CN101525630A - 油菜隐性核不育恢复基因BnCYP704B1及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及包含油菜隐性核不育基因Bncyp704B1以及等位显性恢复基因BnCYP704B1的两条DNA片断的分离克隆、功能验证和应用。隐性不育基因Bncyp704B1是BnCYP704B1基因的功能缺陷突变体。显性基因BnCYP704B1的突变使油菜花粉外壁发育受阻，导致雄性不育。利用基于转基因技术，将恢复基因BnCYP704B1与诱导表达的启动子连接并转入油菜，通过调控恢复基因BnCYP704B1的表达，来繁殖100％不育的核不育系，突破核不育系在油菜等作物杂种优势利用中的瓶颈。
Description
技术领域
本发明属于油菜育种技术领域。具体涉及一个恢复甘蓝型油菜隐性核不育育性的基因BnCYP704B1的分离克隆、功能验证和应用。所述的隐性不育基因Bncyp704B1是BnCYP704B1基因的功能缺陷突变体。恢复基因BnCYP704B1的克隆、验证可以应用于解决油菜隐性细胞核雄性不育系繁殖制种时存在50％可育的缺陷。
背景技术
植物在有性繁殖的过程中不能产生正常花粉的遗传现象称为雄性不育，它涉及到花器中雄蕊的发生与发育、绒毡层结构、小孢子形成、花药开裂以及外部生态环境等很多环节。雄性不育可以分为细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)。细胞质雄性不育为人类所知已有100多年的历史，并且在水稻、玉米、油菜等作物中广泛的用于生产杂交种。目前，世界上可以用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogu、kos、tour和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统，但是波里马不育系育性受到温度的影响表现不稳定，制种风险较大，其应用受到了一定的限制。
甘蓝型油菜细胞核雄性不育系由于育性表现稳定，易于回交转育获得新的不育系，并且一般不受恢保关系的限制，近年来受到育种家的广泛关注。目前国内外利用的油菜核不育系主要有以下四种类型：显性核不育、两对隐性基因控制的核不育、互作型核不育和转基因核不育。中国四川省宜宾地区农科所(1972)发现的宜3A是显性核不育系的典型代表，目前还没有选育出大面积推广的双低杂交组合。9012A(陈凤祥等，1998，作物学报，24(4)：431-438)和7-7365A(huang et al.，2007，Theor Appl Genet.，115(1)：113-8.)均属于互作型核不育系，以其为材料选育的品种中，已审定的杂交种有“皖油14号”(陈凤祥等，2002，安徽农业科学，30(4)：535-537)、“皖油18号”(陈凤祥等，2003，中国油料作物学报，25(1)：63-65)和“沪油杂1号”(孙超才等，2004，中国油料作物学报，26(1)：63-65)等组合，该系统通过引入临保系获得100％的全不育系，在油菜核不育系统研究领域取得了重大进展。但是这个系统遗传基础复杂、临保系选育困难，不利于选育强优势组合。美国和加拿大利用烟草的TA29基因的启动子和核糖核酸水解酶(barnase)基因构建成融合基因转化甘蓝型油菜，人工创造了新的核不育材料，并通过向该材料中导入抗除草剂基因后达到了机械化作业。但是该系统的不足之处是必须对不育系和恢复系都进行转基因，该系统目前也受到专利的保护。S45A(潘涛等，1988)和117A(侯国佐等，1991，种子，5：29-31)是两对隐性基因控制的核不育系的典型代表，由其选育而来的杂交种中已审定的有“蜀杂6号”“蜀杂7号”、“油研7号”、“油研8号”和“油研9号”等。该类系统主要缺陷是不育系中存在50％的可育株，在制种时需要在初花期人工拔除其中50％的可育株，不仅增加了制种的成本，而且往往由于可育株清除不彻底，影响制种纯度，增加了生产的风险。
有关基因BnCYP704B1的序列已在Genebank(ID：199580279)数据库中报道，但是到目前为止尚未揭示该基因的结构和编码的氨基酸序列，也没有报道该基因具有恢复甘蓝型油菜隐性核不育育性的功能，更没有报道该基因可以在繁殖甘蓝型油菜核不育系中应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，具体涉及一个恢复甘蓝型油菜隐性核不育育性的基因BnCYP704B1的分离克隆、功能验证和应用。
本发明的技术方案如下：
申请人从报道的基因BnCYP704B1中获得了一种能够恢复甘蓝型油菜隐性核不育育性的核苷酸序列，它是下列核苷酸序列之一：
1)序列表SEQNO：1中所示的DNA序列；或
2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
具体地，本发明首先利用图位克隆方法，克隆基因BnCYP704B1，用于恢复甘蓝型油菜隐性核不育系S45A和117A(参见：潘涛等，1988，中国油料，(3)：5-8)、和侯国佐等，1991，种子，5：29-31)的育性，或作为甘蓝型油菜新核不育系选育的分子标记。进一步可以通过控制该基因的表达，繁殖甘蓝型油菜100％转基因不育系，突破甘蓝型油菜核不育系杂交制种存在50％可育株的障碍。
本发明的第二方面，进一步提供利用上述基因获得转基因不育系植株和相应的种子，用以繁殖100％不育的核不育系。可以用有性杂交的方式将本发明所述的基因转入其它的植株。
在本发明的实施例部分，我们阐述了隐性基因Bncyp704B1和显性基因BnCYP704B1的分离、功能验证和应用技术路线以及这两个基因的特点。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1.是本发明分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnCYP704B1的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。
图1.本发明鉴定、分离、克隆并验证油菜隐性核不育基因Bncyp704B1和它的等位显性基因BnCYP704B1功能的流程图。
图2.覆盖隐性核不育基因Bncyp704B1-1和Bncyp704B1-2区段的物理图谱。图中：空心线表示Bncyp704B1和Bncyp704B1-2基因精细定位的遗传图谱；分子标记下面的数字表示在近等基因系群体中检测到的Bncyp704B1位点与分子标记之间发生重组交换的单株数；连接分子标记和BAC克隆的竖虚线表示通过序列比较分析证实了相对应的分子标记和BAC克隆具有同源性；实线表示细菌人工染色体(bacterialartificial chromosome，BAC)克隆和拟南芥染色体；线上的黑点代表根据BAC序列预测的油菜基因，线上的空心点代表相应区域拟南芥基因组图谱上注释的基因。
图3.油菜功能互补测验表达载体pBnG15的构建。
图4.具有S45A遗传背景的T0代遗传转化植株开花后育性表型与S45A和S45B表型的比较。S45A遗传转化T0代植株携带显性基因BnCYP704B1的候选基因，表现为花丝伸长，育性部分恢复。
图5.pDS1301载体和pAtG15RNAi克隆的结构。图中：RB和LB：T-DNA的右侧和左侧边界；Hpt：潮霉素磷酸转移酶基因；35S：花椰菜花叶病毒35S启动子；AdhI：玉米乙醇脱氢酶基因的内含子I；OCS：章鱼碱合成酶多聚腺苷酸信号；GUS：葡萄糖醛酸糖苷酶基因。
图6.开花期观察拟南芥RNAi转化植株的育性。(a)转化植株花药醋酸洋红染色镜检的结果，没有观察到花粉。(b)野生型可以观察到可育的花粉。(c)转化植株荚果短小，几乎没有种子。(d)野生型植株荚果饱满，种子发育正常。
图7.Northern杂交分析基因在S45A和S45B中表达差异。S和F分别代表S45A和S45B，图片下面的数字代表花蕾长度。
图8.候选基因多重比较测序的结果。黑色块状盒代表基因的编码区，细线代表内含子，灰色块状盒代表非翻译区。ATG和TAG分别代表翻译起始密码子和终止密码子。黑色数字表示各亚结构在S45B中实际的序列长度。碱基替换、缺失或插入是其它品系与S45B序列相比较的结果。彩色数字表示超过1bp以上的突变差异。蛋白质的差异位置和氨基酸变化在基因的右侧标示。
图9.油菜隐性核不育系S45A半薄切片显微解剖结构。a、b、c、d、e和f分别是可育花药造孢细胞时期、花粉母细胞时期与减数分裂时期、四分体时期、单核早期、单核靠边期和二核花粉期半薄切片显微照片，g、h、i、j、k和l分别是不育花药对应时期的半薄切片显微照片。E：初生外壁。En：内壁。ML：中层。T：绒毡层。MMC：花粉母细胞。Tds：四分体。Msp：单核花粉。
图10.油菜隐性核不育系S45A超薄切片显微解剖结构。i：花粉内壁e：花粉外壁基座。pc：蛋白覆盖层。
图11.核不育恢复基因应用于繁殖100核不育系的技术路线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，参照公开报道的方法或手册，例如：萨姆布鲁克的《分子克隆手册》(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)。
实施例1：构建含隐性核不育基因Bncyp704B1区段的物理图谱
1.实验材料
本实验所用的材料为甘蓝型油菜隐性核不育两型系S45AB(材料来自四川大学，参见：潘涛等，1988，中国油料，(3)：5-8)，材料S45AB经过多代的兄妹交(25代以上)保存。
