CN101525610B

CN101525610B - 蚯蚓纤连蛋白酶在乙型肝炎治疗中的应用

Info

Publication number: CN101525610B
Application number: CN2008101013569A
Authority: CN
Inventors: 赫荣乔; 王学清; 陈岚; 潘荣; 肖蓉
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2008-03-05
Filing date: 2008-03-05
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2028-03-05
Also published as: CN101525610A

Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明提供了蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连接蛋白的降解作用；本发明还提供了所述蚯蚓纤连蛋白酶用于治疗乙型肝炎的应用，尤其是对慢性乙型肝炎，乙型肝炎引起的肝硬化的预防和治疗作用；本发明还提供了一种药物，所述药物包含所述蚯蚓纤连蛋白酶作为活性成分。

Description

蚯蚓纤连蛋白酶在乙型肝炎治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物技术的领域，具体地说，本发明提供蚯蚓纤连蛋白酶降解纤维连接蛋白的应用，以及在乙型肝炎治疗中的应用。

背景技术

乙型肝炎，简称乙肝，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病。通过血液与体液传播，具有慢性携带状态。本病在我国广泛流行。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿。是当前危害人民健康最严重的传染病。多见于儿童及青壮年。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病人可转变为原发性肝癌，这些疾病对病人以及社会的危害更加严重。

发病过程：一般来说，肝细胞受乙肝病毒入侵后，乙肝病毒本身并不直接引起肝细胞的病变。乙肝病毒只是利用肝细胞摄取的养料赖以生存并在肝细胞内进行复制。病毒复制的表面抗原、e抗原和核心抗原都释放在肝细胞膜上，激发人体的免疫系统来辨认，并发生反应。这种在肝细胞膜上发生的抗原抗体反应可造成肝细胞的损伤和破坏，从而产生一系列临床症状。

治疗手段：我国多数患者是在围生期或年幼时感染HBV造成免疫耐受，往往形成慢性感染，这些患者需要积极而有效的治疗，否则可能发展为肝硬化甚至肝癌，导致死亡。然而迄今尚无一种可靠的治疗方法能清除或永久抑制HBV的复制，从而终止肝脏的炎症和坏死。慢性乙型肝炎目前的治疗目标是：①抑制HBV复制(HBsAg、HBeAg消失)；②非扩增法检测不出HBV DNA水平；③病情改善，ALT复常；④肝组织学改善；⑤减少肝脏失代偿、肝硬化、肝细胞肝癌的发生率。目前用于治疗乙肝的药物主要包括干扰素、核苷酸类似物等抗病毒药物和胸腺肽等免疫调节药物。

1.传统干扰素与聚乙二醇干扰素：干扰素目前仍是治疗乙型肝炎的一线药物，它具有明确的疗程，疗效好，可使HBsAg消失和抗HBs产生，无耐药性等优点，但是由于同时存在副作用较多、不能使用于失代偿性肝硬化患者、注射治疗麻烦及代价昂贵等缺点而限制了其使用。在美国，很多的医生倾向于选择核苷(酸)类似物治疗慢性乙肝。

2.拉米夫定：短期用拉米夫定对HBV DNA的抑制作用、HBeAg转阴率、HBeAg血清转换率及血清ALT复常率均优于干扰素，而且服用方便，可以用于失代偿性肝硬化及肝移植前后患者，但是其持续应答率不及干扰素，而且存在一个较突出的耐药性问题，且随着服用时间的延长，耐药性也会逐渐增加。

3.阿德福韦酯：是一新型核昔(酸)类似物，口服阿德福韦酯是阿德福韦的前体，能有效抑制乙肝病毒复制、改善组织学、延缓疾病进展成肝硬化、肝功能失代偿及肝癌，它的耐药性发生低于拉米夫定，且对拉米夫定耐药者有很好的治疗效果，但是长期服用有一定肾毒性，需定期监测血清肌酐和血磷。

