CN101522900A - 具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦植物的制备和使用方法 - Google Patents

具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦植物的制备和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101522900A
CN101522900A CNA2007800228923A CN200780022892A CN101522900A CN 101522900 A CN101522900 A CN 101522900A CN A2007800228923 A CNA2007800228923 A CN A2007800228923A CN 200780022892 A CN200780022892 A CN 200780022892A CN 101522900 A CN101522900 A CN 101522900A
Authority
CN
China
Prior art keywords
wheat
plant
wheat plant
ahasl1a
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2007800228923A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101522900B (zh
Inventor
W·J·霍维
R·E·凯勒
D·R·卡尔森
M·L·达莫尔
B·K·辛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Agrochemical Products BV
Original Assignee
BASF Agrochemical Products BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Agrochemical Products BV filed Critical BASF Agrochemical Products BV
Publication of CN101522900A publication Critical patent/CN101522900A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101522900B publication Critical patent/CN101522900B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4678—Triticum sp. [wheat]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了用于制备具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦植物的新方法。所述方法涉及引入编码抗除草剂的小麦乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的基因。本发明进一步提供了产生高蛋白质籽粒的小麦植物和源自其的人和动物食品。

Description

具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦植物的制备和使用方法
发明领域
本发明涉及农业领域，特别地涉及用于制备和使用具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦植物的新型方法。
背景技术
小麦的籽粒蛋白质含量对于营养价值的改进是重要的，而且小麦的籽粒蛋白质含量还是制作面包的主要贡献因素(Dick & Youngs(1988)＂Evaluation of durum wheat，semolina，and pasta in theUnited States＂，Durum wheat：Chemistry and technology，AACC，St.Paul，MN，pp.237-248；Finney等人(1987)＂Quality of hard，soft，and durum wheats＂.E.G.Heyne(ed.)Wheat and wheatimprovement，Agron.Monogr.13，第2版，ASA，CSSA，and SSSA，Madison，WI，pp.677-748；Khan等人(2000)Crop Sci.40：518-524)。由于具有高籽粒蛋白质的小麦的溢价，因此其对于栽培者而言也是重要的性状(Olmos等人(2003)Theor.Appl.Genet.107：1243-1251)。虽然对于高籽粒蛋白质含量所进行的育种已经付出了很多努力，但由于控制性状的遗传学和与环境相互作用的复杂性使得进展很慢。研究已经鉴定出了几种关于籽粒蛋白质含量的QTL(Turner等人(2004)J.Cereal Sci.40：51-60；Joppa等人(1997)Crop Sci.37：1586-158；Perretant等人(2000)Theor.Appl.Genet.100：1167-1175；Prasad等人(1999)Theor.Appl.Genet.99：341-345；Groos等人(2003)Theor.Appl.Genet.106：1032-1040；Groos等人(2004)J.Cereal Sci.40：93-100；Shewry等人(1997)J.Sci.FoodAgric.73：397-406)。在给定类别或类型的小麦中，1至2％的籽粒蛋白质含量的提高被认为是显著增加(Tokatilidis等人(2004)Field Crops Res.86：33-42；Olmos等人(2003)Theor.Appl.Genet.107：1243-1251；Mesfin等人(2000)Euphytica 116：237-242)。籽粒蛋白质含量受环境条件例如土壤肥力、温度、氮营养、降雨量或温度的影响(Bhullar & Jenner(1985)Aust.J.Plant Physiol.12：363-375；Wardlaw & Wrigely(1994)Aust.J.Plant Physiol.21：695-703；Daniel & Triboi(2000)J.Cereal Sci.32：45-56；Metho等人(1999)J.Sci.Food Agric.79：1823-1831)。研究还表明，高蛋白质对于产量具有负面影响(Cox等人(1985)Crop Sci.25：430-435；Day等人(1985)J.Plant Nutrition 8：555-566)；然而其他人提出，培育出具有这两种性状的小麦应该是有可能的(Day等人(1985)J.Plant Nutrition 8：555-566；Johnson等人(1978)＂Breeding progress for protein and lysine in wheat＂，Proceedings of the Fifth International Wheat Genetics Symposium，New Delhi，India，pp.825-835)。当然，具有单个基因性状或影响籽粒蛋白质的紧密相关的性状将在改善面包制作和面包小麦(breadwheat)的营养价值方面提供显著的优点，特别是如果该性状或紧密相关的性状允许快速和成本有效的选择。
发明概述
本发明提供了用于制备小麦植物的方法，所述小麦植物产生具有增加的籽粒蛋白质含量的籽粒。本发明基于这样的令人惊奇的发现，即小麦植物在其基因组中包含至少一个拷贝的编码AHASL1A蛋白的AHASL1A基因，所述AHASL1A蛋白在普通小麦(Triticum aestivum)AHASL1A蛋白中的氨基酸位置579处包含丝氨酸-天冬酰胺置换。因为相应的丝氨酸-天冬酰胺置换在拟南芥(Arabidopsis thaliana)AHASL1蛋白中位于氨基酸位置653处，所以该氨基酸置换在本文也称为S653N置换。本发明的方法包括在植物中引入至少一个拷贝的小麦AHASL1A基因，所述AHASL1A基因编码包含S653N置换的AHASL1A蛋白。这样的基因可以通过诸如异花传粉、诱变和转化的方法来引入。本发明的方法可以进一步包括使包含AHASL1A S653N基因的小麦植物或其后代植物进行生长以产生籽粒，并测定由所述小麦植物或后代植物所产生的籽粒的蛋白质含量。另外，所述方法还包括选择包含小麦AHASLA1 S653N基因的植物，例如通过向所述植物和/或向其中所述植物正在生长或将要生长的土壤或其他基质施用有效量的AHAS抑制性除草剂。
本发明进一步提供了小麦植物、植物器官、植物组织和植物细胞，和高蛋白质籽粒，以及衍生自由本发明的小麦植物所产生的高蛋白质籽粒的人和动物食品。还提供了使用本发明的高蛋白质籽粒来生产人和动物食品的方法。
附图简述
图1为体外研究结果的图示，该研究使用从BW255-2和对照BW255品系的小麦植物制备的酶提取物来测定缬氨酸和亮氨酸对于AHAS活性的反馈抑制。BW255-2品系对于AHASL1A S653N等位基因而言是纯合体。BW255在AHASL1A基因方面是纯合的野生型，并且是被诱变以产生BW255-2品系的亲本品系。
发明详述
本发明提供了小麦植物的制备和使用方法，所述小麦植物包含具有增加的籽粒蛋白质含量的籽粒。本发明包括在小麦植物中引入至少一个拷贝的小麦AHASL1A基因，所述小麦AHASL1A基因编码包含S653N置换的AHASL1A蛋白。这样的基因可以通过诸如异花传粉、诱变和转化的方法来引入。本发明的方法可以进一步包括使包含AHASL1A S653N基因的小麦植物或其后代植物进行生长以产生籽粒，并测定由所述小麦植物或后代植物所产生的籽粒的蛋白质含量。当与不含小麦AHASL1A S653N基因的小麦植物相比较时，通过本发明方法所产生的小麦植物及其后代植物包含增加的籽粒蛋白质含量。
本发明的方法可用于开发具有增加的籽粒蛋白质含量的新型小麦栽培种。当与现有方法相比较时，本发明的方法显著降低了对于开发高蛋白质小麦而言所需的育种努力，这是因为本发明的方法由于将高蛋白质小麦性状与可容易地选择的除草剂抗性性状相连而提供了强大的选择优势。此外，小麦AHASL1A S653N基因的可选择分子标记物是本领域中已知的，因此所述可选择分子标记物有助于关于具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦的标记辅助育种方法。参见，美国专利申请公开号2005/0208506，其通过提及而合并入本文。除了由易于选择高蛋白质性状所提供的优点外，籽粒蛋白质含量的增加与籽粒产量的损失无关。因此，本发明的方法提供了产生具有增加的蛋白质含量的籽粒的小麦植物，并且这些植物可用于相比于相似的野生型植物而言增加每英亩所产生的籽粒蛋白质的量。最后，本发明的高蛋白质性状可以与现有的已经具有高籽粒蛋白质含量的面包小麦生殖质相组合，以开发具有更加高的籽粒蛋白质含量的小麦品系。
本发明提供了高蛋白质小麦植物和由这些植物产生的高蛋白质籽粒。这样的高蛋白质籽粒可用于各种供人和动物消费的食品和饲料。特别地，由本发明的小麦植物所产生的籽粒可用于生产高蛋白质小麦面粉，尤其可用于面包制作。因此，本发明提供了用于制备高蛋白质面粉的方法，其包括研磨由本发明的高蛋白质小麦植物所产生的籽粒。
本发明的高蛋白质小麦植物还包含相比于野生型小麦植物而言增加的除草剂抗性。特别地，当与野生型小麦植物相比较时，本发明的高蛋白质小麦植物具有增加的对于至少一种干扰AHAS酶活性的除草剂的抗性。本发明的高蛋白质小麦植物包含至少一个拷贝的小麦AHASL1 S653N基因或多核苷酸。这样的小麦AHASL1A蛋白在氨基酸位置579或等价位置处包含天冬酰胺。在野生型AHASL1A蛋白中，丝氨酸存在于位置579处。因为在熟知的拟南芥AHASL1蛋白中的相应位置为氨基酸653，所以编码包含丝氨酸579-至-天冬酰胺置换的AHASL1A蛋白的AHASL1A基因被称为AHASL1A S653N基因以符合已建立的关于植物AHASL序列的命名。
本发明提供了小麦植物的制备方法，所述小麦植物包含具有增加的籽粒蛋白质含量的籽粒。在一个实施方案中，所述方法包括通过诱变在小麦植物中引入至少一个拷贝的编码包含S653N置换的AHASL1A蛋白的小麦AHASL1A基因，特别是通过诱变内源性小麦AHASL1A基因以产生小麦AHASL1A S653基因。任何本领域中已知的诱变方法可用于产生本发明的高蛋白质小麦植物。此类诱变方法可以例如包括使用下列诱变剂中的任何一种或多种：辐射，例如X-射线、γ-射线(例如，钴60或铯137)、中子(例如，在原子反应堆中铀235核裂变的产物)、β辐射(例如，由放射性同位素例如磷32或碳14所发射的)和紫外线辐射(优选2500至2900nm)，和化学诱变剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)、碱基类似物(例如，5-溴-尿嘧啶)、相关化合物(例如，8-乙氧基咖啡因)、抗生素(例如，链黑菌素)、烷化剂(例如，硫芥类(sulfurmustards)、氮芥类、环氧化物、亚乙基胺类(ethylenamines)、硫酸酯类、磺酸酯类、砜类、内酯类)、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶类。包含小麦AHASL1A S653N基因的小麦植物还可以通过下列方式来产生：使用组织培养方法来选择包含除草剂抗性突变的植物细胞，选择包含小麦AHASL1A S653N基因的植物，并由其再生出植物。参见，例如美国专利号5,773,702和5,859,348，这两篇文献均通过提及而以其整体合并入本文。突变育种的进一步的细节可见“Principals ofCulti var Development”Fehr，1993 Macmillan Publishing Company，其公开内容通过提及而合并入本文。
在一个实施方案中，本发明提供了包含一个、两个、三个、四个或更多个拷贝的小麦AHASL1A S653N基因或多核苷酸的高蛋白质小麦植物。例如，高蛋白质小麦可以在天然小麦AHASL1A基因座处包含一个或两个拷贝的AHASL1A S653N基因，并且可以另外地或备选地包含一个、两个、三个或更多个拷贝的AHASL1A S653N多核苷酸，所述AHASL1A S653N多核苷酸与天然小麦AHASL1A启动子或能够在植物中驱动表达(特别是在籽粒灌浆期间)的其他启动子有效地连接，例如例如种子偏爱型或胚胎偏爱型启动子。
本发明提供了小麦植物的制备方法，所述小麦植物包含具有增加的籽粒蛋白质含量的籽粒。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括用包含与在植物细胞中驱动表达的启动子有效地连接的核苷酸序列的多核苷酸构建体转化植物细胞，并从所述经转化的植物细胞再生出经转化的植物。所述核苷酸序列编码在氨基酸位置579或等价位置处包含天冬酰胺的小麦AHASL1A蛋白。先前已经公开了编码小麦AHASL蛋白的核苷酸序列和包含小麦AHASL1A S653N基因的小麦植物。参见，WO 2004/106529和美国专利申请公开号2004/0237134、2004/0244080、2005/0044597、2006/0010514和2006/0095992；所有这些文献均通过提及而合并入本文。在其他的实施方案中，所述方法包括常规植物育种，所述常规植物育种包括将含有至少一个拷贝的小麦AHASL1A S653N基因的小麦植物与另一种小麦植物进行异花传粉；并可能进一步包括选择包含含有AHASL1A S653N基因的亲本植物的除草剂抗性特征的子代植物(F1或F2)。所述方法任选地可以包括F1植物的自花传粉以及选择后继子代植物(F2)，以产生对于AHASL1AS653N而言纯合的小麦品系。如果需要，所述方法可以进一步包括一个或多个后继世代(即，F2、F3、F4等)的自花传粉以及选择对于AHASL1A S653N而言纯合的后继子代植物(即F3、F4、F5等)。除非明确说明或者根据使用时的环境而显而易见，本文所使用的术语“子代”不限于植物的直接后裔，而是包括后继世代的后代。
