CN101519650A - 稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体及其应用，该稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.2869的杂交瘤细胞系所分泌的。本发明所提供的杂交瘤细胞系能够稳定的分泌稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体，所提供的包括该单克隆抗体的试剂盒可以简便、准确、灵敏的定性/定量检测稀有鮈鲫血清中的卵黄蛋白原，是一种简便、高效的检测/评价环境雌性激素效应的分析工具，具有广泛的利用前景。

Description

稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于环境检测领域，具体涉及一种稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体及其在检测环境生物活性物质中的应用。

背景技术

卵黄蛋白原(Vitellogenin，VTG)是卵黄蛋白的前体，是一种高磷糖蛋白。在正常情况下，卵黄蛋白原仅由性成熟的雌性卵生动物的肝脏合成，雄性动物体内并不产生卵黄蛋白原；但是雄性动物肝脏中也存在雌激素受体和卵黄蛋白原基因，在雌激素或类雌激素的诱导下可合成卵黄蛋白原。因此，卵黄蛋白原是一种理想的环境雌激素的生物标志物，被广泛应用于环境内分泌干扰物的相关研究中。

目前国际上对生物体内卵黄蛋白原的检测主要采用免疫学方法，其中最常用的是基于酶联免疫吸附原理的检测方法，该方法根据抗原-抗体特异性结合的机制，将酶标记在抗原或抗体上，形成酶标记的抗原或抗体，而酶能够催化底物水解、氧化或还原，生成可检测的有色产物。由于所使用的检测方法(如直接法、间接法、间接竞争法等)的差异，产物显现的颜色与抗原或抗体的浓度呈现正相关或负相关，据此可以定量计算出抗原或抗体的浓度。

在中国专利CN1624483A中，公开了一种检测环境雌激素效应的试剂盒，该试剂盒利用双抗夹心法，使用鲫卵黄蛋白原兔多克隆抗体和鲫卵黄蛋白原鼠源单克隆抗体来检测环境中分布广、易捕获、普遍性的鲫的卵黄蛋白原。该试剂盒尚存在灵敏度不高、且操作复杂、成本高的缺点(灵敏度为50ng/孔，线性范围在500-1400ng/ml)。

由于卵黄蛋白原的蛋白质一级结构在不同种类的卵生动物之间差异很大，所以一种动物的卵黄蛋白原抗体在用于其它动物卵黄蛋白原检测时受到很大限制。因此，为了准确反映环境雌激素的存在水平，对不同种类的卵生动物，需要制备其相应的卵黄蛋白原抗体。有关这方面的文献包括：(1)C.Porte，G.Janer，M.Ortiz-Zarragoitia，L.C.Lorusso，M.P.Cajaraville，M.C.Fossi，L.Canesi.Comparative Biochemistry and Physiology，Part C，2006，143：303-315.(2)F.Eertmans，W.Dhooge，S.Stuyvaert，F.Comh.Toxicology in Vitro，2003，17：515-524.(3)Janne K.Eidem，Hans Kleivdal，Kevin Kroll，Nancy Denslow，Ronny van Aerle，Charles Tyler，Grace Panter，Tom Hutchinson，Anders .Aquatic Toxicology，2006，78：202-206.(4)Tao Liao，Shiwei Jin，Fang-Xing Yang，Yang Hui，Ying Xu.Science of theTotal Environment，2006，364：284-294.(5)曹文宣，王剑伟.实验动物科学与管理，2003，20(增刊)：96-99.(6)周庆祥，江桂斌.化学进展，2003，15(1)：67-73。

稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)是我国特有的一种小型鲤科鱼类，其生理特征与国际实验动物委员会推荐的模型动物斑马鱼、日本青鳉等有许多相似之处。已有研究表明，稀有鮈鲫对雌激素类化合物的敏感性高于斑马鱼和日本青鳉，因此，稀有鮈鲫有望成为实验模型动物向国际推广。已有文献报道应用纯化的稀有鮈鲫卵黄蛋白原免疫新西兰兔制备多克隆抗体，并应用于ELISA检测中。但是，采用多克隆抗体进行检验存在特异性差、效价低、数量有限、动物间个体差异大，难以重复制备等固有缺陷。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种稀有鮈鲫卵黄蛋白原的单克隆抗体，以保证稀有鮈鲫卵黄蛋白原检测的准确度和灵敏度，从而更加有效地定性和/或定量检测环境中的雌激素。