隐性核不育基因的定位群体是由S45A和S45B兄妹交构建的一个近等基因系群体，2002年秋播种于武汉，2003年春天提取310个单株的DNA(参见：Doyle JJ，Doyle J L.Isolation of plant DNA from freshtissue.Focus，1990，12：13-15)，用于基因的初步定位，并将S45B套袋自交。2004年夏季在兰州播种兄妹交群体和自交分离群体，从兄妹交群体中提取1,664个单株的DNA，用于重组单株的筛选和基因的精细定位；从自交群体中随机选取72个单株用于共显性标记的分析。2004年秋在武汉播种，2005年春天提取兄妹交群体中2,158个单株的DNA，进一步扩大基因精细定位的群体。
2.筛选包含BnCYP704B1基因区段的BAC克隆
根据初步定位的结果该基因位于油菜N7连锁群的两个SCAR(Sequence characterized amplified region)标记SC1和SC7之间(Yi等，2006，Fine mapping of the recessive genic male-sterile gene(Bnmsl)in Brassicanapus.Theor Appl Genet 113：643-650)。即Bncyp704B1位点位于SC1和SC7之间(图2)。利用油菜品种Tapidor的细菌人工染色体(bacterial artifical chromosome，BAC)文库(Rana等，2004，Conservation of themicrostructure of genome segments in Brassica napus and its diploid relatives.Plant J.40：725-733.)，本发明筛选到了1个包含恢复基因BnCYP704B1的BAC克隆(见图2)，该克隆包含基因两侧的SCAR标记SC1和SC7。引物序列如下：
SC1F：5’-ACACGGTGATCCGGTAAGTCGT SC1R：CCAGTAGGAGTCACCGAGATA
SC7F：5’-GGTCTAGAATAGTTGGCGAG SC7R：CTACCTGAGTACATCTGTGC
3.包含目标基因BAC克隆的测序和序列拼接
采用部分酶切法(参见：Yu J等.A draft sequence of the rice genome(Oryzae sativa L.ssp.Indica).Science，2002，296：79-92)构建目标BAC克隆的Shotgun文库。具体步骤是：用Sau3A I处理BAC克隆的DNA，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离出1-3kb的DNA片段，纯化后与BamH I酶切的去磷酸化的pUC18载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接，电转化大肠杆菌DH10B((购自宝生物工程(大连)有限公司)，电转化的条件：电容25μF、电阻200Ω、电压1.8kV)，进行蓝白斑筛选。提取阳性克隆质粒，用通用M13-R和M13-F引物进行PCR扩增，检测插入片段大小。引物系列如下：
M13-R：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
M13-F：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
采用M13-R和M13-F引物和美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit，按照试剂盒的说明书操作)，根据试剂盒的使用说明以双脱氧核苷酸末端终止法分别从每个亚克隆的两端测序。测序仪为PerkinElmer公司的ABI3730Sequencer。
使用报道的SeqMen软件拼接序列。用SeqMen软件自动去除末端测序质量较差的序列和pUC18载体序列(参见：宝生物工程(大连)有限公司pUC18载体操作手册)；对软件没有去除干净的序列则用手工删除。BAC载体序列和污染的细菌DNA序列则通过常用的BLAST分析的方法剔除。用SeqMen软件对两条序列进行拼接的参数是：重叠序列长度(Mini Overlap)大于20bp(Altschul等，1997，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，重叠序列的一致性(Mini Match)大于85％。每一个碱基的确定都要参照重叠在该位点的多个Shotgun片段序列。对于由一个Shotgun片段序列所覆盖的区域要再次测序验证，以确保碱基的准确性。而对于shotgun测序后存在的Gap区域，则用primer walking的方法，填补缺口。测序结果表明目标基因的区域SC1和SC7之间的序列长度为54Kb。
实施例2：精细定位核不育基因BnCYP704B1
利用分子标记SC1和SC7在4132个单株的近等基因系群体中分别检测到4个和18个交换单株，这些单株在标记和Bncyp704B1位点间发生了重组(见图2)。为了进一步缩小目标基因区域的范围，根据目标区域的序列设计了35对特异引物，在S45A、S45B之间进行多态性筛选，发现6个新的分子标记SC8、SC9、SC10、SC11、SC12和SC13。
标记的序列如下：
SC8F 5-TTCCAGGAGCACATCATCCGCAGAG SC8R 5-AGGGGGAGAGAAAAAGATAGAAAC
SC9F 5-CTGAAGAATAAGCGACCAGC SC9R 5-CTTCATGGAAGGCGAGTCTT
SC10F 5-GGCCTACTAAGGTAGTCCTG SC10R 5-CCACACGCTGAGTTCATATTGGACAC
SC11F 5-GAGCTCTCACGTTGAAAGT SC11R 5-CGGCGTAGAAGTGAAGTCTC
SC12F 5-CCCGAACTTCATCTTACTCG SC12R 5-CACGTGTCAAGCTCTGGTGG
SC13F 5-ATCTACTCTTCTTTGGCTGTT SC13R 5-GAGCGTTCAAGTCAGTTCC
用新的SCAR标记进一步分析22个重组交换单株(参见：BinYi等Fine mapping of the recessive genicmale-sterile gene(Bnmsl)in Brassica napus.Theor Appl Genet.，2006，113(4)，643-650.)。然后用新标记SC8、SC9、SC10、SC11、SC12和SC13对交换单株进行分析，在SC1检测到的4个交换单株中，有2个在SC8与BnCYP704B1基因间亦表现交换。在标记SC7检测到的18个交换单株中，标记SC11、SC12和SC13分别检测到6个、7个和9个交换单株。标记SC9和SC10与BnCYP704B1基因共分离。通过以上精细定位，将BnCYP704B1基因定位于分子标记SC8和SC11之间，与SC9和SC10共分离。该区间在BAC克隆JBnBBAC1上跨度约21.2-kb(图2)。
实施例3：显性基因BnCYP704B1的分离和功能验证
1.BnCYP704B1候选基因的确定
本实施例中采用模式生物拟南芥网站的Blast(http://www.arabidopsis.org/blast)软件对分子标记SC8和SC11之间、包含Bncyp704B1的等位显性基因BnCYP704B1、来源于油菜品种Tapidor的21.2kb(图2)序列进行分析，显示该区段可能存在四个基因。进一步的基因注释显示：第一、第三个和第四个基因与花粉发育不相关，第二个基因CYP704B1与花粉外壁合成相关；而且，半薄切片显示S45A败育的特征是外壁缺失，因此推测第二个候选基因基因是核不育恢复基因，命名为BnCYP704B1。用BnCYP704B1序列检索Genebank核酸数据库，结果与白菜细菌人工染色体(BAC)克隆KBrH012E04序列(Genebank登录的ID：199580279)100％同源，该BAC克隆全长98343bp，BnCYP704B1序列与克隆KBrH012E04位于48657-51048的序列的互补序列完全相同。该基因包含6个外显子和5个内含子，编码519个氨基酸的蛋白质。基因结构的详细特征参见序列表SEQ ID NO：1。
2.BnCYP704B1油菜转基因实验
