BRPI0712518A2

BRPI0712518A2 - método para produzir uma planta de trigo de elevado teor proteico

Info

Publication number: BRPI0712518A2
Application number: BRPI0712518-6A
Authority: BR
Inventors: William J Howie; Ronald E Kehler; Dale R Carlson; Mark L Dahmer; Bijay K Singh
Original assignee: Basf Agrochemical Products Bv
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2012-09-04
Also published as: WO2007140451A1; EA200802339A1; NO20084834L; AP2008004707A0; EP2029752A1; MX2008015095A; UA98768C2; CN101522900B; MA30430B1; TNSN08471A1; CA2652845A1; AU2007266510A1; IL195329A0; JP2009538632A; AR061211A1; ZA200810660B; CL2007001552A1; UY30381A1; US20090300783A1; CN101522900A

Abstract

"MéTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE TRIGO DE ELEVADO TEOR PROTEICO" A presente invenção fornece novos métodos para produzir plantas de trigo com conteúdo proteico dos grãos aumentado. Os métodos envolvem introduzir um gene codificando a proteína da subnidade da grande acetoidrxiácido sintase (AHASL) do trigo resistente a herbicida. A invenção ainda fornece plantas de trigo que produzem grãos elevados em proteínas e produtos alimentares humanos e animais deles derivados.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE TRIGO DE ELEVADO TEOR PROTEICO"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito ao campo agrícola, particularmente a novos métodos para produzir e usar plantas de trigo com conteúdo proteico dos grãos aumentado.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O conteúdo proteico dos grãos de trigo é importante tanto para o melhoramento do valor nutritivo quanto também constitui um fator principal que contribui para a produção de pão (Dick & Youngs (1988) "Evaluation of duram wheat, semolina, and pasta in the United States," Em: Durum wheat: Chemistry and technology, AACC, St. Paul, MN, pp. 237-248; Finney et al. (1987) "Quality of hard, soft, and durum wheats". Em E. G. Heyne (ed.) Wheat and wheat improvement, Agron. Monogr. 13, 2~ edição ASA, CSSA e SSSA, Madison, WI, pp. 677-748; Khan et al. (2000) Crop Sei. 40: 518-524). É também um traço importante para os plantadores por causa do premium price para o trigo com elevado teor proteico dos grãos (Olmos et al. (2003) Theor. Appl. Genet. 107: 1243-1251). A cultura quanto ao alto conteúdo proteico dos grãos tem recebido muitos esforços, mas o progresso tem sido lento por causa da complexidade da genética controlando as características e a interação com o ambiente. Estudos têm identificado vários QTLs quanto ao conteúdo proteico dos grãos (Turner et al. (2004) J. Cereal Sci. 40: 51-60; Joppa et al. (1997) Crop Sci. 37: 1586-158; Perretant et al. (2000) Theor. Appl. Genet. 100: 1167-1175; Prasad et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 99: 341-345; Groos et al. (2003) Theor. Appl. Genet. 106: 1032-1040; Groos et al. (2004) J. Cereal Sei. 40: 93-100; Shewry et al. (1997) J. Sci. Food Agric. 73: 397-406). Um melhoramento do conteúdo proteico dos grãos em 1 a 2% foi considerado como um aumento significativo dentro de uma dada classe ou tipo de trigo (Tokatilidis et al. (2004) Field Crops Res. 86: 33-42; Olmos et al. (2003) Theor. Appl. Genet. 107: 1243-1251; Mesfin et al. (2000) Euphytica 116: 237-242). O conteúdo proteico dos grãos é influenciado por condições ambientais tais como a fertilidade do solo, a temperatura, a nutrição de nitrogênio, a precipitação pluviométrica ou a temperatura (Bhullar & Jenner (1985) Aust. J. Plant Physiol. 12: 363-375; Wardlaw & Wrigely (1994) Aust. J. Plant Physiol. 21: 695-703; Daniel & Triboi (2000) J. Cereal Sei. 32: 45-56; Metho et al. (1999) J. Sei. Food Agric. 79: 1823-1831). A pesquisa tem mostrado também existir um efeito negativo no alto teor proteico na produção (Cox et al. (1985) Crop Sei. 25: 430-435; Day et al. (1985) J. Plant Nutrition 8: 555-566); entretanto, outros sugerem que deve ser possível produzir trigo com ambas as características [Day et al. (1985) J. Plant Nutrition 8: 555-566; Johnson et al. (1978) "Breeding progress for protein and lysine in wheat," Em: Proceedings of the Fifth International Wheat Genetics Symposium, Nova Delhi, índia, pp. 825-835). Certamente, ter uma única característica de gene ou características intimamente ligadas afetando a proteína dos grãos deve proporcionar vantagens significativas melhorando tanto a produção de pão quanto o valor nutritivo do trigo para pão, particularmente se a característica ou os traços intimamente ligados levarem em conta a seleção de rapidez e eficácia de custo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos para produzir plantas de trigo que produzam grãos com conteúdo aumentado de proteínas dos grãos. A invenção baseia-se na surpreendente descoberta de que as plantas de trigo que contêm em seus genomas pelo menos uma cópia de um gene AHASL1A, codifica uma proteína AHASL1A compreendendo uma substituição de serina por asparagina na posição 579 do aminoácido na proteína AHASLIA do Triticum aestivum. Esta substituição de aminoácidos é também aqui referida como a substituição S653N porque a substituição correspondente de serina em asparagina situa-se na posição 653 do aminoácido na proteína AGASLl de Arabidopsis thaliana. Os métodos da invenção envolvem introduzir pelo menos uma cópia de um gene AHASLIA do trigo que codifica uma proteína AHASLIA compreendendo a substituição S652N em uma planta. Um tal gene pode ser introduzido por métodos tais como, por exemplo, a polinização cruzada, a mutagênese e a transformação. Os métodos da invenção podem ainda envolver o cultivo da planta de trigo ou de uma planta descendente desta compreendendo o gene S653N AHASLIA para produzir grãos e determinar o conteúdo proteico dos grãos produzidos pela planta de trigo ou a planta descendente. Os métodos podem adicionalmente envolver a seleção de plantas que compreendam o gene S653N AHASLA1 do trigo mediante, por exemplo, a aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de AHAS à planta e/ou ao solo ou a outro substrato em que a planta esteja em cultivo ou venha a ser cultivada.

A presente invenção ainda provê plantas, órgãos de plantas, tecidos de plantas e células de plantas de trigo, e grãos elevados em proteínas, bem como produtos de alimentação humana e animal derivados dos grãos de elevado teor proteico produzidos pelas plantas de trigo da invenção. Métodos de uso dos grãos de alto teor proteico da invenção para produzir produtos alimentares para seres humanos e animais são também fornecidos.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

A Figura 1 é uma representação gráfica dos resultados de uma pesquisa in vitro para determinar a inibição de realimentação da atividade de AHAS pela valina e a leucina com o uso de extratos de enzimas preparados de plantas de trigo das linhagens BW255-2 e BW255 de controle. A linhagem BW255-2 é homozigota para o alelo S653N de AHASLIA e é a linhagem precursora que foi mutagenizada para produzir a linhagem BW255-2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos para produzir e usar plantas de trigo que contenham grãos com conteúdo proteico dos grãos aumentado. A invenção envolve introduzir em uma planta de trigo pelo menos uma cópia de um gene AHASL1A de trigo que codifique a proteína AHASL1A contendo a substituição S653N em uma planta. Um tal gene pode ser introduzido por métodos tais como, por exemplo, a polinização cruzada, a mutagênese e a transformação. Os métodos da invenção podem ainda envolver o cultivo da planta de trigo ou de uma planta dela descendente contendo o gene S653N AHASL1A para produzir grãos e determinar o conteúdo de proteínas dos grãos produzidos pela planta de trigo ou pela planta descendente. As plantas de trigo produzidas pelos métodos da presente invenção e pelas plantas delas descendentes compreendem um conteúdo proteico dos grãos aumentado em comparação com as plantas de trigo deficientes do gene S653N AHASL1 A do trigo.

Os métodos da presente invenção encontram uso no desenvolvimento de novos cultivares de trigo com conteúdo proteico do grão aumentado. Quando comparados com os métodos existentes, os métodos da invenção reduzem consideravelmente os esforços de cultivo necessários para se desenvolver o trigo com teor elevado de proteínas, tendo em vista que os métodos da invenção levam em conta uma vantagem de seleção robusta devida à característica do trigo de elevado conteúdo de proteínas ligada a uma característica de tolerância aos herbicidas facilmente selecionável. Além disso, os marcadores moleculares selecionáveis são conhecidos na técnica quanto ao gene S653N de AHASLIA do trigo e, assim, podem auxiliar nas abordagens de cultivo assistidas pelos marcadores para o trigo com conteúdo proteico aumentado dos grãos. Ver a Publicação do Pedido de Patente U.S. n2 2005/0208506, aqui incorporada como referência. Além das vantagens proporcionadas pela facilidade de seleção quanto à característica de alto teor proteico, o aumento no conteúdo proteico dos grãos não é correlacionado com a perda na produção de grãos. Assim, os métodos da invenção fornecem plantas de trigo que produzem grãos com conteúdo proteico aumentado e estas plantas podem ser usadas para aumentar a quantidade de proteina dos grãos produzida por acre, em comparação com as plantas do tipo selvagem semelhantes. Finalmente, a característica de elevado teor de proteínas da presente invenção pode ser combinada com o idioplasma existente do trigo cultivado que já seja elevado no conteúdo proteico dos grãos para desenvolver linhagens de trigo com conteúdo proteico dos grãos ainda mais elevado.

A presente invenção fornece plantas de trigo de elevado conteúdo de proteína e os grãos de elevado conteúdo de proteína produzidos por estas plantas. Tais grãos de elevado conteúdo de proteína encontram uso em uma variedade de alimentos e de produtos alimentares para o consumo humano e animal. Em particular, os grãos produzidos pelas plantas de trigo da invenção encontram uso na produção de farinha de trigo de elevado conteúdo de proteínas, particularmente para uso na produção de pão. Assim, a invenção provê métodos para produzir farinha de alto teor proteico compreendendo moer os grãos produzidos pelas plantas de trigo de elevado teor proteico da presente invenção.

As plantas de trigo de elevado teor de proteína da invenção também incluem resistência aumentada a herbicidas, em comparação com uma planta de trigo do tipo selvagem. Em particular, as plantas de trigo de elevado teor proteico da invenção têm resistência aumentada a pelo menos um herbicida que interfira com a atividade da enzima AHAS em comparação com uma planta de trigo do tipo selvagem. As plantas de trigo de elevado teor proteico da invenção compreendem pelo menos uma cópia de um gene S653N AHASLl ou polinucleotídeo. Uma tal proteína AHASLIA do trigo compreende uma asparagina na posição 579 do aminoácido ou uma posição equivalente. Na proteína AHASLIA do tipo selvagem, uma serina é encontrada na posição 579. Tendo em vista que a posição correspondente na proteína AHASLl bem conhecida da Arabidopsis thaliana é a 653 de aminoácido, o gene AHASLIA codificando a proteína AHASLIA compreendendo a substituição de serina579 em asparagina é referido como o gene S653N AHASLIA para conformar-se à nomenclatura estabelecida para as seqüências AHASL de plantas.

A presente invenção fornece métodos para produzir plantas de trigo que compreendam grãos com conteúdo proteico de grãos aumentado. Em uma forma de realização, os métodos envolvem introduzir em uma planta de trigo pelo menos uma cópia de um gene AHASLl A do trigo que codifique uma proteína AHASL1A compreendendo a substituição S653N em uma planta por mutagênese, particularmente pela mutagenização de um gene AHASL1A endógeno do trigo para produzir um gene S653 AHASLIA do trigo. Qualquer método de mutagênese conhecido na técnica pode ser usado para produzir as plantas de trigo de elevado conteúdo de proteína da presente invenção. Tais métodos de mutagênese podem envolver, por exemplo, o uso de qualquer um ou mais dos seguintes mutágenos: radiação, tal como raios-X, raios Gama (por exemplo, cobalto 60 ou césio 137), nêutrons (por exemplo, o produto da fissão nuclear pelo urânio 235 em um reator atômico), radiação Beta (por exemplo, emitida por radioisótopos tais como o fósforo 32 ou o carbono 14), e radiação ultravioleta (preferivelmente de 2500 a 2900 nm), e mutágenos químicos tais como o metanossulfonato de etila (EMS), análogos base (por exemplo, 5-bromo-uracila), compostos relacionados (por exemplo a cafeína 8-etóxi), antibióticos (por exemplo, a estreptonigrina), agentes de alquilação (por exemplo, as mostardas de enxofre, as mostardas nitrogenadas, os epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso, ou acrodinas. As plantas de trigo contendo um gene S653N AHASL1A do trigo podem também ser produzidas pelo uso de métodos de cultura tecidual para seleção de células de plantas compreendendo mutações de resistência a herbicidas, seleção de plantas compreendendo um gene S653N AHASLIA, e as plantas delas regeneradas. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. n~ 5.773.702 e 5.859.348, ambas as quais ficando aqui incorporadas em sua totalidade como referencia. Outros detalhes de produção de mutação podem ser encontrados em "Principais of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company cuja apresentação fica aqui incorporada como referência.