本发明提供了一种分泌稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系RVM-3是由稀有鮈鲫卵黄蛋白原免疫Bal B/C小鼠后，产生分泌稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体的B细胞(脾细胞)，该B细胞再与SP2/0骨髓瘤细胞融合后形成的，于2009年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.2869。

具体来说，其制备方法包括以下步骤：

(1)制备稀有鮈鲫卵黄蛋白原；

(2)采用稀有鮈鲫卵黄蛋白原免疫Bal B/C小鼠；

(3)取Bal B/C小鼠的B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。

其中，所述步骤(1)具体包括以下步骤：从长时间暴露于含雌性激素水体中的稀有鮈鲫的血清中提取卵黄蛋白原。

本发明还提供了上述杂交瘤细胞系分泌的稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体，以及上述单克隆抗体在环境中雌性激素检测中的用途。

此外，本发明还提供了一种用于检测环境中雌性激素的试剂盒，其中包括上述稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体，例如鼠源稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体。该试剂盒还可以包括标记物标记的二抗，例如标记物标记的羊抗鼠二抗。其中，标记物可以为酶、生物素、荧光素或胶体金，优选为酶，更优选为辣根过氧化物酶。该试剂盒还包括鮈鲫卵黄蛋白原标准品、质控血清、显色剂和氧化剂。其中，所述显色剂为邻苯二胺和/或所述氧化剂为过氧化氢。

上述试剂盒的制备方法具体包括以下步骤：

(1)制备稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体；

(2)制备标记物标记的二抗；

(3)将稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体和标记物标记的二抗共同包装，制得试剂盒。

上述稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗均可按照常规方法制备。在本发明的一个具体实施方案中，所述用于检测环境中雌性激素的试剂盒包括可拆或不可拆的96孔酶标板，稀有鮈鲫卵黄蛋白原标准品、鼠源稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、邻苯二胺和过氧化氢。

本发明所提供的含有稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体的试剂盒，可应用于定性/定量检测稀有鮈鲫血清中的卵黄蛋白原，进而检测/评价环境雌性激素效应。在使用时，将已纯化的卵黄蛋白原非特异的吸附在酶标板上，封闭多余的结合位点后，加入待测样品与抗体预混溶液，温育一段时间，除去未结合的待测样品与抗体；然后加入酶标记二抗温育一段时间，并除去过量的酶标二抗，最后加入显色底物开始酶促反应，反应终止后在特定波长下测定溶液的吸光度。溶液的吸光度值与待测样品中卵黄蛋白原的含量呈负相关。同时用标准蛋白对比操作，并拟合工作曲线，根据拟合方程计算出待测血清样品中卵黄蛋白原的相应浓度。

综上所述，本发明利用稀有鮈鲫对雌激素类化合物的敏感性，基于间接竞争酶联免疫吸附原理，提供了能够稳定的分泌稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其所分泌的稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体能够特异性识别稀有鮈鲫卵黄蛋白原，通过用该单克隆抗体定性/定量检测稀有鮈鲫血清中的卵黄蛋白原，来检测/评价环境雌性激素效应。据此所制备的试剂盒，其灵敏度为2.6ng/mL，相应标准曲线的线性工作范围为3.9-2000ng/mL，操作简便、快速且样品需要量少(视卵黄蛋白原含量而定，零点几微升至几微升不等)，可降低水环境雌激素污染检测的分析成本，是一种新型的水环境雌激素污染检测工具，为水环境雌激素类物质的生物效应和生态风险评价研究提供了一种简便、高效、灵敏的新方法，具有广泛的应用前景。

本发明提供的分泌稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体的杂交瘤细胞系RVM-3于2009年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.2869。

附图说明

图1A为稀有鮈鲫血清与卵黄蛋白原标准品SDS-PAGE结果图；

图1B为稀有鮈鲫血清与卵黄蛋白原标准品Western blotting结果图；

1：蛋白分子量标准，箭头所示为稀有鮈鲫卵黄蛋白原对应的分子量；2，2’：空白组雄性稀有鮈鲫血清(稀释20倍)；3，3’：空白组雌性稀有鮈鲫血清(稀释20倍)；4，4’：雌二醇诱导的雄性稀有鮈鲫血清(稀释20倍)；5，5’：稀有鮈鲫卵黄蛋白原标准品。