本实施例采用植物表达载体pCAMB1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance toXanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant J.37：517-527)作为甘蓝型油菜转基因载体。通过分析携带候选基因的BAC克隆序列的酶切位点和候选基因的关系，利用高保真PCR方法(Skerra，A.，1992，Phosphorothioate primers improve the amplification of DNA sequences by DNApolymerases with proofreading activity，Nucleic Acids Res.，20，3551-3554，)扩增获得一个3.8kb的片段，该片段包含EcoR I和Sal I酶切位点。片段起始端包基因上游非翻译区784bp的序列、基因区间2,392bp的序列和下游非翻译区的630bp的序列。将扩增片段克隆到pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)上，测序结果表明序列完全准确，没有错配碱基存在。提取序列正确克隆的质粒，用EcoR I和Sal I双酶切后回收3.8kb的片段，连接到经EcoR I和Sal I双酶切的表达载体pCAMBIA1301上，连接产物转化大肠杆菌菌株DH10B，在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，并用通用引物测序检测核苷酸序列是否正确，成功构建了转化载体pBnG15(见图3)。正确的重组质粒通过冻融法(HOLSTERS M等.1978，Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens.Mol Gen Cent，183：181-187.)导入农杆菌菌株LBA4404。甘蓝型油菜遗传转化采用常规的农杆菌转化法(陈苇等，2006，甘蓝型油菜Fad2基因的RNA干扰及无筛选标记高油酸含量转基因油菜新种质的获得，植物生理与分子生物学学报，32(6)：665-671)转化油菜核不育系S45A(用分子标记鉴别两型系中的S45A和S45B)，用70％酒精浸泡种子15min，0.1％升汞消毒15min，20％～30％的次氯酸钠消毒15min，无菌水清洗3次，每次间隔5min。灭菌的种子播于MS基本培养基(PH＝5.8，MURASHIGE，Toshio and SKOOG，Folke.1962，A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiologia Plantarum，15(3)：473-497)，25℃暗培养7d。将幼苗下胚轴切成0.5cm-0.8cm的小段，于含有农杆菌LBA4404(悬浮过夜至对数生长期)的MS液体培养基(PH＝5.8)浸染90min-120min后，吸干液体，于25℃黑暗条件下共培养3d；将外植体转到愈伤组织诱导培养基(MS基本培养基+2，42D 1.0mg/L+KT(激动素)0.3mg/L+蔗糖30g/L)上，25℃光照培养15-18d。将外植体转入分化培养基(MS基本培养基+IAA(吲哚乙酸)0.1mg/L+ZT(玉米素)1.0mg/L+葡萄糖10.0g/L)培养，每15-18d继代1次，直至分化出幼苗。当幼苗长至2-3cm高时，将幼苗转入生根培养基(1/2MS基本培养基+IBA(吲哚丁酸)0.1mg/L+蔗糖10g/L)上培养。转化植株生根后，假植于混有腐质土的细土纸杯中，保持70％相对湿度，一个月后移入大田。
从获得阳性植株上提取叶片总DNA((参见：Doyle J J，Doyle J L.Isolation of plant DNA from freshtissue.Focus，1990，12：13-15))，经PCR方法鉴定转化植株，PCR标准程序参见参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等译，科学出版社，介绍的方法。PCR采用20μl的反应体系，包含：20-50ng DNA模板，10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1％Triton X-100，1.8mM MgCl2，0.1mM dNTP，0.2μM引物(CheckF：5-TCTAGAATGTCAACTTTGTATG-3CheckR：5-CTGCAGTCACTGATTAAGCACG-3)和1U Taq DNA polymerase。PCR扩增的条件为：94℃预变性4min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，34个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。T0代植株检测为阳性的单株观察育性表现，验证候选基因的功能。结果显示在5个转基因T0代植株中，有2株表现为花丝伸长，育性完全恢复(图4)，结果表明BnCYP704B1在油菜花粉发育中发挥不可或缺的作用，能够互补甘蓝型油菜不育系S45A的不育表型。
3.拟南芥RNAi实验
利用两对双链扩增引物dsG15-5’和dsG15-3’分别从拟南芥的cDNA中扩增出350bp的特异片段，扩增片段都不包含Spe I、Kpn I、Sac I和BamH I酶切位点，将扩增片段克隆到pMD18-T载体上，测序结果表明序列完全准确，没有错配碱基存在。提取插入片段序列正确的克隆的质粒，用Kpn I和BamH I双酶切处理pMD18-T质粒和双链RNA载体pDS1301，分别回收目标片段后连接并转化大肠杆菌菌株DH10B，阳性质粒用KpnI和BamH I双酶切检测，然后提取目标克隆的质粒，用Spe I和Sac I双酶切处理插入第一链的质粒和包含基因插入片段的pMD18-T质粒(购自宝生物工程(大连)有限公司)，分别回收目标片段后连接并转化大肠杆菌DH10B，酶切检测准确的克隆所包含的载体就是候选基因的双链RNA载体pAtG15RNAi(图5)。构建的双链RNA载体pAtG15RNAi用农杆菌沾花的方法(参见：许冠东，农杆菌介导Lat52-DTA基因转化拟南芥菜，2000，硕士学位论文，中国知网)转化拟南芥。在含15mg/L潮霉素的LB培养基上筛选转化植株的种子，抗性植株根长，植株较大，子叶和真叶的颜色为鲜绿色；非抗性植株根很短，植株矮小，子叶和真叶颜色较深。植株长到3-5片真叶后移植到营养土中培养，得到35个抗性植株。在开花期观察转化植株的育性，用醋酸洋红染色、镜检发现2个植株表现为雄性不育，图6是其中1个单株育性观察的结果，转化植株花药醋酸洋红染色没有发现花粉(图6a)，荚果短小，几乎没有种子(图6c)；野生型花药醋酸洋红染色观察到可育花粉(图6b)，植株荚果饱满，种子发育正常(图6d)。
实施例4：基因的表达差异分析
本发明分别提取S45A和S45B四个时期花药(花蕾的大小分别为小于1mm、1mm-2mm、2mm-3mm和3mm-4mm)的总RNA，对候选基因BnCYP704B1进行Northern分析。转膜后分别用候选基因的cDNA做探针进行杂交，以rRNA作为Northern杂交的内标，结果表明四个时期总RNA浓度基本一致，可育株与不育株总RNA浓度也基本相同。用候选基因做探针的杂交结果显示，基因在小于1mm和3mm-4mm的花蕾中不表达或者表达量很低，没有检测到明显的杂交信号。在2mm-3mm花蕾中BnCYP704B1的表达量高于1mm-2mm花蕾中的表达量，不育株和可育株之间在1mm-2mm和2mm-3mm的花蕾中表达量都没有差异(见图7)。Northern分析结果表明候选基因的表达量在不育株和可育株之间没有差异，推测育性的变化可能是由于基因结构变化导致功能缺失引起的。
实施例5：候选基因BnCYP704B1的比较测序
针对候选基因BnCYP704B1设计的测序引物为G15-F和G15-R(在BAC1克隆中对应序列扩增基因区间2,392bp的序列。PCR标准程序参见参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社介绍的方法。引物序列如下：
G15-F 5-ATGTCTATGTGGATCGTTCTAG G15-R 5-CTATGAACGTCTGGATACAG
测序结果表明：S45B在基因结构区域的序列(2,392bp)与来自BAC克隆BAC1的序列完全一致。而S45A序列与S45B序列相比有12个位点发生突变，包括10个单碱基替换(2个发生在内含子区域，8个发生在翻译区)和2个插入突变(都发生在内含子区域，一个单碱基的插入和一个7个碱基的插入)，其中位于基因翻译区的8个单碱基替换有6个是同义突变，另外两个单碱基替换造成两处编码的氨基酸(第179位和第297位)发生改变，在第179位S45B编码的氨基酸为甘氨酸，而在S45A中则变为精氨酸；在第297位S45B编码的氨基酸为缬氨酸，而在S45A中则变为丙氨酸基(图8)。
为了进一步确定突变位点是否与育性相关，本发明随机选择了19个油菜品种进行了比较测序。结果表明，2个突变位点中的第二个突变可以在正常可育的白菜型油菜品种中找到，只有第179位的甘氨酸突变是是不育突变体特异的(图8)，表明P179G可能是导致败育的原因。
表1显性基因BnCYP704B1和隐性基因Bncyp704B1序列差异位点
| 突变位点1 | BnCYP704B1(S45B) | Bncyp04B1(S45A) | 突变类型 |
| 174 | A | G | 碱基替换，没有造成氨基酸差异 |
| 192 | T | C | 碱基替换，没有造成氨基酸差异 |
| 210 | T | C | 碱基替换，没有造成氨基酸差异 |
| 228 | C | T | 碱基替换，没有造成氨基酸差异 |
| 237 | A | C | 碱基替换，没有造成氨基酸差异 |
| 656-657 | A | 内含子中碱基插入，没有造成氨基酸差异 | |
| 753 | T | C | 碱基替换，没有造成氨基酸差异 |
| 936-937 | TCGTCAC | 内含子中碱基插入，没有造成氨基酸差异 | |
| 1118 | G | A | 碱基替换，造成第179位氨基酸变异，由BnCYP704B1蛋白的甘氨酸变为Bncyp704B1蛋白的精氨酸 |
| 1351 | A | G | 碱基替换，没有造成氨基酸差异 |
| 1552 | T | C | 碱基替换，造成第297位氨基酸变异，由BnCYP704B1蛋白的缬氨酸变为Bncyp704B1蛋白的丙氨酸 |
| 2179 | T | G | 碱基替换，没有造成氨基酸差异 |
1序列表SEQ IDNO：1(显性基因BnCYP704B1)所示序列位点。
实施例6：细胞学切片分析