Em uma forma de realização, a presente invenção fornece plantas de trigo de elevado teor proteico que compreendem uma, duas, três, quatro ou mais cópias do gene S653N AHASLIA ou polinucleotídeo. Por exemplo, um trigo de elevado teor proteico pode compreender uma ou duas cópias do gene S653N AHASLIA no local de AHASLIA do trigo nativo e pode, adicionalmente ou alternativamente compreender uma, duas, três ou mais cópias do polinucleotídeo S653N AHASLIA que á operavelmente ligado ao promotor de AHASLIA do trigo nativo ou a outro promotor capaz de conduzir a expressão em uma planta, particularmente durante o enchimento do grão, tal como, por exemplo, um promotor preferido da semente ou preferido do embrião.

A presente invenção fornece métodos para produzir plantas de trigo que compreendem grãos com conteúdo de proteína do grão aumentado. Em uma forma de realização da invenção, os métodos compreendem transformar uma célula de planta com uma construção de polinucleotídeos compreendendo uma seqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que conduza a expressão em uma célula de planta e regenerar uma planta transformada da célula de planta transformada. O seqüência de nucleotídeos codifica uma proteína AHASLIA do trigo compreendendo uma asparagina na posição 579 do aminoácido ou em posição equivalente. As seqüências de nucleotídeos codificando as proteínas AHASL do trigo e as plantas de trigo compreendendo o gene S653N AHASLIA do trigo, foram anteriormente apresentadas. Ver a WO 2004/106529 e as Publicações dos Pedidos de Patentes U.S. n° 2004/0237134, 2004/0244080, 2005/0044597, 2006/0010514 e 2006/0095992, todas as quais ficando aqui incorporadas como referência. Em outras formas de realização, os métodos envolvem o cultivo de plantas convencionais envolvendo a polinização cruzada de uma planta de trigo contendo pelo menos uma cópia do gene S653N AHASL1A do trigo com outra planta de trigo, e podem ainda envolver a seleção de plantas progênies (F1 ou F2) que incluam as características de resistência a herbicidas da planta precursora que compreenda um gene S653N AHASLIA. Os métodos podem opcionalmente envolver a auto-polinização das plantas Fl e seleção das plantas progênies subseqüentes (F2) de modo a produzir linhagens de trigo que sejam homozigotas quanto a S653N AHASL1A. Se desejável, os métodos podem ainda envolver a auto-polinização de uma ou mais gerações subseqüentes (isto é, F2, F3, F4 etc.) e seleção das plantas progênies subseqüentes (isto é, F3, F4, F5 etc.) que sejam homozigotas quanto a S653N AHASLIA. A menos que expressamente estabelecido ou de outra forma evidente do contexto de uso, o termo "progênie", como aqui usado, não se limita à prole imediata de uma planta, mas inclui os descendentes das gerações subseqüentes.

Os métodos da presente invenção envolvem o uso de plantas de trigo compreendendo pelo menos um gene S653N AHASLIA do trigo. Tais plantas de trigo incluem, sem limitar: uma planta de trigo depositada na American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia 20110-2209 USA em 11 de janeiro de 2002, sob o número de Designação de Depósito de Patente PTA-3955, o número de Designação de Depósito de Patente PTA-4113, depositado na American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia 20110- 2209 U.S. em 19 de março de 2002; e o número de Designação de Depósito de Patente PTA-4257, depositado na American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia 20110-2209 U.S. em 28 de maio de 2002; um mutante, recombinante, ou geneticamente engenheirado derivado da planta de trigo com os números de Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-3955, PTA-4113 e/ou PTA-4257; quaisquer descendentes da planta com os números de Designação de Depósito de Patente PTA-3955, PTA-4113 e/ou PTA-4257; e uma planta de trigo que seja descendente de qualquer uma ou mais destas plantas. Preferivelmente, tais derivados mutantes, recombinantes ou geneticamente engenheirados de qualquer da plantas de trigo tendo o número de Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-3955, PTA-4113 e PTA-4257, e seus descendentes, compreendem as características de resistência a herbicidas da planta de trigo tendo o número de Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-3955, PTA-4113 ou PTA-4257. As plantas de trigo tendo o número de Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-3955, PTA-4113 e PTA-4257, e os derivados e seus descendentes, são descritos na Publicação dos Pedidos de Patentes U.S. n~ 2004/0237134, 2004/0244080 e 2006/0095992; todas estas ficando aqui incorporadas como referência.

Um depósito de pelo menos 2500 sementes para cada uma das linhagens de trigo tendo os números de Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-3955, PTA-4113 e PTA-4257, foi feito no Patent Depository of the American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110 USA em 3 de janeiro de 2002, em 4 de março de 2002 e em 3 de janeiro de 2002, respectivamente. Cada um destes depósitos foi feito por um período de pelo menos 30 anos, e de pelo menos 5 anos após o pedido mais recente para o fornecimento de uma amostra do depósito seja recebido pela ATCC. Estes depósitos serão mantidos sob os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os fins de Procedimento de Patentes. Adicionalmente, estes depósitos satisfazem a todas as exigências do 37 C.F.R. §§ 1.801 a 1.809, incluindo o fornecimento de uma indicação da viabilidade da amostra.

Como aqui usado, a menos que de outra forma indicado ou evidente do contexto, o termo "planta" inclui, sem limitar, as células de plantas, os protoplastos de plantas, as culturas teciduais das células de plantas de cujas plantas possam ser regeneradas, os calos das plantas, os grupos de plantas, as células de plantas que estejam intactas nas plantas, ou partes das plantas tais como, por exemplo, embriões, pólen, óvulos, cotilédones, folhas, hastes, flores, ramos, pecíolos, fruta, raízes, pontas das raízes, anteras, etc. Além disso, fica reconhecido que uma semente é uma planta.

Entende-se que "planta de trigo de elevado conteúdo proteico" significa uma planta de trigo produzida pelos métodos apresentados no presente relatório, que produza ou seja capaz de produzir grãos com níveis do conteúdo proteico que sejam aumentados sobre o nível de uma planta de trigo semelhante que não compreenda em seu genoma pelo menos uma cópia de um gene S653N AHASLIA do trigo da presente invenção. Em uma forma de realização preferida da invenção, as plantas de trigo de elevado conteúdo de proteínas são as plantas de trigo de Triticum aestivum.

O grão produzido pelas plantas de trigo de alto teor de proteínas da invenção é aqui referido como "grão de alto conteúdo de proteínas".

A "característica de alto conteúdo de proteínas" da presente invenção é o conteúdo elevado de proteínas dos grãos e é devida à presença do gene S653N AHASLIA do trigo ou polinucleotídeo da presente invenção no genoma de uma planta de trigo. Tais genes S653N AHASLIA incluem os genes S653N AHASLIA de qualquer espécie de trigo que possuam o genoma A, incluindo, mas sem limitar, o Triticum aestivum L., T. monococcum L., T. turgidum L (incluindo, sem limitar, as subespécies carthlicum, duram, dicoccoides, dicoccum, polonicum e turanicum), e T. spelta L.

A presente invenção fornece plantas de trigo de alto teor de proteínas que produzem grãos com conteúdo proteico dos grãos aumentado. Tipicamente, o conteúdo proteico dos grãos é determinado como um percentual do peso do grão seco, maduro. Geralmente, o conteúdo de proteína do grão produzido pelas plantas de trigo da presente invenção é de pelo menos cerca de 4, 5, 6 ou 7% mais elevado do que pelas plantas de trigo de controle semelhantes que não contêm uma cópia de um gene S653N AHASLIA. De preferência, o conteúdo de proteína do grão produzido pelas plantas de trigo da presente invenção é de pelo menos cerca de 8, 9, 10 ou 11% mais elevado do que pelas plantas de trigo de controle semelhantes. Mais preferivelmente, o conteúdo proteico do grão produzido pelas plantas de trigo da presente invenção é de pelo menos cerca de 12, 13, 14 ou 15% mais elevado do que pelas plantas de trigo de controle semelhantes. Ainda mais preferível, o conteúdo proteico do grão produzido pelas plantas de trigo da presente invenção é pelo menos cerca de 15, 16, 17 ou 18% mais elevado do que pelas plantas de trigo de controle semelhantes. Mesmo mais preferível ainda, o conteúdo proteico do grão produzido pelas plantas de trigo da presente invenção é de pelo menos é de pelo menos cerca de 19, 20, 21 ou 22% mais elevado do que nas plantas de trigo de controle semelhantes. O mais preferível, o conteúdo proteico do grão de trigo produzido pelas plantas de trigo da presente invenção é pelo menos cerca de 23% mais elevado do que nas plantas de trigo de controle semelhantes.

A presente invenção não depende de quaisquer métodos particulares para se determinar o conteúdo proteico dos grãos ou de outros componentes do grão, tais como o conteúdo de umidade e os níveis dos aminoácidos individuais. Quaisquer métodos conhecidos na técnica podem ser usados para se determinar o conteúdo proteico dos grãos, a umidade e os aminoácidos individuais. Ver, por exemplo, Official Methods of Analysis of AOAC International (2005), 18â Edição, AOAC International, Gaithersburg, MD, USA, Métodos Oficiais 990.03 (proteína bruta), 930.15 (umidade) e 982.30 (relação de eficiência de aminoácidos/proteína); aqui incorporado como referência.

Como aqui usado, um "derivado" de uma planta ou uma "planta de trigo derivada" é uma planta de trigo que é um descendente ou clone de uma planta de trigo de alto teor proteico da presente invenção e compreende pelo menos uma cópia de um gene S653N AHASLIA do trigo que tenha sido herdado de uma planta de trigo de alto teor proteico e seja também uma planta de trigo de alto teor proteico como definido neste relatório, a menos que de outra forma indicado ou evidente do contexto. Tais derivados ou plantas de trigo derivadas incluem os descendentes de uma planta de trigo de alto teor proteico que resultem de reprodução sexual e/ou assexual e, assim, incluem as plantas de trigo tanto não transgênicas quanto transgênicas.

A presente invenção é dirigida a plantas de trigo de alto teor de proteínas que sejam plantas de trigo tolerantes a herbicidas ou resistentes a herbicidas. Por uma planta "tolerante a herbicidas" ou "resistente a herbicidas" é entendido que uma planta que seja tolerante ou resistente a pelo menos um herbicida em um nível que deva normalmente matar ou inibir o crescimento de uma planta normal ou do tipo selvagem. As plantas de trigo de alto teor proteico da invenção compreendem uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida, particularmente uma S653N AHASLIA. Por "proteína AHASL tolerante a herbicida" ou "proteína AHASL resistente a herbicida" denota-se que uma tal proteína AHASL apresenta atividade AHAS mais elevada, em relação à atividade AHAS de uma proteína AHASL do tipo selvagem, quando na presença de pelo menos um herbicida que se saiba interfira com a atividade AHAS e em uma concentração ou nível do herbicida que se saiba iniba a atividade AHAS da proteína AHASL do tipo selvagem. Além disso, a atividade AHAS de uma tal proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ser aqui referida como atividade AHAS "tolerante a herbicida" ou "resistente a herbicida".

Para a presente invenção, as expressões "tolerante a herbicida" e "resistente a herbicida" são usadas intercambiavelmente e se pretende que tenham um significado equivalente e um escopo equivalente. De forma semelhante, as expressões "tolerância a herbicida" e "resistência a herbicida" são usadas intercambiavelmente e pretende-se que tenham um significado equivalente e um escopo equivalente. Da mesma forma, as expressões "resistente à imidazolinona" e "resistência à imidazolinona" são usadas intercambiavelmente e se pretende tenham um significado equivalente e um escopo equivalente às expressões "tolerante à imidazolinona" e "tolerância à imidazolinona", respectivamente.

A invenção inclui o uso de polinucleotídeos AHASL de trigo resistente a herbicidas e de proteínas AHASL de trigo resistente a herbicidas, particularmente os genes S653N AHASLIA do trigo ou polinucleotídeos, e as proteínas S653N AHASL1A do trigo. Por "polinucleotídeo AHASL resistente a herbicidas" considera-se um polinucleotídeo que codifique uma proteína compreendendo a atividade AHAS resistente a herbicida. Por "proteína AHASL resistente a herbicidas" denota-se uma proteína ou polipeptídeo que compreenda atividade AHAS resistente a herbicida.

Além disso, é reconhecido que uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida possa ser introduzida em uma planta pela transformação de uma planta ou seu antepassado com uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida. Tais proteínas AHASL tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida são codificadas pelos polinucleotídeos AHASL tolerantes a herbicidas ou resistentes a herbicidas. Alternativamente, uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ocorrer em uma planta como resultado de uma mutação de ocorrência natural ou induzida em um gene AHASL endógeno no genoma de uma planta ou de seu progenitor.

A presente invenção fornece plantas de trigo de elevado conteúdo proteico e tecidos de plantas, células de plantas e seus grãos, que compreendem tolerância a pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida que interfira com a atividade da enzima AHAS, mais em particular uma imidazolinona ou herbicida de sulfoniluréia. A quantidade ou concentração preferidas do herbicida é uma "quantidade eficaz" ou "concentração eficaz". Por "quantidade eficaz" ou "concentração eficaz" denota-se uma quantidade e concentração, respectivamente, que seja suficiente para matar ou inibir o crescimento de uma planta, tecido de planta, célula de planta, micrósporo ou célula hospedeira, do tipo selvagem, mas que a referida quantidade não extermine ou iniba tão severamente o crescimento das plantas, dos tecidos de plantas, das células de plantas, dos micrósporos, e das células hospedeiras, resistentes a herbicida, da presente invenção. Tipicamente a quantidade eficaz de um herbicida é uma quantidade que seja rotineiramente usada nos sistemas de produção agrícola para matar ervas daninhas de interesse. Uma tal quantidade é conhecida daqueles de habilidade normal na técnica, ou pode ser facilmente determinada com o uso dos métodos conhecidos na técnica. Além disso, é reconhecido que a quantidade eficaz de um herbicida em um sistema de produção agrícola, pode ser substancialmente diferente de uma quantidade eficaz de um herbicida para um sistema de cultura de plantas, tais como, por exemplo, o sistema de cultura de micrósporo descrito abaixo no Exemplo 1.