4.恩替卡韦：是环戊酰鸟苷类似物，我国SFDA去年年底刚批准用于慢性乙型肝炎的治疗。

5.其他：其他还在进行II、III期临床试验的药物有恩曲他滨、特必夫定、克拉夫定。

6.免疫调节治疗：免疫调节治疗是治疗慢性乙型肝炎的重要手段之一，目前用于治疗乙型肝炎的免疫调节药物主要是胸腺肽。胸腺肽刺激T细胞，增强非特异性免疫功能，其不良反应小，耐受性好，使用安全，对于有抗病毒治疗指针，但不能耐受或不愿接受干扰素和核苷酸类似物治疗的患者可选用胸腺肽。

随着乙型肝炎发病机理研究的深入，研究工作者发现纤维连接蛋白在乙型肝炎发病过程中发挥着重要作用。纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)是一种存在于血液、体液及各种组织中的具有多种功能的糖蛋白，来源于肝细胞，枯否细胞和内皮细胞，通过与整合素结合调节细胞间的粘附、免疫、凝血和血小板的聚集，另外在肿瘤与纤维化的发展与发病机制中，FN也起着重要的作用。

一、纤维连接蛋白的结构及功能

FN按分布不同可分为两种，一种是分布于血浆的血浆型FN(pFN)，另一种是广泛分布于人体内细胞表面的细胞型FN(cFN)。pFN是一种可溶性的蛋白质，在血液中浓度很高。血液中的可溶性的FN大部分是由肝细胞合成。cFN作为不溶性FN的一部分，可以掺入到细胞周围基质中，肝脏中的FN主要由内皮细胞，贮脂细胞及枯否细胞分泌。FN分子可以结合多种分子发挥其功能，如胶原蛋白、肝素、血纤维蛋白及细胞表面受体，其中与细胞表面受体的结合主要是通过FN分子中的RGD序列。识别RGD序列的一些粘合素分子都可以识别FN中的RGD序列，所以FN可通过RGD与受体相连，从而发挥调节作用。

FN还具有病毒结合活性，与甲型肝炎病毒(HAV)结合后，发生HAV的屏蔽现象，可干预病毒检测的放免法，通过富含FN的血产品有助于肝炎病毒的频繁传播。有学者发现人肝脏中的FN通过与HBV前S2区编码的一特异抗原决定簇结合，从而使病毒在肝窦内循环时被肝细胞所吸收，促进病毒对肝细胞的作用。同时，在肝纤维化及肝细胞癌时，FN在RNA水平发生变化。

二、纤维连接蛋白与慢性肝炎、肝硬化

HCV和HBV感染后常进展为慢性病毒性肝炎。慢性肝病尤其是活动性病变，由于致病因素的持续作用和机体免疫功能失调，以致肝细胞持续受损，纤维组织不断增生而导致肝硬化。Martinez-Hemandez等提出FN在肝脏的纤维化过程中发挥重要的作用，可促使肝细胞分泌胶原，促进成纤维细胞的趋化性，促进成纤维细胞及肝细胞等与胶原基质的粘附作用。存在于成纤维细胞表面的细胞连结素，它与酸性粘多糖及胶原具有很强的亲和性，以FN为核心，结合粘多糖及胶原成为三元复合体，做成细网构造，被视为肝纤维化的基础。与正常人群相比较，慢性活动型肝炎(CAH)患者中FN水平明显增加。

血浆型FN绝大部分由肝细胞合成，炎症造成血浆中FN消耗导致血浆中FN降低，FN减少则反映了肝细胞合成蛋白质功能的减退，故在肝硬化时，血浆FN水平则明显降低，然而在急、慢性肝炎时增加。Odenthal等提出在肝纤维化的急性阶段及接近纤维化阶段，细胞型的FN mRNA表达增加。Jarnagin等用鼠急性肝损伤模型检测到，内皮细胞主要产生EIII-A阳性的FN，相反被激活的贮脂细胞主要分泌EIII-B阳性FN。Shigeru等采用免疫组化及原位杂交法检测到了在肝纤维化区细胞型FN(EIII-APR阳性)沉积，提示细胞型FN在肝纤维化时起关键作用。在纤维化肝脏中，肝细胞与非实质细胞中细胞型FN的mRNA表达增加，而且表达FN的细胞也有所增加，细胞型FN在肝纤维化形成的早期发挥着重要的作用。