为了进一步确定隐性核不育系S45A败育的细胞学特点，并阐明BnCYP704B1基因的功能，本发明对隐性核不育两型系S45AB花药进行半薄切片和超薄切片，重点观察了造孢细胞时期至二核花粉期过程中小孢子和绒毡层发育情况，比较了不育花药和可育花药绒毡层和小孢子在各时期发育的差异。比较发现：不育花药和可育花药在造孢细胞时期、花粉母细胞时期与减数分裂时期没有差异，不育花药的造孢细胞可以分化形成正常的花粉母细胞，绒毡层也发育正常(图8a和8g、8b和8h)。四分体时期不育花药和可育花药的四分体没有明显差异，花粉母细胞可以进行正常的减数分裂形成四分体，四分体被胼胝质包围；绒毡层结构有细微的差异，不育花药的绒毡层较可育花药的绒毡层稍厚(图8c和8i)。在小孢子从四分体中释放后的单核早期差异明显，主要表现在不育花粉没有外壁的合成；可育花药的绒毡层压缩变扁，而不育花药的绒毡层径向扩大(图8d和8j)。在单核晚期，可育花粉细胞质出现一个大的液泡，细胞核靠近细胞壁的一侧，花粉外壁进一步加厚；不育花粉的细胞质也液泡化，但是花粉外壁合成一直受阻；不育花药的绒毡层进一步增厚(图8e和8k)。随后可育花粉经过一次有丝分裂产生一个大的营养细胞和一个小的生殖细胞，进入二核花粉期，而不育花粉一直停留在单核花粉期，不能进一步的发育，并逐渐解体；绒毡层差异明显，不育花药的绒毡层液泡化严重，而可育花药的绒毡层被压缩成很薄的一层，没有产生液泡化(图8f和81)。因此认为S45A败育与绒毡层功能异常相关，可能的机制是绒毡层不能提供花粉外壁合成的关键物质，花粉外壁合成缺陷而导致花粉发育异常，逐渐走向解体。
确定了败育的关键时期后，对单核花粉期的小孢子进行了超薄切片观察。超薄切片观察的结果进一步确定了花粉外壁合成缺陷的是S45A败育的原因(图9)，因此，BnCYP704B1基因的功能可能与油菜花粉外壁合成相关，这一结论与拟南芥CYP704B1基因的注释吻合。
实施例7：利用油菜细胞核雄性不育基因BnCYP704B1繁殖100％不育群体
将能够在田间应用的化学诱导表达的启动子GVE/VGE(Tavva，Development of amethoxyfenozide-responsive gene switch for applications in plants.Plant J，2006，45(3)：457-469)与致死基因(Bax基因)(Kawai-Yamada，Mammalian Bax-induced plant cell death can be down-regulated by overexpressionof Arabidopsis Bax Inhibitor-1(AtBI-1)，PNAS，2001，98：12295-12300)连接，形成诱导表达的嵌合基因，再将隐性核不育育性恢复基因与该嵌合基因连接到表达载体pCAMB1301上转化核不育材料S45A，从而获得基因工程可育株。然后将该可育材料与核不育材料S45A杂交，后代呈现1∶1的分离。苗期，通过喷施化学诱导剂甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)杀死可育株，从而创造细胞核不育100％的不育群体(具体操作步骤见图11的流程)。
该方法通过转基因技术创造了细胞核雄性不育杂种优势利用的新途径，在转基因安全的问题上，根据本设计，可以看出在杂交种籽中不含有转基因植物，因为所有携带转基因的可育株在制种的苗期被杀死。即使少数没有被杀死的单株，在开花期的除杂过程中，也会被去掉，因此，在杂交种推广的过程中，实际上不含，或极少可能性存在转基因植物。
在本发明所提及的所有文献都在本申请中引用作为参考文献，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明所讲述内容后，本领域的技术人员可以对本发明做各种改动或者修改，这些等价形式同样属于本申请所附的权利要求书所限定的范围。
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<211>2392
<212>DNA
<213>油菜(Brassica napus)
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<221>gene
<222>(1)..(2392)
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<221>CDS
<222>(2213)..(2389)
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<220>
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<223>
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<223>
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<223>
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<223>
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<223>
<400>1
atg tct atg tgg atc gtt cta gct tgc atg ctc aca tca tgg atc ttc 48
Met Ser Met Trp Ile Val Leu Ala Cys Met Leu Thr Ser Trp Ile Phe
1 5 10 15
ttg cac cga tgg gga cag agg aac aag aga ggt ccc aag aca tgg cct 96
Leu His Arg Trp Gly Gln Arg Asn Lys Arg Gly Pro Lys Thr Trp Pro
20 25 30
ttg gtc gga gca gcc att gag cag ttg act aac ttt gac cga atg cac 144
Leu Val Gly Ala Ala Ile Glu Gln Leu Thr Asn Phe Asp Arg Met His
35 40 45
gac tgg ctc gtt gag tat ctt tac gac tca aga acc gta gtg gtt cct 192
Asp Trp Leu Val Glu Tyr Leu Tyr Asp Ser Arg Thr Val Val Val Pro
50 55 60
atg ccc ttc acc act tat aca tac ata gca gat ccc atc aat gta gaa 240
Met Pro Phe Thr Thr Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Ile Asn Val Glu
65 70 75 80
cac gtc ctc aaa acc aac ttc tcc aac tac cca aag gtgagaaaca 286
His Val Leu Lys Thr Asn Phe Ser Asn Tyr Pro Lys
85 90
aactctttta ctaatgtgta agtgttattg tcattttcat ttatgttttt tttttgtgtg 346
aaataag gga gag acg tac cac tcc tat atg gaa gtt ttg ttg gga gat 395
Gly Glu Thr Tyr His Ser Tyr Met Glu Val Leu Leu Gly Asp
95 100 105
ggg atc ttc aat tca gat gga gag ctc tgg agg aaa cag agg aaa acc 443
Gly Ile Phe Asn Ser Asp Gly Glu Leu Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr
110 115 120
gcg agt ttc gag ttt gct tcc aag aat ctc aga gac ttc agt act gta 491
Ala Ser Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Thr Val
125 130 135
gtg ttt aaa gag tat agc ctc aag ctc ttc tcc atc ctt tgt caa gct 539
Val Phe Lys Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Phe Ser Ile Leu Cys Gln Ala
140 145 150
tct ttc aaa gac caa caa gta gac atg cag gtacaatcca cccattatat 589
Ser Phe Lys Asp Gln Gln Val Asp Met Gln
155 160
tcaagatcat atctaaagca tgtccatcgg tgagatgagc accagtttct aaacttaaaa 649
aaaaaaatat ggcaaaagag aaagagagat tgccagagag tatccctgca tacaaatttt 709
aggaaccaca ttagaaacta ccttgccaaa tgtcattata ttattagcta aatttctgtt 769
attattaaaa atttaattca ataatctaat taaataaaaa atattcttat tatgactttt 829
agatacctat ttaagtttct ataccgttga ggaatttatg ggtcataaac atttttaggt 889
