背景技术
心脑血管疾病己成为影响现代社会人类健康的首要杀手,目前全球每年大约有2千万人死于急性心脑血管事件,而且其死亡率还在逐年增加。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是大多数心脑血管疾病的共同病理基础,由之引发的心肌梗死、脑血管栓塞等致死性疾病又是心血管疾病中致命性最高的。
AS是一个多种致病因素、多种因子参与的慢性病理过程。大量研究表明,脂质代谢异常和炎症反应是AS形成和发展的病理生理学基础。含大量脂质的巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是AS初期的特征性病理变化,也是AS发病的核心环节,泡沫细胞生成的多少对病变斑块的面积、血管的狭窄程度等具有直接的影响。而炎症反应贯穿于AS起始、进展及斑块破裂血栓形成的全过程,是不稳定斑块发生破裂的中心环节。目前,临床上发现的AS病人大部分属于中、晚期病变,这一时期最大的威胁是不稳定斑块破裂后产生的并发症。因此,调节脂质代谢、抑制炎症反应和稳定易损斑块现已成为防治AS的重要研究方向。
泡沫细胞形成的机制主要涉及巨噬细胞对脂质的摄入、包裹保护和逆向外流三方面:(1)正常情况下,巨噬细胞并不会主动吞噬低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL),只有当LDL被氧化成氧化修饰成为氧化低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein,ox-LDL)后,才会被巨噬细胞相应受体识别并吞噬。吞噬后的结果就是脂质在巨噬细胞内的大量沉积,形成巨噬细胞源性的泡沫细胞。巨噬细胞的脂质内吞是通过细胞表面受体介导的胞吞实现的,A和B两类清道夫受体是人们在研究巨噬细胞转变成泡沫细胞的机制时发现的膜表面受体,在AS的泡沫细胞和斑块形成中起重要作用,其中B类清道夫受体CD36被认为是ox-LDL的生理性受体,抑制CD36的表达可以减少巨噬细胞摄入脂质,从而抑制泡沫细胞形成。(2)脂质进入细胞内以后,不是以游离状态存在的,而是在由相关蛋白形成的小囊中存在,这些蛋白的保护对防治其中的脂质被水解有非常重要的作用,其中周脂素是包裹保护细胞内脂质的重要蛋白。周脂素在泡沫细胞中的表达情况,与脂质在动脉壁下沉积,也就是动脉粥样硬化形成具有直接的联系,而此种联系就在于周脂素对巨噬细胞源性泡沫细胞中脂滴的包裹保护作用,故降低周脂素mRNA及蛋白的表达可以减少巨噬细胞内脂滴的含量,抑制泡沫细胞形成。(3)细胞为保持其内部的胆固醇稳态环境,有一套将其逆向转运出细胞外的系统。这套系统与内吞和包裹系统协同作用,相互制约,对保持细胞内的胆固醇代谢平衡起到重要作用,其中ATP结合的转运盒A1(ATP-Binding Cassette A1,ABCA1)介导胆固醇逆向外流至贫脂或无脂的载脂蛋白(如载脂蛋白AI,Apo AI)是一个单向转运的过程。另外,肝孤儿受体α(Liver X Receptor α,LXRα)扮演着维持细胞内胆固醇水平稳态的重要角色,其转录因子直接调控胆固醇转运途径中多种基因的转录,激活LXRα会促进与胆固醇外流途径相关基因的表达,降低细胞内胆固醇含量。ABCA1是LXRα导致胆固醇外流的最关键部分。增加ABCA1 mRNA和LXRα mRNA的表达可以增加巨噬细胞内胆固醇的逆转运,抑制泡沫细胞形成。
AS斑块的形成是一个局部和系统的炎症过程。研究表明,决定斑块稳定性的主要因素如脂质核心的大小、纤维帽的厚度及其修复能力等与AS炎症反应密切相关。炎症引起斑块不稳定的机制主要表现在两个方面:(1)炎症细胞可促进AS斑块内脂质的沉积。脂蛋白和炎症反应相互作用,形成恶性循环,从而使斑块趋于不稳定;(2)炎症细胞分泌的基质金属蛋白酶、肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素等炎性介质相互作用后可促进细胞外基质的降解、削弱纤维帽,或抑制细胞外基质合成,降低其修复能力,从而使斑块不稳定,导致斑块易损及破裂。