本发明的方法涉及使用包含至少一个小麦AHASL1A S653N基因的小麦植物。这样的小麦植物包括但不限于：于2002年1月15日以专利保藏指定编号PTA-3955保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(Manassas，Virginia 20110-2209USA)的小麦植物，于2002年3月19日以专利保藏指定编号PTA-4113保藏于美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia 20110-2209US)的小麦植物，和于2002年5月28日以专利保藏指定编号PTA-4257保藏于美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia 20110-2209US)的小麦植物；具有ATCC专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113、和/或PTA-4257的小麦植物的突变体、重组体或基因工程衍生物；具有ATCC专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113和/或PTA-4257的植物的任何后代；和作为这些植物中的任何一种或多种植物的后代的小麦植物。优选地，具有ATCC专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113和PTA-4257的小麦植物中的任一种小麦植物的此类突变体、重组体或基因工程衍生物，以及其后代，包含具有ATCC专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113或PTA-4257的小麦植物的除草剂抗性特征。具有ATCC专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113和PTA-4257的小麦植物及其衍生物和后代描述于美国专利申请公开号2004/0237134、2004/0244080和2006/0095992中；所有这些文献均通过提及而合并入本文。
分别于2002年1月3日、2002年3月4日和2002年1月3日将具有专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113和PTA-4257的小麦品系中的每一种的至少2500粒种子保藏在美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA 20110 USA)的专利保藏处。这些保藏物中的每一个保藏至少30年的期限，并且在ATCC接受最近一份提供保藏样品的请求后至少5年期间进行保藏。将按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约维持这些保藏。此外，这些保藏满足37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品的存活证明。
除非另外说明或者根据上下文而显而易见，本文所使用的术语“植物”包括但不限于植物细胞、植物原生质体、从其可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、株丛(plant clump)、在植物中完整的植物细胞、或植物的部分，例如胚胎、花粉、胚珠、子叶、叶、茎、花、枝、叶柄、果实、根、根尖、花药等。此外，将种子也认为是植物。
“高蛋白质小麦植物”意指通过本文公开的方法产生的小麦植物，其产生或能够产生籽粒蛋白质含量水平增加超过类似小麦植物水平的籽粒，所述类似小麦植物在其基因组中不包含至少一个拷贝的本发明的小麦AHASL1A S653N基因。在本发明的一个优选实施方案中，高蛋白质小麦植物是普通小麦植物。
由本发明的高蛋白质小麦植物产生的籽粒在本文称为“高蛋白质籽粒”。
本发明的“高蛋白质性状”是指高籽粒蛋白质含量，并且归因于在小麦植物的基因组中存在本发明的小麦AHASL1A S653N基因或多核苷酸。此类AHASL1A S653N基因包括来自任何具有A基因组的小麦物种的AHASL1A S653N基因，所述小麦物种包括但不限于普通小麦(Triticum aestivum L.)、一粒小麦(T.monococcum L.)、圆柱小麦(T.turgidum L.)(包括但不限于波斯小麦(T.turgidum subsp.carthlicum)、硬粒小麦(T.turgidum subsp.durum)、野生二粒小麦(T.turgidum subsp.dicoccoides)、二粒小麦(T.turgidumsubsp.dicoccum)、波兰小麦(T.turgidum subsp.polonicum)和东方小麦(T.turgidum subsp.turanicum))和斯佩尔特小麦(T.spelta L.)。
本发明提供了高蛋白质小麦植物，其产生具有增加的籽粒蛋白质含量的籽粒。通常，将籽粒蛋白质含量测定为占成熟的干籽粒重量的百分比。一般地，由本发明的小麦植物所产生的籽粒的蛋白质含量比不包含至少一个拷贝的小麦AHASL1A S653N基因的相似的对照小麦植物高至少约4、5、6或7％。优选地，由本发明的小麦植物所产生的籽粒的蛋白质含量比相似的对照小麦植物高至少约8、9、10或11％。更优选地，由本发明的小麦植物所产生的籽粒的蛋白质含量比相似的对照小麦植物高至少约12、13、14或15％。更加优选地，由本发明的小麦植物所产生的籽粒的蛋白质含量比相似的对照小麦植物高至少约15、16、17或18％。更为优选地，由本发明的小麦植物所产生的籽粒的蛋白质含量比相似的对照小麦植物高至少约19、20、21或22％。最优选地，由本发明的小麦植物所产生的籽粒的蛋白质含量比相似的对照小麦植物高至少约23％。
本发明不依赖于任何特定的用于测定籽粒蛋白质含量或其他籽粒组分例如含水量和各单种氨基酸水平的方法。可以使用任何本领域中已知的方法来测定籽粒蛋白质含量、含水量和各单种氨基酸。参见，例如，Official Methods of Analysis of AOAC International(2005)，第18版，AOAC International，Gaithersburg，MD，USA，OfficialMethods 990.03(粗蛋白质)，930.15(含水量)和982.30(氨基酸/蛋白质效率比)；通过提及而合并入本文。
如本文所使用的，植物的“衍生物”或“衍生的小麦植物”是指这样的小麦植物，其为本发明的高蛋白质小麦植物的后代或克隆并包含遗传自所述高蛋白质小麦植物的至少一个拷贝的小麦AHASL1AS653N基因，并且也是本文中所定义的高蛋白质小麦植物，除非另外说明或根据上下文而显而易见。此类衍生物或衍生的小麦植物包括高蛋白质小麦植物的有性和/或无性繁殖的后代，并因此包括非转基因的和转基因的小麦植物。
本发明涉及作为耐受除草剂的或抗除草剂的小麦植物的高蛋白质小麦植物。“耐受除草剂的”或“抗除草剂的”植物意指，植物对于处于通常可杀死正常或野生型植物或者抑制其生长的水平上的至少一种除草剂具有耐受性或抗性。本发明的高蛋白质小麦植物包括耐受除草剂的或抗除草剂的AHASL蛋白质，特别是AHASL1A S653N。“耐受除草剂的AHASL蛋白”或“抗除草剂的AHASL蛋白”意指，当在至少一种已知干扰AHAS活性的除草剂存在下和在已知抑制野生型AHASL蛋白的AHAS活性的除草剂浓度或水平下时，AHASL蛋白展示出相对于野生型AHASL蛋白的AHAS活性而言更高的AHAS活性。此外，此类耐受除草剂的或抗除草剂的AHASL蛋白的AHAS活性在本文可以称为“耐受除草剂的”或“抗除草剂的”AHAS活性。
对于本发明，术语“耐受除草剂的”和“抗除草剂的”可互换使用，并且希望具有等同的含义和等同的范围。类似地，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”可互换使用，并且希望具有等同的含义和等同的范围。同样地，术语“抗咪唑啉酮类的”和“咪唑啉酮类抗性”可互换使用，并且希望分别与术语“耐受咪唑啉酮类的”和“咪唑啉酮类耐受性”具有等同的含义和等同的范围。
本发明包括抗除草剂的小麦AHASL多核苷酸和抗除草剂的小麦AHASL蛋白，特别是小麦AHASL1A S653N基因或多核苷酸和小麦AHASL1A S653N蛋白的用途。“抗除草剂的AHASL多核苷酸”意指编码包含抗除草剂的AHAS活性的蛋白质的多核苷酸。“抗除草剂的AHASL蛋白”意指包含抗除草剂的AHAS活性的蛋白质或多肽。
此外，要认识到，通过用编码耐受除草剂的或抗除草剂的AHASL蛋白的核苷酸序列来转化植物或其祖先，可以将耐受除草剂的或抗除草剂的AHASL蛋白引入到植物中。此类耐受除草剂的或抗除草剂的AHASL蛋白由耐受除草剂的或抗除草剂的AHASL多核苷酸所编码。备选地，由于在植物或其祖先的基因组中在内源性AHASL基因中自然存在的或诱导的突变，在植物中可能出现耐受除草剂的或抗除草剂的AHASL蛋白。
本发明提供了包含对于至少一种除草剂(特别是干扰AHAS酶的活性的除草剂，更特别地是咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂)的抗性的高蛋白质小麦植物以及植物组织、植物细胞和其籽粒。优选的除草剂量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。“有效量”和“有效浓度”分别意指这样的量和浓度，即所述量和浓度足以杀死或抑制相似的野生型植物、植物组织、植物细胞、小孢子或宿主细胞的生长，但所述量不杀死或不同样严重地抑制本发明的抗除草剂的植物、植物组织、植物细胞、小孢子和宿主细胞的生长。通常，除草剂的有效量是在农业生产系统中为了杀死目的杂草而常规使用的量。这样的量对于本领域技术人员来说是已知的，或可以使用本领域已知的方法而容易地确定。此外，要认识到，农业生产系统中的除草剂的有效量可能与用于植物培养系统(例如，下文中在实施例1中描述的小孢子培养系统)的除草剂的有效量显著不同。
本发明的除草剂是干扰AHAS酶的活性从而使得在除草剂存在下AHAS活性降低的那些除草剂。此类除草剂在本文中还可以称为“AHAS抑制性除草剂”或简单地称为“AHAS抑制剂”。如本文所使用的，“AHAS抑制性除草剂”或“AHAS抑制剂”并不意味着局限于干扰AHAS酶的活性的单一除草剂。因此，除非另外说明或根据上下文而显而易见，“AHAS抑制性除草剂”或“AHAS抑制剂”可以是一种除草剂或者两种、三种、四种或更多种除草剂的混合物，它们中的每一种都干扰AHAS酶的活性。
“相似的野生型小麦植物”意指缺少本文公开的高蛋白质籽粒和除草剂抗性性状的小麦植物。因此，术语“野生型”的使用并不旨在暗示，植物、植物组织、植物细胞或其他宿主细胞在其基因组中没有重组DNA，和/或不具有与本文所公开的那些除草剂抗性特征不同的除草剂抗性特征。
本发明的植物包括非转基因植物和转基因植物。“非转基因植物”意指在其基因组中没有重组DNA的植物。“转基因植物”意指在其基因组中包含重组DNA的植物。此类转基因植物可以通过将重组DNA引入至植物的基因组中来产生。当这样的重组DNA被整合到转基因植物的基因组中时，所述植物的子代也可以包含所述重组DNA。包含至少一个祖先转基因植物的重组DNA的至少一部分的子代植物也是转基因植物。
本发明涉及包含AHASL1A蛋白的小麦植物，所述AHASL1A蛋白在氨基酸位置579(其位于小麦AHASL1A蛋白的已知的保守区域内)处具有氨基酸置换。参见下表4。本领域技术人员将会意识到，这样的氨基酸位置可以变化，这取决于是否例如在氨基酸序列的N-末端添加或除去氨基酸。因此，本发明包括在所述位置或等价位置(例如，“氨基酸位置579或等价位置”)处具有氨基酸置换的小麦AHASL1A蛋白。“等价位置”意指与所例示的氨基酸位置处于相同的保守区域内的位置。参见下表4。因为与小麦AHASL1A蛋白的氨基酸579等价的位置是拟南芥AHASL1蛋白的氨基酸653，所以在氨基酸位置579处具有丝氨酸-天冬酰胺置换的小麦AHASL1A蛋白在本文中也称为小麦AHASL1AS653N蛋白，以便符合在本发明的领域中已广泛接受的基于拟南芥AHASL1蛋白的氨基酸序列的命名。类似地，编码小麦AHASL1A S653N蛋白的基因或多核苷酸在本文中称为小麦AHASL1A S653N基因或小麦AHASL1A S653N多核苷酸。
本发明涉及高蛋白质小麦植物，其包含增强的对于至少一种干扰AHAS酶活性的除草剂的耐受性或抗性。此类AHAS抑制性除草剂包括咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类除草剂或其混合物。优选地，所述AHAS抑制性除草剂为咪唑啉酮类除草剂。对于本发明，咪唑啉酮类除草剂包括但不限于，PURSUIT
Figure A200780022892D0017161322QIETU
(咪草烟)、CADRE
Figure A200780022892D0017161322QIETU
(甲灭草烟)、RAPTOR
Figure A200780022892D0017161322QIETU
(咪草啶酸)、SCEPTER
Figure A200780022892D0017161322QIETU
(灭草喹)、ASSERT
Figure A200780022892D0017161322QIETU
(imazethabenz)、ARSENAL
Figure A200780022892D0017161322QIETU
(灭草烟)、前述除草剂中任一种的衍生物和前述除草剂中两种或更多种的混合物，例如，灭草烟/咪草啶酸(ODYSSEY
Figure A200780022892D0017161322QIETU
)。更具体地，咪唑啉酮类除草剂可选自但不限于：2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、[2-(4-异丙基)-4-][甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧]酸、[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸、和[6-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯与[2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。优选使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-]基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。特别优选使用[2-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。
磺酰脲类除草剂包括但不限于，氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、砜嘧磺隆、氟胺磺隆、醚苯磺隆、氟嘧磺隆、醚磺隆、amidosulfiuon、fluzasulfuron、唑吡嘧磺隆、吡嘧磺隆、吡氯磺隆、四唑嘧磺隆、cyclosulfuron、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆(iodosulfuron)、环氧嘧磺隆、甲磺胺磺隆、氟磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、三氟甲磺隆、前述除草剂中任一种的衍生物、和前述除草剂中两种或更多种的混合物。本发明的三唑并嘧啶类除草剂包括，但不限于，氯酯磺草胺(cloransulam)、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺。本发明的嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂包括，但不限于，双草醚(bispyribac)、嘧草硫醚(pyrithiobac)、嘧草醚(pyriminobac)、嘧啶肟草醚和环酯草醚。磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类除草剂包括，但不限于，氟酮磺隆(flucarbazone)和丙苯磺隆(propoxycarbazone)。
要认识到，嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂和嘧啶基硫代苯甲酸酯类除草剂紧密相关，并且由Weed Science Society of America都归纳在后一名称的标题之下。因此，本发明的除草剂还包括嘧啶基硫代苯甲酸酯类除草剂，包括但不限于，上述的嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂。
本发明提供了用于产生高蛋白质小麦植物的方法，包括将至少一个拷贝的小麦AHASL1A S653N基因引入小麦植物的基因组中以产生高蛋白质小麦植物。在本发明的一个实施方案中，通过用多核苷酸构建体转化小麦植物来将至少一个拷贝的小麦AHASL1A S653N基因引入到小麦植物中，所述多核苷酸构建体包含与本发明的小麦AHASL1A S653N多核苷酸序列有效地连接的启动子。所述方法包括将本发明的多核苷酸构建体引入到至少一个植物细胞中并从其再生出经转化的植物。所述方法进一步包括使用能够在植物细胞中驱动基因表达的启动子。优选地，所述启动子是在正在发育的小麦籽粒中，特别是在已知发生蛋白质累积的时期期间驱动表达的启动子。此类启动子例如包括组成型启动子和种子偏爱型启动子。当与相似的未转化的小麦植物相比较时，通过这种方法产生的小麦植物包含增强的AHAS活性，特别是耐受除草剂的AHAS活性，以及增加的籽粒蛋白质含量。