Os herbicidas da presente invenção são aqueles que interferem com a atividade da enzima AHAS, de tal modo que a atividade AHAS seja reduzida na presença do herbicida. Tais herbicidas podem também ser aqui referidos como "herbicidas inibidores da AHAS" ou simplesmente "inibidores da AHAS". Como aqui usado, um "herbicida inibidor da AHAS" ou um "inibidor da AHAS" não significam ser limitados a um único herbicida que interfira com a atividade da enzima AHAS. Assim sendo, a menos que de outra forma estabelecido ou evidente do contexto, um "herbicida inibidor da AHAS" ou um "inibidor da AHAS" pode ser um herbicida ou uma mistura de dois, três, quatro ou mais herbicidas, cada um dos quais interfira com a atividade da enzima AHAS.

Por "planta de trigo do tipo selvagem semelhante" denota-se uma planta de trigo que carece das características de grão de alto teor proteico e de resistência a herbicida, que são apresentadas neste relatório. O uso da expressão "tipo selvagem" não implica, portanto, em que uma planta, tecido de planta, célula de planta ou outra célula hospedeira careçam do DNA recombinante em seu genoma, e/ou não possuam as características resistentes a herbicidas que sejam diferentes daquelas aqui apresentadas.

As plantas da presente invenção incluem tanto plantas não transgênicas quanto plantas transgênicas. Por "planta não transgênica" denota-se uma planta destituída de DNA recombinante em seu genoma. Por "planta transgênica" denota-se uma planta contendo DNA recombinante em seu genoma. Uma tal planta transgênica pode ser produzida pela introdução do DNA recombinante no genoma da planta. Quando tal DNA recombinante é incorporado no genoma da planta transgênica, a progênie da planta pode também compreender o DNA recombinante. Uma planta progênie que compreenda pelo menos uma porção do DNA recombinante de pelo menos uma planta transgênica progenitora, é também uma planta transgênica.

A presente invenção envolve plantas de trigo compreendendo as proteínas AHASLIA com uma substituição de aminoácido em uma posição 579 de aminoácido, que se situe dentro de uma região conservada conhecida da proteína AHASLIA de trigo. Ver Tabela 4 abaixo. Aqueles de experiência normal reconhecerão que tais posições de aminoácido podem variar, dependendo se os aminoácidos são adicionados à, ou removidos da, por exemplo, extremidade N-terminal de uma seqüência de aminoácidos. Assim, a invenção inclui a proteína AHASLIA de trigo com substituições de amino na posição citada ou em posição equivalente (por exemplo, "posição 579 de aminoácidos ou posição equivalente"). Por "posição equivalente" denota-se uma posição que se situe dentro da mesma região conservada como a posição dos aminoácidos exemplificada, Ver a Tabela 4, abaixo. Tendo em vista que a posição equivalente à 579 de aminoácidos da proteína AHASLIA do trigo, é a 653 de aminoácidos da proteína AHASLl de Arabdopsis thaliana, a proteína AHASLIA do trigo com a substituição da serina por asparagina na posição 579 de aminoácidos é também referida aqui como a proteína S653N AHASLIA do trigo para conformar-se à nomenclatura bem aceita no campo da presente invenção, que se baseia na seqüência de aminoácidos da proteína AHASLl de Arabdopsis thaliana. De forma semelhante, o gene ou polinucleotídeo codificando a proteína S653N AHASLIA é referida aqui como o gene S653N AHASL1A do trigo ou o polinucleotídeo S653N AHASLIA do trigo.

A presente invenção refere-se a plantas de trigo de alto teor de proteínas compreendendo tolerância ou resistência aumentadas a pelo menos um herbicida que interfira com a atividade da enzima AHAS. Tais herbicidas inibidores de AHAS incluem herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfoniluréia, herbicidas de triazolpirimidina, herbicida de pirimidinilóxi- benzoato, herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona, ou misturas destes. Preferivelmente, o herbicida inibidor de AHAS é um herbicida de imidazolinona. Para a presente invenção, os herbicidas de imidazolinona incluem, porém sem limitar, o PURSU1T® (imazethapyr), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquin), ASSERT® (imazethabenz), ARSENAL® (imazapyr), um derivado de qualquer dos herbicidas acima mencionados, e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas acima mencionados, por exemplo imazapyr/imazamox (ODYSSEY®). Mais especificamente, o herbicida de imidazolinona pode ser selecionado, sem limitação, dentre o ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin-2-il)- nicotínico, ácido [2-(4-isopropil)-4-] [metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3- quinolinocarboxílico], ácido [5-etil-2-(4-isopropil]4-metil-5-oxo-2-imidazolin -2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5- (metoximetil)-nicotínico, ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-]imidazolin- 2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de [6-(4-isopropil-4-]metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-m-toluato de metila e [2-(4-isopropil-4-metil-5]-oxo-2- imidazolin-2-il)-p-toluato de metila. O uso do ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4- metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico e do ácido [2-(4-isopropil-4-metil- 5-oxo-2-imidazolin-2-]il)-5-(metoximetil)-nicotínico é preferido. O uso do ácido [2-(4-isopropil-4]-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)- nicotínico é particularmente preferido.

Os herbicidas de sulfoniluréia incluem, porém sem limitar, o clorsulfuron, o metsulfuron metila, o sulfometuron metila, o clorimuron etila, o tifensulfuron metila, tribenuron metila, bensulfuron metila, nicossulfuron, etametsulfuron metila, rimsulfuron, triflussulfuron metila, triassulfuron, mrimissulfuron metila, cinossulfuron, amidossulfiuon, fluzassulfuron, imazossulfuron, pirazossulfuron etila, halossulfuron, azimsulfuron, ciclossulfuron, etoxissulfuron, flazassulfuton, flupirsulfuron metila, foramsulfuron, iodossulfuron, oxassulfuron, mesossulfuron, prossulfuron, sulfossulfuron, trifloxissulfuron, tritossulfuron, um derivado de qualquer dos herbicidas acima mencionados, e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas acima mencionados. Os herbicidas de triazolopirimidina da invenção incluem, porém sem limitar, o cloransulam, diclossulam, florassulam, flumetsulam, metossulam e penoxsulam. Os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato da invenção incluem, porém sem limitar, o bispiribac, piritiobac, piriminobac, piribenzoxim e piriftalid. Os herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona incluem, porém sem limitar, flucarbazona e propoxicarbazona.

E reconhecido que os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato são intimamente relacionados com os herbicidas de pirimidiniltiobenzoato e são generalizados sob o título do último nome pela Weed Science Society of America. Conseqüentemente, os herbicidas da presente invenção ainda incluem os herbicidas de pirimidiniltiobenzoato, incluindo, porém sem limitar, os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato descritos acima.

A presente invenção provê métodos para produzir uma planta de trigo de elevado teor de proteínas, envolvendo a introdução no genoma de uma planta de trigo de pelo menos uma cópia de um gene S653N de AHASLIA do trigo, de modo a produzir uma planta de trigo de elevado teor de proteínas. Em uma forma de realização da invenção, pelo menos uma cópia de um gene S653N AHASLIA do trigo é introduzida em uma planta de trigo pela transformação desta com uma construção de polinucleotídeo compreendendo um promotor operavelmente ligado a uma seqüência de polinucleotídeo S653N AHASLIA de trigo da invenção. Os métodos envolvem introduzir a construção de polinucleotídeo da invenção em pelo menos uma célula de planta e regenerar um planta dela transformada. Os métodos ainda envolvem o uso de um promotor que seja capaz de conduzir a expressão de genes em uma célula de planta. Preferivelmente, um tal promotor é um promotor que conduz a expressão no grão de trigo em desenvolvimento, particularmente durante o período em que se saiba ocorra o acúmulo de proteína. Tais promotores incluem, por exemplo, promotores constitutivos e promotores preferidos das sementes. Uma planta de trigo produzida por este método compreende atividade de AHAS aumentada, particularmente atividade de AHAS tolerante a herbicidas, e aumenta o conteúdo proteico do grão em comparação com uma planta de trigo semelhante não transformada.

O uso da expressão "construções de polinucleotídeos", neste relatório, não intenta limitar a presente invenção a construções de polinucleotídeos compreendendo DNA. Aqueles de experiência normal na técnica reconhecerão que as construções de polinucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos, consistidas de ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, podem também ser empregadas nos métodos aqui apresentados. Assim, as construções de polinucleotídeos da presente invenção incluem todas as construções de polinucleotídeos que possam ser empregadas nos métodos da presente invenção para transformar plantas, incluindo, porém sem limitar, aquelas consistidas de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e combinações destes. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas de ocorrência natural quanto análogos sintéticos. As construções de polinucleotídeos da invenção também incluem todas as formas de construções de polinucleotídeos incluindo, porém sem limitar, as formas de filamento único, as formas de filamento duplo, as estruturas de grampo de cabelo, de talo-e-alça, e outras. Além disso, é entendido por aqueles de experiência normal na técnica, que cada seqüência de nucleotídeos aqui apresentada também inclui o complemento daquela seqüência de nucleotídeos exemplificada.

Além disso, é reconhecido que, para a expressão de um polinucleotídeo da invenção em uma planta, o polinucleotídeo tipicamente é operavelmente ligado a um promotor que seja capaz de conduzir a expressão do gene na planta de interesse. Os métodos da invenção não dependem do promotor particular. Os métodos incluem o uso de qualquer promotor que seja conhecido na técnica e que seja capaz de conduzir a expressão do gene na planta de interesse.

Em certas formas de realização, os métodos da presente invenção envolvem transformar plantas de trigo com os polinucleotídeos S653N AHASLIA do trigo, que sejam fornecidos em cassetes de expressão para a expressão nas plantas de trigo. O cassete incluirá seqüências reguladoras 5' e 3' operavelmente ligadas a um polinucleotídeo S653N AHASLIA do trigo. Por "operavelmente ligadas" intenta-se exprimir uma articulação funcional entre um promotor e uma segunda seqüência, em que a seqüência promotora inicia e medeia a transcrição da seqüência de DNA correspondente à segunda seqüência. Geralmente, operavelmente ligadas significa que as seqüências de ácido nucléico sendo ligadas são contíguas e, quando necessário unir duas regiões codificadoras de proteínas, contíguas e na mesma matriz de leitura. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional a ser cotransformado nos organismos. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser provido(s) em cassetes de expressão múltiplos.

Um tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção do polinucleotídeo S653N AHASLIA do trigo para ficar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis.

O cassete de expressão incluirá na direção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação transcricional e translacional (isto é, um promotor), um polinucleotídeos S653N AHASLIA do trigo da invenção, e uma região transcricional e translacional (isto é, região de terminação) funcional nas plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou estranho ou heterólogo, ao hospedeiro da planta e/ou ao polinucleotídeo S653N AHASLIA do trigo. Adicionalmente, o promotor pode ser a seqüência natural ou alternativamente uma seqüência sintética. Quando o promotor é "estranho" ou "heterólogo" ao hospedeiro da planta, entende-se que o promotor não seja encontrado na planta nativa em que o promotor é introduzido. Quando o promotor é "estranho" ou "heterólogo" ao polinucleotídeos S653N AHASLIA do trigo, pretende-se que o promotor não seja o promotor nativo ou de ocorrência natural para o polinucleotídeo S653N AHASLIA do trigo operavelmente ligado. Como aqui usado, um gene quimérico compreende uma seqüência codificadora operavelmente ligada a uma região de iniciação da transcrição que seja heteróloga à seqüência codificadora.

Embora possa ser preferível expressar os polinucleotídeos S653N AHASLIA do trigo com o uso de promotores heterólogos, as seqüências promotoras nativas podem ser usadas. Tais construções devem mudar os níveis de expressão da proteína S653N AHASLIA do trigo na planta ou célula de planta. Assim, o fenótipo da planta ou da célula de planta é alterado.

A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com a operavelmente ligada ao polinucleotídeo S653N AHASLl A do trigo, pode ser nativa com o hospedeiro da planta, ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, ao polinucleotídeo S663N AHASLIA do trigo de interesse, à planta hospedeira, ou a qualquer de suas combinações). Regiões de terminação convenientes acham-se disponíveis do Ti-plasmídeo de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação da octopina sintase e da nopalina sintase. Ver, também, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891- 7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

Quando apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para expressão aumentada na planta transformada. Isto é, os genes podem ser sintetizados com o uso de códons preferidos da planta para expressão melhorada. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1- 11 para um exame do emprego do códon preferido do hospedeiro. Métodos se acham disponíveis na técnica para sintetizar os genes preferidos das plantas. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. n- 5.380.831 e 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, aqui incorporados como referência.