大规模前瞻研究结果表明高敏C反应蛋白(high-sensitive C-Reactive Protein,hs-CRP)是全身炎症反应的敏感标志物,也是目前急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndrome,ACS)最可靠的独立预测因子,与AS斑块的形成和发展密切相关。而作为肿瘤坏死因子(TumorNecrosis Factor,TNF)超家族中的一种II型跨膜性蛋白质,可溶性CD40L(soluble CD40 ligand,sCD40L)与其受体CD40结合后,可激活AS斑块中粘附分子、细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶的产生,sCD40L是预测AS斑块不稳定的血清生化标志物。研究发现,与稳定型心绞痛病人相比,不稳定型心绞痛患者的血清hs-CRP及sCD40L水平明显高于稳定型心绞痛患者。
核因子κB(Nulear Factor-κB,NF-κB)是一类能与多种基因启动子或增强子部位位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质,NF-κB及其介导的炎性细胞因子、介质和蛋白酶在AS的发生和发展中起着极其重要的作用。NF-κB可作为斑块破裂的标志物,它通过调节白细胞介素1(Interleukin-1,IL-1)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TumorNecrosisFactor-α,TNF-α)、单核细胞趋化因子1(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)、组织因子(Tissue Factor,TF)、细胞间粘连分子-1(Intercellular Adhesion Molecule-1,ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(Vascular Cell Adhesion Molecule-1,VCAM-1)等基因的转录而在斑块的破裂中发挥重要作用。在不稳定型心绞痛患者中NF-κB的活性明显高于稳定型心绞痛患者,说明NF-κB与斑块的破裂关系密切。
基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)是一组酶活性依赖锌离子的可降解细胞外基质的蛋白酶超家族,基质金属蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)与AS斑块的不稳定尤为相关,特别是在不稳定斑块的肩区,MMP-9的活动明显升高,较稳定斑块高3~5倍。MMP-9能特异地与构成AS斑块纤维帽部分的细胞外基质相结合,降解细胞外各型胶原和明胶,可使弹性蛋白变弱,斑块的纤维帽变薄,削弱其抵抗应力的作用,使斑块易发生破裂。
因此,通过药物干预来调节AS病人的脂质代谢,降低其血清hs-CRP及sCD40L水平,抑制其NF-κB和MMP-9的表达,从而稳定易损斑快,已逐渐成为防治AS的新策略。
人参皂苷Compound K具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏和免疫调节等药理活性,但其在预防和治疗AS中的应用却未见报道。
具体实施方式
实施例1 初测毒
人参皂苷Compound K,口服灌胃400mg/kg,小鼠活动正常,未见异常。
实施例2 人参皂苷Compound K对大鼠腹腔巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响