在本文中使用术语“多核苷酸构建体”并不意图将本发明限制于包含DNA的多核苷酸构建体。本领域技术人会意识到，在本文所公开的方法中也可以使用由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合所组成的多核苷酸构建体，特别是多核苷酸和寡核苷酸。因此，本发明的多核苷酸构建体包括所有能够在本发明方法中用于转化植物的多核苷酸构建体，包括但不限于，由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合所组成的那些。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸构建体还包括所有形式的多核苷酸构建体，包括但不限于，单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。此外，本领域技术人员会理解，本文公开的每一种核苷酸序列还包括所例示的核苷酸序列的互补序列。
此外，要认识到，为了在植物中表达本发明的多核苷酸，通常将多核苷酸与能够在目的植物中驱动基因表达的启动子有效地连接。本发明的方法不依赖于特定的启动子。所述方法包括使用本领域中已知的并且能够在目的植物中驱动基因表达的任何启动子。
在某些实施方案中，本发明的方法包括使用小麦AHASL1A S653N多核苷酸来转化小麦植物，所述小麦AHASL1A S653N多核苷酸被提供在用于在小麦植物中表达的表达盒中。所述盒将包含与小麦AHASL1AS653N多核苷酸有效地连接的5′和3′调控序列。“有效地连接”意指在启动子和第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列起始和介导相应于所述第二序列的DNA序列的转录。一般地，“有效地连接”表示，被连接的核酸序列是邻接的，并且在需要时连接两个蛋白质编码区(邻接的，并且在同一个阅读框中)。另外，所述盒还可以包含至少一个待被共转化到生物体中的另外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供所述另外基因。
这样的表达盒配备有多个限制性位点，其用于插入小麦AHASL1AS653N多核苷酸以处于调控区的转录调节之下。另外，所述表达盒还可以包含可选择标记基因。
所述表达盒将在5′-3′转录方向上包含在植物中有功能的转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明的小麦AHASL1A S653N多核苷酸、以及转录和翻译终止区(即，终止区)。对于植物宿主和/或小麦AHASL1AS653N多核苷酸而言，启动子可以是原生的或类似的，或者外源的或异源的。此外，启动子可以是天然序列或备选地为合成序列。当启动子对于植物宿主而言是“外源的”或“异源的”时，意指所述启动子不存在于向其中引入所述启动子的天然植物中。当启动子对于小麦AHASL1A S653N多核苷酸而言是“外源的”或“异源的”时，意指所述启动子对于有效地连接的小麦AHASL1A S653N多核苷酸而言不是原生的或天然存在的启动子。如本文所使用的，嵌合基因包含与对于编码序列而言异源的转录起始区有效地连接的编码序列。
虽然使用异源启动子来表达小麦AHASL1A S653N多核苷酸可能是优选的，但可以使用原生的启动子序列。此类构建体将改变植物或植物细胞中小麦AHASL1A S653N蛋白的表达水平。因此，改变了所述植物或植物细胞的表型。
终止区对于转录起始区可以是原生的，对于有效地连接的小麦AHASL1A S653N多核苷酸可以是原生的，对于植物宿主可以是原生的，或者可以源自另一个来源(即，对于启动子、目的小麦AHASL1A S653N多核苷酸、植物宿主或任何其组合而言是外源的或异源的)。方便的终止区可获自根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还可参见，Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。
当合适时，可以就增加的在转化的植物中的表达来对所述基因进行优化。即，可以使用植物偏爱的密码子来合成所述基因以获得提高的表达。关于宿主偏爱的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。在本领域中可获得用于合成植物偏爱的基因的方法。参见，例如美国专利号5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，通过提及而合并入本文。
已知用于增强细胞宿主中的基因表达的另外序列修饰。这些包括除去编码假的多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列的序列以及其他经充分表征的可能对基因表达不利的序列。可以将所述序列的G-C含量调节至给定的细胞宿主的平均水平，如通过参考在所述宿主细胞中表达的已知基因而计算出的。当可能时，修饰所述序列以避免预期的发夹二级mRNA结构。
也可以在植物表达载体中使用用于提高基因表达的核苷酸序列。这些包括玉米AdhI的内含子，intronl基因(Callis等人Genes andDevelopment 1：1183-1200，1987)，以及来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒的前导序列(W-序列)(Gallie等人Nucleic Acid Res.15：8693-8711，1987；和Skuzeski等人PlantMol.Biol.15：65-79，1990)。已显示，来自玉米shrunken-1基因座的第一个内含子增加嵌合基因构建体中基因的表达。美国专利号5,424,412和5,593,874公开了在基因表达构建体中使用特定的内含子，和Gallie等人(Plant Physiol.106：929-939，1994)还显示了，内含子可用于在组织特异性的基础上调节基因表达。为了进一步提高或优化AHAS小亚基基因的表达，本发明的植物表达载体还可以包含含有基质附着区(MARs)的DNA序列。那么，用此类经修饰的表达系统转化的植物细胞可以展示出本发明核苷酸序列的过表达或组成型表达。
另外，表达盒还可以在表达盒构建体中包含5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域中是已知的，并且包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人(1995)Gene165(2)：233-238)，MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Virology 154：9-20)，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256)；和玉米退绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology 81：382-385)。还可参见，Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968。也可以使用其他已知用于增强翻译的方法，例如内含子等。
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以便以正确的方向以及在合适时在正确的阅读框内提供所述DNA序列。为此，可以采用接头或连接体来连接DNA片段或者可以包括其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等等。为此目的，可以包括体外诱变、引物修复、限制、退火、再置换(resubstitution)(例如转换和颠换)。
在本发明的实践中可以使用许多启动子。可以根据所需要的结果来选择启动子。可以将核酸与组成型启动子、组织偏爱型启动子或其他启动子相组合以在植物中表达。
此类组成型启动子包括例如在WO 99/43838和美国专利号6,072,050中公开的Rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白质(McElroy等人(1990)Plant Cell 2：163-171)；遍在蛋白(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632；和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。
组织偏爱型启动子可用于在特定植物组织内的靶向增强的AHASL1表达。所述组织偏爱型启动子包括但不限于，叶偏爱型启动子、根偏爱型启动子、种子偏爱型启动子和茎偏爱型启动子。组织偏爱型启动子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20：181-196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要，可以就弱表达来对此类启动子进行修饰。
在一个实施方案中，将目的核酸靶向叶绿体以进行表达。以这种方式，在不将目的核酸直接插入叶绿体的情况下，表达盒将额外地包含叶绿体靶向序列，所述叶绿体靶向序列包含编码将目的基因产物导向叶绿体的叶绿体转运肽的核苷酸序列。这样的转运肽在本领域中是已知的。关于叶绿体靶向序列，“有效地连接”是表示，将编码转运肽的核酸序列(即叶绿体靶向序列)如此地与小麦AHASL1A S653N多核苷酸相连接，从而使这两个序列邻接并在同一个阅读框中。参见，例如Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。尽管本发明的AHASL1蛋白包含天然的叶绿体转运肽，但可以通过将叶绿体靶向序列有效地连接至编码本发明成熟AHASL1A蛋白的核苷酸序列的5′-末端来将本领域已知的任何叶绿体转运肽融合至本发明的成熟AHASL1A蛋白的氨基酸序列。
叶绿体靶向序列在本领域中是已知的，包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等人(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-(烯醇丙酮酰基)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao等人(1995)J Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；和集光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。还可参见Von Heijne等人(1991)PlantMol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)PlantPhysiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。
用于转化叶绿体的方法在本领域中是已知的。参见，例如Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。所述方法依赖于包含可选择标记物的DNA的基因枪递送和通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，可通过核编码和质体定向的RNA聚合酶的组织偏爱型表达来反式激活沉默的质体所携带的转基因，从而完成质体转化。在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中已报导了这样的系统。
可以就在叶绿体中的表达来优化待被靶向叶绿体的目的核酸以解决植物的细胞核和该细胞器之间的密码子使用方面的差异。以这种方式，可使用叶绿体偏爱密码子来合成目的核酸。参见，例如美国专利号5,380,831，通过提及而合并入本文。
如本文所公开的，本发明提供了用于产生高蛋白质小麦植物的方法，所述高蛋白质小麦植物包含对于AHAS抑制性除草剂的抗性。所述小麦植物在其基因组中包含至少一个拷贝的小麦AHASL1A S653N基因。这样的基因可以为本文所公开的内源性基因或转基因。另外，在某些实施例中，小麦AHASL1A S653N基因可以堆叠有目的多核苷酸序列(包括其他抗除草剂的AHASL1基因)的任意组合，以产生具有所需表型的小麦植物。例如，本发明的多核苷酸可以堆叠有任何其他多核苷酸，所述其他多核苷酸编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白(描述在美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene 48：109中)。所产生的组合还可以包括多个拷贝的所述目的多核苷酸中的任一种。
本发明的表达盒可以包含可选择标记基因以用于选择经转化的细胞。可选择标记基因(包括本发明的那些)用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括，但不限于，编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对于除草剂化合物例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-D)的抗性的基因。一般可参见，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人(1980)The Operon，pp.177-220；Hu等人(1987)Cell 48：555-566；Brown等人(1987)Cell 49：603-612；Figge等人(1988)Cell52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人(1988)Nature 334：721-724。这些公开内容通过提及而合并入本文。
可选择标记基因的上述列表并不是限定性的。在本发明中可使用任何可选择标记基因。
可在载体中使用所述多核苷酸构建体和表达盒(包含小麦AHASL1AS653N多核苷酸)以转化小麦植物。可将小麦AHASL1A S653N多核苷酸单独地或与编码AHAS酶的小亚基(AHASS)的核苷酸序列相组合地用于载体中，以在植物中赋予除草剂抗性。参见，美国专利号6,348,643；其通过提及而合并入本文。
本发明还涉及用于产生转基因小麦植物的方法，所述转基因小麦植物产生具有增加的蛋白质含量的籽粒并且对于除草剂具有抗性，所述方法包括用多核苷酸构建体转化植物，所述构建体包含与小麦AHASL1A S653N多核苷酸有效地连接的在植物中驱动表达的启动子。
本发明还涉及通过本发明方法产生的非转基因小麦植物和转基因小麦植物，以及此类非转基因和转基因小麦植物的子代及其他后代，这些植物展现出提高或增强的对于干扰AHAS酶的除草剂(特别是咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂)的抗性，并且产生具有增加的蛋白质含量的籽粒。
除了至少一个拷贝的小麦AHASL1A S653N基因外，本发明的高蛋白质小麦植物在其基因组中还可以包含一个或多个另外的AHASL多核苷酸。编码耐受除草剂的AHASL蛋白的核苷酸序列以及包含编码耐受除草剂的AHASL蛋白的内源性基因的耐受除草剂的植物，包括本发明的多核苷酸和植物以及本领域中已知的那些。参见，例如美国专利号5,013,659、5,731,180、5,767,361、5,545,822、5,736,629、5,773,703、5,773,704、5,952,553和6,274,796；所有这些文献均通过提及而合并入本文。
用于转化植物的许多植物转化载体和方法是可获得的。参见，例如An，G.等人(1986)Plant Pysiol.，81：301-305；Fry，J.等人(1987)Plant Cell Rep.6：321-325；Block，M.(1988)Theor.ApplGenet.76：767-774；Cousins等人(1991)Aust.J.Plant Physiol.18：481-494；Chee，P.P.和Slightom，J.L.(1992)Gene 118：255-260；Christou等人(1992)Trends.Biotechnol.10：239-246；D′Halluin等人(1992)Bio/Technol.10：309-314；Dhir等人(1992)Plant Physiol.99：81-88；Casas等人(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA90：11212-11216；Christou，P.(1993)InVitro Cell.Dev.Biol.-Plant；29P：119-124；Davies等人(1993)Plant Cell Rep.12：180-183；Dong，J.A.和Mchughen，A.(1993)Plant Sci.91：139-148；Franklin，C.I.和Trieu，T.N.(1993)Plant.Physiol.102：167；Golovkin等人(1993)Plant Sci.90：41-52；Guo Chin Sci.Bull.38：2072-2078；Asano等人(1994)Plant Cell Rep.13；AyeresN.M.和Park，W.D.(1994)Crit.Rev.Plant.Sci.13：219-239；Barcelo等人(1994)Plant.J.5：583-592；Becker等人(1994)Plant.J.5：299-307；Borkowska等人(1994)Acta.Physiol Plant.16：225-230；Christou，P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.5：17-27；Eapen等人(1994)Plant Cell Rep.13：582-586；Hartman等人(1994)Bio-Technology 12：919923；Ritala等人(1994)Plant.Mol.Biol.24：317-325；以及Wan，Y.C.和Lemaux，P.G.(1994)Plant Physiol.104：3748。
