CN101503702B - 一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用 - Google Patents
一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101503702B CN101503702B CN2008100335495A CN200810033549A CN101503702B CN 101503702 B CN101503702 B CN 101503702B CN 2008100335495 A CN2008100335495 A CN 2008100335495A CN 200810033549 A CN200810033549 A CN 200810033549A CN 101503702 B CN101503702 B CN 101503702B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- promotor
- pfura
- primer
- lacz
- differential expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属微生物和生物工程领域。涉及一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法。本发明采用结核杆菌furA基因启动子/操纵子序列(pfurA)及其突变体为启动子构建分支杆菌差异表达的载体系统-pMFA系列,利用BCG为宿主菌差异表达结核杆菌主要保护性抗原。试验结果表明,用pMFA系列,嵌合蛋白Ag856A2在耻垢分支杆菌及BCG中能在不同pfurA启动子系列驱动下差异表达,具有起始密码子及AT富集区联合突变的pfurAma导致最高水平的基因表达。本发明-pMFA系列,能使任何有价值的免疫优势抗原基因在BCG中以不同水平进行差异表达,进一步诱导机体产生最佳的免疫反应,并通过动物实验筛选理想的候选重组BCG疫苗。
Description
技术领域
本发明属微生物和生物工程领域。具体涉及一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用。
背景技术
结核病是全世界关注的一种主要的公众传染性疾病。早在1993年,世界卫生组织(WHO)就全球的结核病例日趋增多而宣布结核病疫情进入紧急状态。目前,全世界约有1/3人口(18.6亿)携带有结核杆菌,每年约有800万新增病例,200万人死于结核病;我国大约有活动性结核病人600万,每年有25万人死于结核病。根据卫生部公布的2005年传染病疫情,在27种法定甲、乙类传染病中,肺结核的发病数已经超过乙型肝炎,肺结核的死亡数超过了狂犬病,发病数和死亡数均居第一位。而且,结核病的控制也因为多重抗药性(Multidrug-resistant,MDR)菌株和艾滋病的出现使得本就越来越严重的结核病疫情变得更加复杂化。
目前,预防结核病唯一有效的疫苗是卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG),一种活的减毒牛型分支杆菌(Mycobacterium bovis)。然而遗憾的是由于BCG发明的当时还没有冻干技术,用来生产BCG的菌种在早期是通过培养的方法进行传代和保存的,这种方法一直沿用到20世纪60年代,结果造成了世界各国使用的卡介苗菌种之间极大的差异性。据统计,在世界各国进行过大小数十次的卡介苗临床试验,然而试验结果显示,卡介苗对肺结核的免疫保护力为0-80%,差异性极大(Brewer,T.F.and Colditz,G.A.Clin Infect Dis.1995;20:126-35.Colditz,G.A.,Brewer,T.F.,et al.JAMA.1994;271:698-702.)。因此,研究一种保护效力超过BCG的结核病新疫苗势在必行。