1.实验动物
SD大鼠,雄性,200~250g,购于第三军医大学实验动物中心。
2.试剂
无酚红RPMI1640培养基购自Invitrogen公司;LDL(115mg/mL)购自北京协和医科大学;总胆固醇试剂盒及游离胆固醇试剂盒购自上海名典生物工程有限公司;人参皂苷Compound K(以下简称C-K。白色粉剂,纯度99%),由昆明诺维金参生物工程有限责任公司提供(批号为NTGA070521)。
3.ox-LDL的制备
将LDL置含10μM Cu2+的PBS中,37℃透析12h,然后置含0.01% EDTA的PBS中,4℃透析24h后中止氧化,过滤除菌后保存待用。
4.巨噬细胞的培养及泡沫细胞模型的建立
每只大鼠腹腔内注射无血清无酚红RPMI1640培养液2mL,20min后将其椎脱臼处死,75%乙醇浸泡10min,剖腹收集腹腔内液,750r/min离心5min后收集细胞,用含10%胎牛血清的无酚红RPMI1640培养液调整细胞浓度至5×106/mL。取6孔培养板10张,每孔加细胞悬液1mL,置5% CO2、37℃孵箱培养2h后去上清液,用PBS洗去未贴壁细胞。弃去原培养基,加入5mL含有20mg/L ox-LDL的培养基培养48h,即形成泡沫细胞。
5.分组
分为ox-LDL模型组、吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)对照组以及C-K干预组。每组5皿培养板。置5% CO2、37℃孵箱培养48h。
6.泡沫细胞内TC和CE含量的测定
吸去培养液,用Folch法抽提泡沫细胞中脂质,按试剂盒说明进行。
7.统计学分析
数据以x±s表示,组间用SPSS13.0统计软件进行方差分析。
8.结果
C-K和PDTC对大鼠腹腔巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响见表1,结果表明:与模型组相比,C-K(25μM)显著降低泡沫细胞内TC和CE含量,减轻泡沫细胞化,效果与同等浓度的PDTC相当。
表1 PDTC(25μM)以及C-K(25μM)对泡沫细胞内TC、CE以及CE/TC的影响(x±s,n=5)
注:a与模型组相比P<0.05。
实施例3 人参皂苷Compound K抑制大鼠腹腔巨噬细胞源性泡沫细胞形成的作用机制
1.人参皂苷Compound K对大鼠腹腔巨噬细胞源性泡沫细胞脂质摄入的影响
(1)材料和试剂(同实施例2)。
(2)实时定量PCR分析(参照方法:张翼冠,李晓辉,樊继山,张海港,李淑惠,廖文强,庞燕,贾乙。三七总皂苷通过抗炎和调血脂作用抑制大鼠动脉粥样硬化形成。现代生物医学进展。2007,27(11),1601~1607)。
(3)统计学分析
数据以x±s表示,组间用SPSS13.0统计软件进行方差分析。
(4)结果
经人参皂苷Compound K(25μM)处理后的泡沫细胞与模型组相比,其CD36 mRNA的表达变化不明显,而阳性对照药PDTC(25μM)会导致CD36 mRNA表达的增加(见图1)。
2.人参皂苷Compound K对大鼠腹腔巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质包裹保护的影响
(1)材料和试剂(同实施例2)。
(2)实时定量PCR分析(参照方法:张翼冠,李晓辉,樊继山,张海港,李淑惠,廖文强,庞燕,贾乙。三七总皂苷通过抗炎和调血脂作用抑制大鼠动脉粥样硬化形成。现代生物医学进展。2007,27(11),1601~1607)。
(3)统计学分析
数据以x±s表示,组间用SPSS13.0统计软件进行方差分析。
(4)结果
与模型组相比,人参皂苷Compound K(25μM)显著下调周脂素mRNA及蛋白表达,降低巨噬细胞内脂滴的含量(见图2,图3),效果与同等浓度的PDTC相当。