本发明的方法包括在植物中引入多核苷酸构建体。“引入多核苷酸构建体”以使构建体进入植物细胞内部的方式将所述多核苷酸构建体呈递给植物。本发明的方法不依赖于用于将多核苷酸构建体引入植物的特定方法，只要所述多核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸构建体引入植物的方法在本领域中是已知的，其包括，但不限于，稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的方法。
“稳定转化”意指被引入植物中的多核苷酸构建体整合入植物的基因组中，并能够通过其子代而进行遗传。“瞬时转化”意指被引入植物中的多核苷酸构建体不整合入植物的基因组中。
关于植物和植物细胞的转化，使用标准技术将小麦AHASL1A S653N多核苷酸插入本领域已知的任何适合于在植物或植物细胞中表达所述核苷酸序列的载体之中。载体的选择取决于首选的转化技术和待转化的靶植物物种。在本发明的一个实施方案中，将小麦AHASL1A S653N多核苷酸与已知用于在植物细胞中高水平表达的植物启动子有效地连接，然后将该构建体引入对咪唑啉酮类除草剂易感的植物中，并再生出转化的植物。所述转化的植物对于在可杀死或严重损伤未转化的植物的咪唑啉酮类除草剂水平下的暴露具有耐受性。可将该方法应用于任何植物物种；然而，当应用于作物植物，特别是通常在至少一种除草剂(特别是咪唑啉酮类除草剂)存在的情况下生长的作物植物时，是最有益的。
用于构建植物表达盒和将外源核酸导入植物的方法在本领域中是普遍已知的，并且在前面已进行了描述。例如，可使用根瘤诱导(Ti)质粒载体将外源DNA引入植物。用于外源DNA递送的其他方法包括使用PEG介导的原生质体转化、电穿孔、显微注射须状物(whisker)和生物射弹或微粒轰击法以进行直接的DNA摄取。这样的方法在本领域中是已知的。属于Vasil等人的美国专利号5,405,765；Bilang等人(1991)Gene 100：247-250；Scheid等人，(1991)Mol.Gen.Genet.，228：104-112；Guerche等人，(1987)Plant Science 52：111-116；Neuhause等人，(1987)Theor.Appl Genet.75：30-36；Klein等人，(1987)Nature 327：70-73；Howell等人，(1980)Science 208：1265；Horsch等人，(1985)Science 227：1229-1231；DeBlock等人，(1989)Plant Physiology 91：694-701；Methods for Plant MolecularBiology(Weissbach和Weissbach，eds.)Academic Press，Inc.(1988)；和Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski，eds.)Academic Press，Inc.(1989)。转化的方法取决于待转化的植物细胞、所用载体的稳定性、基因产物的表达水平和其他参数。
将核苷酸序列引入植物并随后插入植物基因组中的其他合适方法包括由Crossway等人(1986)Biotechniques 4：320-334所描述的显微注射，由Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606所描述的电穿孔，由Townsend等人，美国专利号5,563,055，Zhao等人，美国专利号5,981,840所描述的土壤杆菌介导的转化，由Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722所描述的直接的基因转移，以及描述于例如Sanford等人，美国专利号4,945,050；Tomes等人，美国专利号5,879,918；Tomes等人，美国专利号5,886,244；Bidney等人，美国专利号5,932,782；Tomes等人(1995)＂Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment＂，Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods，ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology6：923-926)；和Lecl transformation(WO 00/28058)中的弹道颗粒加速(ballistic particle acceleration)。还可参见，Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)InVitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；Tomes，美国专利号5,240,855；Buising等人，美国专利号5,322,783和5,324,646；Tomes等人(1995)＂Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment＂，Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；Bowen等人，美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人(1985)The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等人(Longman，NewYork)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant CellReports 9：415-418，和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(须状物介导的转化)；D′Halluin等人(1992)PlantCell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports12：250-255，和Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(通过根瘤土壤杆菌转化玉米)；所有这些文献均通过提及而合并入本文。
可通过将植物与病毒或病毒核酸接触而将本发明的小麦AHASL1AS653多核苷酸引入植物中。一般地，这样的方法涉及将本发明的多核苷酸构建体整合入病毒DNA或RNA分子中。要认识到，小麦AHASL1A S653多核苷酸在开始时可作为病毒多蛋白的一部分来合成，其在后来可在体内或体外通过蛋白水解进行加工，从而产生所需的重组蛋白质。此外，要认识到，本发明的启动子还包括用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸构建体引入植物并在其中表达所编码的蛋白质的方法，在本领域中是已知的。参见，例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931；通过提及而合并入本文。
按照常规方法可将已被转化的细胞培养成植物。参见，例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可让这些植物生长，并用相同的转化的株系或不同的株系进行授粉，所得到的杂交体具有经鉴定的所需表型特征的组成型表达。可生长两代或更多代以确保所需表型特征的表达得到稳定地保持和遗传，然后收获种子以确保已获得了所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了具有本发明的多核苷酸构建体(例如，稳定地整合入其基因组中的本发明的表达盒)的经转化的种子(也称为“转基因种子”)。
本发明的高蛋白质小麦植物可在用于控制杂草的方法中使用。因此，本发明进一步提供了在本发明的高蛋白质小麦植物附近控制杂草的方法。所述方法包括向杂草和向高蛋白质小麦植物施用有效量的除草剂，其中，所述高蛋白质小麦植物，当与相似的野生型小麦植物相比较时，具有增加的对于至少一种除草剂特别是咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂的抗性。
通过提供具有增加的对于除草剂特别是咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂的抗性的高蛋白质小麦植物，多种制剂可用于保护植物免受杂草的侵害，从而增强植物的生长和减少对营养的竞争。可单独地使用除草剂在本文所描述的植物的周围区域内进行杂草的苗前(pre-emergence)、苗后(post-emergence)、植前(pre-planting)和植时(at planting)的控制，或者可使用包含其他添加剂的咪唑啉酮类除草剂制剂。也可将除草剂用于种子处理。即，在种子播种前或播种过程中，可将有效浓度或有效量的除草剂、或包含有效浓度或有效量的除草剂的组合物直接施用于种子。可在咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂制剂或组合物中使用的添加剂包括其他除草剂、去污剂、佐剂、铺展剂、粘着剂、稳定剂等。除草剂制剂可以是湿润的或干燥的制剂，并可包括但不限于，可流动性粉剂(flowable powders)、乳油和液体浓缩剂(liquid concentrates)。可按照常规方法，例如通过喷洒、灌溉、撒粉(dusting)、包被等来使用除草剂和除草剂制剂。
本发明提供了用于通过常规的植物育种(包括有性繁殖)来产生高蛋白质小麦植物的方法。所述方法包括将在其基因组中包含至少一个拷贝的小麦AHASL1A S653N基因或多核苷酸的第一亲本小麦植物与第二亲本小麦植物杂交以产生F1子代。第一植物可以是本发明的高蛋白质小麦植物中的任一种，包括例如包含至少一个拷贝的小麦AHASL1AS653N基因的转基因小麦植物，或包含小麦AHASL1A S653N基因的非转基因小麦植物，例如通过在WO 2004/106529以及美国专利申请公开号2004/0237134和2004/0244080中公开的突变而产生的那些；所有这些文献均通过提及而合并入本文。第二亲本小麦植物可以是当与第一植物杂交时能够产生有生活力的子代植物(即，种子)的任何小麦植物。通常，但非必需地，第一和第二亲本小麦植物是相同的小麦物种。所述方法可以进一步包括使F1子代自交以产生F2子代。另外，本发明的方法可以进一步包括将F1或F2子代植物与具有与第一或第二亲本小麦植物相同的品系或基因型的植物回交一代或多代。备选地，可使第一次杂交或任何后继杂交的F1子代与具有与第一或第二植物不同的品系或基因型的第三小麦植物进行杂交。另外，本发明的方法还包括选择包含第一植物的除草剂抗性特征的植物，例如通过将有效量的除草剂施用给包含小麦AHASL1S653N基因的子代小麦植物，或者通过标准方法例如PCR来检测AHASL1S653N基因。
本发明提供了包括使用AHAS抑制性除草剂在内的方法。在这些方法中，可以通过本领域已知的任何方法，包括但不限于，种子处理、土壤处理和叶处理，来施用AHAS抑制性除草剂。
在施用之前，可以将AHAS抑制性除草剂转变成惯用的制剂，例如溶液、乳液、悬浮液、粉末(dusts)、粉剂、糊剂和颗粒剂。使用形式取决于特定的所希望的目的；在每种情况下，它应当确保本发明的化合物的精细和均匀的分布。
以已知的方式制备所述制剂(参见，例如，关于综述可见US3,060,084，EP-A 707 445(对于液体浓缩剂)，Browning，＂Agglomeration＂，Chemical Engineering，Dec.4，1967，147-48，Perry’s Chemical Engineer’s Handbook，第4版，McGraw-Hill，NewYork，1963，第8-57页，以及下列，WO 91/13546，US 4,172,714，US4,144,050，US 3,920,442，US 5,180,587，US 5,232,701，US5,208,030，GB 2,095,558，US 3,299,566，Klingman，Weed Controlas a Science，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，Hance等人，Weed Control Handbook，第8版，Blackwell ScientificPublications，Oxford，1989，和Mollet，H.，Grubemann，A.，Formulation technology，Wiley VCH Verlag GmbH，Weinheim(Germany)，2001，2.D.A.Knowles，Chemistry and Technology ofAgrochemical Formulations，Kluwer Academic Pub lishers，Dordrecht，1998(ISBN 0-7514-0443-8))，例如通过用适合于配制农用化学药品的辅助剂例如溶剂和/或载体来扩充活性化合物，如果想要，可使用乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、防沫剂、防冻剂，对于种子处理制剂还任选地可用着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂。
合适的溶剂的实例是水、芳香族溶剂(例如Solvesso产品，二甲苯)、石蜡(例如矿物油级分)、醇类(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮类(例如环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP，NOP)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、二醇类、脂肪酸二甲基酰胺(fattyaciddimethylamides)、脂肪酸和脂肪酸酯。原则上，也可使用溶剂混合物。
合适的载体的实例是磨细的天然矿物(例如高岭土、粘土、滑石、白垩)和磨细的合成矿物(例如高度分散的二氧化硅、硅酸盐)。
合适的乳化剂是非离子和阴离子型乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)。
分散剂的实例是木质素-亚硫酸盐(酯)废液和甲基纤维素。
所用的合适的表面活性剂是木素质磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸、烷基芳基磺酸、烷基硫酸、烷基磺酸、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸和硫酸化脂肪醇二醇醚的碱金属、碱土金属和铵盐，此外还有磺化萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯酚醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基苯酚、烷基苯酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨糖醇酯、木质素亚硫酸盐(酯)废液和甲基纤维素。
适合用于制备可直接喷施的溶液、乳液、糊剂或油分散体的物质是具有中至高沸点的矿物油级分，例如煤油或柴油，此外还有煤焦油和植物或动物来源的油，脂族烃、环烃和芳族烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘或其衍生物，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛尔酮，高极性溶剂，例如二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮或水。
