下组的结构式表示的化合物或其盐：
Figure A2007800391190007C1
其中：
R2是H或烷基；且
E是H或胺保护基。
23.如权利要求22所述的化合物，其中R2是H或(C1-C3)烷基。
24.如权利要求23所述的化合物，其中R2是H或甲基。
25.如权利要求22所述的化合物，其中所述化合物选自：
(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁酯；
(S)-1-氨基-3-((R)-四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁酯；
1-氨基-3-(四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基氨基甲酸叔丁基酯；和
1-氨基-3-(四氢-2H-吡喃-3-基)丙-2-基(甲基)氨基甲酸叔丁基酯。
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