CN101500514A - 脂肪组织衍生的基质细胞在脊柱融合术中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明包括用于治疗骨病的方法和组合物。本发明分离的脂肪组织衍生的基质细胞及其相关产品具有多种应用，包括，但不限于研究，诊断和治疗应用，诸如在脊柱融合术中。

Description

脂肪组织衍生的基质细胞在脊柱融合术中的应用

发明背景

一般存在两种类型的骨病：1)非代谢性骨病，诸如骨折、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育不良和脊柱侧凸；和2)代谢性骨病，诸如骨质疏松症、骨软化、软骨病、纤维性骨炎、肾性骨营养不良和佩吉特骨病。代谢性骨病骨质疏松症为全身性疾病，其特征在于因骨质减少和精细骨组织结构的改变导致的骨脆性和骨折性增加，其主要临床症状包括脊柱后凸和腰背侧骨、中央椎骨、股骨颈、桡骨下端、肋骨、肱骨上端等的骨折。在骨组织中，骨形成和因骨吸收导致的破坏不断发生。在骨形成与因骨吸收导致的破坏之间的平衡恶化时，发生骨的定量减少。在传统上，骨吸收阻抑物，诸如雌激素、降钙素和二膦酸盐主要用于治疗骨质疏松症。

就骨/脊柱疾病而言，超过75％的美国人群在其生命过程中一度患有背痛。主要的医学疾病可以导致背痛。这些疾病包括脊柱侧凸、椎管狭窄、关节盘变性疾病、传染过程、肿瘤和创伤。骨干骨中大段缺损的修复是当前矫形外科医师面临的重大问题。尽管这类骨丢失可以作为急性损伤的结果发生，但是这些大的缺陷通常继先天畸形、良性和恶性肿瘤、骨感染和骨折不愈合之后出现。新鲜的自体骨移植材料的应用已经被视为治疗的历史性标准，但伴随显著发病率，包括感染、畸形、疼痛和功能丧失(Kahn等，1995，Clin.Orthop.Rel.Res.313：69-75)。因移植物采集的复杂化，结合其有限的供给已经启示了需要研发用于修复临床显著性骨缺陷的可选择的策略。解决这一问题的主要手段已经集中在研发有效性的骨植入物材料。

已经从这些研究尝试中产生了三大类骨植入物，并且可以将这些种类分类为骨传导性、骨诱导性或直接成骨性的。异体移植骨可能是已知最佳类型的骨传导性植入物。尽管广泛应用了许多年，但是疾病传播、宿主排斥和缺乏骨诱导的风险损害了其理想性(Leads，1988，JAMA 260：2487-2488)。合成的骨传导性植入物包括钛纤维金属和羟磷灰石和/或磷酸三钙构成的陶瓷。这些材料有利的多孔性促进了骨向内生长，但是其缺乏骨诱导性潜能限制了它们的应用。还研究了各种骨诱导性化合物，包括脱矿质骨基质，已知它包含骨形态发生蛋白(BMP)。自BMP最初发现以来，其他人已经在修复大的骨缺损的正位部位中表征，克隆，表达和植入了纯化或重组BMP(Gerhart等，1993，Clin.Orthop.Rel.Res.293：317-326；Stevenson等，1994，J.Bone JointSurg.76：1676-1687；Wozney等，1988 Science 242：1528-1534)。这种手段的成功依赖于存在能够对BMP提供的诱导信号产生反应的间充质细胞(Lane等，1994，In First International Conference onBone Morphogenic Proteins)。正是这些间充质先祖进行成骨分化且最终导致在手术部位合成新的骨。

骨诱导性手段的一种可替代的选择为植入直接成骨性的活细胞。由于已经证实骨髓包含具有成骨潜能的细胞群，所以一些人已经设计了基于在需要骨骼修复的部位植入新鲜的自体或同源骨髓的实验疗法(Grundel等，1991，Clin.Orthop.Rel.Res.266：244-258；Werntz等，1996，J.Orthop.Res.14：85-93；Wolff等，1994，J.Orthop.Res.12：439-446)。尽管在原则上是正确的，但是获得足够的具有必要数量的骨先祖细胞的骨髓的可实施性是有限的。