也可向制剂中加入防冻剂，例如甘油、乙二醇、丙二醇和杀菌剂。
合适的防沫剂是例如基于硅氧烷或硬脂酸镁的防沫剂。
合适的防腐剂是例如双氯酚和enzylalkoholhemiformal。
种子处理制剂还可以额外地包含粘合剂和任选地着色剂。
可加入粘合剂以在处理后促进活性材料在种子上的附着。合适的粘合剂是嵌段共聚物EO/PO表面活性剂，还有聚乙烯醇类、聚乙烯吡咯烷酮类、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚丁烯类、聚异丁烯类、聚苯乙烯、聚乙烯胺类、聚乙烯酰胺类、聚乙烯亚胺类
Figure A200780022892D00341
聚醚类、聚氨酯类、聚乙酸乙烯酯、纤基乙酸钠和源自这些聚合物的共聚物。
任选地，制剂中还可包含着色剂。种子处理制剂的合适的着色剂或染料是罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。
合适的胶凝剂的实例是角叉菜
Figure A200780022892D00343
可通过将活性物质与固体载体混合或相伴碾磨来制备粉末、用于撒播的材料和可撒粉产品(dustable products)。
可通过将活性物质结合至固体载体来制备颗粒剂，例如包被的颗粒剂、浸渍的颗粒剂和均质的颗粒剂。固体载体的实例是矿物土，例如硅胶，硅酸盐，滑石，高岭土，镁质粘土(attaclay)，石灰石，石灰，白垩，红玄武土，黄土，粘土，白云石，硅藻土，硫酸钙，硫酸镁，氧化镁，磨细的合成材料，肥料，例如硫酸铵，磷酸铵，硝酸铵，尿素，和植物来源的产物，例如谷类粗粉，树皮粗粉，木材粗粉和坚果壳粗粉，纤维素粉末，和其他固体载体。
一般地，制剂包含0.01-95wt％，优选地0.1-90wt％的AHAS抑制性除草剂。在该情况下，以90wt％-100wt％的纯度，优选地95wt％-100wt％的纯度(根据NMR谱)使用AHAS抑制性除草剂。对于种子处理目的，可将各个制剂稀释2-10倍，从而导致即时可用的制备物中活性化合物的浓度为0.01-60wt％，优选地0.1-40wt％。
可就这样使用AHAS抑制性除草剂，以其制剂的形式或从中制备的使用形式进行使用，例如以可直接喷洒的溶液、粉剂、悬浮液或分散体、乳液、油分散体、糊剂、可撒粉产品、用于撒播的材料、或颗粒剂的形式进行使用，通过喷洒、雾化、撒粉、撒播或灌注进行施用。使用形式完全取决于所想要的目的；其希望在每种情况下确保本发明的AHAS抑制性除草剂的最佳的可能分布。
可通过加入水而从乳液浓缩物、糊剂或可湿性粉剂(可喷洒的粉末、油分散体)制备水性使用形式。为制备乳剂、糊剂或油分散体，借助于湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂可将就这样的或溶解在油或溶剂中的物质在水中进行均质化。然而，也可能制备由活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂和如果合适还有溶剂或油组成的浓缩物，这样的浓缩物适合于用水进行稀释。
即时可用的制剂中的活性化合物浓度可在相对宽的范围内变化。一般地，其为0.0001-10wt％，优选地0.01-1wt％。
AHAS抑制性除草剂还可成功地用于超低容量过程(ULV)中，从而可能施用包含超过95wt％的活性化合物的制剂，或甚至施用无添加剂的活性化合物。
下面是制剂的实例：
1.用于叶面施用的用水稀释的产品。对于种子处理目的，可将这样的产品以稀释或未稀释的形式施用于种子。
A)水溶性浓缩物(SL、LS)
将10重量份的AHAS抑制性除草剂溶解在90重量份的水或水溶性溶剂中。作为备选方案，可加入湿润剂或其他辅助剂。在用水稀释时，AHAS抑制性除草剂溶解，由此获得具有10％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。
B)可分散的浓缩物(DC)
将20重量份的AHAS抑制性除草剂溶解在添加了10重量份的分散剂例如聚乙烯吡咯烷酮的70重量份的环己酮中。用水稀释产生分散体，由此获得具有20％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。
C)乳油(EC)
将15重量份的AHAS抑制性除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(在每种情况下为5重量份)的7重量份的二甲苯中。用水稀释产生乳剂，由此获得具有15％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。
D)乳剂(EW、EO、ES)
将25重量份的AHAS抑制性除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(在每种情况下为5重量份)的35重量份的二甲苯中。借助于乳化器(例如Ultraturrax)将该混合物引入至30重量份的水中，并制备成均一的乳剂。用水稀释产生乳剂，由此获得具有25％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。
E)悬浮剂(SC、OD、FS)
在搅动式球磨机中，将20重量份的AHAS抑制性除草剂在加入了10重量份的分散剂、湿润剂和70重量份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，从而产生精细的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。
F)水分散性颗粒剂和水溶性颗粒剂(WG、SG)
将50重量份的AHAS抑制性除草剂在加入了50重量份的分散剂和湿润剂的情况下精细地进行碾磨，并借助于技术器具(例如挤出、喷雾塔、流化床)而制备为水分散性或水溶性的颗粒。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有50％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。
G)水分散性粉剂和水溶性粉剂(WP、SP、SS、WS)。
将75重量份的AHAS抑制性除草剂在加入了25重量份的分散剂、湿润剂和硅胶的情况下在转子-定子研磨机中进行碾磨。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有75％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。
I)凝胶制剂(GF)
在搅动式球磨机中，将20重量份的AHAS抑制性除草剂在加入了10重量份的分散剂、1份重量的凝胶剂湿润剂和70重量份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，从而产生精细的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。该凝胶制剂适合用于种子处理。
2.用于叶面施用的非稀释地施用的产品。对于种子处理目的，可将这样的产品以稀释的形式施用于种子。
A)可撒粉粉剂(dustable powder)(DP、DS)
将5重量份的AHAS抑制性除草剂精细地碾磨，并紧密地与95重量份的精细粉碎的高岭土混合。这产生了具有5％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的可撒粉产品。
B)颗粒剂(GR、FG、GG、MG)
将0.5重量份的AHAS抑制性除草剂精细地碾磨，并将其与95.5重量份的载体组合，由此获得具有0.5％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。现有的方法是挤出、喷雾干燥或流化床。这产生了用于叶面使用的非稀释地施用的颗粒剂。
常规的种子处理制剂包括例如可流动性浓缩物(flowableconcentrates)FS、液剂LS、用于干处理的粉剂DS、用于浆处理的水分散性粉剂WS、水溶性粉剂SS和乳剂ES和EC以及凝胶制剂GF。这些制剂可以以稀释的或未稀释的形式施用于种子。在播种前施用于种子，或直接施用在种子上。
在优选的实施方案中，使用FS制剂进行种子处理。一般地，FS制剂可以包含1-800g/l的活性成分、1-200g/l的表面活性剂、0-200g/l的防冻剂、0-400g/l的粘合剂、0-200g/l的色素和直至1升的溶剂，所述溶剂优选地是水。
关于种子处理，使用除草剂，优选地选自下列AHAS抑制性除草剂的除草剂，或使用包含AHAS抑制性除草剂的制剂，来处理本发明的高蛋白质小麦植物的种子，所述AHAS抑制性除草剂是例如酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸(imazamethabenz)、咪草啶酸、甲灭草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚、嘧草硫醚及其混合物。更优选地，用咪唑啉酮类除草剂来处理本发明的高蛋白质小麦植物的种子。
术语“种子处理”包括本领域已知的所有合适的种子处理技术，例如拌种(seed dressing)、种子包衣(seed coating)、种子涂粉(seed dusting)、浸种(seed soaking)和种子丸粒化(seedpelleting)。
根据本发明的一个变化形式，本发明的进一步目的是处理土壤的方法，其通过施用作为组合物/制剂的包含AHAS抑制性除草剂的颗粒制剂(例如任选地具有一种或多种固体或液体的、农业上可接受的载体和/或任选地具有一种或多种农业上可接受的表面活性剂的颗粒制剂)来进行，特别是施用到条播机中。有利地，在例如谷类、玉米、棉花和向日葵的苗床中使用该方法。
本发明还包括用含有至少一种ALS抑制剂的种子处理制剂包被的或包含所述种子处理制剂的种子，所述ALS抑制剂选自酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸、咪草啶酸、甲灭草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚和嘧草硫醚。优选地，所述ALS抑制剂为咪唑啉酮类除草剂。
术语“种子”包括所有种类的种子和植物繁殖体，其包括但不限于真正的种子、插条、吸根、球茎、鳞茎、果实、块茎、籽粒、扦插条(cuttings)、伐条(cuts hoot)等，和在优选的实施方案中表示真正的种子。
术语“用...包被和/或包含”一般表示，活性成分在施用时绝大部分存在于繁殖产品的表面上，尽管依赖于施用方法，或多或少的成分可能渗透入繁殖产品中。当(重新)种植所述繁殖产品时，其可能吸收活性成分。
在植物播种前和植物出苗前，通过对种子进行喷洒或撒粉，使用AHAS抑制性除草剂或使用包含AHAS抑制性除草剂的制剂来施行种子处理应用。
在种子的处理中，通过用有效量的AHAS抑制性除草剂或包含AHAS抑制性除草剂的制剂处理种子来施用相应的制剂。此处，施用率通常是0.1g-10kga.i./100kg种子(或a.i.的混合物，或制剂)，优选地1g-5kg/100kg种子，特别地1g-2.5kg/100kg种子。对于特定的作物例如莴苣，施用率可更高。
本发明的高蛋白质小麦植物可在用于防治不希望的植被或控制杂草的方法中使用，所述方法包括在播种前和/或在催芽后将本发明的高蛋白质小麦植物的种子与AHAS抑制性除草剂接触。所述方法可以进一步包括例如在田间的土壤中或在温室中的盆栽介质中播种种子。所述方法特别地可用于在紧邻种子的附近防治不希望的植被或控制杂草。
“控制不希望的植被”可理解为表示，杀死杂草和/或延缓或抑制杂草的正常生长。杂草，在广义上理解为表示在不希望其生长的位置处生长的所有植物。
本发明的杂草包括，例如，双子叶和单子叶的杂草。双子叶杂草包括，但不限于下列属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、刺酸模属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛茛属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括，但不限于下列属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、蟋蟀草属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高梁属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)和阿披拉草属(Apera)。
此外，本发明的杂草可包括，例如，生长在不希望的位置处的作物植物。例如，如果在大豆植物的田中不想要玉米植物，那么可以将在主要包含大豆植物的田中的自生自长的玉米植物当作杂草。
此处所用的冠词“a”和“an”是指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)的语法对象。举例来说，“要素(an element)”表示一种或多种要素。
如此处所用的，单词“包含”或者变化形式例如“包括”或“含有”，将理解为表示包括所述的要素、整数或步骤或者要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组。
以举例说明的方式而不是以限定的方式提供下列实施例。
实施例1：具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦品系
采用标准诱变和常规植物育种方法来产生小麦品系。诱变的目的是形成具有对于咪唑啉酮类除草剂的抗性的小麦品系。造成这些小麦品系中的咪唑啉酮类除草剂抗性的突变是从鸟嘌呤向腺嘌呤的单个核苷酸变化，这导致密码子从AGC变为AAC以及在AHASL(乙酰羟酸合酶大亚基)蛋白中从丝氨酸至天冬酰胺的单个氨基酸置换，其命名为TaAHASL1A S653N。AHAS酶催化支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的生物合成中的第一步(Stidham和Singh(1991)＂Imidazolinone-Acetohydroxyacid Synthase Interactions，＂TheImidazolinone Herbicides，Ch.6，Shaner，D.，and O’Connor，S.，eds.；CRC Press，Boca Raton，Florida，U.S.A.，pp.71-90)，并且在植物中受这些氨基酸的反馈调节。AHAS基因中的单点突变通过改变在突变体AHAS酶上的用于这些除草剂的结合位点而赋予对于咪唑啉酮类除草剂的抗性，但对于由支链氨基酸引起的反馈调节以及该酶的正常生物合成功能没有可辨认的影响(Newhouse等人，(1992)PlantPhysiol.100：882-886)(图1)。
在选择展现出除草剂耐受性的小麦品系的过程中进行籽粒组成研究，从这些研究中发现较高的籽粒蛋白质含量。在1999年至2004年期间在不同的地理位置(California，Minnesota，North Dakota，Washington State，和Canada)进行了这些研究(表2)。展现出该性状的5个品系(BW255-2、BW238-3、K42、Teal15A和ElsaxEM2)通过独立的诱变事件而独立地衍生自不同的生殖质，并且一个品系(ElsaxEM2)通过渐渗现象(introgression)而衍生自已经经诱变的Einkorn小麦(一粒小麦)。
与它们的亲本相比较，品系BW255-2、BW238-3、K42、Teal15A和ElsaxEM2具有更高的蛋白质百分比值(表1)。与它们各自的亲本品系相比较，对于年份和地点而言，显著的增加在3-13％的范围内变化(表2)，或者与它们的亲本相比较，在所有品系、地点和年份中实际的增加在0.4-2.1％的范围内变化，平均为1.3％。支链氨基酸(缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)和必需氨基酸(赖氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸和苏氨酸)的值通常显著更高，但有一些例外(表2)。与它们各自的亲本品系相比较，平均增加在为6-11％的范围内变化(表2)，或者与它们的亲本相比较，在所有氨基酸值中实际的增加在0.02-0.09％的范围内变化，平均为0.04％。在2003和2004年进行的田间实验中，突变体BW255-2和BW238-3的籽粒产量和测试重量值没有显著地不同于它们各自的亲本品系(表3)。同样地，对于品系BW255-2和亲本BW255所给出的反馈抑制结果(图1)与其他品系相当，并且显示所述突变对于反馈抑制没有影响，所述反馈抑制可能改变了支链氨基酸生物合成的调节。
在该实施例中所呈现的研究中使用的耐受除草剂的小麦品系为M5代或更高代，并且对于AHASL1A S653N性状而言是纯合的。
表1.与其亲本相比较，对于AHASL1A S653N而言纯合的品系的籽粒蛋白质含量增加的平均百分比，其是横跨地点和年份而概括得到的。
 