3.人参皂苷Compound K对大鼠腹腔巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇逆向转运的影响
(1)材料和试剂(同实施例2)。
(2)实时定量PCR分析(参照方法:张翼冠,李晓辉,樊继山,张海港,李淑惠,廖文强,庞燕,贾乙。三七总皂苷通过抗炎和调血脂作用抑制大鼠动脉粥样硬化形成。现代生物医学进展。2007,27(11),1601~1607)。
(3)统计学分析
数据以x±s表示,组间用SPSS13.0统计软件进行方差分析。
(4)结果
与模型组相比,人参皂苷Compound K(25μM)显著上调ABCA1 mRNA和LXRα mRNA的表达,增加巨噬细胞内胆固醇的逆转运(见图4,图5),效果与同等浓度的PDTC相当。
实施例4 人参皂苷Compound K对载脂蛋白E基因缺陷小鼠血脂、AS炎症反应及斑块稳定性的影响
1.材料和方法
(1)动物
10周龄健康清洁级C57BL/6J apo E-/-小鼠80只,雌雄各半,体重20~22g,于无菌层流架中分笼饲养,自由饮水摄食。以“西方膳食”(常规小鼠饲料+0.15%胆固醇+21%脂肪)高脂饲料(60钴灭菌照射处理)饲养30周,饲养条件为SPF级,室温保持在24℃,相对湿度50%,光照时间7:30~19:30。每两天用紫外灯消毒动物房1次,以保持层流架的无菌环境。
(2)动物分组及给药方法
饲养15周后的apo E-/-小鼠随机处死5只,取其主动脉根部,HE色观察AS模型复制情况。其余小鼠随机分成以下5组(n=15):
A.模型组:溶媒;
B.人参皂苷Compound K低剂量组:人参皂苷Compound K 12.5mg/kg/day;
C.人参皂苷Compound K中剂量组:人参皂苷Compound K 25.0mg/kg/day;
D.人参皂苷Compound K高剂量组:人参皂苷Compound K 50.0mg/kg/day;
E.辛伐他汀对照组:辛伐他汀10.0mg/kg/day。
以上药物先溶于DMSO,然后混悬于0.5%羧甲基纤维素溶液,混匀后灌胃,每天1次。每周测1次体重并记录摄食量,根据体重调整药物剂量,干预15周。所有动物第30周末全部处死。
(3)动物取材
apo E-/-小鼠血清标本:药物干预15周后的apo E-/-小鼠,于取材前禁食水12h,处死前以1%戊巴比妥0.5~1.0mL经腹腔麻醉,无菌条件下从其眼眶静脉丛采血1.5mL,2500r/min离心10min后分离血清,-80℃冻存,用于测定血清中的血脂浓度和炎症标志物。
apo E-/-小鼠AS斑块病理组织切片:apo E-/-小鼠经眼眶静脉丛采血后颈椎脱臼处死,以含4%多聚甲醛的生理盐水从左心室逆行灌注固定主动脉后,自主动脉根部至腹主动脉末端离断整个主动脉。取主动脉根部,常规石蜡包埋,从主动脉根部连续取5μm厚度的切片分别经HE染色和MASSON染色后用于分析主动脉瓣横截面AS斑块形态学指标。
apo E-/-小鼠主动脉根部总RNA样品:提取各组小鼠主动脉根部总RNA样品,用于分析各种与AS斑块进展相关脂质代谢因子、炎症因子和核转录因子的基因表达。
病理染色:①从每只小鼠主动脉根部连续石蜡切片的每个切面取连续的2张切片分别进行HE染色和MASSON染色,光镜下观察。②取剩余的主动脉用苏丹IV染色,光镜下观察。(4)检测指标与检测方法
①血脂测定:采用Olympus Au2700全自动生化仪测定血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C浓度。
②血清炎症标志物测定:采用双抗夹心ELISA法测定hs-CRP和sCD40L浓度,按照ELISA试剂盒说明书进行操作。