As modificações adicionais das seqüências são conhecidas para acentuar a expressão dos genes em um hospedeiro celular. Estas incluem a eliminação das seqüências codificando sinais de poliadenilação espúrios, sinais do sítio de enlace de éxon-íntron, repetições semelhantes ao transpóson, e outras de tais seqüências bem caracterizadas que possam ser deletérias à expressão de genes. O conteúdo G-C da seqüência pode ser ajustado à média dos níveis para um dado hospedeiro celular, como calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a seqüência é modificada para evitar as estruturas de mRNA secundárias de grampo de cabelo previstas.

As seqüências de nucleotídeos para intensificar a expressão dos genes podem também ser usadas nos vetores de expressão das plantas. Estas incluem os íntrons do milho AdhI, o gene íntronl (Callis et al. Genes and Development 1: 1183-1200, 1987), e seqüências condutoras, (seqüência W) do vírus do Mosaico do Tabaco (TMV), Vírus da Mancha Clorótica do Milho e Vírus do Mosaico da Alfafa (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15: 8693-8711, 1987 e Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15: 65-79, 1990). O primeiro íntron do local encolhido-1 do milho foi mostrado aumentar a expressão de genes nas construções de genes quiméricos. As Patentes U.S. n— 5.424.412 e 5.593.874 apresentam o uso de íntrons específicos nas construções de expressão de genes, e Gallie et al. (Plant Physiol. 106: 929- 939, 1994) também mostraram que os íntrons são úteis para regular a expressão de genes em uma base específica do tecidual. Para ainda reforçar ou otimizar a expressão de genes da pequena subunidade AHAS, os vetores de expressão da planta da invenção podem também conter seqüências de DNA contendo regiões de ligação da matriz (MARs). As células das plantas transformadas com tais sistemas de expressão modificados, então, podem apresentar a superexpressão ou a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos da invenção.

Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter as seqüências condutoras 5' na construção do cassete de expressão. Tais seqüências condutoras podem atuar de modo a intensificar a translação. Os condutores da translação são conhecidos na técnica e incluem: os condutores do picornavírus, por exemplo, o condutor EMCV (região não codificadora 5' da encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); os condutores do potivírus, por exemplo, o condutor do TEV (Vírus da Corrosão do Tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), condutor MDMV (Vírus Mosaico Anão do Milho) (Virology 154: 9-20), e a proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); condutor não transladado do mRNA da proteína da casca do vírus mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); condutor do vírus mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e o condutor do vírus da mancha clorótica do milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). Ver também Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968. Outros métodos conhecidos para intensificar a translação podem também ser utilizados, por exemplo íntrons e outros.

No preparo do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a levar em conta as seqüências de DNA na orientação apropriada e, quando apropriado, na própria matriz de leitura. Para este fim, adaptadores ou articuladores podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para levar em conta sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição, ou coisa parecida. Para este fim, a mutagênese in vitro, reparo do preparador, restrição, recozimento, ressubstituições, por exemplo transições e transversões, podem ser envolvidas.

Vários promotores podem ser usados na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucléicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferidos dos tecidos, ou outros promotores para expressão nas plantas. Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos apresentados na WO 99/43838 e na Patente U.S. n° 6.072.050; o promotor CaMV 35S do núcleo (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); a actina do arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); a ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); o promotor ALS (Patente U.S. n° 5.659.026), e outros. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, as Patentes U.S. n- 5.608.149, 5.608.144, 5.604.121, 5.569.597, 5.466.785, 5.399.680, 5.268.463, 5.608.142 e 6.177.611.

Os promotores preferidos do tecido podem ser utilizados para a expressão alvo AHASLl intensificada dentro de um tecido de planta particular. Tais promotores preferidos do tecido incluem, sem que a estes fiquem limitados, os promotores preferidos pelas folhas, os promotores preferidos pelas raízes, os promotores preferidos pelas sementes, e os promotores preferidos pelas hastes, Os promotores preferidos pelo tecido incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90(20): 9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3): 495-505. Esses promotores podem ser modificados, se necessário, para fraca expressão.

Em uma forma de realização, os ácidos nucléicos de interesse são alvejados ao cloroplasto para expressão. Desta maneira, quando o ácido nucléico de interesse não seja diretamente introduzido no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adicionalmente uma seqüência de alvejamento do cloroplasto compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifique um peptídeo de trânsito do cloroplasto para dirigir o produto de genes de interesse aos cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Com respeito às seqüências de alvejamento do cloroplasto, "operavelmente ligado" significa que a seqüência de ácidos nucléicos codificando um peptídeo de trânsito (isto é, a seqüência de alvejamento do cloroplasto) é ligada ao polinucleotídeo S653N AHASL1A do trigo, de tal modo que as duas seqüências fiquem contíguas e na mesma matriz de leitura. Ver, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233: 478-481. Embora as proteínas AHASL1 da invenção incluam um peptídeo de trânsito do cloroplasto nativo, qualquer peptídeo de trânsito do cloroplasto conhecido na técnica pode ser fundido à seqüência de aminoácidos de uma proteína AHASL1A madura da invenção, operavelmente ligando uma seqüência de alvejamento do cloroplasto à extremidade 5' de uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASLIA madura da invenção.

As seqüências de alvejamento do cloroplasto são conhecidas na técnica e incluem a subunidade pequena do cloroplasto da ribulose-1,5- bisfosfato carboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5): 3335- 3342); 5-(enolpiruvil)chiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6): 789-810); triptofano sintase (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11): 6081-6087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33): 20357-20363); corismato sintase (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36): 27447-27457); e a proteína de ligação a/b da clorofila de colheita clara (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999). Ver também Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della- Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233: 478-481.

Métodos para transformação dos cloroplastos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 913- 917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. O método depende da liberação de partículas por pistola, do DNA contendo um marcador selecionável e alvejamento do DNA ao genoma plastídico através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação dos plastídios pode ser realizada por transativação de um transgene carregado por plastídeo silencioso por expressão preferida do tecido, de uma RNA polimerase de codificação nuclear e dirigida ao plastídio. Um tal sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305.

Os ácidos nucléicos de interesse a serem alvejados ao cloroplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto para responder pelas diferenças no uso do códon entre os núcleos das plantas e esta organela. Desta maneira, os ácidos nucléicos de interesse podem ser sintetizados com o uso dos códons preferidos pelo cloroplasto. Ver, por exemplo, a Patente U.S. n° 5.380.831, aqui incorporada como referência.

Como aqui apresentado, a invenção fornece métodos para produzir plantas de trigo de elevado teor proteico, que compreendem resistência a um herbicida inibidor de AHAS. As plantas de trigo compreendem em seus genomas pelo menos uma cópia de um gene S653N AHASL1A de trigo. Um tal gene pode ser um gene endógeno ou um transgene como aqui apresentado. Adicionalmente, em certas formas de realização, o gene S653N AHASL1A do trigo pode ser disposto com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeos de interesse, incluindo outros genes AHASL1 resistentes a herbicidas, de modo a criar plantas de trigo com um fenótipo desejado. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser dispostos com quaisquer outros polinucleotídeos codificando polipeptídeos tendo atividade pesticida e/ou inseticida, tais como, por exemplo, as proteínas da toxina de Bacillus thuringiensis (descritas nas Patentes U.S. η*5 5.366.892, 5.747.450, 5.737.514, 5.723.756, 5.593.881; e em Geiser et al. (1986) Gene 48: 109). As combinações geradas podem também incluir cópias múltiplas de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse.

Os cassetes de expressão da invenção podem incluir um gene marcador selecionável para a seleção das células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis, incluindo aqueles da presente invenção, são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem, porém sem limitar, genes codificando a resistência a antibióticos, tais como aqueles codificando a neomicina fosfotransferase II (NEO) e a higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes conferindo resistência aos compostos herbicidas, tais como o glufosinato amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ver, de uma forma geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl Acad. Sei. USA 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al. (1980) em The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48: 555-566; Brown et al. (1987) Cell 49: 603-612; Figge et al. (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86: 5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 89: 3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 88: 5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleie Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topies Mol. Struc. Biol. 10: 143- 162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinsehnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 89: 5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 78 (Springer-Verlag, Berlim); Gill et al. (1988) Nature 334: 721-724. Tais apresentações são aqui incorporadas como referência.

A lista acima de genes marcadores selecionáveis não deve ser considerada como limitativa. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado na presente invenção.

As construções de polinucleotídeos e cassetes de expressão compreendendo os polinucleotídeos S653N AHASLIA do trigo podem ser usados nos vetores para transformar as plantas de trigo. Os polinucleotídeos S653N AHASLIA do trigo podem ser usados nos vetores sozinhos ou em combinação com uma seqüência de nucleotídeos codificando a pequena subunidade da enzima AHAS (AHASS) em conferir resistência a herbicidas nas plantas. Ver a Patente U.S. n2 6.348.643, que fica aqui incorporada como referência.

A invenção também diz respeito a um método para criar uma planta transgênica de trigo que produza grãos com conteúdo aumentado de proteínas e que seja resistente a herbicidas, compreendendo transformar uma planta com uma construção de polinucleotídeo contendo um promotor que conduza a expressão em uma planta operavelmente ligada a um polinucleotídeo S653N AHASLIA do trigo.

A invenção também diz respeito às plantas de trigo não transgênicas, às plantas de trigo transgênicas produzidas pelos métodos da invenção, e à progênie e outros descendentes de tais plantas de trigo não transgênicas e transgênicas, plantas estas que apresentam resistência intensificada ou aumentada aos herbicidas que interferem com a enzima AHAS, particularmente os herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia e produzem grãos com conteúdo de proteínas aumentado.

As plantas de trigo com elevado teor proteico da presente invenção podem compreender em seus genomas, além de pelo menos uma cópia de um gene S653N AHASLIA do trigo, um ou mais polinucleotídeos AHASL adicionais. As seqüências de nucleotídeos codificando as proteínas AHASL tolerante a herbicidas e as plantas tolerantes a herbicidas contendo um gene endógeno que codifique uma proteína AHASL tolerante a herbicida, incluem os polinucleotídeos e as plantas da presente invenção e aquelas que são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. n- 5.013.659, 5.731.180, 5.767.361, 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796, todas as quais ficando aqui incorporadas como referência.

Numerosos vetores de transformação de plantas e métodos para transformar plantas, acham-se disponíveis. Ver, por exemplo, An, G. et al. (1986) Plant Physiol, 81: 301-305; Fry, J. et al. (1987) Plant Cell Rep. 6: 321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl. Genet. 76: 767-774; Cousins et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18: 481-494; Chee, Ρ. P. e Slightom, J. L. (1992) Gene 118: 255-260; Christou et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10: 239-246; D'Halluin et al. (1992) Bio/Technol. 10: 309-314; Dhir et al. (1992) Plant Physiol. 99: 81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90: 11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P: 119- 124; Davies et al. (1993) Plant Cell Rep. 12: 180-183; Dong, J. A. e Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91: 139-148; Franklin, C. I. e Trieu, Τ. N. (1993) Plant. Physiol. 102: 167; Golovkin et al. (1993) Plant Sei. 90: 41-52; Guo Chin Sci. Buli. 38: 2072-2078; Asano et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres, Ν. Μ. e Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13: 219-239; Barcelo et ai. (1994) Plant. J. 5: 583-592; Beeker et al. (1994) Plant. J. 5: 299- 307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16: 225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13: 582-586; Hartman et al. (1994) Bio-Technology 12: 919-923; Ritala et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24: 317-325; e Wan5 Y. C. e Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104: 3748.

Os métodos da invenção envolvem introduzir uma construção de polinucleotídeo em uma planta. Por "introduzir uma construção de polinucleotídeo" intenta-se significar apresentar à planta a construção de polinucleotídeos de uma maneira tal que a construção obtenha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introduzir uma construção de polinucleotídeo em uma planta, apenas que a construção de polinucleotídeo obtenha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir construções de polinucleotídeos nas plantas são conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitar, os métodos de transformação estável, os métodos de transformação transiente, e os métodos mediados por vírus.

Por "transformação estável" denota-se que a construção de polinucleotídeo introduzida em uma planta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdada pela sua progênie. Por "transformação transiente" entende-se que uma construção de polinucleotídeo introduzida em uma planta não se integra no genoma da planta.

Para a transformação das plantas e das células das plantas, os polinucleotídeos S653N AHASLIA do trigo são introduzidos com o uso de técnicas padrão em qualquer vetor conhecido na técnica que seja adequado para expressão das seqüências de nucleotídeos em uma planta ou célula de planta. A seleção do vetor depende da técnica de transformação preferida e da espécie de planta alvo a ser transformada. Em uma forma de realização da invenção, um polinucleotídeo S653N AHASL1A do trigo é operavelmente ligado a um promotor da planta que seja conhecido para expressão de alto nível em uma célula da planta, e esta construção é então introduzida em uma planta que seja suscetível a um herbicida de imidazolinona e a uma planta transformada que se tenha regenerado. A planta transformada é tolerante à exposição a um nível de um herbicida de imidazolinona que deva exterminar ou significativamente danificar uma planta não transformada. Este método pode ser aplicado a qualquer espécie de planta; entretanto, é mais benéfico quando aplicado a plantas de colheita, particularmente a plantas de colheitas que sejam tipicamente cultivadas na presença de pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona.