三、纤维连接蛋白与肝细胞癌

细胞外基质(ECM)被认为在肿瘤、肿瘤侵袭及转移中发挥重要的作用。不同分化的肝癌其ECM定位不同。FN、FN受体(整合素α5与β1)及其片段mAD2(恶性病变相关DNA连接蛋白2)的研究，提示整合素α5β1和FN与肝癌分化有关，并影响肝癌的侵袭性与转移。

现已证实FN参与慢性肝炎、肝硬化及肝癌的发生发展，主要通过选择性剪切和改变与受体的结合来发挥调节作用。其在分子水平中的调控机制仍不清楚，尚需进一步的研究。

蚯蚓俗称地龙，其种类繁多，资源丰富。蚯蚓作为药物使用，在我国已有1200多年的历史。最原始的方法是利用整个鲜蚯蚓或干蚯蚓；随着发展，后来发现蚯蚓的药用价值与其中含有的多种化学成分有关。目前已经分离到多种不同纯度的蚯蚓成分，其中包括纤溶酶、纤溶酶原激活剂、钙调素和钙调素结合蛋白、胆碱酯酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶SOD、促髓系细胞增殖组分、抗微生物蛋白、收缩血管蛋白、溶血蛋白、免疫球蛋白样粘连物和抗肿瘤蛋白、抗菌肽等，取得了较大的进展。

在蚯蚓体内有一组蛋白，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1.SEQ IDNO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15(这15种氨基酸序列的共性：具有共同的功能域：H⁴³，D⁹¹，S¹⁸⁸(其上编号对应于SEQ ID NO.1氨基酸序列)组成的催化三联体，其中SEQ ID NO.2-SEQID NO.11与SEQ ID NO.1具有85％以上的同源性)。本发明首次发现其在与血清孵育过程中可迅速降解血清组分纤维连接蛋白，因此将其称为蚯蚓纤连蛋白酶。通过进行用所述蚯蚓纤连蛋白酶对HepG 2.2.15细胞水平的作用的研究，发现蚯蚓纤连蛋白酶处理组对HBsAg，HBeAg的分泌具有抑制作用，通过用所述蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作用的研究表明，转基因小鼠血清中ALT，AST上升被抑制，HBsAg分泌受到抑制，并且其可使HBsAg转基因小鼠的肝脏坏死病变减轻。因此，所述蚯蚓纤连蛋白酶可以用于制备预防或治疗与纤维连接蛋白相关的疾病，如乙型肝炎的药物的应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供蚯蚓纤连蛋白酶用于降解纤维连接蛋白的应用。

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。

在另一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，其氨基酸序列具有H⁴³，D⁹¹，S¹⁸⁸(其上编号对应于SEQ ID NO.1氨基酸序列)组成的催化三联体。

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性。

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有85％以上的同源性。

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列。

在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为选自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，或SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列的单一组分使用。

在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用，所述混合物包括SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列中的两种或多种。

在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用，所述混合物主要成分有SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.12，SEQID NO.13，SEQ ID NO.14，以及SEQ ID NO.15，其中SEQ ID NO.1丰度最高。

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的用量为0～10μM。

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的用量为0-2μM。

在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的用量为0-5μg/ml。

本发明的另一个目的是提供所述蚯蚓纤连蛋白酶用于制备药物的应用，所述药物用于预防或治疗与纤维连接蛋白有关的疾病。

在一个实施方案中，所述疾病为乙型肝炎，慢性乙型肝炎，肝硬化，肿瘤等疾病。

在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为选自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列的单一组分使用。

在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用，所述混合物主要成分有SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.12，SEQID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15，其中SEQ ID NO.1丰度最高。