再生性药物的新出现的领域探索将生物材料，生长因子和细胞合并成修复受损组织和器官的新治疗剂。随着这种特制品的开发，对用于组织改造应用的可靠，安全和有效的人成体干细胞来源存在需求。为了制定规章的目的，这些细胞必须根据可定量的纯度衡量标准来确定。为了在临床水平上的实施目的，这些细胞应该是在护理要求时即刻可得到的“现货供应”产品。从商品的观点来看，与自体成体干细胞相反，将同种异体成体干细胞用于移植的能力可以对产品的研发具有显著的积极影响。在这些情况下，可以将来源于一个供体的单批细胞植入多个哺乳动物，从而可降低质量控制和质量保证的成本。

研究已经证实多重组织部位中存在成体干细胞。来源于骨髓的细胞，称作间充质干细胞(MSC)或骨髓基质细胞(BMSC)已经得到广泛表征(Castro-Malaspina等，1980，Blood 56：289-30125；Piersma等，1985，Exp.Hematol 13：237-243；Simmons等，1991，Blood 78：55-62；Beresford等，1992，J.细胞.Sci.102：341-3 51；Liesveld等，1989，Blood 73：1794-1800；Liesveld等，Exp.Hematol 19：63-70；Bennett等，1991，J.细胞.Sci.99：131-139)。近期的研究已经证实可以植入同种异体骨髓衍生的MSC(Bartholomew等，2002，Exp.Hematol.30：42-8)并且用于修复犬模型中的临界大小的矫形外科缺陷(Arinzeh等，2003，J.Bone Joint Surg.Am.85-A：1927-35)。然而，MSC表示每10,000-100,000个有核的骨髓细胞中有约1个或每ml骨髓抽吸物中有约200个细胞(Bruder等，2000，Principles of TissueEngineering，2^nd Edition，Academic Press)。为了获得足以用于组织改造应用的MSC数量，必须通过体外多次传代扩充骨髓衍生的MSC。

与骨髓对比，脂肪组织易于进行手术采集并且在普通成年美国人中富含。近来，已经证实脂肪组织可以用作干细胞源(称作脂肪衍生的成体干细胞或ADAS细胞)。这些细胞能够沿着多重谱系途经分化。作为对特殊化学品，激素和/或细胞因子的反应，人和啮齿动物ADAS细胞表达与脂肪，骨，软骨，肌肉和神经元细胞一致的生化和组织学特征。在近期的研究中，鼠ADAS细胞加速修复临界大小的颅盖缺陷(Cowan等，2004，Nat.Biotechnol.22：560-7)。

骨移植术通常用于治疗骨病。实际上，每年进行超过140万例骨移植术。骨移植术的成功或失败取决于许多因素，包括移植物部位的生命力，移植物处理和植入组织的免疫相容性。鉴于骨病的普遍性，对用于治疗、诊断和研究应用的新骨源存在需求。本发明可满足这一需求。

发明概述

本发明包括促进哺乳动物脊柱融合术后融合的方法，包括对哺乳动物脊柱给予分离的脂肪组织衍生的成体基质(ADAS)细胞，其中ADAS细胞在体内分化成表达至少一种骨细胞特征的细胞。

本发明还包括对哺乳动物实施一种或多种脊柱融合术的方法，包括对哺乳动物脊柱给予ADAS细胞以有利于单或多个水平的脊柱融合术。优选在将ADAS给予到哺乳动物脊柱中后，ADAS细胞在体内分化成表达至少一种骨细胞特征的细胞。

在一个方面中，在将ADAS细胞给予哺乳动物前在体外培养该细胞一段时间，而不被诱导分化。

在另一个方面中，就哺乳动物而言，ADAS细胞为同种异体的。

在另一个方面中，ADAS细胞诱导椎体间脊柱融合术的骨形成。

在另一个方面中，ADAS细胞诱导横突间脊柱融合术的骨形成。

在一个方面中，ADAS细胞进一步包含生物相容性基质。优选地，生物相容性基质选自藻酸钙、琼脂糖、纤维蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素A、硫酸皮肤素和骨基质明胶。