As metodologias para construir os cassetes de expressão das plantas e introduzir ácidos nucléicos estranhos nas plantas, são geralmente conhecidas na técnica e foram anteriormente descritas. Por exemplo, o DNA estranho pode ser introduzido nas plantas, com o uso de vetores plasmídios indutores de tumores (Ti). Outros métodos utilizados para liberar o DNA estranho envolve o uso da transformação do protoplasto mediado por PEG, a eletroporação, os filamentos de microinjeção, e o bombardeamento biolístico ou de microprojéteis para absorção direta do DNA. Tais métodos são conhecidos na técnica (Patente U.S. ns 5.405.765 para Vasil et al; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104- 112; Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al., (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., (1980) Science 208: 1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229- 1231; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach e Weissbach, editores) Academic Press, Inc. (1988) e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, editores) Academic Press, Inc. (1989). O método de transformação depende da célula da planta a ser transformada, da estabilidade dos vetores usados, do nível de expressão dos produtos do gene e de outros parâmetros.

Outros métodos adequados de introduzir seqüências de nucleotídeos nas células da planta e subseqüente introdução no genoma da planta, incluem a microinjeção como Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334, eletroporação como descrito por Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606, transformação mediada pela Agrobacterium como descrito por Townsend et al., Patente U.S. n2 5.563.055, Zhao et al., Patente U.S. n° 5.981.840, transferência direta de genes como descrito por Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722, e aceleração de partículas balísticas, como descrito, por exemplo, em Sanford et al., Patente U.S. ns 4.945.050, Tomes et al., Patente U.S. n° 5.879.918, Tomes et al., Patente U.S. ne 5.886.244, Bidney et al., Patente U.S. n° 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment" em Plant Cell, Tissue, e Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); e transformação Lecl (WO 00/28058). Ver também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (feijão soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (feijão soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (feijão soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (feijão soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6: 559-563 (milho); Tomes, Patente U.S. n° 5.240.855; Buising et al., Patentes U.S. rF 5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment" em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlim) (milho); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; Bowen et al., Patente U.S. n° 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformação mediada por filamento); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (milho através da Agrobacterium tumefaciens); todos os quais aqui incorporados como referência.

Os polinucleotídeos S653 AHASLIA do trigo da invenção podem ser introduzidos nas plantas mediante o contato das plantas com um vírus ou ácidos nucléicos virais. Geralmente tais métodos envolvem incorporar uma construção de polinucleotídeo da invenção dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral. É reconhecido que um polinucleotídeo S653 AHASLIA do trigo pode ser inicialmente sintetizado como parte de uma poliproteína viral, o qual mais tarde pode ser processado por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Além disso, é reconhecido que os promotores da invenção também incluem promotores utilizados para transcrição por RNA polimerases virais. Os métodos para introduzir construções de polinucleotídeo nas plantas e expressar uma proteína nelas codificadas, envolvendo moléculas de DNA ou RNA virais, são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. n~ 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931; aqui incorporadas como referência.

As células que tenham sido transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com meios convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas, e também polinizada com a mesma cepa transformada ou com diferentes cepas, e o híbrido resultante tendo a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada, identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada, e depois as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido alcançada. Desta maneira, a presente invenção fornece semente transformada (também referida como "semente transgênica" com uma construção de polinucleotídeos da invenção, por exemplo um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporada em seu genoma.

As plantas de trigo com alto teor de proteínas da presente invenção encontram uso nos métodos para controlar as ervas daninhas. Assim, a presente invenção ainda fornece um método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta de trigo de alto teor proteico da invenção. O método compreende aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida às ervas daninhas e à planta de trigo de alto teor proteico, em que a planta de trigo de alto teor proteico possua resistência aumentada a pelo menos um herbicida, em particular um herbicida de imidazolinona ou de sulfoniluréia, em comparação com uma planta de trigo semelhante do tipo selvagem.

Pelo fornecimento de plantas de trigo de alto teor proteico tendo resistência aumentada a herbicidas, particularmente os herbicidas de imidazolinona e de sulfoniluréia, uma ampla variedade de formulações pode ser empregada para proteger as plantas contra as ervas daninhas, de modo a reforçar o crescimento das plantas e reduzir a competição quanto aos nutrientes. Um herbicida pode ser usado por si próprio para controle de pré- emergência, pós-emergência, pré-plantio e no controle no plantio das ervas daninhas em áreas que circundam as plantas descritas neste relatório, ou uma formulação de herbicida de imidazolinona pode ser usada que contenha outros aditivos. O herbicida pode também ser usado como um tratamento de sementes. Isto é, uma concentração eficaz ou uma quantidade eficaz do herbicida, ou uma composição compreendendo uma concentração eficaz ou uma quantidade eficaz do herbicida, podem ser aplicadas diretamente às sementes antes ou durante a semeadura das sementes. Os aditivos encontrados em uma formulação ou composição herbicidas de imidazolinona ou sulfoniluréia incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de dispersão, agentes de pegajosidade, agentes estabilizantes, ou coisa parecida.

A formulação herbicida pode ser uma preparação úmida ou seca e pode incluir, porém sem limitar, pós escoáveis, concentrados emulsificáveis e concentrados líquidos. O herbicida e as formulações herbicidas podem ser aplicadas de acordo com métodos convencionais, por exemplo por pulverização, irrigação, polvilhamento, cobertura e outros.

A presente invenção fornece métodos para produzir uma planta de trigo de alto teor de proteínas, através de reprodução convencional da planta envolvendo a reprodução sexual. Os métodos compreendem o cruzamento de um primeiro precursor de planta de trigo que compreenda em seu genoma pelo menos uma cópia de um gene ou polinucleotídeo S653N AHASL1A do trigo para um segundo precursor de planta de trigo de modo a produzir a progênie Fl. A primeira planta pode ser qualquer das plantas de trigo de alto teor de proteínas da presente invenção, incluindo, por exemplo, plantas transgênicas de trigo compreendendo pelo menos uma cópia de um gene S653N AHASL1A do trigo ou plantas de trigo não transgênicas que compreendam o gene S653N AHASL1A do trigo tais como aquelas produzidas por mutagênese, como apresentado na WO 2004/106529 e nas Publicações dos Pedidos de Patente U.S. n° 2004/0237134 e 2004/0244080, todos os quais ficando aqui incorporados como referência. A segunda planta de trigo precursora pode ser qualquer planta de trigo que seja capaz de produzir plantas de trigo progênies viáveis (isto é, sementes) quando cruzadas com a primeira planta. Tipicamente, mas não necessariamente, a primeira e a segunda plantas de trigo precursoras são da mesma espécie de trigo. Os métodos podem ainda envolver fertilização cruzada da progênie Fl para produzir a progênie F2. Adicionalmente, os métodos da invenção podem ainda envolver uma ou mais gerações de cruzamento reversível das plantas progênies Fl ou F2 para uma planta da mesma linhagem ou genótipo como ou a primeira ou a segunda planta de trigo precursora. Alternativamente, a progênie F1 do primeiro cruzamento ou de qualquer cruzamento subseqüente pode ser cruzada com uma terceira planta de trigo que seja de uma linhagem ou genótipo diferentes ou da primeira ou da segunda planta. Os métodos da invenção podem adicionalmente envolver a seleção de plantas que compreendam as características da primeira planta de resistência a herbicidas, por exemplo, pela aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida às plantas de trigo progênies que compreendam o gene S653N AHASLl do trigo, ou por métodos padrão para detectar o gene S653N AHASL1, tal como, por exemplo, PCR.

A presente invenção fornece métodos que envolvem o uso de um herbicida inibidor de AHAS. Nestes métodos, o herbicida inibidor de AHAS pode ser aplicado por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, porém sem limitar, o tratamento da semente, o tratamento do solo e o tratamento foliar.

Antes da aplicação, o herbicida inibidor de AHAS pode ser transformado nas formulações costumeiras, por exemplo soluções, emulsões, suspensões, polvilhos, pós, pastas e grânulos. A forma de uso depende dos fins particulares pretendidos; em cada caso, deve assegurar uma distribuição fina e uniforme do composto de acordo com a invenção.

As formulações são preparadas de uma maneira conhecida (ver, por exemplo, para exame, a U.S. 3.060.084, a EP-A 707 445 (para concentrados líquidos), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, 4 de dezembro de 1967, 147-148, Perry's Chemical Engineer's Handbook (Manual do Engenheiro Químico de Perry), 4- Edição, McGraw-Hill, New York, 1963, páginas 8 a 57 e seguintes, a WO 91/13546, as U.S. 4.172.714, U.S. 4.144.050, U.S. 3.920.442, U.S. 5.180.587, U.S. 5.232.701, U.S. 5.208.030, GB 2.095.558, U.S. 3.299.566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et ai., Weed Control Handbook, 8â Edição, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989, e Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Alemanha), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), por exemplo pela extensão do composto ativo com auxiliares adequados para a formulação de agroquímicos, tais como solventes e/ou carreadores, se desejável emulsificantes, tensoativos e dispersantes, conservantes, agentes antiformação de espuma, agentes anticongelamento, para a formulação de tratamento de sementes também opcionalmente colorantes e/ou aglutinantes e/ou agente de gelação.

Exemplos de solventes adequados são a água, solventes aromáticos (por exemplo os produtos da Solvesso, xileno), parafinas (por exemplo as frações de óleos minerais), álcoois (por exemplo o metanol, o butanol, o pentanol, o álcool benzílico), cetonas (por exemplo a cicloexanona, a gama-butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP), acetatos (diacetato glicol), glicóis, dimetilamidas de ácidos graxos, ácidos graxos e ésteres de ácidos graxos. Em princípio, as misturas de solventes podem também ser usadas.

Exemplos de carreadores adequados são os minerais naturais moídos (por exemplo caulins, argilas, talco, giz) e minerais sintéticos moídos (por exemplo a sílica altamente dispersa, os silicatos).

Emulsificantes adequados são os emulsificantes não iônicos e aniônicos (por exemplo, os éteres de álcool graxo de polioxietileno, os alquilsulfonatos e os arilsulfonatos).

Exemplos de dispersantes são os líquidos residuais de sulfito de lignina e a metilcelulose.

Tensoativos adequados usados são os sais de metais alcalinos, de metais alcalino-terrosos e de amônio, de ácido lignossulfônico, de ácido naftalenossulfônico, de ácido fenolsulfônico, ácido dibutilnaftalenossulfônico, alquilarilsulfonatos, sulfatos de alquila, alquilsulfonatos, sulfatos de álcoois graxos, ácidos graxos e éteres glicólicos de álcoois graxos sulfatados, além dos condensados de naftaleno sulfonado e derivados de naftaleno com formaldeído, condensados de naftaleno ou de ácido naftalenossulfônico com fenol e formaldeído, éter octilfenólico de polioxietileno, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol, alquilfenol, éteres poliglicólicos, éter poliglicólico de tributilfenila, éter poliglicólico de triestearilfenila, álcoois de poliéter alquilarílicos, condensado de óxido de etileno de álcool e álcool graxo, óleo de mamona etoxilado, éteres alquílicos de polioxietileno, polioxipropileno etoxilado, acetal de éter poliglicólico de lauril álcool, ésteres de sorbitol, líquidos residuais de lignossulfito e metilcelulose.

Substâncias que são adequadas para a preparação de soluções diretamente pulverizáveis, emulsões, pastas ou dispersões oleosas, são as frações de óleo mineral de ponto de ebulição médio a alto, tais como o querosene ou o óleo diesel, além dos óleos de alcatrão e dos óleos de origem vegetal ou animal, hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos e aromáticos, por exemplo tolueno, xileno, parafina, tetraidronaftaleno, naftalenos alquilados ou seus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, cicloexanol, cicloexanona, isoforona, solventes altamente polares, por exemplo o sulfóxido de dimetila, a N-metilpirrolidona ou água.

Igualmente os agentes anticongelamento, tais como a glicerina, o etileno glicol, o propileno glicol e os bactericidas, podem ser adicionados à formulação. Agentes antiespuma adequados são, por exemplo, os agentes antiespuma com base em silício ou estearato de magnésio.

Conservantes adequados são, por exemplo, o diclorofeno e o enzilalcoolhemiformal.

As formulações de tratamento das sementes podem compreender adicionalmente aglutinantes e, opcionalmente, colorantes.

Os aglutinantes podem ser adicionados para melhorar a aderência dos materiais ativos nas sementes após o tratamento. Aglutinantes adequados são os tensoativos de EO/PO de copolímeros de bloco, mas também os polivinilálcooisl, as polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno, polietilenoaminas, polietilenoamidas, polietilenoiminas (Lupasol®, Polymin®), poliéteres, poliuretanos, polivinilacetato, tilose e copolímeros derivados destes polímeros.

Opcionalmente, também colorantes podem ser incluídos na formulação. Colorantes ou tinturas adequadas para formulações de tratamento de sementes são a Rodamina B, C.I. Pigment Red 112, C.I. Solvent Red I, pigment blue 15:4, pigment blue 15:3, pigment blue 15:2, pigment blue 15:1, pigment blue 80, pigment yellow 1, pigment yellow 13, pigment red 112, pigment red 48:2, pigment red 48:1, pigment red 57:1, pigment red 53:1, pigment orange 43, pigment orange 34, pigment orange 5, pigment green 36, pigment green 7, pigment white 6, pigment brown 25, basic violet 10, basic violet 49, acid red 51, acid red 52, acid red 14, acid blue 9, acid yellow 23, basic red 10, basic red 108.

Um exemplo de um agente de gelação adequado é a carragenano (Satiagel®).