品系 蛋白质(％增加)
BW238-3 7.4
BW255-2 7.3
K42 13.3
EM2xElsa 5.6
Tea115A 8.2
表2.TaAHASL1A S653N突变体与其亲本背景的蛋白质和氨基酸值的比较。
Figure A200780022892D00431
Figure A200780022892D00432
Figure A200780022892D00441
1值为九个观察值的平均值(％干重基础)。在同样的区组田间实验中生长突变体和亲本源。
2在给定的分析物内通过比较突变体和亲本来进行统计学分析。同样的字母(like letters)是没有显著差异的。
表3.在2003和2004年期间在美国的三个地点生长的亲本品系BW255和BW238以及突变体BW255-2和BW238-3(TaAHASL1A S653N)的产量和测试重量值。
Figure A200780022892D00451
1值为在ND和MN田间位点处的随机化完全区组设计(randomizedcomplete block design)中生长的九个观察值的平均值。
2同样的字母是没有显著差异的。
与它们各自的亲本品系相比较，对于咪唑啉酮类除草剂具有抗性的面包小麦品系的籽粒蛋白质含量、支链氨基酸和必需氨基酸值显著增加。与它们各自的亲本品系相比，具有普通小麦AHASL1A S653N基因的四个独立衍生的品系以及通过相同突变的渐渗现象而衍生自一粒小麦的另一个品系都表现出籽粒蛋白质性状的增加。这些结果证实，籽粒蛋白质的增加归因于小麦AHASL1A S653N突变，并且与亲本相比较，籽粒产量没有降低而且在这些AHASL1A S653N品系中的反馈抑制响应也没有变化。尽管迄今所检查的所有AHASL1A S653N小麦品系均包含关于天冬酰胺653的AAC密码子，但还是预期包含关于天冬酰胺653的AAT密码子的小麦品系生产具有增加的蛋白质含量的籽粒。
由S653N突变所提供的增加的籽粒蛋白质含量的优势仅限于AHASL1A基因。在同源的AHASL1D和AHASL1B基因中发生S653N突变的小麦品系没有展现出籽粒蛋白质的增加(数据未显示)。
实施例2：抗除草剂的小麦AHASL蛋白
本发明公开了编码小麦AHASL1A S653N多肽的多核苷酸的用途。先前已经鉴定了包含抗除草剂的AHASL多肽的植物，并且已经描述了AHASL多肽的许多保守区域，所述保守区域为赋予除草剂抗性的氨基酸置换的位点。参见Devine和Eberlein(1997)＂Physiological，biochemical and molecular aspects of herbicide resistance basedon altered target sites＂，Herbicide Activity：Toxicology，Biochemistry and Molecular Biology，Roe等人(eds.)，pp.159-185，IOS Press，Amsterdam；以及Devine和Shukla，(2000)CropProtection 19：881-889。
使用本发明的小麦AHASL1A S653N序列和本领域技术人员已知的方法，可以产生编码抗除草剂的AHASL多肽的另外的多核苷酸，所述AHASL多肽具有S653N置换以及在这些保守区域中的经鉴定的位点处的一个、两个、三个或更多个另外氨基酸置换。表4提供了AHASL蛋白的保守区域，在这些保守区域内的已知赋予除草剂抗性的氨基酸置换，和在小麦(普通小麦)AHASL1蛋白中相应的氨基酸。
表4.在AHASL多肽的保守区域内已知赋予抗除草剂的的氨基酸置换。
Figure A200780022892D00471
1保守区域，其来自Devine和Eberlein(1997)＂Physiological，biochemical and molecular aspects of herbicide resistance basedon altered target sites＂，Herbicide Activity：Toxicology，Biochemistry and Molecular Biology，Roe等人(eds.)，pp.159-185，IOS Press，Amsterdam；以及Devine和Shukla，(2000)CropProtection 19：881-889。
2氨基酸编号相应于拟南芥AHASL多肽的氨基酸序列。
3野生型普通小麦AHASL1的氨基酸序列包含相同的保守区域。
4Bernasconi等人(1995)J.Biol.Chem.270(29)：17381-17385。
5Wright和Penner(1998)Theor.Appl.Genet.96：612-620。
6Boutsalis等人(1999)Pestic.Sci.55：507-516。
7Guttieri等人(1995)Weed Sci.43：143-178。
8Guttieri等人(1992)Weed Sci.40：670-678。
9Kolkman等人(2004)Theor.Appl.Genet.109：1147-1159。
10Hartnett等人(1990)＂Herbicide-resistant plants carryingmutated acetolactate synthase genes＂，Managing Resistance toAgrochemicals：Fundamental Research to Practical Strategies，Green等人(eds.)，American Chemical Soc.Symp.，Series No.421，Washington，DC，USA。
11Simpson(1998)Down to Earth 53(1)：26-35。
12White等人(2003)Weed Sci.51：845-853。
13Bruniard(2001)Inheritance of imidazolinone resistance，characterization of cross-resistance pattern，and identificationof molecular markers in sunflower(Helianthus annuusL.).Ph.D.Thesis，North Dakota State University，Fargo，ND，USA，pp 1-78。
14Devine和Eberlein(1997)＂Physiological，biochemical andmolecular aspects of herbicide resistance based on altered targetsites＂，Herbicide Activity：Toxicology，Biochemistry andMolecular Biology，Roe等人(eds.)，pp.159-185，IOS Press，Amsterdam.
15Chang和Duggleby(1998)Biochem J.333：765-777。
16Lee等人(1999)FEBS Lett.452：341-345。
实施例3：在Arizona和California田间试验中高蛋白质小麦品系的性能
使包含AHASL1A S653(At)N突变的春小麦品系(普通小麦)及其同基因非突变型亲本品系于冬天(2005-2006)在北半球的三个地点(California和Arizona，USA)进行生长。测量每个品系的籽粒蛋白质含量，以确定在其适应地区外的环境中和在亚最佳光周期条件下(即白天更短)，AHASL1A S653N突变体小麦品系是否展现出相对于其亲本品系而言增加的籽粒生长。
项目(entries)和地点
使以两种遗传上不同的基因型形式存在的纯合AHASL1A(S653N)突变体，即Kirchauff-K42(一种澳大利亚的春小麦品系，本文中也称为＂K42＂)和BW238-3(一种北美的春小麦品系)，连同其同基因非突变型亲本品系(分别为Kirchauff和BW238)一起，于冬季(2005-2006)生长于美国西南部三个地点处的邻近的大地块上(单次重复)。两个地点靠近Yuma，Arizona，而第三个地点在Dinuba，California附近。于2005年11月在所述地点进行种植，并于2006年7月收获。
地块尺寸和播种量
播种量：100g种子/35m2
地块大小：2×1.75m×10m(1Rep.)
地块被10m宽的大麦带隔开。
农艺学性能和籽粒收获
所有的地块都经历同样的农艺学行为。所有土地都没有用咪唑啉酮类除草剂处理。为了证实Kirchauff和BW238品系的基因型独特性，就生长习性和高度对地块进行了评价。Kirchauff-K42品系和其同基因亲本品系Kirchauff比BW238-3品系和其同基因亲本品系BW238长得更高并且展现出更少的分蘖。当在每个地点的田地中观察时，在包含AHASL1A S653N突变的品系和其各自的同基因非突变型亲本品系之间没有检测到农艺学性能方面的显著差异。表5提供了在Dinuba，California地点处的所有四个品系的生长习性的概括。
表5：在Dinuba，California处于冬季生长的四个面包小麦品系的生长特征。
Figure A200780022892D00501
结果和讨论
分别在表6-8中提供了来自Yuma，Arizona的两个地点和Dinuba，California的一个地点的籽粒测试重量、SDS沉降值和蛋白质含量百分比。表9提供了横跨所有三个地点的结果的概括。当横跨所述三个地点计算籽粒蛋白质含量结果的平均值时，Kirchauff-K42展示出比其同基因亲本对照品系高5％的籽粒蛋白质水平(表9)。类似地，当横跨所述三个地点计算籽粒蛋白质含量的平均值时，BW238-3展示出比其同基因亲本对照品系高5.1％的籽粒蛋白质水平(表9)。Kirchauff-K42的平均籽粒测试重量略微高于其非突变型亲本品系；然而BW238-3的籽粒测试重量与其非突变型亲本品系没有显著不同(表9)。在突变型AHASL1A品系和其各自的亲本对照之间，用于预测面筋强度和焙烤品质(bakingquality)的SDS沉降值也没有显著不同。
这些结果证实，即使当在其适应地区外和在其正常的生长季节外进行生长时，包含AHASL1A S653N突变的六倍体面包小麦品系也产生具有比其亲本对照品系更高的籽粒蛋白质含量的籽粒。
表6.在Yuma试验1中，TaAHASL1A S653N突变体品系和亲本品系的籽粒测试重量(1bs/bu)、％籽粒蛋白质含量和SDS沉降(mm)的值。
＊小麦的SDS(十二烷基硫酸钠)沉降测试为一种美国谷物化学师协会(American Associate of Cereal Chemists，AACC)国际认可的方法，其用于预测硬粒小麦和面包小麦的面筋强度和焙烤品质。参见，Morris等人(2007)J.Sci.Food Agric.87：607-615。
Figure A200780022892D0051093959QIETU
相对于亲本品系的籽粒蛋白质含量而言S653N品系的籽粒蛋白质含量的增加百分比。Kirchauff和BW238分别为K42和BW238-3的亲本品系。
表7.在Yuma试验2中TaAHASL1A S653N突变体品系和亲本品系的籽粒测试重量(1bs/bu)、％籽粒蛋白质含量和SDS沉降(mm)的值。
 