在另一个方面中，ADAS细胞为遗传修饰的。

在另一个方面中，将ADAS细胞给予入哺乳动物脊柱中一个或多个椎体间空间。

在另一个方面中，脊柱融合术在脊柱区段中进行，所述的脊柱区段选自颈段、胸段、腰段、腰骶和骶髂(SI)关节。

在另一个方面中，通过选自后部途径、后外侧途径、前部途径、前外侧途径和外侧途径的途径将ADAS细胞给予入一个或多个椎体间空间。

在另一个方面中，所述的哺乳动物是人。

附图简述

为了解释本发明的目的，图中描述了本发明的某些实施方案。然而，本发明并不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1为描绘脊柱融合术的图像。图1A描绘了腰椎脊柱中的椎间隙。图1B和1C分别表明机械装置和骨移植物的导入以便稳定空间。图1D为描绘脊柱的图像。

图2为ADAS细胞沿着多重谱系途经分化潜能的图像。作为对特殊的化学品和生长因子混合物的反应，人ADAS细胞可以在体外分化成软骨细胞，成骨细胞，脂肪细胞和神经元-和神经胶质-样细胞。

图3为描绘人ADAS细胞的骨发生的图像。

图4为脂肪形成和成骨分化过程中ADAS细胞中醛磷酸酶表达的图。

图5为表明ADAS细胞在体内形成骨的图像。

详细描述

本发明包括用于治疗骨病的方法和组合物。在一个优选的实施方案中，本发明分离的脂肪组织衍生的成体基质(ADAS)细胞用于促进哺乳动物脊柱融合术后的骨融合。

定义

本文所用的下列术语各自具有与它在这部分中相关的含义。

本文所用的冠词“一种”意指该冠词的语法对象中的一种或一种以上(即指至少一种)。作为实例，“一种成分”意指一种成分或一种以上成分。

术语“约”为本领域技术人员所理解，且改变至其使用的一定程度。

术语“脂肪组织衍生的细胞”意指来源于脂肪组织的细胞。分离自脂肪组织的起始细胞群为同种异体细胞群，包括，但不限于间质血管部分(SVF)细胞。

本文所用的术语“脂肪衍生的基质细胞”，“脂肪组织衍生的基质细胞”，“脂肪组织衍生的成体基质(ADAS)细胞”或“脂肪组织衍生的干细胞(ASC)”可以互换使用并且意指来源于来源于脂肪组织的基质细胞，所述的脂肪组织可以用作各种不同细胞类型的干细胞-样前体，所述的细胞类型，诸如，但不限于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉和神经元/神经胶质细胞系。

“脂肪”意指任何脂肪组织。脂肪组织可以为棕色或白脂肪组织。优选脂肪组织为皮下白脂肪组织。这类细胞可以包含初级细胞培养物或无限增殖细胞系。脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任何生物体。优选脂肪组织为哺乳动物的，最优选脂肪组织为人的。人脂肪组织的便利来源为来源于脂肪抽吸手术的脂肪组织。然而，脂肪组织来源或脂肪组织的分离方法对本发明而言并不关键。

“同种异体”意指来源于相同种类的不同动物的移植物。

本文所用的术语“自体”意指来源于随后再导入个体的相同个体的任何材料。

“异种”意指来源于不同种类的哺乳动物的移植物。

本文所用的术语“生物相容性网状结构”的含义是指可以有利于形成有助于组织发育的三维结构的底物。因此，例如，可以在这类生物相容性网状结构上培养或接种生物相容性细胞，所述的生物相容性网状结构诸如包括胞外基质材料，合成聚合物，细胞因子，生长因子等。可以将网状结构模制成有利于组织类型发育的所需形状。此外，至少在细胞培养过程中的早期阶段，给培养基和/或底物补充有利于适当组织类型和结构发育的因子(例如生长因子，细胞因子，胞外基质材料等)。

本文所用的术语“骨病(或损伤或疾病)”意指骨的病症或疾病，包括，但不限于骨的急性，慢性，代谢性和非代谢性疾患。该术语包括因组织一般发生疾病，创伤或衰竭导致的疾患。骨病的实例包括，但不限于骨折、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育不良、脊柱侧凸、骨质疏松症、骨软化、软骨病、纤维性骨炎、肾性骨营养不良和佩吉特骨病。

本文所用的“分化培养基”意指包含添加剂或缺乏添加剂的细胞生长培养基，使得在培养基中孵育时未完全分化的干细胞，脂肪衍生的成体基质细胞或其它这类先祖细胞发育成具有分化细胞的某些或全部特征的细胞。