尽管BCG对成人结核病的保护效力差强人意,但是由于其良好的免疫刺激效果以及数十年来业已证实的安全性,使得其可作为预防结核病以及其他传染病的优良细菌表达载体。有报道证实了不同来源的保护性候选抗原均可在其中克隆并得以表达,从而构建了相应更为高效的重组BCG疫苗(Stover,C.K.,de la Cruz, V.F.,et al.Nature.1991;351:456-60.Stover,C.K.,Bansal,G.P.,et al.J Exp Med.1993;178:197-209.Grode,L.,Seiler,P.,et al.J Clin Invest.2005;115:2472-9.)。几项致力于提高针对结核病、麻风病、利氏曼原虫感染的接种效率的研究表明,不同的抗原可能需要不同的表达水平才能诱导出机体最佳的免疫效果(Bloom,B.R.and Fine,P.E.M.in Tuberculosis:Pathogenesis,Protection and Control(Bloom,B.R.,Ed.),1994;pp.531-7.ASM Press.Washington,DC.DasGupta,S.K.,Jain,S.,et al.Biochem Biophys Res Commun.1998;246:797-804.)。
在过去的二十年中,分支杆菌的分子遗传学研究取得了重要的进展。有关研究利用来源于M.fortuitum质粒pAL5000的复制起点(Ranes,M.G.,Rauzier,J.,et al.J Bacteriol,1990;172:2793-7.),构建了多种不同的大肠杆菌-分支杆菌穿梭载体用来控制分支杆菌的遗传操作及基因表达(Stover,C.K.,de la Cruz,V.F.,et al.Nature.1991;351:456-60.Timm,J.,Lim,E.M.et al.J Bacteriol.1994;176:6749-53.Garbe,T.R.,Barathi,J.,et al.Microbiology,1994;140:133-8.)。研究发现大部分分支杆菌的表达载体都依赖于热休克蛋白hsp60基因的启动子(phsp60),因而这在一定程度上限制了基因表达的范围(Stover,C.K.,de la Cruz,V.F.,et al.Nature.1991;351:456-60.Stover,C.K.,Bansal,G.P.,et al.J Exp Med.1993);而且phsp60来源质粒的稳定性也受到了一定的质疑(Kumar,D.,Srivastava,B.S.et al.Vaccine,1998;16:1212-5.Haeseleer,F.Res Microbiol,1994;145:683-7.),Al-Zarouni和Dale最近报道了phsp60在电转化后的短暂诱导过程中易导致其质粒的不稳定(Al-Zarouni,M.and Dale,J.W.Tuberculosis(Edinb),2002;82:283-91.)。其他早期成功应用的启动子,包括那些分别来源于M.kansasii α抗原(Matsuo,K.,Yamaguchi,R.,et al.Infect Immun,1990;58:4049-54.)、M.paratuberculosis IS900 ORF2(Murray,A.,Winter,N.,et al.Mol Microbiol,1992;6:3331-42.)、M.tb.19kDa抗原(Stover,C.K.,Bansal,G.P.,et al.J Exp Med.1993)、M.leprae 18kDa抗原(Dellagostin,O.A.,Esposito,G.,et al.Microbiology,1995;141:1785-92.)等基因的启动子。然而,由于对分支杆菌转录调节机制缺乏足够的认识,阻碍了其调控基因表达的多功能表达载体的建立。
pfurA尽管被证实为强启动子(Sala,C.,Forti,F.,et al.J Bacteriol,2003;185:5357-62.Zahrt,T.C.,Song,J.,et al.Mol Microbiol,2001;39:1174-85.),然而,在正 常的生长条件下,pfurA活性几乎被其自身编码的FurA蛋白所阻遏。如果保守的furA基因上游调控区的23-bpAT富集区序列突变(pfurAm),则可以阻止FurA蛋白与其结合并解除阻遏;而且,该种形式的突变也不会降低pfurA活性,因为当其克隆至luxAB报告基因上游时可表现比野生型启动子高得多的荧光素酶活性。而起始密码子GTG突变为ATG,翻译起始效率可以提高2-4倍(Shaw,G.C.and Fulco,A.J.J Biol Chem,1992;267:5515-26.Martin,R.G.and Rosner,J.L.MolMicrobiol,2004;53:183-91.)。