在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的剂量为2000mg/kg大鼠体重。

在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的剂量为50mg/kg小鼠体重。

本发明还提供一种用于治疗与纤维蛋白相关的疾病的药物，所述药物包含上述蚯蚓纤连蛋白酶作为活性成分。所述药物的有效量可以由本领域技术人员根据实际情况确定。

在一个优选实施方案中，所述药物所用剂量为2000mg/kg大鼠体重。

在另一个优选实施方案中，所述药物所用剂量为50mg/kg小鼠体重。

所述药物的所用配制方法，使用方法以及所用的辅料为本领域技术人员所众所周知。

本发明所针对的对象，为哺乳动物，如人，小鼠，大鼠。在一个实施方案中，本发明所述的蚯蚓纤连蛋白酶以及包含其的药物针对人进行施用。

本发明通过蚯蚓纤连蛋白酶与人血清孵育后SDS-PAGE检测血清蛋白的变化，首次发现所述蚯蚓纤连蛋白酶有快速降解纤维连接蛋白的能力。本发明将所述蚯蚓纤连蛋白酶与血清共孵育，经SDS-PAGE发现有几个血清蛋白条带消失或者变淡。经质谱鉴定，得到一快速降解的蛋白为纤维连接蛋白。该蛋白在机体内有相当多的生理功能，其中之一就是与乙型肝炎病变的发展有关。用蚯蚓纤连蛋白酶降解纤维连接蛋白纯品，将降解片段进行N端测序，发现作用位点比较单一，主要集中在赖氨酸和精氨酸两个碱性氨基酸附近，具有典型的胰蛋白酶的特性，具有一定的水解特异性。

本实验还进行了所述蚯蚓纤连蛋白酶对HepG 2.2.15细胞水平的作用的研究。实验结果表明，与空白细胞相比，蚯蚓纤连蛋白酶处理组HBsAg，HBeAg的分泌均受到抑制，细胞培养基中HBsAg，HBeAg含量有所下降。与拉米夫定阳性对照组相比，蚯蚓纤连蛋白酶对HBeAg的分泌有更强的抑制作用。

本实验室还进行了蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作用的研究。结果表明，与生理盐水阴性对照组相比，转基因小鼠血清中ALT，AST上升被抑制，HBsAg分泌受到抑制，这两个指标均优于拉米夫定的治疗效果。生理盐水组及拉米夫定组转基因小鼠的血清FN随生存时间的延长而增加，使用蚯蚓纤连蛋白酶后含量基本维持在恒定的水平。对肝脏的病理学观察结果显示，蚯蚓纤连蛋白酶组对乙型肝炎有治疗作用，与生理盐水组相比，可使HBV转基因小鼠的肝脏坏死病变减轻，疗效与拉米夫定组类似。

因此，本发明在HBV转基因小鼠水平证明蚯蚓纤连蛋白酶对乙型肝炎转基因小鼠的HBsAg分泌有一定的抑制作用，对血清ALT、AST维持正常的水平有有益的帮助。乙型肝炎转基因小鼠病理切片观察发现，蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的肝脏病变有一定的保护作用。

本发明认为蚯蚓纤连蛋白酶在对乙型肝炎治疗中，对慢性乙型肝炎的治疗更有优势。目前临床使用的乙型肝炎治疗药物，包括干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯等主要使HBsAg，HBV DNA恢复到一定的水平。但乙型肝炎治疗的另一个困难是病变引起肝硬化的发生，蚯蚓纤连蛋白酶恰巧具有降解纤维连接蛋白的能力，不仅可以在一定程度上阻断病毒的传播，而且可以降低肝脏的纤维连接蛋白的量，缓解肝硬化的发生。

本发明认为蚯蚓纤连蛋白酶对乙型肝炎、尤其是慢性乙型肝炎预防和治疗作用机理之一是蚯蚓纤连蛋白酶有快速降解纤维连接蛋白的能力。由于纤维连接蛋白在机体内的生理功能很多，与细胞间的粘附、免疫、凝血和血小板的聚集以及老化都有关系，所以预期蚯蚓纤连蛋白酶对凝血、肿瘤等疾病也有一定的作用。

附图说明

图1：蚯蚓纤连蛋白酶与血清共同孵育后SDS-PAGE图

A：血清在37℃孵育不同时间后SDS-PAGE图(M：标准分子量；1：对照(未加蚯蚓纤连蛋白酶的血清)；2：15min；3：30min；4：45min；5：60min；6：90min；7：120min；8：180min)