本文所用的“可扩充性”意指细胞增殖，例如在数量上或就发生群体倍增的细胞群而言扩充的能力。

“移植物”意指用于移植的细胞，组织，器官，乃至任何其它生物相容性网状结构。

所谓“生长因子”意指下列特定因子，包括，但不限于生长激素、红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素3、白细胞介素6、白细胞介素7、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、骨保护素配体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板衍生生长因子(PDGF)和骨形态发生蛋白，其浓度在皮克/ml-毫克/ml的水平。

本文所用的术语“生长培养基”意指促进细胞生长的培养基。生长培养基一般包含动物血清。在某些情况中，生长培养基可以不含动物血清。

“分离的细胞”意指从其它成分和/或天然伴随组织或哺乳动物中分离的细胞的细胞。

本文所用的术语“多能”或“多能性”的含义是指中枢神经系统的干细胞分化成一种以上类型的细胞的能力。

本文所用的术语“调节”的含义是指生物状态的任何改变，即增加，减少等。

本文所用的术语““非免疫原性”的含义是指ADAS细胞不会诱导MLR中T细胞增殖的发现。然而，非免疫原性不应限于MLR中的T细胞增殖，而是还应适用于不诱导体内T细胞增殖的ADAS细胞。

本文所用的“增殖”意指类似形式，尤其是细胞的繁殖或增殖。即，增殖包括大量细胞的产生并且其中可以通过对细胞数量进行简单计数，测定掺入细胞的³H-胸苷等来测量。

“细胞周期的进展或通过细胞周期的进展”用于指细胞准备和/或进入有丝分裂和/或减数分裂的过程。通过细胞周期的进展包括通过G1期，S期，G2期和M-期的进展。

术语““前体细胞”，“先祖细胞”和“干细胞”在本领域和本文中可以互换使用，并且意指多能或谱系-未定型的先祖细胞，它潜在地能够进行无限数量的有丝分裂以便更新其自身或产生分化成所需细胞类型的子代细胞。不同于多能干细胞，一般将谱系-定型的先祖细胞视为不能产生在表型上彼此不同的大量细胞类型。而先祖细胞产生一种或可能产生两种谱系-定型的细胞类型。

本文所用的术语“基质细胞培养基”意指用于培养ADAS细胞的培养基。基质细胞培养基的非限制性实例为包含DMEM/F 12 Ham′s，10％胎牛血清，100U青霉素/100μg链霉素/0.25μg两性霉素B的培养基。一般而言，基质细胞培养基包含基质培养基，血清和抗生素/抗霉菌剂。然而，可以不含抗生素/抗霉菌剂的基质细胞培养基培养ADAS细胞并且补充至少一种生长因子。优选生长因子为人表皮生长因子(hEGF)。优选的hEGF浓度约为1-50ng/ml，更优选该浓度约为5ng/ml。优选的基质培养基为DMEM/F12(1:1)。优选的血清为胎牛血清(FBS)，但可以使用其它血清，包括马血清或人血清。优选向上述培养基中加入达20％ FBS以支持基质细胞生长。然而，可以使用确定的培养基，如果必要，确定FBS中用于基质细胞生长的生长因子，细胞因子和激素并且以适当浓度提供在生长培养基中。进一步认识到可以向培养基中加入额外的成分。这类成分包括，但不限于抗生素，抗霉菌剂，清蛋白，生长因子，氨基酸和其它本领域中公知用于细胞培养的成分。可以加入到培养基中的抗生素包括，但不限于青霉素和链霉素。青霉素在培养基中的浓度约为10-约200个单位/ml。链霉素在培养基中的浓度约为10-约200μg/ml。然而，本发明决不应限于用于培养基质细胞的任何一种培养基。而是可以使用能够支持组织培养物中基质细胞的任何培养基。

可以与生物学相容性载体或培养基互换使用的术语“药学上可接受的载体(或培养基)”意指适用于接触人和动物组织，但无过度毒性，刺激，过敏反应或与合理效益/风险比相应的其它并发症范围内的试剂，细胞，化合物，材料，组合物和/或剂型。

作为本文所用的术语“合适的椎体间空间”意指盘居留在健康脊柱中，但因脊椎上磨损和撕裂导致至少部分缺乏盘物质的相邻椎骨之间或使用本领域公知的技术以手术方式在盘空间中生成空隙而制备的空间。