外源基因在重组BCG中表达必然会给宿主菌带来一定的代谢负担,以phsp60为启动子的载体在BCG中表达外源基因也并非总是成功。Stover等就不能以质粒形式表达HIV-1 gp120基因,但能够以整合形式表达(Stover,C.K.,de laCruz,V.F.,et al.Nature.1991);Kong和Kunimoto也只能以整合质粒的形式表达IL-2,而非游离载体(Kong,D.and Kunimoto,D.Y.Infect Immun,1995;63:799-803.)。上述案例中不成功的原因可能在于外源蛋白过表达的致死性或者蛋白毒性等其他形式,提示了应用较弱活性的启动子可能使得外源基因能够在多拷贝的游离载体中也得以成功表达(Burlein,J.E.,Stover,C.K.,et al.in Tuberculosis:Pathogenesis,Protection and Control(Bloom,B.R.,Ed.),1994;pp.531-537.ASMPress.Washington,DC.Dennehy,M.and Williamson,A.L.Vaccine,2005;23:1209-24.)。因此,差异表达载体系统的建立,如pMFA系列,必将方便克隆并以可控的形式表达任何有价值的免疫优势抗原基因,从而诱导机体产生最佳的免疫反应,并在动物实验基础上从中筛选出理想的候选重组BCG疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种分支杆菌差异表达系统,采用结核杆菌furA基因启动子/操纵子序列(pfur A)及其衍生的突变体为启动子构建分支杆菌差异表达的载体系统,可实现外源基因以不同的水平在分支杆菌中差异表达。
本发明的另一目的是提供上述分支杆菌差异表达系统的制备方法。
本发明用突变引物对结核分支杆菌furA基因操纵子序列进行PCR扩增,分别产生了一个正常序列的furA启动子(pfurA)、一个AT富集区序列6-bp替换突变的启动子(pfurAm),一个起始密码GTG突变为ATG的启动子(pfurAa),以及兼有后二者突变的启动子(pfurAma)。随后,pfurA系列被克隆至启动子探 针载体pMC210中评估其各自启动子的强度,并亚克隆至父系穿梭载体pMV261中,取代其BCG phsp60启动子及部分酶切位点,建立新的分支杆菌差异表达载体,命名为pMFA系列。
本发明的分支杆菌差异表达系统通过下述方法和步骤制备:
1、构建一种分支杆菌-大肠杆菌穿梭探针载体pMC210用以评估启动子强度:以pSV-β-gal质粒为模板,PCR扩增获得截短的大肠杆菌lacZ基因片段(9-1023 aa.),经BamHI-HindIII双酶切消化后克隆至pBluescript KS(pKS)产生pKS-LacZ’,质粒pMV261经XbaI-HindIII双酶切消化去除BCG hsp60启动子,并与经同样酶切消化的lacZ’片段连接,最终得启动子探针载体pMC210;
2、pfurA基因定点突变及其启动子强度分析:带有6-bp突变或者起始密码突变为ATG的下游引物分别与同样的上游引物配对,扩增出结核杆菌furA基因启动子(pfurA)及其突变体,扩增的片段经XbaI-BamHI双酶切消化后克隆至pBluescript KS(+),经DNA测序验证各自启动子相应的突变后,pfurA及其突变体经XbaI-BamHI双酶切消化后克隆至pMC210载体的lacZ’上游,通过β-半乳糖苷酶活性鉴定来分析其各自的启动子强度;
3、构建差异表达载体----pMFA系列:pfurA系列在分析了其启动子强度后,亚克隆至父系穿梭载体pMV261中,取代其BCG phsp60启动子及部分酶切位点,得新的分支杆菌差异表达载体----pMFA系列(图3A),其表达框包含了406-bp的结核杆菌furA基因5’端调控序列及其头6个编码氨基酸,7个调整过的多克隆酶切位点以及rrnB T1转录终止子(图3B);
4、嵌合基因ag856a2在分支杆菌中的克隆与表达:利用结核杆菌嵌合基因ag856a2作为基因表达的报告基因,结果显示,pMFA载体系列成功的实现目的基因在分支杆菌中的差异表达。
本发明的进一步目的是提供上述分支杆菌差异表达系统在重组卡介苗中的应用。
所述的分支杆菌差异表达系统通过一套来源于结核杆菌furA基因的上游调控序列作为启动子,可驱动外源目的基因在分支杆菌中以不同的水平差异表达,并利用BCG作为宿主菌差异表达结核杆菌主要保护性抗原。