B：蚯蚓纤连蛋白酶与血清在37℃共同孵育不同时间后SDS-PAGE图(M：标准分子量；1：对照(未加蚯蚓纤连蛋白酶的血清)；2：15min；3：30min；4：45min；5：60min；6：90min；7：120min；8：180min)

图2：MALDI-TOF MS法鉴定被蚯蚓纤连蛋白酶迅速降解的条带

图3：蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连接蛋白作用位点图

图4：大鼠口服蚯蚓纤连蛋白酶后血清中纤维连接蛋白相对含量的变化(Mean±SD，n＝6)。

图5：蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作用

5-1：ALT的变化

5-2：AST的变化

5-3：HBsAg的变化

5-4：血清中纤维连接蛋白FN相对含量的变化

5-5：转基因小鼠肝脏病理观察结果

A：生理盐水组(10倍)

B：蚯蚓纤连蛋白酶处理组(10倍)

C：拉米夫定组(10倍)

图6蚯蚓纤连蛋白酶对HepG 2.2.15细胞水平的作用

6-1：蚯蚓纤连蛋白酶对HBsAg和HBeAg分泌的影响

6-2：拉米夫定对HBsAg和HBeAg分泌的影响

以下本文将通过具体的实施例来描述本发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的参考书：如蛋白质技术手册(汪家政、范明主编，科学出版社)、抗体技术实验指南(沈关心、龚非力等译，科学出版社)、药理实验方法学(第三版，主编：徐淑云，人民卫生出版社)、分子生物学实验指导(刘进元，清华大学出版社)、分子克隆实验指南(第三版，黄培堂等译，科学出版社)等以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。

实施例：

实施例1蚯蚓纤连蛋白酶与血清共孵育试验

实验方法与结果

1.取新鲜人血清，稀释2倍，加入一定浓度的蚯蚓纤连蛋白酶(0～10μM)(SEQ ID NO.1)于37℃孵育，分别于15，30，45，60，90，120和180min取样，同时以空白血清(在37℃孵育15，30，45，60，90，120和180min)作为对照。

2.将上述血清酶解产物及空白血清孵育样品用去离子水稀释10倍，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10分钟，进行8％SDS-PAGE，最后以考马斯亮蓝染色。

3.SDS-PAGE图见图1。结果显示空白血清在37℃孵育不同时间蛋白质条带无明显变化(见图1A)。血清与蚯蚓纤连蛋白酶的孵育产物中有一些蛋白条带迅速降解(见图1B)。

实施例2典型蛋白条带的鉴定

实验方法与结果

仪器：日本岛津/KRATOS激光离子化质谱仪AX1MA-CFRTMPlus型，质量数范围1～500,000Da，质量数精度＜5ppm，分辨率20,000，灵敏度10fmol。

步骤：

1.将所选择的胶带‘a’用切胶笔切下，置于eppendorf(EP)管中，并记录点号及相应的位置；

2.加50μL DDH₂O洗两次，10min/次；

3.加50mM NH₄HCO₃/乙腈＝1∶1溶液50μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；

4.重复步骤3，直至蓝色褪去；

5.加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min；

6.加10mM二硫苏糖醇(DTT)(10μL 1M DTT，990μL 25mM NH₄HCO₃配制)20μL，56℃水浴1hr；

7.冷却到室温后，吸干，快速加55mM碘代乙酰胺(IAM)(55μL 1MIAM，945μL 25mM NH₄HCO₃配制)20μL，置于暗室45min；

8.依次用25mM NH₄HCO₃、50％乙腈溶液和100％乙腈洗，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干5min；

9.将0.1μg/μL的胰蛋白酶储液以25mM NH₄HCO₃稀释10倍，每EP管加2μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH₄HCO₃ 10-15μL置37℃，消化过夜；

10.加入2％三氟醋酸(TFA)终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，10000rpm离心。

11.消化产物上清液进行质谱分析(参考蛋白质化学与蛋白质组学一书。夏其昌、曾嵘等，科学出版社)，获得酶解肽段的分子质量。

12.将不同肽段的分子质量结果与NCBI数据库进行比对(MASCOTsearch program)。确定鉴定的蛋白质。

结果：鉴定结果表明，蛋白条带‘a’为纤维连接蛋白(见图2，在鉴定肽段中，有21个肽段与纤维连接蛋白的酶解肽段比对成功，可能性分数为92，结果可靠。)