本文所用的“治疗有效量”为足以对给予所述细胞的受试者提供有益作用的ADAS细胞的量。

“治疗”意指对骨病改善的作用或延迟，阻止或逆转其发展或延缓或预防其发作。

本文所用的“内源性”意指来自从生物体，细胞或系统内部或在其中产生的任何物质。

“外源性”意指来自生物体，细胞或系统外部或在其外部产生的任何物质。

“编码”意指多核苷酸中核苷酸特异性序列的内在属性，所述的多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA，以便用作合成生物过程中的其它聚合物和大分子的模板，所述的聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物特性。

因此，基因编码蛋白质，条件是相当于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质。编码链，即与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的核苷酸序列和用作基因或cDNA转录模板的非编码链可以称作编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。

除非另作陈述，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。

“分离的核酸”意指从位于其天然存在状态侧翼的序列中分离的核酸区段或片段，即从一般与该片段相邻的序列中取出的DNA片段，即与其天然存在的基因组中的片段相邻的序列。该术语还适合于基本上从其它成分中纯化的核酸，所述的其它成分天然伴随核酸，即RNA或DNA或蛋白质，它们在细胞中天然伴随核酸。因此，该术语包括：例如掺入载体，掺入自主复制质粒或病毒或原核细胞或真核细胞基因组DNA或作为不依赖于其它序列的单独分子存在(即作为通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)的重组DNA。还包括为编码额外多肽序列的杂合基因部分的重组DNA。

在本发明的上下文中，使用用于通常存在的核酸的下列缩写。“A”意指腺苷，“C”意指胞嘧啶，“G”意指鸟苷，“T”意指胸腺嘧啶，且“U”意指尿苷。

本文所用的术语“在转录控制下”或“可操作地连接”意指在与多核苷酸相关的正确位置和方向上的启动子以控制RNA聚合酶引发和多核苷酸表达。

本文所用的术语“启动子/调节序列”意指表达可操作地与启动子/调节序列连接的基因产物所需的核酸序列。在某些情况中，该序列可以为核心启动子序列，而在其它情况中，该序列还可以包括增强子序列和表达基因产物所需的其它调节元件。例如，启动子/调节序列可以为以组织特异性方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子为一种核苷酸序列，在与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，它在细胞的大部分或所有生理条件下导致基因产物在细胞中产生的。

“诱导型”启动子为一种核苷酸序列，在与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，它基本上仅在诱导物相当于存在于细胞中的启动子时导致基因产物在细胞中产生。

“组织特异性”启动子为一种核苷酸序列，在与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，它基本上导致基因产物在细胞中出产生，唯一的条件在于该细胞为相当于启动子的组织类型的细胞。

““载体”为包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。大量载体为本领域中公知的，包括，但不限于线性多核苷酸，与离子型或两性化合物结合的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应用以包括非质粒和非病毒化合物，它们有利于核酸转移入细胞，诸如，例如聚赖氨酸化合物，脂质体等。病毒载体的实例包括，但不限于腺病毒载体，腺伴随病毒载体，逆转录病毒载体等。

“表达载体”意指包含重组多核苷酸的载体，该多核苷酸包含可操作地与所表达的核苷酸序列连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域中公知的所有那些，诸如掺入重组多核苷酸的粘粒，质粒(即，裸的或包含在脂质体中的)和病毒。

描述

本发明涉及如下发现：脂肪组织衍生的成体基质(ADAS)细胞可以分化成各种不同细胞类型，包括，但不限于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉和神经元/神经胶质细胞谱系。特别地，本发明涉及ADAS细胞可以沿体内成骨谱系分化的观察结果。

基于本发明披露的内容，ADAS细胞可以成功地用于实验/治疗目的的细胞和/或基因疗法。例如，细胞可以用于治疗骨病。优选细胞用于强化脊柱融合术后的骨融合。脊柱融合术为用于治疗患有关节盘变性疾病，椎管狭窄，脊柱侧凸，脊柱骨折，肿瘤等的哺乳动物背痛的常用矫形外科和神经外科手术操作。