Pós, materiais para dispersão, e produtos pulverizáveis podem ser preparados pela mistura ou moagem concomitante das substâncias ativas com um carreador sólido. Grânulos, por exemplo grânulos revestidos, grânulos impregnados e grânulos homogêneos, podem ser preparados pela ligação dos compostos ativos a carreadores sólidos. Exemplos de carreadores sólidos são as terras minerais tais como os géis de sílica, os silicatos, talco, caulim, attaclay, pedra calcária, cal, giz, argila (ferruginosa ou aluminosa), loess, argila, dolomita, terra diatomácea, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio, materiais sintéticos moídos, fertilizantes tais como, por exemplo, o sulfato de amônio, o fosfato de amônio, o nitrato de amônio, as uréias, e produtos de origem vegetal, tais como a farinha de cereais, a farinha de casca de árvores, a serragem e a farinha de casca de nozes, pós de celulose e outros carreadores sólidos.

Em geral, as formulações compreendem de 0,01 a 95% em peso, preferivelmente de 0,1 a 90% em peso, do herbicida inibidor de AHAS. Neste caso, os herbicidas inibidores de AHAS são empregados em uma pureza de 90% a 100% em peso, preferivelmente de 95% a 100% em peso (de acordo com o espectro de RMN). Para fins de tratamento de sementes, as formulações respectivas podem ser diluídas em 2 a 10 vezes, levando a concentrações nas preparações prontas-para-uso de 0,01 a 60% em peso do composto ativo em peso, preferivelmente de 0,1 a 40% em peso.

O herbicida inibidor de AHAS pode ser usado como tal, na forma de suas formulações ou na forma de uso delas preparada, por exemplo na forma de soluções diretamente pulverizáveis, pós, suspensões ou dispersões, emulsões, dispersões oleosas, pastas, produtos pulverizáveis, materiais para dispersão, ou grânulos, por meio de pulverização, atomização, polvilhamento, dispersão ou derramamento. As formas de uso dependem inteiramente dos fins pretendidos; elas se destinam a assegurar, em cada caso, a distribuição mais perfeita possível do herbicida inibidor de AHAS de acordo com a invenção.

As formas de uso aquosas podem ser preparadas de concentrados de emulsão, pastas ou pós umectáveis (pós pulverizáveis, dispersões oleosas) pela adição de água. Para preparar emulsões, pastas ou dispersões oleosas, as substâncias, como tais ou dissolvidas em um óleo ou solvente, podem ser homogeneizadas em água por meio de um umedecedor, pegajosificador, dispersante ou emulsificante. Entretanto, é também possível preparar concentrados compostos de substância ativa, umedecedor, pegajosificador, dispersante ou emulsificante e, se apropriado, solvente ou óleo, e tais concentrados são adequados para diluição com água.

As concentrações do composto ativo nas preparações prontas- para-uso pode ser variadas dentro de faixas relativamente amplas. Em geral, elas são de 0,0001 a 10 %, preferivelmente de 0,01 a 1 % em peso.

O herbicida inibidor de AHAS pode também ser usado com sucesso no processo de volume ultrabaixo (ULV), sendo possível aplicar formulações compreendendo acima dos 95 % em peso do composto ativo, ou mesmo aplicar o composto ativo sem aditivos.

O seguinte são exemplos de formulações:

1. Produtos para diluição com água para aplicações foliares. Para fins de tratamento de sementes, tais produtos podem ser aplicados à semente diluídos ou não diluídos.

A) Concentrados solúveis em água (SL, LS)

Dez partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 90 partes em peso de água ou solvente solúvel em água. Como uma alternativa, os umedecedores ou outros auxiliares são adicionados. O herbicida inibidor de AHAS se dissolve após diluição com água, por meio do que uma formulação com 10 % (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida.

B) Concentrados dispersáveis (DC)

Vinte partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 70 partes em peso de cicloexanona com adição de 10 partes em peso de um dispersante, por exemplo a polivinilpirrolidona. A diluição com água dá uma dispersão, por meio do que uma formulação com 20 % (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida.

C) Concentrados emulsificáveis (EC)

Quinze partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 7 partes em peso de xileno com adição de dodecilbenzenossulfonato de cálcio e etoxilato de óleo de mamona (em cada caso 5 partes em peso). A diluição com água dá uma emulsão, por meio do que uma formulação com 15 % (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida.

D) Emulsões (EW, EO, ES)

Vinte e cinco partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 35 partes em peso de xileno com adição de dodecilbenzenossulfonato de cálcio e etoxilato de óleo de mamona (em cada caso 5 partes em peso). Esta mistura é introduzida em 30 partes em peso de água por meio de uma máquina emulsificadora (por exemplo, Ultraturrax) e produzida em uma emulsão homogênea. A diluição com água dá uma emulsão, por meio do que uma formulação com 25 % (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida.

E) Suspensões (SC, OD, FS)

Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são cominuídas com a adição de 10 partes em peso de dispersantes, umedecedores e 70 partes em peso de água ou de um solvente orgânico para dar uma suspensão herbicida inibidora de AHAS fina. A diluição com água dá uma suspensão estável do herbicida inibidor de AHAS, por meio do que uma formulação com 20 % (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida.

F) Grânulos dispersáveis em água e grânulos solúveis em água (WG, SG)

Cinqüenta partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são moídas finamente com a adição de 50 partes em peso de dispersantes e umedecedores e produzidas como grânulos dispersáveis em água ou solúveis em água por meio de aplicações técnicas (por exemplo, extrusão, torre de pulverização, leito fluidizado). A diluição com água dá uma dispersão ou solução estáveis do herbicida inibidor de AHAS, por meio do que uma formulação com 50% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida.

G) Pós dispersáveis em água e pós solúveis em água (WP, SP, SS, WS)

Setenta e cinco partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são moídas em um moinho de rotor-estator com a adição de 25 partes em peso de dispersantes, umedecedores e gel de sílica. A diluição com água dá uma dispersão ou solução estáveis do herbicida inibidor de AHAS, por meio do que uma formulação com 75% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida.

I) Formulação em Gel (GF)

Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são cominuídas com a adição de 10 partes em peso de dispersantes, 1 parte em peso de umedecedores de agentes de gelação e 70 partes em peso de água, ou de um solvente orgânico, para dar uma suspensão herbicida inibidora de AHAS fina. A diluição com água dá uma suspensão estável do herbicida inibidor de AHAS, por meio do que uma formulação com 20% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. Esta formulação em gel é adequada para uso como um tratamento das sementes.

2. Produtos a serem aplicados não diluídos para aplicações foliares. Para os fins de tratamento de sementes, tais produtos podem ser aplicados às sementes diluídas.

A) Pós polvilháveis (DP, DS)

Cinco partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são moídas finamente e misturadas intimamente com 95 partes em peso de caulim finamente dividido. Isto dá um produto polvilhável tendo 5% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS. Β) Grânulos (GR, FG5 GG, MG)

Meia parte em peso do herbicida inibidor de AHAS é moída finamente e associada com 95,5 partes em peso do carreador, por meio do que uma formulação com 0,5 % (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtido. Métodos correntes são a extrusão, a secagem por pulverização ou o leito fluidizado. Isto é grânulos a serem aplicados não diluídos para uso foliar.

Formulações convencionais de tratamento de sementes incluem, por exemplo, os concentrados fluíveis FS, as soluções LS, os pós para tratamento seco DS, pós dispersáveis em água para tratamento de pasta WS, pós solúveis em água SS e emulsão ES e EC e formulação em gel GF. Estas formulações podem ser aplicadas à semente diluída ou não diluída. A aplicação às sementes é realizada antes da semeadura, ou diretamente sobre as sementes.

Em uma forma de realização preferida, uma formulação FS é usada para tratamento da semente. Tipicamente, uma formulação FS pode compreender de 1 a 800 g/litro de ingrediente ativo, 1 a 200 g/litro de tensoativo, 0 a 200 g/litro de agente anticongelamento, 0 a 400 g/litro de aglutinante, 0 a 200 g/litro de um pigmento, e até 1 litro de um solvente, de preferência água.

Para o tratamento das sementes, as sementes das plantas de trigo de elevado teor proteico de acordo com a presente invenção são tratadas com herbicidas, preferivelmente herbicidas selecionados do grupo consistindo de herbicidas inibidores de AHAS tais como o amidossulfmon,, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinossulfuron, ciclossulfamuron, etametsulfuron, etoxissulfuron, flazassulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halossulfuron, imazossulfuron, iodossulfuron, mesossulfiiron, metsulfuron, nicossulfuron, oxassulfuron, primissulfiiron, prossulfuron, pirazossulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfossulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxissulfiiron, triflussulfiiron, tritossulfuron, imazametabenzo, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclossulam, florassulam, flumetsulam, metossulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalida, piritiobac, e misturas destes, ou com uma formulação compreendendo um herbicida inibidor de AHAS. Mais preferivelmente, as sementes das plantas de trigo de elevado teor proteico de acordo com a presente invenção são tratadas com um herbicida de imidazolinona.

A expressão tratamento das sementes compreende todas as técnicas adequadas de tratamento de sementes conhecidas na prática, tais como o cultivo das sementes, a cobertura das sementes, o polvilhamento das sementes, o embebimento das sementes e a pelotização das sementes.

De acordo com uma variante da presente invenção, um outro objeto desta é um método de tratar do solo pela aplicação, em particular no sulco das sementes: ou de uma formulação granular contendo o herbicida inibidor de AHAS como uma formulação de composição (por exemplo uma formulação granular, opcionalmente com um ou mais carreadores sólidos ou líquidos agricolamente aceitáveis e/ou opcionalmente com um ou mais tensoativos agricolamente aceitáveis. Este método é vantajosamente empregado, por exemplo, em leitos de sementes de cereais, milho, algodão e girassol.

A presente invenção também compreende sementes cobertas ou contendo uma formulação de tratamento de sementes compreendendo pelo menos um inibidor ALS selecionado do grupo consistindo de amidossulfuron, azimsulfiiron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfiiron, cinossulfuron, ciclossulfamuron, etametsulfuron, etoxissulfuron, flazassulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, imazossulfuron, iodossulfuron, mesossulfuron, metsulfuron, nicossulfuron, oxassulfuron, primissulfiiron, prossulfuron, pirazossulfuron, rimsulfliron, sulfometuron, sulfossulfuron, tifensulfuron, triassulfuron, tribenuron, trifloxissulfuron, triflussulfuron, tritossulfuron, imazametabenzo, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclossulam, florassulam, flumetsulam, metossulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, pirifitalida e piritiobac. Preferivelmente, o inibidor ALS é um herbicida de imidazolinona.

O termo semente inclui sementes e propágulos de plantas de todas as espécies, incluindo, porém sem limitar, sementes genuínas, peças de sementes, rebentos, cormos, bulbos, frutas, tubérculos, grãos, mudas, brotos e outros, e significa, em uma forma de realização preferida, sementes genuínas.

A expressão "revestido com e/ou contendo" geralmente significa que o ingrediente ativo se acha, em sua maior parte, sobre a superfície do produto de propagação no momento da aplicação, não obstante uma parte maior ou menos do ingrediente possa penetrar no produto de propagação, dependendo do método de aplicação. Quando o referido produto de propagação é (re)plantado, ele pode absorver o ingrediente ativo.

A aplicação do tratamento das sementes com o herbicida inibidor de AHAS ou com uma formulação contendo o herbicida inibidor de AHAS, é realizada por pulverização ou polvilhamento das sementes antes da semeadura das plantas e antes da emergência das plantas.

No tratamento das sementes, as formulações correspondentes são aplicadas pelo tratamento das sementes com uma quantidade eficaz do herbicida inibidor de AHAS ou com uma formulação compreendendo o herbicida inibidor de AHAS. Aqui, as taxas de aplicação são geralmente de 0,1 g a 10 kg do ingrediente ativo (ou da mistura de ingrediente ativo ou da formulação) por 100 kg de sementes, preferivelmente de 1 g a 5 kg por 100 kg de sementes, em particular de 1 g a 2,5 kg por 100 kg de sementes. Para plantações específicas tais como a alface, a taxa pode ser mais elevada.

A planta de trigo de alto teor de proteínas da presente invenção encontra uso em um método para combater a vegetação indesejável ou controlar as ervas daninhas, compreendendo colocar em contato as sementes das plantas de trigo de elevado conteúdo proteico de acordo com a presente invenção antes da semeadura e/ou após a pré-germinação, com um herbicida inibidor de AHAS. O método pode ainda compreendes a semeadura das sementes, por exemplo no solo em um campo ou em um meio de vasos na estufa. O método encontra uso particular no combate à vegetação indesejável ou no controle das ervas daninhas na vizinhança imediata da semente.

O controle da vegetação indesejável é entendido como significando o extermínio das ervas daninhas e/ou de outra forma retardando ou inibindo o crescimento normal das ervas daninhas. As ervas daninhas, no sentido mais amplo, são entendidas como significando todas aquelas plantas que crescem nos locais onde elas são indesejáveis.

As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo, as ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. As ervas daninhas dicotiledôneas incluem, porém sem limitar, as ervas daninhas dos gêneros: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria5 Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Verônica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus e Taraxacum. As ervas daninhas monocotiledôneas incluem, porém sem limitar, as ervas daninhas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus e Apera.

Além disso, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas de colheita que estejam crescendo em um local indesejável. Por exemplo, uma planta de milho de crescimento espontâneo que esteja em um campo que predominantemente compreenda plantas de feijão soja pode ser considerada uma erva daninha, se a planta de milho não for desejada no campo das plantas de feijão soja.

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para se referirem a um(a) ou mais do que um(a) (isto é, a pelo menos um(a) do objeto gramatical do artigo. Como exemplo, "um elemento" significa um ou mais elementos.