图2为间接竞争ELISA方法检测稀有鮈鲫卵黄蛋白原的标准曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明所提供的稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体及其应用进行详细说明。

实施例1 稀有鮈鲫卵黄蛋白原标准品的诱导和纯化

将10mg17β-雌二醇(17β-estradiol，E₂)溶于10mL甲醇中，配制浓度为1mg/mL的储备液。按照1L水1g鱼的标准，将稀有鮈鲫置于玻璃缸中，加入适当体积17β-雌二醇储备液，使17β-雌二醇的最终浓度为100ng/L，甲醇浓度不高于0.01％。对稀有鮈鲫的暴露采用半静态的方式，每日换水。暴露21天后从稀有鮈鲫尾部静脉采集血液，于4℃离心获得血清。使用离子交换膜色谱(Sartobind^TM MA15 Q)纯化血清中的卵黄蛋白原。血清用磷酸盐缓冲溶液(PBS，20mM磷酸盐缓冲液，含有0.16M NaCl，pH6.5)稀释，并用0.22μm滤膜过滤。滤液通过预先用上述PBS平衡的阴离子交换膜，冲洗掉未吸附的蛋白后，通过改变流动相中NaCl的浓度，采用阶梯式洗脱模式将阴离子交换膜上吸附的不同蛋白组分洗脱，于280nm检测。收集各个洗脱组分，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，具体实验方法见《生物化学实验原理和方法》，李健武等合编，北京大学出版社，2004)，确定各组分中是否含有卵黄蛋白原。对含有卵黄蛋白原的洗脱液使用透析袋或超滤管脱盐后冻干，制得卵黄蛋白原冻干粉。

实施例2 稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体的制备

取适量卵黄蛋白原冻干粉，用去离子水溶解后，加入等体积弗氏完全佐剂。乳化后，采用皮下多点注射的方式(0.2mL/点)，初次免疫BalB/C小鼠(购自军事医学科学院)。三周后，采用卵黄蛋白原加弗氏不完全佐剂乳化抗原(剂量同上)，再次免疫小鼠。再间隔三周，不加佐剂，于生理盐水中腹腔注射抗原，七天后采血测定效价，检测免疫效果。两周后加强免疫，三天后，取脾细胞与SP2/0细胞(购自军事医学科学院)融合(具体方法见《细胞和分子免疫学实验技术》，金伯泉主编，第四军医大学出版社，2003)。

融合后，将细胞接种在96孔板内，加入HAT培养基，置于CO₂培养箱中37℃培养。培养两周后取上清初筛阳性孔。选取融合率达100％、阳性率达25％、OD值在1.0以上的孔进行亚克隆，用直接ELISA方法(具体实验方法见《生物化学实验原理和方法》，李健武等合编，北京大学出版社，2004)筛选阳性克隆。扩大培养阳性克隆，冻存部分细胞。部分注入小鼠腹腔，制备含有抗体的腹水。含有抗体的腹水可直接用于ELISA检测，也采用辛酸-饱和硫酸铵法将腹水中的单克隆抗体纯化(具体方法见《细胞和分子免疫学实验技术》，金伯泉主编，第四军医大学出版社，2003)。

采用SDS-PAGE和免疫蛋白印迹(Western blotting，具体实验方法见《分子克隆实验指南》第二版，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis主编，冷泉港实验室出版，1989)检测稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体的特异性，结果如图1A和图1B所示。图中所示结果表明，所制得的单克隆抗体特异性地与鮈鲫卵黄蛋白原相结合，而不与血清中的其他蛋白相结合。

实施例3 稀有鮈鲫卵黄蛋白原检测试剂盒的制备

本发明提供的稀有鮈鲫卵黄蛋白原定量检测试剂盒，包括以下成分：

1)空白酶标板(1块)，可以是可拆或不可拆的96孔酶标板；

2)标准品：1支(10μg稀有鮈鲫卵黄蛋白原冻干粉)；

3)卵黄蛋白原单克隆抗体(10μL)，使用前稀释32000倍；

4)辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体(10μL)，使用前稀释10000倍；

5)包被缓冲液(A)、样品稀释液(B)、底物缓冲液(C)、底物(D，即显色剂)、氧化剂(E)各1支；

6)终止液(2mol/L H₂SO₄)10mL；

其中，包被缓冲液(A)为0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6；样品稀释液(B)为0.2M PBS缓冲液，pH7.4，含0.05％ Tween-20；酶标板清洗液与样品稀释液相同；封闭液为含1％牛血清白蛋白的包被缓冲液；底物缓冲液(C)为磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH5.0；底物(D)为邻苯二胺(OPD)；氧化剂(E)为过氧化氢。