ADAS的分离和培养

可以通过本领域技术人员公知的各种方法分离用于本发明方法的ADAS细胞。例如，这类方法描述在美国专利US 6,153,432中，将该文献完整地引入本文。在一种优选的方法中，从哺乳动物受试者，优选人体受试者中分离ADAS细胞。在人中，一般从抽脂材料中分离ADAS细胞。如果将本发明的细胞植入人体受试者，那么优选从相同受试者中分离ADAS细胞，以便提供自体移植物。

在本发明的另一个方面中，所给予的ADAS细胞就接受者而言可以为同种异体的。从与接受者相同种类中的不同个体的供体中分离同种异体ADAS细胞。在分离后，术语本文披露的方法培养细胞以便产生同种异体产物。本发明还包括就接受者而言为异种的ADAS细胞。

由于无论如何并不限制本发明，所以可以术语本文披露的方法从脂肪组织中分离基质细胞。简言之，通过抽脂术从皮下储库中取出人体脂肪组织。然后将脂肪组织从抽脂杯中转入500ml无菌烧杯并且使其沉降约10分钟。通过抽吸除去沉淀的血液。将约125ml体积(或更少)的组织转入250ml连续离心管且然后给该管充Krebs-Ringer缓冲液。使组织和缓冲液沉降约3分钟或直到获得澄清分离物，且然后通过抽吸除去缓冲液。用Krebs-Ringer缓冲液将组织再洗涤4-5分钟或直到组织变成橙-黄色并且直到缓冲液变成淡褐色为止。

可以使用胶原酶处理分离脂肪组织的基质细胞。简言之，从组织中除去缓冲液并且以1ml胶原酶溶液/ml组织的比例用约2mg胶原酶/ml Krebs缓冲(Worthington，ME)溶液替代。将管在37℃下的水浴中通过间歇振摇孵育约30-35分钟。

通过在室温下以500×g离心5分钟从脂肪组织的其它成分中分离基质细胞。通过抽吸除去油和脂肪细胞层。可以通过剧烈涡旋将剩余的部分重新悬浮于约100ml磷酸缓冲盐水(PBS)中，分入50ml试管并且以500×g离心5分钟。通过抽吸除去缓冲液，遗留下基质细胞。然后将基质细胞重新悬浮于基质细胞培养基中并且以适当的细胞密度铺板且在37℃下和5％ CO₂中孵育过夜。一旦粘附在培养皿或烧瓶上，就可以即刻使用培养的基质细胞或将其维持在培养物中一段时间或大量传代，此后按照本文披露的方法使用细胞。然而，本发明决不应限于分离基质细胞的任何一种方法。而分离ADAS细胞的任何方法均应包括在本发明中。

能够支持细胞培养物中成纤维细胞的任何培养基可以用于培养ADAS。支持成纤维细胞生长的培养基制品包括，但不限于极限必需培养基Eagle，ADC-I，LPM(不含牛血清清蛋白)，F10(PIAM)，F12(HAM)，DCCM1，DCCM2，RPMI 1640，BGJ培养基(使用和不使用Fitton-Jackson改变)，基础培养基Eagle(BME-添加了Earle盐基质)，Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM-不含血清)，Yamane，IMEM-20，Glasgow改进的Eagle培养基(GMEM)，Leibovitz L-15培养基，McCoy′s 5A培养基，培养基M199(M199E-含有Earle盐基质)，培养基M199(M199H-含有Hank盐基质)，极限必需培养基Eagle(MEM-E-含有Earle盐基质)，极限必需培养基Eagle(MEM-H-含有Hank盐基质)和极限必需培养基Eagle(含有非必需氨基酸的MEM-NAA)等。用于培养ADAS的优选培养基为DMEM，更优选DMEM/F12(1:1)。

用于本发明方法的培养基的额外的非限制性实例可以包含浓度至少为1％-约30％，优选至少约5％-15％，最优选约10％的牛或其它种类的胎血清。小鸡或其它重量胎胚胎提取物可以以约1％-30％，优选至少约5％-15％，最优选约10％的浓度存在。

在分离后，在培养仪器中的基质细胞培养基中孵育ADAS细胞一段时间或直到细胞达到汇合，此后使细胞通过另一培养仪器。培养仪器可以属于常用于体外培养细胞任何培养仪器。优选汇合水平高于70％，此后使细胞通过另一培养仪器。更优选汇合水平高于90％。时间期限可以为适合于体外培养细胞的任何时间。可以在培养ADAS细胞的任何时间时替换基质细胞培养基。优选每隔3-4天替换一次基质细胞培养基。然后从培养仪器中收集ADAS细胞，此时可以即刻使用ADAS细胞或将其冷藏保存以便储存为以后应用。可以通过胰蛋白酶消化，EDTA处理或用于从培养仪器中收集细胞的任何其它操作步骤收集ADAS细胞。