Como aqui usada, a palavra "compreendendo", ou variações tais como "compreende" ou "compreender", será entendida como implicando na inclusão de um elemento estabelecido, todo ou em etapa, ou grupo de elementos, todos ou em etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, total ou em etapa, ou grupo de elementos, totais ou em etapas.

Os seguintes exemplos são oferecidos como ilustração e não como limitação.

EXEMPLO 1

LINHAGENS DE TRIGO COM CONTEÚDO PROTEICO DOS GRÃOS AUMENTADO

As linhagens de trigo foram produzidas com o uso de métodos de mutagênese padrão e métodos convencionais de reprodução de plantas. O objetivo da mutagênese foi desenvolver linhagens de trigo com tolerância aos herbicidas de imidazolinonas. A mutação responsável pela tolerância à imidazolinona nestas linhagens de trigo é uma única mudança de nucleotídeo de guanina para adenina, a qual resulta em uma mudança do códon de AGC para AAC e uma substituição única de aminoácidos de serina por asparagina na proteína AHASL (grande subunidade de acetoidroxiácido sintase), designada como TaAHASLlA S653N. A enzima AHAS catalisa a primeira etapa na biossíntese dos aminoácidos de cadeia ramificada, valina, leucina e isoleucina (Stidham e Singh (1991) "Imidazolinone-Acetohydroxyacid Synthase Interactions," Em: The Imidazolinone Herbicides, Capítulo 6, Shaner, D. e O1Connor, S., editores; CRC Press, Boca Raton, Florida, U.S.A., pp. 71-90) e se acha sob regulação de realimentação por estes aminoácidos nas plantas. A única mutação pontual no gene AHAS confere tolerância aos herbicidas de imidazolinona mediante alteração do sítio de ligação para estes herbicidas sobre a enzima AHAS mutante, mas não tem nenhum efeito reconhecido sobre a regulação da realimentação pelos aminoácidos de cadeia ramificada e pela função biossintética normal da enzima (Newhouse et al., (1992) Plant Physiol. 100: 882-886) (Figura 1).

Estudos de composição dos grãos foram conduzidos durante o processo de seleção das linhagens do trigo que apresentavam tolerância a herbicidas, e destes estudos o maior conteúdo proteico dos grãos foi descoberto. Estes estudos foram conduzidos em diferentes localizações geográficas (Califórnia, Minnesota, Dakota do Norte, Estado de Washington e Canadá) e nos anos de 1999 até 2004 (Tabela 2). As cinco linhagens (BW255- 2, BW238-3, K42, Teall5A e ElsaxEM2) apresentando este traço são independentemente originadas de diferente idioplasma, e mediante eventos independentes de mutagênese, e uma linhagem (ElsaxEM2) foi originada através da introgressão do trigo Einkorn (Triticum monococcum) que havia sido mutagenizado.

Os valores proteicos percentuais foram mais elevados para as linhagens BW255-2, BW238-3, K42, Teall5A e ElsaxEM2 em comparação com seus precursores (Tabela 1). Os aumentos significativos quanto aos anos e à localização variaram de 3 a 13% em comparação com sua linhagem precursora respectiva (Tabela 2) ou um aumento real de 0,4 a 2,1%, em média de 1,3%, através de todas as localizações das linhagens e dos anos, em comparação com seus precursores. Os valores quanto aos aminoácidos de mudança ramificadas valina, isoleucina e leucina e aos aminoácidos essenciais lisina, metionina, cistina e treonina, usualmente foram significativamente mais elevados, porém existiram algumas exceções (Tabela 2). O aumento médio variou de 6 a 11% em comparação com sua linhagem precursora respectiva (Tabela 2), ou um aumento real de 0,02 a 0,09, em média 0,04 %, através de todos os valores de aminoácidos em comparação com seus precursores. A produção de grãos e os valores dos pesos do teste para os mutantes BW255-2 e BW238-3 não foram significativamente diferentes de suas respectivas linhagens precursoras quanto às experiências de campo desenvolvidas em 2003 e 2004 (Tabela 3). Da mesma forma, os resultados da inibição de realimentação apresentados para as linhagens BW255-2 e a precursora BW255 (Figura 1) são comparáveis quanto às outras linhagens e mostram que não houve nenhum efeito da mutação sobre a inibição da realimentação que poderia ter alterado a regulação da biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada.

As linhagens de trigo tolerante a herbicidas usadas nos estudos apresentados neste exemplo, são a geração M5 ou mais elevada e são homozigotos quanto à característica S653N AHASLIA.

TABELA 1

Aumento médio percentual no conteúdo proteico dos grãos quanto aos homozigotos das linhagens para AHASLIA S653N em comparação com seus precursores, resumido através das localizações e dos anos

<table>table see original document page 51</column></row><table> TABELA 2

Comparação dos valores de proteína e aminoácidos dos mutantes

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1 Os valores são as médias de nove observações (% à base de peso seco). Os mutantes e as fontes precursoras foram cultivadas em experiências de campo de bloco replicadas.

2 A análise estatística foi feita dentro de um dado analito comparando o mutante com o precursor. Letras iguais não são significativamente diferentes. TABELA 3

Valores em peso de produção e do teste das linhagens precursoras BW255 e BW238 e mutantes BW255-2 e BW-238-3 (TaAHASLlA S653N) cultivadas em três localizações nos US durante 2003 e 2004.

<table>table see original document page 53</column></row><table>

1Os valores são as médias de nove observações de cultivo em modelos de blocos completos randomizados de sítios de campos em ND e MN.

2Letras iguais não são significativamente diferentes.

Os valores do conteúdo proteico dos grãos, da cadeia ramificada e dos aminoácidos essenciais das linhagens de trigo para pão que são resistentes ao herbicida de imidazolinonas, foram significativamente aumentados em comparação com suas linhagens precursoras respectivas. As quatro linhagens independentemente originadas tendo o gene S653N AHASLIA de Triticum aestivum e outras derivadas através da introgressão da mesma mutação de Triticum munococcum L., apresentaram todas o aumento nas características proteicos dos grãos, em comparação com suas respectivas linhagens precursoras. Estes resultados demonstram que o aumento na proteína dos grãos é devido à mutação de S653N AHASLIA do trigo e que não existiram nem um decréscimo na produção de grãos nem uma mudança na resposta de inibição da realimentação nestas linhagens S653N AHASLIA em comparação com os precursores. Enquanto todas as linhagens de trigo S653N AHASLIA examinadas até agora compreendam o códon AAC para a asparagina 653, espera-se também que as linhagens de trigo compreendendo um códon AAT para a asparagina 653 produzam grãos com conteúdo proteico aumentado.

A vantagem do conteúdo proteico dos grãos aumentado provido pela mutação S653N é limitada apenas ao gene AHASLIA. As linhagens de trigo com a mutação S653N ocorrente nos genes AHASLID e AHASLIB não apresentaram o aumento na proteína dos grãos (dados não mostrados).

EXEMPLO 2

PROTEÍNAS AHASL DO TRIGO RESISTENTES A HERBICIDAS

A presente invenção apresenta o uso dos polinucleotídeos codificando os polipeptídeos S653N AHASLIA do trigo. As plantas que compreendem polipeptídeos AHASL resistentes a herbicidas foram previamente identificadas, e várias regiões conservadas de polipeptídeos AHASL que são os sítios das substituições de aminoácidos que conferem resistência a herbicidas foram descritas. Ver Devine e Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites". Em: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al. (editores), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam; e Devine e Shukla, (2000) Crop Protection 19: 881-889.

Com o uso das seqüências S653N AHASLIA da invenção e dos métodos conhecidos daqueles de experiência normal na técnica, pode-se produzir polinucleotídeos adicionais codificando os polipeptídeos AHASL resistentes a herbicidas tendo a substituição S653N e uma, duas, três ou mais substituições adicionais de aminoácidos nos sítios identificados nestas regiões conservadas. A Tabela 4 fornece as regiões conservadas das proteínas AHASL5 as substituições de aminoácidos conhecidas por conferirem resistência a herbicidas dentro destas regiões conservadas, e os aminoácidos correspondentes nas proteínas AHASL1 do trigo (Triticum aestivum).

TABELA 4

Substituições de aminoácidos em regiões conservadas dos polipeptídeos AHASL que são conhecidos por conferirem resistência a herbicidas

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1 Regiões conservadas de Devine e Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites". Em: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al. (editores), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam, e Devine e Shukla, (2000) Crop Protection 19: 881-889.

2A numeração dos aminoácidos corresponde à seqüência de aminoácidos do polipeptídeo AHASL de Arabidopsis thaliana.

3A seqüência de aminoácidos do AHASLl de Triticum aestivum do tipo selvagem compreende a mesma região conservada.

4Bernasconi et al (1995) J. Biol. Chem. 270(29): 17381- 17385.

5Wright e Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 612-620.

6Boutsalis et al. (1999) Pestic. Sei. 55: 507-516.

7Guttieri et al. (1995) Weed Sei. 43: 143-178.

8Guttieri et al. (1992) Weed Sei. 40: 670-678.

9Kolkman et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159.

10Hartnett et al. (1990) "Herbicide-resistant plants carrying mutated acetolactate synthase genes" Em: Managing Resistance to Agrochemicals: Fundamental Research to Practical Strategies, Green et al. (editores), American Chemical Soe. Symp., Série n- 421, Washington, DC, USA

11Simpson (1998) Down to Earth 53(1): 26-35.

12White et al. (2003) Weed Sei. 51: 845-853.

13Bruniard (2001) Inheritance of imidazolinone resistance, characterization of cross-resistance pattern, and identification of molecular markers in sunflower (Helianthus annuus L.). Ph.D. Thesis, Universidade do Estado de Dakota do Norte, Fargo, ND, USA, pp. 1-78.

14Devine e Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites". Em: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al. (editores), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam.

15Chang e Duggleby (1998) Biochem J. 333: 765-777.

16Lee et al. (1999) FEBS Lett. 452: 341-345.

EXEMPLO 3

DESEMPENHO DAS LINHAGENS DE TRIGO DE ELEVADO TEOR PROTEICO NAS EXPERIÊNCIAS DE CAMPO DO ARIZONA E DA CALIFÓRNIA As linhagens de trigo iniciais (Triticum aestivum) contendo a mutação S653(At)N AHASL1A e suas linhagens isogênicas, não mutantes, precursoras foram cultivadas durante o inverno (2005-2006) em três localidades no hemisfério norte (Califórnia e Arizona, USA). O conteúdo proteico dos grãos de cada uma das linhagens foi medido para se determinar se as linhagens de trigo mutantes S653N AHASLIA apresentadas aumentavam o crescimento dos grãos em relação às suas linhagens precursoras nos ambientes que se situavam fora de suas zonas de adaptação e sob condições de fotoperíodo subótimas (isto é, dias mais curtos).

ENTRADAS E LOCALIZAÇÕES

Os mutantes homozigotos AHASLIA (S653N) em dois genótipos geneticamente distintos, Kirchauff-K42 (uma linhagem de trigo inicial australiana, também referida aqui como "K42") e BW238-3 (uma linhagem de trigo inicial norte-americana), junto com suas linhagens precursoras, não mutantes, isogênicas (Kirchauff e BW238, respectivamente), foram cultivadas em grandes lotes adjacentes (repetição única) em três localizações durante a estação de inverno de 2005-2006 no sudoeste dos Estados Unidos. Duas localizações ficaram perto de Yuma, Arizona, enquanto a terceira localização ficou na vizinhança de Dinuba, Califórnia. As localizações foram plantadas em novembro de 2005 e colhidas em julho de 2005.

DIMENSÕES DOS LOTES E TAXAS DE SEMEAPURA

Taxa de Semeadura: 100 g de sementes por 35 m2

Tamanho do Lote: 2 X 1,75 m X 10 m (1 Rep.)

Os lotes foram separados por faixas de cevada de 10 m de largura

DESEMPENHO AGRONÔMICO E COLHEITA DOS GRÃOS

Todos os lotes foram submetidos às mesmas práticas agronômicas. Nenhum dos lotes foi tratado com herbicidas de imidazolinona. Para demonstrar a distinção genotípica das linhagens Kirchauff e BW238, os lotes foram avaliados quanto às condições de crescimento e altura. A linhagem Kirchauff-K42 e sua linhagem precursora isogênica, Kirchauff, cresceram mais alto e apresentaram menos rebentos do que a linhagem BW238-3 e sua linhagem precursora isogênica, BW238. Nenhuma diferença significativa no desempenho agronômico foi detectada entre as linhagens contendo a mutação S653N AHASLIA e suas respectivas linhagens precursoras não mutantes isogênicas quando observadas no campo em cada uma das localizações. A Tabela 5 fornece um sumário das condições de crescimento de todas as quatro linhagens na localização de Dinuba, Califórnia.

TABELA 5

CARACTERÍSTICAS DO CRESCIMENTO DE QUATRO LINHAGENS DE TRIGO PARA PÃO NA ESTAÇÃO DE INVERNO, EM DINUBA, CALIFÓRNIA.