③实时定量PCR分析apo E-/-小鼠主动脉内CD36、周脂素、ABCA1、LXRα、MMP-9及NF-κB mRNA表达(参照方法:张翼冠,李晓辉,樊继山,张海港,李淑惠,廖文强,庞燕,贾乙。三七总皂苷通过抗炎和调血脂作用抑制大鼠动脉粥样硬化形成。现代生物医学进展。2007,27(11),1601~1607)。
④形态学指标图像分析:HE染色切片,×40倍普通光镜下,利用“Image Pro Plus 5.0”图像分析软件测定各个切面的动脉粥样斑块面积。测量斑块面积(PA)、血管横截面积(CVA)、脂质核心面积(LCA)和最小纤维帽厚度(mFCT),计算校正斑块面积(斑块面积/血管横截面积,PA/CVA)及校正脂质核面积(脂质核心面积/斑块面积,LCA/PA),每个标本取4个切面的平均值。Masosn染色,利用“Image Pro Plus5 .0”图像分析软件测量主动脉根部胶原面积(CA),计算胶原血管面积比(CA/CVA)。苏丹IV染色,×4倍光镜分析计算主动脉内膜面的全部斑块面积,以及斑块面积占整个动脉内膜面积的比例。
(5)统计学分析
数据以x±s表示,组间用SPSS13.0统计软件进行方差分析。
(6)结果
①人参皂苷Compound K(以下简称C-K)对apo E-/-小鼠血脂的影响见表2。结果表明:与模型组相比,C-K低、中、高剂量组均显著降低apo E-/-小鼠血清中TC、TG和LDL-C浓度,上调HDL-C浓度;C-K调节血脂的作用不及辛伐他汀。
表2 C-K对apo E-/-小鼠血脂浓度的影响(mmol/L,x±s,n=15)
注:a与模型组相比P<0.05。b与模型组相比P<0.01。
②人参皂苷Compound K(以下简称C-K)对apo E-/-小鼠血清中hs-CRP和sCD40L的影响见表3。结果表明:与模型组相比,C-K低、中、高剂量组均显著降低apo E-/-小鼠血清中hs-CRP和sCD40L浓度。
表3 C-K对apo E-/-小鼠血清中hs-CRP和sCD40L浓度的影响(ng/mL,x±s,n=15)
注:a与模型组相比P<0.05。b与模型组相比P<0.01。
③人参皂苷Compound K(以下简称C-K)对apo E-/-小鼠主动脉内CD36、周脂素、ABCA1、LXRα、MMP-9及NF-κB mRNA表达的影响见表4。结果表明:与模型组相比,C-K低、中、高剂量组均显著下调apo E-/-小鼠主动脉内CD36、周脂素、MMP-9及NF-κB mRNA的表达;C-K低、中、高剂量组均显著上调apo E-/-小鼠主动脉内ABCA1和LXRαmRNA的表达。
表4 C-K对apo E-/-小鼠主动脉内CD36、周脂素、LXRα、ABCA1、MMP-9
和NF-κBmRNA表达(相对浓度)的影响(x±s,n=15)
注:a与模型组相比P<0.05。b与模型组相比P<0.01。
④人参皂苷Compound K(以下简称C-K)对apo E-/-小鼠主动脉AS斑块及其稳定性的影响见表5。结果表明:与模型组相比,C-K低、中、高剂量组显著降低apo E-/-小鼠主动脉AS校正斑块面积(斑块面积/血管横截面积,PA/CVA),显著减小apo E-/-小鼠主动脉AS斑块内脂质核心面积及校正脂质核心面积(脂质核心面积/斑块面积,LCA/PA),显著增大apo E-/-小鼠主动脉AS斑块纤维帽厚度和校正胶原面积(胶原面积/血管横截面积,CA/CVA),稳定AS斑块。
表5 C-K对apo E-/-小鼠主动脉AS斑块及斑块内成分的影响(x±s,n=15)
注:a与模型组相比P<0.05。b与模型组相比P<0.01。
⑤人参皂苷Compound K(以下简称C-K)对apo E-/-小鼠主动脉AS病变程度的影响见表6。结果表明:与模型组相比,C-K低、中、高剂量组显著降低apo E-/-小鼠主动脉AS斑块面积占整条动脉内膜面积的百分比,减轻主动脉的AS病变程度。
表6 C-K对apo E-/-小鼠主动脉AS病变程度的影响(x±s,n=15)
注:b与模型组相比P<0.01。