品系 测试重量(1bs/bu) SDS沉降(mm)    籽粒蛋白质含量(％)   籽粒蛋白质含量的增加百分比    
K42(S653N品系) 60.0 104 14.7 4.3
Kirchauff(亲本品系) 57.6 109 14.1 ---
BW238-3(S653N品系) 58.6 111 19.2 5.5
BW238(亲本品系) 58.4 112 18.2 ---
表8.在Dinuba试验中TaAHASL1A S653N突变体品系和亲本品系的籽粒测试重量(1bs/bu)、％籽粒蛋白质含量和SDS沉降(mm)的值。
 
品系 测试重量(1bs/bu) SDS沉降(mm)    籽粒蛋白质含量(％)   籽粒蛋白质含量的增加百分比    
K42(S653N品系) 62.0 99 14.7 8.1
Kirchauff(亲本品系) 57.2 91 13.6 ---
BW238-3(S653N品系) 59.3 114 18.1 2.3
BW238(亲本品系) 58.2 116 17.7 ---
表9.横跨所有位置，TaAHASL1A S653N突变体品系和亲本品系的籽粒测试重量(1bs/bu)、％籽粒蛋白质含量和SDS沉降(mm)的值的平均值＊。
Figure A200780022892D00531
*来自两个Yuma试验(表6和7)和一个Dinuba试验(表8)的值的平均值。
Figure A200780022892D0051093959QIETU
标准偏差(s.d.)。
@相对于亲本品系的平均籽粒蛋白质含量而言S653N品系的平均籽粒蛋白质含量的增加百分比。Kirchauff和BW238分别为K42和BW238-3的亲本品系。
实施例4：由高蛋白质小麦品系产生的籽粒的焙烤品质测试
通过独立的实验室，对在上面实施例3中公开的田间试验中在所述三个地点中的两个地点(一个在Dinuba，California；和一个在Yuma，Arizona)处生长的籽粒样品进行许多的小麦和面粉测试方法，以确定在AHASL1A突变体中籽粒蛋白质的增加是否对焙烤品质有影响。来自每个项目(AHASL1A和亲本同基因品系)的籽粒样品经历实验室研磨过程(Buhler Laboratory Flour Mill)以产生经碾磨的小麦和面粉样品。然后对小麦和经研磨的样品进行许多品质测试(水份含量、蛋白质含量、灰分含量和降落值(falling number))以测定许多标准的小麦品质参数。进行专门的标准测试，例如单谷粒表征系统(Single KernelCharacterization System，SKCS)、粉质仪测试(Farinograph)和盘式面包焙烤测试(Pan Bread bake test)，以测定每个样品的加工和焙烤特性。这些方法描述于＂Wheat and Flour Testing Methods.AGuide to Understanding Wheat and Flour Quality＂，(2004)WheatMarketing Center，Inc.and North American Export GrainAssociation，Inc.，USA；其通过提及而合并入本文。这些测试的结果提供在下表10-13中。
虽然AHASL1A S653N突变体品系均显示出籽粒蛋白质的增加，但所有的突变体品系在焙烤数据方面与其亲本同基因品系没有显著的差异(表10-13)。这是在预料之中的，因为用于预测面筋强度和焙烤品质的SDS沉降值(参见，上面的实施例3)在突变体AHASL1A品系和各自的亲本对照之间也没有显著的差异。
能够增加籽粒蛋白质但不影响焙烤品质是小麦产业的一个理想特性。因此，本发明的突变型AHASL1A品系可用于生产这样的面粉，所述面粉具有增加的蛋白质含量而同时保持来自对照小麦品系的面粉的焙烤品质。相比于由从对照或野生型小麦品系的籽粒碾磨得到的面粉生产的焙烤制品而言，来自突变型AHASL1A小麦品系的籽粒的面粉还可用于生产具有增加的蛋白质含量的焙烤制品。
表10.小麦数据。
Figure A200780022892D00551
CMDTY：农产品；HWS：硬质白粒春小麦；和HRS：硬质红粒春小麦。
LOC：地点。
PRO：在8.5％的含水量下，小麦中的蛋白质％。
MOI：含水量(％)。
TW：测试重量。
TKW：千粒重(克)。
Hard：谷粒硬度(-20至120的指数)。
FN：降落值(秒)。FN为粘度的量度，其通过测量面粉和水的糊状物对于降落中的搅拌棒(falling stirrer)的阻力来测定。
SKCS：单谷粒表征系统。该系统就谷粒重量(mg)、谷粒直径(mm)、水份含量(％)和谷粒硬度(-20至120的指数)来独个地分析300颗谷粒。
表11.面粉数据和粉质仪测试结果。
CMDTY：农产品；HWS：硬质白粒春小麦；和HRS：硬质红粒春小麦。
LOC：地点。
PRO：在14％的含水量下，面粉中的蛋白质％。
MOI：含水量(％)。
ASH：面粉灰分(％)。
ABS：吸水量(％)，对于将粉质仪曲线置于500-Brabender-Unit(BU)线的中心所需的水量。
峰：峰值时间(分钟)，其表示面团(dough)形成时间，即从加入水那时候开始直到面团达到最大稠度(consistency)时所需的时间。
稳定性：稳定时间(分钟)，其为面团维持最大稠度的时间。
MTI：耐混合指数(Mixing Tolerance Index)(分钟)，其表示在混合期间面团的软化程度。
表13.关于焙烤品质测试的评述。
Figure A200780022892D00581
CMDTY：农产品；HWS：硬质白粒春小麦；和HRS：硬质红粒春小麦。
LOC：地点。
本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过提及而合并入本文，就如同具体地和单独地指明每一个单个的出版物或专利申请通过提及而合并入本文一样。
尽管为了使能够理解得清楚的目的已通过举例说明和实施例在一定程度上详述了上述发明，但很显然的是，可在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修饰。