实施例3蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连接蛋白水解位置的确定

实验方法与结果

1.将10μl纤维连接蛋白(Sigma-aldrich，USA，1mg/ml)与2μl蚯蚓纤连蛋白酶(SEQ ID NO.1)(0～2μM)在37℃孵育不同时间，将酶解产物进行8％SDS-PAGE并转至PVDF膜(Millipore，USA)。

2.将膜进行考马斯亮蓝染色，将酶解产生的主要条带进行N端测序(仪器为Applied Biosystem Automated Protein Sequencer，Applied BiosystemInc.，USA)，确定水解位点。

3.蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连结蛋白的作用位点见图3。结果显示蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连结蛋白的作用位点比较单一，主要集中在赖氨酸和精氨酸两个碱性氨基酸附近，具有典型的胰蛋白酶的特性。

实施例4大鼠口服蚯蚓纤连蛋白酶后血清中纤维连接蛋白浓度的变化

实验方法与结果

1.选择健康雄性SD大鼠6只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)(200～250g)，禁食12小时，自由饮水。

2.服药前取空白血0.5ml。灌胃服用蚯蚓纤连蛋白酶(粗酶，硫酸铵沉淀法获得，参考文献：Zhou J，Wu C，He RQ，(1998)J.Biochem.Mol.Bio.&Biophys.5，17-18，主要成分有SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15，其中SEQ IDNO.1丰度最高)(每kg大鼠体重灌胃服用2000mg蚯蚓纤连蛋白酶)，定时取血(0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，26h)，经眼眶静脉丛收集全血，分离血清，于-20℃保存备用。

3.ELISA法测定上述血清中纤维连结蛋白的浓度：

(1)将血清(步骤2制得)稀释50倍，在96孔酶标板(Corningincorporated Costar

，USA)中每孔加入样品50μl，37℃孵育2小时，PBST(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/LKH₂PO4，0.02％Tween 20，pH7.4)洗涤。

(2)加入100μl 5％马血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)37℃封闭2小时，PBST洗涤。

(3)加入50μl纤维连结蛋白抗体(Sigma，USA)，37℃孵育2h，PBST洗涤。

(4)加入100μl辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育1h，PBST洗涤。

(5)加入100μl显色剂暗处显色10分钟。加入50μl 2M的硫酸终止反应。显色剂的配制方法为：

四甲基联苯胺(TMB)溶液(6mg TMB溶于1ml N，N-二甲基甲酰胺)100μl，30％双氧水15μl，0.1mol/L PB(1.0M NaH₂PO₄ 87.7ml，1.0MNa₂HPO₄ 12.3ml，稀释至1000ml，pH6.0)10ml。酶标仪450nm测定OD值。用OD值的变化表征纤维连结蛋白浓度的变化(以用药前纤维连结蛋白的OD₀值为100％，用药后某一时刻t纤维连结蛋白的相对浓度

F N_{t} = \frac{O D_{t}}{O D_{0}} \times 100 %,

OD_t为不同时间点测得的血清中纤维连结蛋白的OD值。

4.大鼠灌胃服用蚯蚓纤连蛋白酶后血清中纤维连接蛋白浓度的变化见图4。结果显示纤维连接蛋白浓度首先随着时间的延长而降低，约4小时达到最低点，然后随时间的延长有所恢复。

实施例5蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作用

实验方法与结果

1.实验动物：C57BL/6J-HBV转基因小鼠(购自北京大学医学部实验动物部)。转入的基因片段是编码包膜蛋白HBsAg的S基因，preS基因以及编码X抗原的X基因(参考文献：董宇红、席宏丽、田枫、康爱君，苦参素对HBsAg转基因小鼠血清Th1和Th2细胞因子水平的影响中华实验和临床病毒学杂志，2004，18(3)277-280。Chisarl FV.Hepatitis B virustransgenic mice：insights into the virus and the disease.Hepatology，1995，22：1316-1325.)小鼠在北京大学医学部实验动物部符合SPF级动物饲养标准的环境中进行实验。