本发明以动物实验验证过的免疫原性良好的嵌合基因ag856a2作为目标基因,将其克隆至差异表达载体----pMFA系列中,电转化至分支杆菌中,并通过Western-blot检测其各自嵌合蛋白的表达水平。结果显示,嵌合蛋白Ag856A2在耻垢分支杆菌及BCG中均能在不同pfurA启动子系列的驱动下差异表达,而且,具有起始密码子及AT富集区联合突变的pfurAma导致了最高水平的基因表达,与β-半乳糖苷酶活性测定结果一致。
结果显示,pfurA系列被亚克隆至启动子探针载体pMC210的lacZ′基因的上游,通过测定重组分支杆菌的β-半乳糖苷酶活性以评估其各自启动子的强度。在两种分支杆菌中,无论是耻垢分支杆菌还是牛分枝杆菌BCG,pfurA起始密码子GTG→ATG突变(pfurAa)仅能引起大约2倍β-半乳糖苷酶活性的升高,而AT富集区序列6-bp的替换突变(pfurAm)则使β-半乳糖苷酶活性升高4-6倍;如果是上述两者的联合突变(pfurAma),β-半乳糖苷酶活性则升高约10倍,比在分枝杆菌过表达蛋白时常用的强启动子phsp60也要高1.7-2倍(图2)。而且,furA启动子系列在慢速生长的BCG中比在快速生长的耻垢分支杆菌中表现出了更高的β-半乳糖苷酶活性。进一步以结核杆菌嵌合基因ag856a2作为基因表达的报告基因,利用差异表达载体pMFA系列,嵌合蛋白Ag856A2在耻垢分支杆菌及BCG中均能在不同pfurA启动子系列的驱动下差异表达(图4),而且,具有起始密码子及AT富集区联合突变的pfurAma导致了最高水平的基因表达,这与β-半乳糖苷酶活性测定结果一致。
本发明采用强启动子pfurA系列为基础构建了差异表达载体----pMFA系列,实现了使得任何有价值的免疫优势抗原基因在BCG中以不同水平进行差异表达,进一步能诱导机体产生最佳的免疫反应,并通过动物实验从中筛选出理想的候选重组BCG疫苗。
附图说明:
图1是启动子探针载体pMC210的构建图,
其中,5’端截短的E.coli lacZ’基因(9-1023aa)以pSV-β-gal为模板PCR扩增并克隆至pMV261中产生lacZ’基因融合的探针载体pMC210(A),其多克隆位点被显示,lacZ’基因的第9氨基酸残基及终止密码分别被标记为Val,STOP (B)。
图2是M.tb pfurA系列启动子强度的分析图,
其中,pfurA启动子系列及phsp60分别克隆至探针载体pMC210的lacZ′基因上游,重组穿梭质粒转化M.smegmatis mc2155及M.bovis BCG-Pasteur株,然后测定重组分支杆菌对数生长期的β-半乳糖苷酶活性。
图3是分支杆菌差异表达载体pMFA系列的构建图,
其中,pfurA及其突变体克隆至pMV261中取代phsp60即产生了差异表达载体----pMFA系列(A);pMFA40载体表达框包含了406-bp的M.tbfurA基因上游5’端调控序列(pfurAma),包括其头6个编码氨基酸(小方框内,单字母注释)和7个单一的多克隆酶切位点(B);
pfurAma突变的6个碱基以*标示于序列上方,-35及-10序列加粗显示,AT富集区加框显示。
图4是Western-blot分析嵌合基因ag856a2在重组耻垢分支杆菌(A)及BCG(B)中的表达图,
其中,Lane 1-4为分别携带有不同pfurA,pfurAm,pfurAa,和pfurAma启动子的pMFA表达载体系列的重组分枝杆菌克隆的超声波裂解上清液;
Lane NC为宿主分支杆菌M.smegmatis mc2155或M.bovis BCG-Pasteur株,
Lane PC为0.2μgE.coli表达的重组嵌合蛋白Ag856A2。
具体实施方式
实施例1.构建分支杆菌-大肠杆菌穿梭探针载体pMC210
以pSV-β-gal质粒(Promega)为模板,以表1所示序列的lacZ-F和lacZ-R为引物,PCR扩增获得截短的大肠杆菌lacZ基因片段(9-1023 aa.),经BamHI-HindIII双酶切消化后克隆至pBluescript KS(pKS,MBI Fermentas)产生pKS-LacZ’。质粒pMV261经XbaI-HindIII双酶切消化去除BCGhsp60启动子,并与经同样酶切消化的lacZ’片段连接,最终得到了启动子探针载体pMC210(图1)。
表1是质粒构建所用的引物序列(按顺序排序序列1~11)。
表1.