实施例4 稀有鮈鲫卵黄蛋白原检测试剂盒的使用方法

本发明所提供的稀有鮈鲫卵黄蛋白原检测试剂盒，其具体操作步骤如下：

(1)在96孔酶标板每孔中加入150μL用包被缓冲液稀释了的稀有鮈鲫卵黄蛋白原标准品，室温放置2小时后，转移至4℃冰箱中，包被过夜(14-16小时)。

(2)样品和标准品浓度系列的准备：用样品稀释液稀释样品和标准品，同时将卵黄蛋白原单克隆抗体用样品稀释液稀释至合适浓度(1:10000～1:30000)；将稀释后的样品、标准品分别与稀释后的上述抗体等体积混合，37℃温育2小时，然后转移至4℃冰箱中过夜。以单克隆抗体的稀释液为阳性对照，样品稀释液为试剂空白。

(3)弃去酶标板中液体，用清洗液洗板4次后，每孔加入300μL封闭液，37℃封闭2小时。

(4)弃去封闭液，每孔加入300μL清洗液，轻微震荡1分钟后弃去清洗液，重复4次。

(5)将配制好的样品、标准品浓度系列、阳性对照和试剂空白加入酶标板内，每孔150μL，并设置3个平行孔，37℃温育2小时。

(6)弃去孔内液体，按照步骤(4)洗涤酶标板。

(7)用样品稀释液稀释酶标记羊抗鼠IgG抗体至合适浓度，每孔加入150μL，37℃温育2小时。

(8)弃去酶标板中酶标记羊抗鼠IgG抗体，按照步骤(4)洗涤酶标板。

(9)每孔加入100μL显色底物(氧化剂终浓度为0.02％)，37℃暗处反应10-30分钟，待标准品加样孔呈现明显的黄色后，加入50μL终止液，终止反应。

(10)用酶标仪于490nm处检测吸光度。

(11)以吸光度的Logit值(见公式①)为纵坐标，稀有鮈鲫卵黄蛋白原标准品浓度的对数值(LgC_VTG)为横坐标作图，根据标准曲线的拟合方程计算样品吸光度相应的卵黄蛋白原浓度。

$\mathrm{Logit\; y}=\ln \left(\frac{B_i}{B_0-B_i}\right)$         ①

其中，B_i为稀有鮈鲫卵黄蛋白原标准品浓度系列各浓度对应的吸光度，B₀为阳性对照吸光度。

本发明检测试剂盒的灵敏度为2.6ng/mL，其检测标准曲线如图2所示，线性工作范围为3.9-2000ng/mL，测定时所需的样品量极少(0.5-10μL)。间接竞争ELISA方法检测稀有鮈鲫卵黄蛋白原的标准曲线为：y＝-2.3647x+5.191，线性相关系数R²＝0.9921。所配制的稀有鮈鲫卵黄蛋白原标准品浓度系列为：3.9、7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000和2000ng/mL，所使用的单克隆抗体为未经纯化的小鼠腹水。

Claims (10)

1.一种分泌稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏编号为CGMCC No.2869。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞系的制备方法，其包括以下步骤：

(1)制备稀有鮈鲫卵黄蛋白原；

(2)采用稀有鮈鲫卵黄蛋白原免疫Bal B/C小鼠；

(3)取Bal B/C小鼠的B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：从长时间暴露于含雌性激素水体中的稀有鮈鲫的血清中提取卵黄蛋白原。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞系分泌的稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的单克隆抗体在环境中雌性激素检测中的用途。

6.一种用于检测环境中雌性激素的试剂盒，其中包括根据权利要求4所述的稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体，例如鼠源稀有鮈鲫卵黄蛋白原单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标记物标记的二抗，例如标记物标记的羊抗鼠二抗。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物为酶、生物素、荧光素或胶体金，优选为酶，更优选为辣根过氧化物酶。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括鮈鲫卵黄蛋白原标准品；质控血清；显色剂和氧化剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂为邻苯二胺和/或所述氧化剂为过氧化氢。

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