2.实验分组：实验前进行动物的筛选，选择HBsAg阳性(按照商业购买试剂盒的操作步骤进行测定与评判，HepanostikaHBsAg Ultra，Biomérieux，Netherlands)的实验动物27只，按照HBV转基因小鼠血清中分泌HBsAg的高低(以OD值(450nm)的大小表示)进行分组，每组9只。

阴性对照：生理盐水(0.9％NaCl)

阳性对照：拉米夫定(灌胃剂量为100mg拉米夫定/kg小鼠体重)

药物：蚯蚓纤连蛋白酶(混合物(与上同)，灌胃剂量为50mg蚯蚓纤连蛋白酶/kg小鼠体重)

3.给药方案：

(1)灌胃：每天灌胃一次，持续21天，观察至30天。

(2)取血：分别在用药前，用药10天、20天取血，制备血清，测定谷-丙转氨酶(ALT)，谷-草转氨酶(AST)(使用中生北控公司的IFCC推荐法，仪器为日立7170A型全自动生化分析仪。操作步骤按照试剂盒说明书进行操作)。在用药后7、14、21、30天取血，制备血清，测定HBsAg(使用试剂盒为：Hepanostika

HBsAg Ultra，Biomérieux，Netherlands，检测仪器为BIO-TEK Instruments EL311型酶标仪。操作步骤按照试剂盒说明书进行操作)。

因为小鼠血容量有限，为了保证小鼠的生存质量，每次取血体积一般控制在0.2ml以下，并间隔足够的时间，所以测定ALT、AST的取血时间与测定HBsAg的取血时间不同。

(3)取组织：在实验最后一天取血完成后，断颈处死小鼠，收集肝组织，部分保存于4％甲醛中固定，制备石蜡切片，HE染色，进行肝脏病理变化观察；部分保存于液氮中备用。

4.检测指标：(1)体重；(2)谷-丙转氨酶(ALT)；(3)谷-草转氨酶(AST)；(4)HBsAg；(5)对肝脏的病理学观察。

5.实验结果：随着实验的进行，三个实验组动物活动状态没有显著性的差别。体重也没有显著性差异。与生理盐水组相比，转基因小鼠血清中ALT，AST上升有所抑制，结果见图5-1，5-2。与生理盐水组相比，转基因小鼠血清中HBsAg有所降低，结果见图5-3。转基因小鼠血清中纤维连接蛋白(FN)含量的变化见图5-4，结果显示，生理盐水组及拉米夫定组转基因小鼠的FN随生存时间的延长而增加，蚯蚓纤连蛋白酶实验动物组FN含量基本维持在恒定的水平。对转基因小鼠肝脏的病理学观察结果见图5-5。A：生理盐水组，肝小叶结构存在，肝细胞水肿，以肝小叶中央区为著。肝血窦和中央静脉明显扩张，点灶状肝细胞坏死，每10个低倍视野可见12个肝细胞坏死灶。B：肝小叶结构存在，肝细胞水肿，以肝小叶中央区为著。肝血窦和中央静脉明显扩张，点灶状肝细胞坏死和少量单核淋巴细胞浸润，每10个低倍视野可见4个肝细胞坏死灶。C：肝小叶结构存在，肝细胞水肿，以肝小叶中央区为著。肝血窦和中央静脉明显扩张，小灶状肝细胞微泡状脂肪性变性，每10个低倍视野可见4个肝细胞坏死灶。生理盐水组6只转基因小鼠，蚯蚓纤连蛋白酶处理组6只转基因小鼠与拉米夫定组6只转基因小鼠的肝组织病理切片观察结果表明：与生理盐水组相比，蚯蚓纤连蛋白酶实验动物组HBsAg转基因小鼠的肝脏坏死病变减轻，疗效与拉米夫定组类似。