a限制性内切酶下划线表示,pfurA序列中突变碱基粗体显示。
实施例2.pfurA基因定点突变
带有6-bp突变或者起始密码突变为ATG的表1所示序列的下游引物(pfurA-R1-4)分别与同样的上游引物(pfurA-F)配对,对结核杆菌furA基因操纵子序列进行PCR扩增,分别产生了一个正常序列的furA启动子(pfurA)、一个AT富集区序列6-bp替换突变的启动子(pfurAm),一个起始密码GTG突变为ATG的启动子(pfurAa),以及兼有后二者突变的启动子(pfurAma)。扩增的片段经XbaI-BamHI双酶切消化后克隆至pKS(图2),经DNA测序验证各自启动子相应的突变后,pfurA及其突变体经XbaI-BamHI双酶切消化后克隆至pMC210载体的lacZ’上游,通过测定重组分支杆菌的β-半乳糖苷酶活性以评估其各自启动子的强度。
实施例3.β-半乳糖苷酶活性分析pfurA系列的启动子强度
带有不同pfurA-lacZ’融合基因的重组分支杆菌菌株在完全Middlebrook 7H9培养基中生长至对数期后,测定其OD600值。然后取10μl菌液加入990μl Z buffer(6mM Na2HPO4,40mM NaH2PO4,10mM KCl,1mM MgSO4,50mM-mercaptoethanol),然后加入1滴0.1%SDS和2滴氯仿,振荡混匀后于37℃放置15分钟裂解细菌,加入200μl ONPG底物(4mg/ml,溶于100mM KH2PO4,pH7.0),监控酶学反应直到产生黄色后,加入0.2ml of 2.5M Na2CO3终止反应,12,000rpm离心5分钟后测定OD420值,按下式计算β-半乳糖苷酶活性:
(OD420×1,000)/(t×v×OD600),
t为孵育时间(min),v为加入体积(ml),OD420、OD600分别为420nm、600nm的光密度值。
实施例4.构建分支杆菌差异表达系统
pfurA系列在分析了其启动子强度后,亚克隆至父系穿梭载体pMV261中,取代其BCG phsp60启动子及部分酶切位点,得新的分支杆菌差异表达载体-- --pMFA系列(图3A),其表达框包含了406-bp的结核杆菌furA基因5’端调控序列及其头6个编码氨基酸,7个调整过的多克隆酶切位点以及rrnB T1转录终止子(图3B)。
实施例5.嵌合基因ag856a2在分支杆菌中的克隆与表达
采用结核杆菌嵌合基因ag856a2为报告基因(Li,Z.,Song,D.,et al.DNA CellBiol.2006;25:25-30.Li,Z.,Zhang,H.,Fan,X.,et al.Vaccine.2006;24:4565-8.),观察其在分支杆菌中的差异表达情况。嵌合基因ag856a2以DNA疫苗HG856A为模板,PCR扩增后连接转化至克隆载体pKS中,经DNA测序验证验证其序列无误后,经BamHI/EcoRI双酶切后克隆至差异表达载体pMFA系列中;构建得的重组质粒电转化耻垢分支杆菌mc2155及BCG-Pasteur株,涂布于完全Middlebrook 7H11 Kna抗性平板上进行筛选;重组分支杆菌阳性克隆接种至完全Middlebrook 7H9液体培养基中至对数生长期后期,离心收获的细胞重悬于1×TBS缓冲液后超声波破碎,收集裂解液上清,用Bradford法测定其蛋白浓度后,Western-blot鉴定其蛋白表达情况;各取等量蛋白(约15μg)跑12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,20V×30min半干转印,PVDF膜在10%脱脂奶粉中封闭1小时后与小鼠嵌合蛋白Ag856A2抗血清(Li,Z.,Song,D.,et al.DNA Cell Biol.2006;25:25-30.Li,Z.,Zhang,H.,Fan,X.,et al.Vaccine.2006;24:4565-8)1∶1000孵育1小时,再于HRP标记的羊抗鼠IgG 1∶6000孵育45分钟,最后用化学发光底物ECL反应1分钟后曝光于X光片。
结果表明利用差异表达载体pMFA系列,嵌合蛋白Ag856A2在耻垢分支杆菌及BCG中均能在不同pfurA启动子系列的驱动下差异表达(图4),而且,具有起始密码子及AT富集区联合突变的pfur Ama导致了最高水平的基因表达。
一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用序列表
SEQUENCE LISTING
<110>复旦大学
<120>一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用
<130>11
<140>200810033549.5
<141>2005-02-05
<160>11
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>微生物
<400>1
cgcggatccg tcgttttaca acgtcgtg 28
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>微生物
<400>2
ccaagctttc attatttttg acaccagacc aac 33
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>微生物
<400>3
ggtctagagg cgggcaccgg gacacac 27
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>微生物
<400>4
cgcggatccg tccggtatag aggacacact 30
<210>5
<211>58
<212>DNA
<213>微生物
<400>5
cgcggatccg tccggtatag aggacacact agacaatatg actcccagga gaggaatc
58
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>微生物
<400>6
cgcggatccg tccggtatag aggacatac 29
<210>7
<211>58
<212>DNA
<213>微生物
<400>7
cgcggatccg tccggtatag aggacatact agacaatatg actcccagga gaggaatc
58
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>微生物
<400>8
cactctagag gtgaccacaa cgacgcgcc 29
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>微生物