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RESULTADOS E EXAME

Os pesos do teste dos grãos, os valores de sedimentação do SDS5 e o conteúdo percentual proteico das duas localizações de Yuma, Arizona e da localização de Dinuba, Califórnia, são fornecidos nas Tabelas 6 a 8, respectivamente. A Tabela 9 fornece um sumário dos resultados através de todas as três localizações. Quando os resultados dos conteúdos proteicos dos grãos foram calculados em média através das três localizações, Kirchauff-K42 apresentou um nível de proteína dos grãos que foi 5% mais elevado do que sua linhagem de controle percursora isogênica (Tabela 9). De forma semelhante, BW238-3 apresentou um nível de proteína dos grãos que foi 5,1% mais elevado do que a sua linhagem de controle precursora isogênica quando o conteúdo proteico dos grãos foi calculado em média através das três localizações (Tabela 9). O peso médio de teste dos grãos foi levemente mais elevado para Kirchauff-K42 em comparação com sua linhagem precursora não mutante; ao passo que o peso de teste dos grãos do BW238-3 não foi significativamente diferente de sua linhagem precursora não mutante (Tabela 9). Os valores de sedimentação do SDS5 que são usados para predizer a intensidade do glúten e a qualidade do cozimento também não foram significativamente diferentes entre as linhagens AHASLIA mutantes e os controles precursores respectivos.

Estes resultados demonstram que as linhagens de trigo hexaplóides para pão contendo a mutação S653N AHASLIA produz grãos com um conteúdo proteico dos grãos maior do que as linhagens precursoras de controle, mesmo quando cultivadas fora de suas zonas de adaptação e fora de sua estação normal de crescimento.

TABELA 6

Peso de teste dos grãos (kg/f), % do conteúdo proteico dos grãos, e valores de sedimentação do SDS (mm) das linhagens mutantes TaAHASLlA S653N e

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* Teste de Sedimentação do SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) para o trigo é um Método Aprovado pela American Associate of Cereal Chemists of Cereal Chemists (AACC) para predizer a intensidade do glúten e a qualidade de cozimento tanto nos trigos-duros quanto para pão. Ver Morris et al. (2007) J. Sei. Food Agric. 87: 607-615.

Percentual de aumento no conteúdo proteico dos grãos da linhagem S653N sobre o conteúdo proteico dos grãos da linhagem precursora. Kirchauff e BW238 são as linhagens precursoras para K42 e BW238-3, respectivamente.

TABELA 7

PESOS DE TESTE DOS GRÃOS (kg/l), % DE CONTEÚDO PROTEICO DOS GRÃOS. E VALORES DA SEDIMENTAÇÃO DO SDS (mm) DAS LINHAGENS MUTANTES TaAHASLlA S653N R DAS LINHAGENS PRECURSORAS EM EXPERIÊNCIAS 2 DE YUMA

<table>table see original document page 60</column></row><table> TABELA 8

PESOS DE TESTE DOS GRÃOS fkg/M. % DE CONTEÚDO PROTEICO DOS GRÃOS, E VALORES DA SEDIMENTAÇÃO DO SDS (mm) DAS LINHAGENS MUTANTES S653N TaAHASLlA E DAS LINHAGENS PRECURSORAS EM EXPERIÊNCIAS DE DINUBA

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TABELA 9

Médias* dos pesos de teste dos grãos (kg/í), % de conteúdo proteico dos grãos, e valores da sedimentação do sds (mm) das linhagens mutantes

TAAHASL1A S653N e das linhagens precursoras através das localizações

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* Media dos valores das duas experiências de Yuma (Tabelas 6 e 7) e da experiência de Dinuba (Tabela 8).

Desvio padrão (d.p.)

® Percentual de aumento no conteúdo médio proteico dos grãos da linhagem S653N sobre o conteúdo proteico dos grãos da linhagem precursora. Kirchauff e BW238 são as linhagens precursoras para K42 e BW238-3, respectivamente.

EXEMPLO 4

TESTES DA QUALIDADE DO COZIMENTO DO GRÃO PRODUZIDO DE LINHAGENS DE TRIGO DE ELEVADO TEOR PROTEICO

Amostras de grãos cultivados em duas das três localizações (uma em Dinuba, Califórnia, e uma em Yuma, Arizona) nas experiências de campo apresentadas no Exemplo 3 acima foram submetidas a vários métodos de teste de trigo e farinha, por um laboratório independente para determinar se o aumento na proteína dos grãos nos mutantes AHASLIA tinha um efeito sobre a qualidade do cozimento. Amostras de grãos de cada item (AHASL1A e linhagem isogênica precursora) foram submetidas a um processo de moagem de laboratório (Buhler Laboratory Flour Mill) para produzir trigo moído e amostras de farinha. Amostras de trigo e moídas foram então submetidas a vários testes de qualidade (conteúdo de umidade, conteúdo de proteínas, conteúdo de cinzas e número de quedas) para determinar vários parâmetros de qualidade do trigo padrão. Testes padrão especializados, tais como o Sistema Único de Caracterização da Semente (Single Kernel Characterization System) (SKCS), o Farinograph e o teste de cozimento Pan Bread foram conduzidos para se determinar as características de processamento e de cozimento de cada amostra. Estes métodos são descritos em "Wheat and Flour Testing Methods. A Guide to Understanding Wheat and Flour Quality", (2004) Wheat Marketing Center, Inc. e North American Export Grain Association, Inc., USA; aqui incorporado como referência. Os resultados destes testes são fornecido nas Tabelas 10 a 13, abaixo. Não obstante as linhagens mutantes S653N AHASLl A tenham todas demonstrado um aumento na proteína dos grãos, nenhuma das linhagens mutantes diferiu significativamente de suas linhagens isogênicas precursoras em termos de dados de cozimento (Tabelas 10 a 13). Isto era de se esperar, tendo em vista que os valores da sedimentação do SDS, que são usados para se predizer a intensidade de glúten e a qualidade de cozimento (ver Exemplo 3, acima), não foram também significativamente diferentes entre as linhagens AHASLIA mutantes e as provas precursoras respectivas.

Ser capaz de aumentar a proteína dos grãos sem afetar a qualidade de cozimento é uma característica desejável para a indústria de trigo. Assim sendo, as linhagens mutantes AHASLIA da presente invenção encontram uso na produção de farinha que tenha o conteúdo de proteína aumentado enquanto se mantém a qualidade de cozimento da farinha das linhagens de controle de trigo. A farinha dos grãos das linhagens de trigo mutantes AHASLIA também encontra uso na produção de artigos cozidos com conteúdo proteico aumentado, em comparação com os artigos cozidos produzidos da farinha moída do grão de controle ou das linhagens de trigo do tipo selvagem.

TABELA 10

DADOS DO TRIGO

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CMDTY, comodidade; HWS, trigo inicial branco duro; e HRS, trigo inicial vermelho duro.

LOC, localização. PRO, % de proteína no trigo em 8,5 % de umidade.

MOI, umidade (%).

TW, peso de teste.

TKW, peso da semente em milhares (gramas).

Duro, Dureza do Grão (índice de -20 a 120).

FN, Número de Quedas (segundos). FN é uma medida da viscosidade determinada pela medição da resistência de uma farinha e pasta de água a um agitador de queda.

SKCS, Sistema Único de Caracterização da Semente (Single Kernel Characterization System). Este sistema analisa 300 sementes individualmente quanto ao peso da semente (mg), o diâmetro da semente (mm), o conteúdo de umidade (%) e a dureza da semente (um índice de -20 a 120).

TABELA 11

DADOS DA FARINHA E RESULTADOS FARINOGRÁFICOS

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LOC, localização.

PRO, % de proteína na farinha em 14% de umidade.

MOI, umidade (%).

ASH, cinza da farinha (%). ABS, Absorção (%): a quantidade de água necessária para centralizar a curva da farinografia sobre a linhagem 5 OO-Brabender-Unit (BU).

Pico, tempo do Pico (minutos): indica o tempo de desenvolvimento da massa de farinha, iniciando no momento em que a água é acrescentada até que a massa alcance a consistência máxima.

Estabilidade, tempo de Estabilidade (minutos): é o tempo em que a massa mantém a consistência máxima.

MTI, índice de Tolerância da Mistura (minutos): indica o grau de amolecimento da massa durante a mistura. Tabela 12

<table>table see original document page 66</column></row><table> TABELA 13

COMENTÁRIOS SOBRE OS TESTES DE QUALIDADE DO COZIMENTO

<table>table see original document page 67</column></row><table>

CMDTY, comodidade; HWS5 trigo inicial branco duro; e HRS, trigo inicial vermelho duro.

LOC, localização.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível daqueles habilitados na técnica à qual pertence esta invenção. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados como referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especifica e individualmente indicado como sendo incorporado como referência.

Não obstante a invenção acima tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para os fins de clareza de entendimento, será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Método para produzir uma planta de trigo de elevado teor proteico, referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) introduzir em uma planta de trigo pelo menos uma cópia de um gene S653N AHASLIA de trigo; (b) cultivar a planta de trigo ou uma planta descendente da mesma, compreendendo o gene S653N AHASLlA para produzir grãos; e (c) determinar o conteúdo de proteína dos grãos produzidos pela planta de trigo ou pela planta descendente, em que a planta de trigo ou a planta descendente produza grãos tendo um nível aumentado de proteína em comparação com os grãos produzidos por uma planta de trigo destituída do referido gene S653N AHASLIA de trigo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene S653N AHASLIA do trigo codifica uma proteína AHASLIA compreendendo uma asparagina na posição 579 do aminoácido ou em posição equivalente.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido gene S653N AHASLIA do trigo é um gene S653N AHASLIA de Triticum aestivum ou Triticum monococcum.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de selecionar uma planta de trigo compreendendo o referido gene S653N AHASLIA do trigo.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que referida etapa de seleção compreende aplicar um herbicida inibidor de AHAS à referida planta de trigo após referido gene S653N AHASLIA do trigo ter sido introduzido.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido gene S653N AHASLIA do trigo é introduzido na referida planta de trigo de elevado teor proteico, mediante polinização cruzada.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida polinização cruzada compreende cruzar uma primeira planta precursora de trigo com uma segunda planta precursora de trigo, de modo a produzir pelo menos uma progênie Fl, em que referida primeira planta precursora de trigo compreenda pelo menos uma cópia do referido gene S653N AHASLIA e em que referida planta de trigo de elevado teor proteico seja descendente das referidas primeira e segunda plantas precursoras de trigo.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida primeira planta precursora de trigo é selecionada do grupo consistindo de: (a) uma planta de trigo tendo os números de Designação de Depósito de Patente da American Type Culture Collection (ATCC) PTA- 3955, PTA-4113 ou PTA-4257; (b) um derivado mutante, recombinante ou geneticamente engenheirado da planta de trigo com os números de Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-3955, PTA-4113 ou PTA-4257; (c) qualquer descendente da planta com os números de Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-3955, PTA-4113 ou PTA- 4257; e (d) uma planta de trigo que seja a descendente de qualquer uma, ou mais, destas plantas.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida primeira planta de trigo precursora compreende as características de resistência a herbicida da planta de trigo que têm os números de Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-3955, PTA- - 4113 ou PTA-4257.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida primeira planta de trigo precursora é a doadora do pólen, a referida segunda planta de trigo precursora é a aceptora de pólen para o referido cruzamento, e a referida progênie Fl é produzida na referida segunda planta de trigo precursora.

11. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida segunda planta de trigo precursora é a doadora do pólen, a referida primeira planta de trigo precursora é a aceptora de pólen para o referido cruzamento, e a referida progênie Fl é produzida na referida primeira planta de trigo precursora.

12. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida planta de trigo de elevado teor proteico é selecionada pela aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de AHAS à progênie F1, de modo a selecionar quanto às plantas de trigo com resistência aumentada a um herbicida inibidor de AHAS.

13. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida primeira planta de trigo precursora é heterozigota ou homozigota quanto ao referido gene S653N AHASLl A.

14. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a progênie F1 produzida pelo referido cruzamento é cultivada e deixada auto-polinizar de modo a produzir a progênie F2.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida planta de trigo de elevado teor proteico é selecionada da referida progênie F2 pela aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de AHAS à progênie F2 de modo a selecionar-se pelo menos uma planta de trigo com resistência aumentada a um herbicida inibidor de AHAS.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido gene S653N AHASLIA é introduzido na referida planta de trigo de elevado teor proteico mediante mutagênese e seleção das plantas de trigo compreendendo resistência a uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de AHAS.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que ainda compreende selecionar plantas de trigo compreendendo o gene S653N de AHASL1A.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido gene S653N AHASLIA do trigo é introduzido na referida planta de trigo de elevado teor proteico mediante transformação, compreendendo introduzir em pelo menos uma célula de uma planta de trigo uma construção de polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeo S653N AHASLIA operavelmente ligado a um promotor que conduza a expressão em uma célula de planta de modo a produzir uma célula de trigo transformada e regenerar referida célula de trigo transformada em uma planta de trigo transformada, em que a planta de trigo transformada seja a referida planta de trigo de elevado teor proteico.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que ainda compreende aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de AHAS à célula de trigo transformada de modo a selecionar-se uma célula de trigo transformada compreendendo resistência aumentada a um herbicida inibidor de AHAS.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado do grupo consistindo de promotores constitutivos e promotores preferidos das sementes.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta de trigo de elevado teor proteico tem resistência intensificada a pelo menos um herbicida inibidor de AHAS selecionado do grupo consistindo de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de triazolpirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato e um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o referido herbicida de imidazolinona é selecionado do grupo consistindo de: ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-]imidazolin-2-il)- nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3- quinolina-carboxílico, ácido [5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-]-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin- -2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de [6-(4-isopropil-4-metil- -5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metila e [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo- -2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metila, e misturas destes.

23. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a espécie da planta de trigo de elevado teor proteico é a Triticum aestivum.