Claims (29)

1.用于产生高蛋白质小麦植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将至少一个拷贝的小麦AHASL1A S653N基因引入到小麦植物中；
(b)使包含AHASL1A S653N基因的小麦植物或其后代植物进行生长以产生籽粒；和
(c)测定由所述小麦植物或后代植物所产生的籽粒的蛋白质含量，其中当与由缺乏所述小麦AHASL1A S653N基因的小麦植物所产生的籽粒相比较时，所述小麦植物或后代植物产生具有增加的蛋白质水平的籽粒。
2.权利要求1的方法，其中小麦AHASL1A S653N基因编码在氨基酸位置579或等价位置处包含天冬酰胺的AHASL1A蛋白。
3.权利要求1的方法，其中所述小麦AHASL1A S653N基因是普通小麦(Triticum aestivum)或一粒小麦(Triticum monococcum)AHASL1A S653N基因。
4.权利要求1的方法，其进一步包括选择包含所述小麦AHASL1AS653N基因的小麦植物的步骤。
5.权利要求4的方法，其中所述选择步骤包括在引入了所述小麦AHASL1A S653N基因后向所述小麦植物施用AHAS抑制性除草剂。
6.权利要求1的方法，其中通过异花传粉将所述小麦AHASL1AS653N基因引入到所述高蛋白质小麦植物中。
7.权利要求6的方法，其中所述异花传粉包括将第一亲本小麦植物与第二亲本小麦植物进行杂交以产生至少一个F1子代，其中所述第一亲本小麦植物包含至少一个拷贝的所述AHASL1A S653N基因，并且其中所述高蛋白质小麦植物是所述第一亲本小麦植物和所述第二亲本小麦植物的后代。
8.权利要求7的方法，其中所述第一亲本小麦植物选自：
(a)具有美国典型培养物保藏中心(ATCC)专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113或PTA-4257的小麦植物；
(b)具有ATCC专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113或PTA-4257的小麦植物的突变体、重组体或基因工程衍生物；
(c)具有ATCC专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113或PTA-4257的植物的任何后代；和
(d)作为这些植物中的任何一种或多种植物的后代的小麦植物。
9.权利要求7的方法，其中所述第一亲本小麦植物包含具有ATCC专利保藏指定编号PTA-3955、PTA-4113或PTA-4257的小麦植物的除草剂抗性特征。
10.权利要求7的方法，其中所述第一亲本小麦植物是所述杂交的花粉供体，所述第二亲本小麦植物是所述杂交的花粉受体，并且所述F1子代在所述第二亲本小麦植物上产生。
11.权利要求7的方法，其中所述第二亲本小麦植物是所述杂交的花粉供体，所述第一亲本小麦植物是所述杂交的花粉受体，并且所述F1子代在所述第一亲本小麦植物上产生。
12.权利要求7的方法，其中所述高蛋白质小麦植物通过下列方式来进行选择：向F1子代施用有效量的AHAS抑制性除草剂，以选择具有增加的对于AHAS抑制性除草剂的抗性的小麦植物。
13.权利要求7的方法，其中所述第一亲本小麦植物对于所述AHASL1A S653N基因而言是杂合的或纯合的。
14.权利要求7的方法，其中使通过所述杂交而产生的F1子代进行生长，并允许其进行自花传粉以产生F2子代。
15.权利要求14的方法，其中通过下列方式从所述F2子代中选择出所述高蛋白质小麦植物：向F2子代施用有效量的AHAS抑制性除草剂以选择至少一种具有增加的对于AHAS抑制性除草剂的抗性的小麦植物。
16.权利要求1的方法，其中通过下列方式将所述小麦AHASL1AS653N基因引入到所述高蛋白质小麦植物中：诱变，并选择包含对于有效量的AHAS抑制性除草剂的抗性的小麦植物。
17.权利要求16的方法，其进一步包括选择包含AHASL1A S653N基因的小麦植物。
18.权利要求1的方法，其中通过转化来将所述小麦AHASL1AS653N基因引入到所述高蛋白质小麦植物中，包括在小麦植物的至少一个细胞中引入包含与在植物细胞中驱动表达的启动子有效地连接的小麦AHASL1A S653N多核苷酸的多核苷酸构建体以产生经转化的小麦细胞，并将所述经转化的小麦细胞再生成经转化的小麦植物，其中所述经转化的小麦植物为所述高蛋白质小麦植物。
19.权利要求18的方法，其进一步包括向经转化的小麦细胞施用有效量的AHAS抑制性除草剂以选择包含增加的对于AHAS抑制性除草剂的抗性的经转化的小麦细胞。
20.权利要求18的方法，其中所述启动子选自组成型启动子和种子偏爱型启动子。
21.权利要求1的方法，其中所述高蛋白质小麦植物具有增强的对于至少一种选自下列的AHAS抑制性除草剂的抗性：咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂和磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类除草剂。
22.权利要求21的方法，其中所述咪唑啉酮类除草剂选自：[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基)-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧酸、[5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-]5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸、和6-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯与[2-(4-]异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物、以及其混合物。
23.权利要求1的方法，其中所述高蛋白质小麦植物的物种是普通小麦。
24.通过权利要求1-23中任一项的方法产生的高蛋白质小麦植物。
25.由权利要求24的高蛋白质小麦植物产生的高蛋白质籽粒。
26.包含权利要求25的高蛋白质籽粒的人或动物食品。
27.用于产生高蛋白质小麦面粉的方法，其包括研磨权利要求25的高蛋白质籽粒。
28.通过权利要求27的方法产生的高蛋白质面粉。
29.包含权利要求28的高蛋白质面粉的人或动物食品。
CN2007800228923A 2006-05-31 2007-05-31 具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦植物的制备和使用方法 Expired - Fee Related CN101522900B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US80972206P 2006-05-31 2006-05-31
US60/809,722 2006-05-31
PCT/US2007/070070 WO2007140451A1 (en) 2006-05-31 2007-05-31 Methods for making and using wheat plants with increased grain protein content

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101522900A true CN101522900A (zh) 2009-09-02
CN101522900B CN101522900B (zh) 2013-04-03

Family

ID=38566132

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007800228923A Expired - Fee Related CN101522900B (zh) 2006-05-31 2007-05-31 具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦植物的制备和使用方法

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20090300783A1 (zh)
EP (1) EP2029752A1 (zh)
JP (1) JP2009538632A (zh)
CN (1) CN101522900B (zh)
AP (1) AP2008004707A0 (zh)
AR (1) AR061211A1 (zh)
AU (1) AU2007266510A1 (zh)
BR (1) BRPI0712518A2 (zh)
CA (1) CA2652845A1 (zh)
CL (1) CL2007001552A1 (zh)
EA (1) EA200802339A1 (zh)
IL (1) IL195329A0 (zh)
MA (1) MA30430B1 (zh)
MX (1) MX2008015095A (zh)
NO (1) NO20084834L (zh)
TN (1) TNSN08471A1 (zh)
UA (1) UA98768C2 (zh)
UY (1) UY30381A1 (zh)
WO (1) WO2007140451A1 (zh)
ZA (1) ZA200810660B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA108733C2 (uk) 2006-12-12 2015-06-10 Толерантна до гербіциду рослина соняшника
US10017827B2 (en) 2007-04-04 2018-07-10 Nidera S.A. Herbicide-resistant sunflower plants with multiple herbicide resistant alleles of AHASL1 and methods of use
CA2867139A1 (en) 2011-04-11 2012-10-18 Targeted Growth, Inc. Identification and the use of krp mutants in plants
BR112014014664B1 (pt) 2011-12-16 2023-02-28 Basf Agrochemical Products, B.V Método para analisar um gene ahasl de planta e kit para analisar um gene ahasl de planta
CA2888157A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Montana State University Production of high quality durum wheat having increased amylose content
US9504223B2 (en) 2014-06-25 2016-11-29 Monsanto Technology Llc Wheat cultivar BZ9WM09-1663
US9648827B2 (en) 2014-10-20 2017-05-16 Monsanto Technology Llc Wheat cultivar BZ6WM09-1030
KR101862265B1 (ko) * 2016-01-06 2018-05-29 씨제이제일제당 주식회사 콩 품종의 종자, 식물체 및 그의 용도
KR102201400B1 (ko) * 2018-11-29 2021-01-11 서울대학교산학협력단 기능성 성분의 함량이 높고 불마름병 내병성이며 다수성인 콩 신품종 및 이의 육종 방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0965265B1 (en) * 1991-04-08 2011-01-05 Basf Se AHAS-inhibiting herbicide resistant wheat and method for selection thereof
EP1414976B1 (en) * 2001-08-09 2011-10-05 University Of Saskatchewan Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
MXPA04001012A (es) * 2001-08-09 2005-06-06 Univ Saskatchewan Plantas de trigo que tienen resistencia incrementada a los herbicidas de imidazolinona.
AU2003282264B2 (en) * 2002-07-10 2008-10-09 The Department Of Agriculture, Western Australia Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
ES2389767T3 (es) * 2003-05-28 2012-10-31 Basf Se Plantas de trigo que tienen mayor tolerancia a herbicidas de imidazolinona
US7432082B2 (en) * 2004-03-22 2008-10-07 Basf Ag Methods and compositions for analyzing AHASL genes
CN101006178A (zh) * 2004-06-16 2007-07-25 巴斯福种植科学有限公司 用于建立咪唑啉酮耐受性的植物的编码成熟的ahasl蛋白质的多核苷酸

Also Published As

Publication number Publication date
UA98768C2 (ru) 2012-06-25
JP2009538632A (ja) 2009-11-12
UY30381A1 (es) 2008-01-02
WO2007140451A1 (en) 2007-12-06
ZA200810660B (en) 2010-11-24
MX2008015095A (es) 2008-12-12
MA30430B1 (fr) 2009-05-04
EA200802339A1 (ru) 2009-06-30
AP2008004707A0 (en) 2008-12-31
AU2007266510A1 (en) 2007-12-06
TNSN08471A1 (en) 2010-04-14
EP2029752A1 (en) 2009-03-04
IL195329A0 (en) 2011-08-01
US20090300783A1 (en) 2009-12-03
CN101522900B (zh) 2013-04-03
CL2007001552A1 (es) 2008-01-18
AR061211A1 (es) 2008-08-13
CA2652845A1 (en) 2007-12-06
NO20084834L (no) 2008-12-19
BRPI0712518A2 (pt) 2012-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101668419B (zh) Ahas突变体
CN101287836B (zh) 抗除草剂的向日葵植物、编码抗除草剂的乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的多核苷酸和使用方法
CN101522900B (zh) 具有增加的籽粒蛋白质含量的小麦植物的制备和使用方法
CN101711283B (zh) 除草剂抗性的芸苔属植物及其使用方法
CN101443450A (zh) 植物中牵涉增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的新型突变
CN102216461B (zh) 抗除草剂的向日葵植物
AU2013270631B2 (en) AHAS mutants

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130403

Termination date: 20150531

EXPY Termination of patent right or utility model