<400>9
cactctagag gtgaccacaa cgacgcgcc 29
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>微生物
<400>10
acaggatccttttcccggcc gggcttgc 28
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>微生物
<400>11
tctgaattcc taggcgccct ggggcgc 27
Claims (2)
1.一种分支杆菌差异表达载体----pMFA系列,其特征是以结核杆菌furA基因的启动子pfurA及其突变体实现外源基因在分支杆菌中差异表达;通过下述方法制备:
用下游引物pfurA-R1-4分别与同样的上游引物pfurA-F配对,对结核分支杆菌furA基因操纵子PCR扩增,分别产生启动子pfurA、启动子pfurAm,启动子pfurAa,启动子pfurAma后,上述启动子分别克隆至启动子探针载体pMC210,并亚克隆至父系穿梭载体pMV261中,取代其BCG phsp60启动子及部分酶切位点,建立分支杆菌差异表达载体,命名为pMFA系列;
所述的启动子pfurAm是AT富集区序列6-bp替换突变的启动子,其中,突变形式为furA基因启动子上游AT富集区AGAGGA突变为TCTCCT;所述的启动子pfurAa是起始密码GTG突变为ATG的启动子,所述的启动子pfurAma为兼有启动子pfurAm和pfurAa突变的启动子;
所述的下游引物pfurA-R1-4与上游引物pfurA-F的序列为:
引物pfurA-F:5’-GGTCTAGAGGCGGGCACCGGGACACAC-3’
引物pfurA-R1:5’-CGCGGATCCGTCCGGTATAGAGGACACACT-3’
引物pfurA-R2:5’-CgCGGATCCGTCCGGTATAGAGGACACACTAGACAATATGACTCCCAGGAGAGGAAT C-3’
引物pfurA-R3:5’-CGCGGATCCGTCCGGTATAGAGGACATACT-3’
引物pfurA-R4:5’-CgCGGATCCGTCCGGTATAGAGGACATACTAGACAATATGACTCCCAGGAGAGGAAT C-3’;
所述的探针载体pMC210是以pSV-β-gal质粒为模板,lacZ-F和lacZ-R为引物,PCR扩增获得截短的大肠杆菌lacZ基因片段,经BamHI-HindIII双酶切消化后克隆至pBluescript KS得pKS-LacZ’,质粒pMV261经XbaI-HindIII双酶切消化去除BCG hsp60启动子,与经过pKS-LacZ’酶切消化得到的lacZ’片段连接,制得;所述的lacZ-F和lacZ-R引物的序列分别为:
引物lacZ-F:5’-CGCGGATCCGTCGTTTTACAA CGTCGTG-3’
引物lacZ-R:5’-CCAAGCTTTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3’。
2.权利要求1所述的分支杆菌差异表达载体----pMFA系列在制备重组卡介苗中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008100335495A CN101503702B (zh) | 2008-02-05 | 2008-02-05 | 一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008100335495A CN101503702B (zh) | 2008-02-05 | 2008-02-05 | 一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101503702A CN101503702A (zh) | 2009-08-12 |
CN101503702B true CN101503702B (zh) | 2012-07-04 |
Family
ID=40976077
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008100335495A Expired - Fee Related CN101503702B (zh) | 2008-02-05 | 2008-02-05 | 一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101503702B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101912605A (zh) * | 2010-04-23 | 2010-12-15 | 上海市公共卫生临床中心 | 增强型嵌合基因重组卡介苗及其制备方法 |
CN104685054A (zh) * | 2012-09-27 | 2015-06-03 | 成都永安制药有限公司 | Lsr2活性降低或敲除的改良BCG菌株及包含该菌株的药物组合物 |
CN111979162B (zh) * | 2019-05-22 | 2024-02-13 | 上海市公共卫生临床中心 | 重组卡介苗菌株、其制备方法和用途 |
CN113416745A (zh) * | 2021-03-25 | 2021-09-21 | 上海晶诺生物科技有限公司 | 一种aTc诱导表达结核分枝杆菌基因的游离型质粒 |
-
2008
- 2008-02-05 CN CN2008100335495A patent/CN101503702B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Claudia Sala et al.Mycobacterium tuberculosis FurA Autoregulates Its Own Expression.《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》.2003,第185卷(第18期),全文. * |
Gwo-Chyuan Shaw et al.Barbiturate-mediated Regulation of Expression of the Cytochrome P450BM3 Gene of Bacillus megaterium by Bm3R1 Protein.《THE JOURNAL OF BIOLOGICACL CHEMISTRY》.1992,第267卷(第8期),全文. * |