taatcttaat aagaaaatat ttcaacaatt tggaggtcac tcgtcacttg tataataatt 949
ctacaaaatt tagaagtcaa gacgaatgtt tcatgtggtt gtgtccagaa ccagtcctag 1009
tcatatctat gaacatgtcg tatgttctct tcttttaaat ccttttcttg atatttttgg 1069
ctgcag gaa ctg ttg atg aga atg act cta gac tcc ata tgt aaa gtg 1117
Glu Leu Leu Met Arg Met Thr Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val
165 170 175
gga ttt ggt gtg gag ata gga aca ttg gct cca gat cta cca gag aat 1165
Gly Phe Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu Ala Pro Asp Leu Pro Glu Asn
180 185 190
cgc ttt gct aag gct ttc gat acc gca aat ata atc gta aca ctt cgt 1213
Arg Phe Ala Lys Ala Phe Asp Thr Ala Asn Ile Ile Val Thr Leu Arg
195 200 205 210
ttc ata gac cct ctt tgg aag atg aaa aag tac ctt aac ata gga tct 1261
Phe Ile Asp Pro Leu Trp Lys Met Lys Lys Tyr Leu Asn Ile Gly Ser
215 220 225
gag gca tta ctt ggc aag agc ata aaa gta gtc gat gat ttc aca tat 1309
Glu Ala Leu Leu Gly Lys Ser Ile Lys Val Val Asp Asp Phe Thr Tyr
230 235 240
tca atg ata aga aga agg aaa aca gag ata tta gag gca caa aaa tct 1357
Ser Met Ile Arg Arg Arg Lys Thr Glu Ile Leu Glu Ala Gln Lys Ser
245 250 255
cct tcc aac aac att aag gtaaaaaaat aatgttagaa ctcaaatgta 1405
Pro Ser Asn Asn Ile Lys
260
tatgcatgca cttgtcacgt agtaacattt ttttctcaaa atgtactag atg aag cat 1463
Met Lys His
265
gat ata ctc tcg agg ttt att gag atc agc gac gat cct gat agc aaa 1511
Asp Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Ile Ser Asp Asp Pro Asp Ser Lys
270 275 280
tca act gag aaa agc cta aga gat ata gtc ctc aac ttt gtt att gct 1559
Ser Thr Glu Lys Ser Leu Arg Asp Ile Val Leu Asn Phe Val Ile Ala
285 290 295
gga aga gat aca aca gca aca act ctc act tgg gct ata tat atg ata 1607
Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Thr Trp Ala Ile Tyr Met Ile
300 305 310 315
atg atg aat gaa cat gtg gcc gag aag ctt tgc tca gag cta caa gaa 1655
Met Met Asn Glu His Val Ala Glu Lys Leu Cys Ser Glu Leu Gln Glu
320 325 330
ctc gaa aga gaa aag gcc gaa gag aca aac aca ccg ttg cgt caa tac 1703
Leu Glu Arg Glu Lys Ala Glu Glu Thr Asn Thr Pro Leu Arg Gln Tyr
335 340 345
gat aca gag gac ttc aag tcc ttc aac gag agg gta aca cag ttt gca 1751
Asp Thr Glu Asp Phe Lys Ser Phe Asn Glu Arg Val Thr Gln Phe Ala
350 355 360
gga atg ttg agt tat gat tct tta gga aaa tta cat tac tta cat gct 1799
Gly Met Leu Ser Tyr Asp Ser Leu Gly Lys Leu His Tyr Leu His Ala
365 370 375
gtg gta aca gaa aca ctt cgt ctc tac cca gca gtt cct cag 1841
Val Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln
380 385 390
gtatatatca caccattaat ccataaaaaa attgggaaac aagtgggact tacaacttaa 1901
atattttaaa acattgtag gat cca aaa gga gtg tta gaa gat gat ata ttg 1953
Asp Pro Lys Gly Val Leu Glu Asp Asp Ile Leu
395 400
cct aat gga aca aaa gta aaa gca gga ggt atg gta aca tat gtt cct 2001
Pro Asn Gly Thr Lys Val Lys Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro
405 410 415 420
tac tca atg ggt cgt atg gaa tac aac tgg gga tca gat gca gcc acg 2049
Tyr Ser Met Gly Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Ser Asp Ala Ala Thr
425 430 435
ttt aaa ccc gag aga tgg ctt aaa gat ggg atg ttt cag aac gct tcc 2097
Phe Lys Pro Glu Arg Trp Leu Lys Asp Gly Met Phe Gln Asn Ala Ser
440 445 450
cca ttc aag ttc aca gca ttt cag gtataagcta acaaacacat actaattttt 2151
Pro Phe Lys Phe Thr Ala Phe Gln
455 460
tatatggatt atgaaaaatg tcaacattaa gaaatgtgag tttgtgtgag tgatcatgca 2211
g gct gga cct agg ata tgc ttg gga aag gat tca gct tat cta caa atg 2260
Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met
465 470 475
aag atg gcg atg gca att ctt tgc aga ttt tat aag ttc cat ttg gta 2308
Lys Met Ala Met Ala Ile Leu Cys Arg Phe Tyr Lys Phe His Leu Val
480 485 490
cca aat cat cct gtc aag tac cgg atg atg aca att cta tct atg gcg 2356
Pro Asn His Pro Val Lys Tyr Arg Met Met Thr Ile Leu Ser Met Ala
495 500 505
cat ggt ttg aaa gtt act gta tcc aga cgt tca tag 2392
His Gly Leu Lys Val Thr Val Ser Arg Arg Ser
510 515
<210>2
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<212>PRT
<213>油菜(Brassica napus)
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Met Ser Met Trp Ile Val Leu Ala Cys Met Leu Thr Ser Trp Ile Phe
1 5 10 15
Leu His Arg Trp Gly Gln Arg Asn Lys Arg Gly Pro Lys Thr Trp Pro
20 25 30