实施例6蚯蚓纤连蛋白酶对HepG 2.2.15细胞水平的作用

1.细胞系及培养条件：HepG 2.2.15细胞系(Mount Sinai MedicalCollege，New York)，其特点是基因组中插入HVB基因(参考文献：Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected withcloned hepatitis B virus DNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1987，84，1005-1009)。培养基为DMEM高糖培养基(Dulbecco’s modified eaglemedium，Gibco，Invitrogen Corporation，USA)，同时加入10％的胎牛血清(PAA，Austria)，380μg/ml抗生素G-418(Amresco，USA)和青霉素-链霉素溶液(终浓度为100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素，HyClone，USA)。培养条件为CO₂培养箱，37℃培养。

2.实验分组：

阳性对照：拉米夫定处理组；

用药组：蚯蚓纤连蛋白酶处理组(单一组分SEQ ID NO.1)。

3.用药方案

将HepG2.2.15细胞进行接种(96孔板，每孔1×10⁴个细胞)。细胞接种三天后，分别加入不同浓度的蚯蚓纤连蛋白酶(培养基中药物终浓度为0-5μg/ml)和拉米夫定(培养基中药物终浓度为0-100μM)。细胞接种六天时更换相应的含药培养基。在细胞接种九天时收集细胞培养基，用于测定HBsAg，HBeAg。

4.HBsAg，HBeAg的测定方法：将步骤3收集的细胞培养基12000rpm离心5min，取适量，采用乙型肝炎病毒s抗原及e抗原诊断试剂盒(酶联免疫法，华美生物工程公司)按照说明书步骤进行测定。

5.实验结果见图6，结果表明，与空白细胞相比，蚯蚓纤连蛋白酶处理组HBsAg，HBeAg的分泌均受到抑制，细胞培养基中HBsAg，HBeAg含量有所下降。

蚯蚓纤连蛋白酶的几种纯化产物的氨基酸序列序列表

参考文献

1.乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒对纤维连接蛋白基因表达的调节。胃肠病学和肝病学杂志2004，13(1)：85-87。

2.纤维连接蛋白在慢性中毒性肝病中的变化及其意义。现代中西医结合杂志2003，12(16)：1692-1693。

3.纤维连接蛋白检测在肝病中的临床意义。中国热带医学2006，6(5)：818-819。

4.Activation of fibronectin gene expression by hepatitis B Virus x antigen.Journal of Viral Hepatitis，2004，11，332-341。

5.Differentially expressed cellular genes following HBV：potential targets ofanti-HBV drugs？Journal of Viral Hepatitis，2005，12，357-363。

6.Fibronectin is essential for hepatitis B virus propagation in Vitro：May be apotential cellular target？Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 344(2006)757-764。

7.Fibronectin of Human Liver Sinusoids Binds Hepatitis B Virus：Identification by an Anti-Idiotypic Antibody Bearing the Internal Image of thePre-S2 Domain.Journal of Virology，Feb.1995，p.840-848。

8.Expression，localization and alternative splicing pattern of fibronectinmessenger RNA in fibrotic human liver and hepatocellular carcinoma.Journalof Hepatology，1997，27：843-853。

9.Latent fibronectin-degrading serine proteiBase activity in N-terminalheparin-binding domain of human plasma fibronectin.Eur.J.Biochem.1991，201：71-77。

10.Collagen-binding domain of human plasma fibronectin contains a latenttype-IV collagenase.Eur.J.Biocheni.1991，201：79-84。

序列表

Claims

1.蚯蚓纤连蛋白酶用于制备药物的应用，所述药物用于预防或治疗乙型肝炎，其中所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，或所述蚯蚓纤连蛋白酶为粗酶混合物，所述粗酶混合物主要成分有SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15，其中SEQ ID NO.1丰度最高。

2.权利要求1的应用，其中所述乙型肝炎是慢性乙型肝炎。

3.一种用于治疗与纤维连接蛋白相关疾病的药物，所述药物包含所述蚯蚓纤连蛋白酶作为活性成分，其中所述纤维连接蛋白相关疾病为乙型肝炎，其中所述蚯蚓纤连蛋白酶为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的单一组分；或为粗酶混合物，所述粗酶混合物主要成分有SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ IDNO.15，其中SEQ IDNO.1丰度最高。

4.权利要求3的药物，其中所述乙型肝炎为慢性乙型肝炎。