Robert G. Martin et al.Transcriptional and translational regulation of the marRAB multiple antibiotic resistance operon in Escherichia coli.《Molecular Microbiology》.2004,第53卷(第1期),全文. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101503702A (zh) | 2009-08-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Heym et al. | Effects of overexpression of the alkyl hydroperoxide reductase AhpC on the virulence and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis | |
Dasgupta et al. | Characterization of a two-component system, devR-devS, of Mycobacterium tuberculosis | |
Spaink et al. | The Rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria | |
KR101937682B1 (ko) | L-아미노산을 생산하는 재조합균, 이의 구성 방법 및 l-아미노산 생산 방법 | |
EP1817061B1 (en) | Electroporation of mycobacterium and overexpression of antigens in mycobacteria | |
US7829104B2 (en) | Electroporation of Mycobacterium and overexpression of antigens in mycobacteria | |
CN101503702B (zh) | 一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用 | |
CN108913706B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpK及其应用 | |
Feng et al. | Mycobacterium smegmatis L-alanine dehydrogenase (Ald) is required for proficient utilization of alanine as a sole nitrogen source and sustained anaerobic growth | |
Keller et al. | Tuberculosis vaccine strain Mycobacterium bovis BCG Russia is a natural recA mutant | |
CN106085934B (zh) | 食品级纳豆激酶表达菌 | |
CN102174557A (zh) | 一种表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢及其制备方法 | |
CN102439134A (zh) | 包含过表达PhoP和/或PhoP调节子蛋白的重组BCG菌株的结核疫苗 | |
Oh et al. | Identification of trans-and cis-control elements involved in regulation of the carbon monoxide dehydrogenase genes in Mycobacterium sp. strain JC1 DSM 3803 | |
CN109022396A (zh) | 一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用 | |
Inui et al. | Isolation and molecular characterization of pMG160, a mobilizable cryptic plasmid from Rhodobacter blasticus | |
CN1703238A (zh) | 重组细胞内病原体免疫原组合物及其使用方法 | |
Jin et al. | Induction of oxalate decarboxylase by oxalate in a newly isolated Pandoraea sp. OXJ-11 and its ability to protect against Sclerotinia sclerotiorum infection | |
CA2481108C (en) | Tuberculosis vaccines including recombinant bcg strains expressing alanine dehydrogenase, serine dehydratase and/or glutamine synthetase | |
CN103993021B (zh) | 一种十字花科黑腐病菌的iii型效应物基因及其应用 | |
JP2015501641A (ja) | 関連するアクチノバクテリアの遺伝的形質転換のためのプラスミドとしての、アクチノプラネス属se50/110由来の新規な放線菌組込み接合エレメント | |
Amara et al. | Differential immunogenicity of novel Mycobacterium tuberculosis antigens derived from live and dead bacilli | |
Wang et al. | First report of bacterial leaf spot caused by Curtobacterium flaccumfaciens on Dendrobium officinale Kimura et Migo in China | |
WO2013039069A1 (ja) | 新規な組換えbcgワクチン | |
CN101912605A (zh) | 增强型嵌合基因重组卡介苗及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120704 Termination date: 20150205 |
|
EXPY | Termination of patent right or utility model |