Leu Val Gly Ala Ala Ile Glu Gln Leu Thr Asn Phe Asp Arg Met His
35 40 45
Asp Trp Leu Val Glu Tyr Leu Tyr Asp Ser Arg Thr Val Val Val Pro
50 55 60
Met Pro Phe Thr Thr Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Ile Asn Val Glu
65 70 75 80
His Val Leu Lys Thr Asn Phe Ser Asn Tyr Pro Lys
85 90
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<212>PRT
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Gly Glu Thr Tyr His Ser Tyr Met Glu Val Leu Leu Gly Asp Gly Ile
1 5 10 15
Phe Asn Ser Asp Gly Glu Leu Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala Ser
20 25 30
Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Thr Val Val Phe
35 40 45
Lys Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Phe Ser Ile Leu Cys Gln Ala Ser Phe
50 55 60
Lys Asp Gln Gln Val Asp Met Gln
65 70
<210>4
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Glu Leu Leu Met Arg Met Thr Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val Gly Phe
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Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu Ala Pro Asp Leu Pro Glu Asn Arg Phe
20 25 30
Ala Lys Ala Phe Asp Thr Ala Asn Ile Ile Val Thr Leu Arg Phe Ile
35 40 45
Asp Pro Leu Trp Lys Met Lys Lys Tyr Leu Asn Ile Gly Ser Glu Ala
50 55 60
Leu Leu Gly Lys Ser Ile Lys Val Val Asp Asp Phe Thr Tyr Ser Met
65 70 75 80
Ile Arg Arg Arg Lys Thr Glu Ile Leu Glu Ala Gln Lys Ser Pro Ser
85 90 95
Asn Asn Ile Lys
100
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Met Lys His Asp Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Ile Ser Asp Asp Pro
1 5 10 15
Asp Ser Lys Ser Thr Glu Lys Ser Leu Arg Asp Ile Val Leu Asn Phe
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Val Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Thr Trp Ala Ile
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Leu His Ala Val Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro
115 120 125
Gln
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sp Pro Lys Gly Val Leu Glu Asp Asp Ile Leu Pro Asn Gly Thr Lys
1 5 10 15
Val Lys Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg
20 25 30
Met Glu Tyr Asn Trp Gly Ser Asp Ala Ala Thr Phe Lys Pro Glu Arg
35 40 45
Trp Leu Lys Asp Gly Met Phe Gln Asn Ala Ser Pro Phe Lys Phe Thr
50 55 60
Ala Phe Gln
65
<210>7
<211>59
<212>PRT
<213>油菜(Brassica napus)
<400>7
Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met
1 5 10 15
Lys Met Ala Met Ala Ile Leu Cys Arg Phe Tyr Lys Phe His Leu Val
20 25 30
Pro Asn His Pro Val Lys Tyr Arg Met Met Thr Ile Leu Ser Met Ala
35 40 45
His Gly Leu Lys Val Thr Val Ser Arg Arg Ser
50 55
<210>8
<211>2400
<212>DNA
<213>油菜(Brassica napus)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(2400)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(2221)..(2397)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(2130)..(2220)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1929)..(2129)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(1850)..(1928)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1463)..(1849)
<223>
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<221>Intron
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<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1084)..(1383)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(570)..(1083)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(354)..(569)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(277)..(353)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(276)
<223>
<400>8
atg tct atg tgg atc gtt cta gct tgc atg ctc aca tca tgg atc ttc 48
Met Ser Met Trp Ile Val Leu Ala Cys Met Leu Thr Ser Trp Ile Phe
1 5 10 15
ttg cac cga tgg gga cag agg aac aag aga ggt ccc aag aca tgg cct 96
Leu His Arg Trp Gly Gln Arg Asn Lys Arg Gly Pro Lys Thr Trp Pro
20 25 30
ttg gtc gga gca gcc att gag cag ttg act aac ttt gac cga atg cac 144
Leu Val Gly Ala Ala Ile Glu Gln Leu Thr Asn Phe Asp Arg Met His
35 40 45
gac tgg ctc gtt gag tat ctt tac gac tcg aga acc gta gtg gtt ccc 192
Asp Trp Leu Val Glu Tyr Leu Tyr Asp Ser Arg Thr Val Val Val Pro
50 55 60
atg ccc ttc acc act tac aca tac ata gca gat cct atc aat gtc gaa 240
Met Pro Phe Thr Thr Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Ile Asn Val Glu
65 70 75 80
cac gtc ctc aaa acc aac ttc tcc aac tac cca aag gtgagaaaca 286
His Val Leu Lys Thr Asn Phe Ser Asn Tyr Pro Lys
85 90
aactctttta ctaatgtgta agtgttattg tcattttcat ttatgtt ttt tttttgtgtg 346
aaataag gga gag acg tac cac tcc tat atg gaa gtt ttg ttg gga gat 395
Gly Glu Thr Tyr His Ser Tyr Met Glu Val Leu Leu Gly Asp
95 100 105
ggg atc ttc aat tca gat gga gag ctc tgg agg aaa cag agg aaa acc 443
Gly Ile Phe Asn Ser Asp Gly Glu Leu Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr
110 115 120
gcg agt ttc gag ttt gct tcc aag aat ctc aga gac ttc agt act gta 491
Ala Ser Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Thr Val
125 130 135
gtg ttt aaa gag tat agc ctc aag ctc ttc tcc atc ctt tgt caa gct 539
Val Phe Lys Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Phe Ser Ile Leu Cys Gln Ala
140 145 150
tct ttc aaa gac caa caa gta gac atg cag gtacaatcca cccattatat 589
Ser Phe Lys Asp Gln Gln Val Asp Met Gln
155 160
tcaagatcat atctaaagca tgtccatcgg tgagatgagc accagtttct aaacttaaaa 649
aaaaaaaata tggcaaaaga gaaagagaga ttgccagaga gtatccctgc atacaaattt 709
taggaaccac attagaaact accttgccaa atgtcattat attactagct aaatttctgt 769
tattattaaa aatttaattc aataatctaa ttaaataaaa aatattctta ttatgacttt 829
tagataccta tttaagtttc tataccgttg aggaatttat gggtcataaa catttttagg 889
ttaatcttaa taagaaaata tttcaacaat ttggaggtca ctcgtcactc gtcacttgta 949
taataattct acaaaattta gaagtcaaga cgaatgtttc atgtggttgt gtccagaacc 1009
agtcctagtc atatctatga acatgtcgta tgttctcttc ttttaaatcc ttttcttgat 1069
atttttggct gcag gaa ctg ttg atg aga atg act cta gac tcc ata tgt 1119
Glu Leu Leu Met Arg Met Thr Leu Asp Ser Ile Cys
165 170 175
aaa gtg aga ttt ggt gtg gag ata gga aca ttg gct cca gat cta cca 1167
Lys Val Arg Phe Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu Ala Pro Asp Leu Pro
180 185 190
gag aat cgc ttt gct aag gct ttc gat acc gca aat ata atc gta aca 1215
Glu Asn Arg Phe Ala Lys Ala Phe Asp Thr Ala Asn Ile Ile Val Thr
195 200 205
ctt cgt ttc ata gac cct ctt tgg aag atg aaa aag tac ctt aac ata 1263
Leu Arg Phe Ile Asp Pro Leu Trp Lys Met Lys Lys Tyr Leu Asn Ile
210 215 220
gga tct gag gca tta ctt ggc aag agc ata aaa gta gtc gat gat ttc 1311
Gly Ser Glu Ala Leu Leu Gly Lys Ser Ile Lys Val Val Asp Asp Phe
225 230 235 240
aca tat tca atg ata aga aga agg aaa aca gag ata tta gag gca cag 1359
Thr Tyr Ser Met Ile Arg Arg Arg Lys Thr Glu Ile Leu Glu Ala Gln
245 250 255
aaa tct cct tcc aac aac att aag gtaaaaaaat aatgttagaa ctcaaatgta 1413
Lys Ser Pro Ser Asn Asn Ile Lys
260
tatgcatgca cttgtcacgt agtaacattt ttttctcaaa atgtactag atg aag cat 1471
Met Lys His
265
gat ata ctc tcg agg ttt att gag atc agc gac gat cct gat agc aaa 1519
Asp Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Ile Ser Asp Asp Pro Asp Ser Lys
270 275 280
tca act gag aaa agc cta aga gat ata gtc ctc aac ttt gct att gct 1567
Ser Thr Glu Lys Ser Leu Arg Asp Ile Val Leu Asn Phe Ala Ile Ala
285 290 295
gga aga gat aca aca gca aca act ctc act tgg gct ata tat atg ata 1615
Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Thr Trp Ala Ile Tyr Met Ile
300 305 310 315
atg atg aat gaa cat gtg gcc gag aag ctt tgc tca gag cta caa gaa 1663
Met Met Asn Glu His Val Ala Glu Lys Leu Cys Ser Glu Leu Gln Glu
320 325 330
ctc gaa aga gaa aag gcc gaa gag aca aac aca ccg ttg cgt caa tac 1711
Leu Glu Arg Glu Lys Ala Glu Glu Thr Asn Thr Pro Leu Arg Gln Tyr
335 340 345
gat aca gag gac ttc aag tcc ttc aac gag agg gta aca cag ttt gca 1759
Asp Thr Glu Asp Phe Lys Ser Phe Asn Glu Arg Val Thr Gln Phe Ala
350 355 360
gga atg ttg agt tat gat tct tta gga aaa tta cat tac tta cat gct 1807
Gly Met Leu Ser Tyr Asp Ser Leu Gly Lys Leu His Tyr Leu His Ala
365 370 375
gtg gta aca gaa aca ctt cgt ctc tac cca gca gtt cct cag 1849
Val Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln
380 385 390
gtatatatca caccattaat ccataaaaaa attgggaaac aagtgggact tacaacttaa 1909
atattttaaa acattgtag gat cca aaa gga gtg tta gaa gat gat ata ttg 1961
Asp Pro Lys Gly Val Leu Glu Asp Asp Ile Leu
395 400
cct aat gga aca aaa gta aaa gca gga ggt atg gta aca tat gtt cct 2009
Pro Asn Gly Thr Lys Val Lys Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro
405 410 415 420
tac tca atg ggt cgt atg gaa tac aac tgg gga tca gat gca gcc acg 2057
Tyr Ser Met Gly Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Ser Asp Ala Ala Thr
425 430 435
ttt aaa ccc gag aga tgg ctt aaa gat ggg atg ttt cag aac gct tcc 2105
Phe Lys Pro Glu Arg Trp Leu Lys Asp Gly Met Phe Gln Asn Ala Ser
440 445 450
cca ttc aag ttc aca gca ttt cag gtataagcta acaaacacat actaattttt 2159
Pro Phe Lys Phe Thr Ala Phe Gln
455 460
tatatggatt atgaaaaatg tcaacatgaa gaaatgtgag tttgtgtgag tgatcatgca 2219
g gct gga cct agg ata tgc ttg gga aag gat tca gct tat cta caa atg 2268
Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met
465 470 475
aag atg gcg atg gca att ctt tgc aga ttt tat aag ttc cat ttg gta 2316
Lys Met Ala Met Ala Ile Leu Cys Arg Phe Tyr Lys Phe His Leu Val
480 485 490
cca aat cat cct gtc aag tac cgg atg atg aca att cta tct atg gcg 2364
Pro Asn His Pro Val Lys Tyr Arg Met Met Thr Ile Leu Ser Met Ala
495 500 505
cat ggt ttg aaa gtt act gta tcc aga cgt tca tag 2400
His Gly Leu Lys Val Thr Val Ser Arg Arg Ser
510 515
<210>9
<211>92
<212>PRT
<213>油菜(Brassica napus)
<400>9
Met Ser Met Trp Ile Val Leu Ala Cys Met Leu Thr Ser Trp Ile Phe
1 5 10 15
Leu His Arg Trp Gly Gln Arg Asn Lys Arg Gly Pro Lys Thr Trp Pro
20 25 30
Leu Val Gly Ala Ala Ile Glu Gln Leu Thr Asn Phe Asp Arg Met His
35 40 45
Asp Trp Leu Val Glu Tyr Leu Tyr Asp Ser Arg Thr Val Val Val Pro
50 55 60
Met Pro Phe Thr Thr Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Ile Asn Val Glu
65 70 75 80
His Val Leu Lys Thr Asn Phe Ser Asn Tyr Pro Lys
85 90
<210>10
<211>72
<212>PRT
<213>油菜(Brassica napus)
<400>10
Gly Glu Thr Tyr His Ser Tyr Met Glu Val Leu Leu Gly Asp Gly Ile
1 5 10 15
Phe Asn Ser Asp Gly Glu Leu Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala Ser
20 25 30
Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Thr Val Val Phe
35 40 45
Lys Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Phe Ser Ile Leu Cys Gln Ala Ser Phe
50 55 60
Lys Asp Gln Gln Val Asp Met Gln
65 70
<210>11
<211>100
<212>PRT
<213>油菜(Brassica napus)
<400>11
Glu Leu Leu Met Arg Met Thr Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val Arg Phe
1 5 10 15
Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu Ala Pro Asp Leu Pro Glu Asn Arg Phe
20 25 30
Ala Lys Ala Phe Asp Thr Ala Asn Ile Ile Val Thr Leu Arg Phe Ile
35 40 45
Asp Pro Leu Trp Lys Met Lys Lys Tyr Leu Asn Ile Gly Ser Glu Ala
50 55 60
Leu Leu Gly Lys Ser Ile Lys Val Val Asp Asp Phe Thr Tyr Ser Met
65 70 75 80
Ile Arg Arg Arg Lys Thr Glu Ile Leu Glu Ala Gln Lys Ser Pro Ser
85 90 95
Asn Asn Ile Lys
100
<210>12
<211>129
<212>PRT
<213>油菜(Brassica napus)
<400>12
Met Lys His Asp Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Ile Ser Asp Asp Pro
1 5 10 15
Asp Ser Lys Ser Thr Glu Lys Ser Leu Arg Asp Ile Val Leu Asn Phe
20 25 30
Ala Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Thr Trp Ala Ile
35 40 45
Tyr Met Ile Met Met Asn Glu His Val Ala Glu Lys Leu Cys Ser Glu
50 55 60
Leu Gln Glu Leu Glu Arg Glu Lys Ala Glu Glu Thr Asn Thr Pro Leu
65 70 75 80
Arg Gln Tyr Asp Thr Glu Asp Phe Lys Ser Phe Asn Glu Arg Val Thr
85 90 95
Gln Phe Ala Gly Met Leu Ser Tyr Asp Ser Leu Gly Lys Leu His Tyr
100 105 110
Leu His Ala Val Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro
115 120 125
Gln
<210>13
<211>67
<212>PRT
<213>油菜(Brassica napus)
<400>13
Asp Pro Lys Gly Val Leu Glu Asp Asp Ile Leu Pro Asn Gly Thr Lys
1 5 10 15
Val Lys Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg
20 25 30
Met Glu Tyr Asn Trp Gly Ser Asp Ala Ala Thr Phe Lys Pro Glu Arg
35 40 45
Trp Leu Lys Asp Gly Met Phe Gln Asn Ala Ser Pro Phe Lys Phe Thr
50 55 60
Ala Phe Gln
65
<210>14
<211>59
<212>PRT
<213>油菜(Brassica napus)
<400>14
Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met
1 5 10 15
Lys Met Ala Met Ala Ile Leu Cys Arg Phe Tyr Lys Phe His Leu Val
20 25 30
Pro Asn His Pro Val Lys Tyr Arg Met Met Thr Ile Leu Ser Met Ala
35 40 45
His Gly Leu Lys Val Thr Val Ser Arg Arg Ser
50 55
Claims (2)
1、一种恢复甘蓝型油菜隐性核不育育性的基因BnCYP704B1在繁殖甘蓝型油菜核不育系中的应用，其特征在于，该恢复甘蓝型油菜隐性核不育育性的基因BnCYP704B1是下列核苷酸序列之一：
1)序列表SEQ NO：1中所示的DNA序列；或
2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
2、权利要求1所述的基因在繁殖甘蓝型油菜核不育系中的应用。
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