各种术语用于描述培养物中的细胞。细胞培养物一般意指取自活生物体并且在受控条件下生长的细胞。初级细胞培养物为直接取自生物体和首次传代培养前的细胞，组织或器官的培养物。细胞在它们置于有利于细胞生长和/或分裂的条件下的生长培养基中时在培养物中扩充，由此产生大量细胞群。当细胞在培养物中扩充时，细胞增殖率一般根据细胞数量倍增所需的时间量，否则称作倍增时间确定。

每个周期的传代培养称作传代。当传代培养细胞时，它们称作已经传代。特异性细胞群或细胞系有时称作或特征在于它已经传代的次数。例如，已经传代10次的培养的细胞群可以称作P10培养物。将初级培养物，在从组织中分离细胞后的首次培养物命名为P0。在首次传代培养后，将细胞描述为继代培养物(P1或第1代)。在第二次传代培养后，细胞变成三级培养物(P2或第2代)等。本领域技术人员可以理解在传代期限过程中可以存在许多群体倍增数；因此，培养物的群体倍增数大于传代数。传代之间期限过程中细胞的扩充(即群体倍增数)取决于许多因素，包括，但不限于接种密度，底物，培养基和传代之间的时间。

遗传修饰

本发明的细胞还可以用于表达治疗目的或追踪接受者细胞同化和/或其分化方法中的异种蛋白或分子。因此，本发明包括用于将外源性DNA导入ADAS细胞的表达载体和方法，同时在ADAS细胞中外源性DNA得以表达。用于在细胞中导入和表达DNA的方法为本领域技术人员众所周知的并且包括，例如在Sambrook等(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和Ausubel等(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York)中所述的那些。

分离的核酸可以编码用于追踪ADAS细胞被导入接受者的迁移，同化和存活的分子。用于追踪细胞的蛋白质包括，但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，其它荧光蛋白中的任何种(例如增强的绿色，青色，黄色，蓝色和红色荧光蛋白；Clontech，Palo Alto，CA)或其它标记蛋白(例如LacZ，FLAG-标记，Myc，HiS6等)。

追踪本发明ADAS细胞的迁移，同化和/或分化并不限于载体或病毒表达的可检测分子的应用。还可以使用一系列有利于哺乳动物体内植入的ADAS细胞定位的探针评价细胞的迁移，同化和/或分化。可以使用本文额外处对细胞-特异性标记详细描述的抗体或核酸进一步追踪ADAS细胞移植物。

本文所用的术语“遗传修饰”意指外源性DNA的有意导入对ADAS细胞基因型的稳定或暂时改变。DNA可以为合成的或天然衍生的并且可以包含基因，基因部分或其它有用的DNA序列。本文所用的术语“遗传修饰”并不意味着包括天然存在的改变，诸如通过天然病毒活性，天然遗传重组等发生的改变。

可以使用病毒载体(逆转录病毒，修饰的疱疹病毒，疱疹病毒，腺病毒，腺伴随病毒，慢病毒等)或通过直接DNA转染(脂转染、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔等)将外源性DNA导入ADAS细胞。

当对细胞进行遗传修饰的目的在于产生生物活性物质时，该物质一般为用于治疗指定病症的物质。例如，需要对细胞进行遗传修饰，以便它们分泌与骨形成相关的某些生长因子产物。

可以用导入细胞的外源性遗传物质对本发明的细胞进行遗传修饰，以便产生诸如营养因子、生长因子、细胞因子等这类对培养细胞有益的分子。此外，通过对细胞遗传修饰以产生这类分子，该细胞可以在植入有此需要的哺乳动物时对哺乳动物提供附加的治疗作用。例如，遗传修饰的细胞可以分泌对哺乳动物中相邻细胞有益的分子。

本文所用的术语“生长因子产物”意指对细胞具有生长，增殖，分化或营养作用的蛋白质，肽，促分裂原或其它分子。例如，用于治疗骨病的生长因子产物包括，但不限于FGF，TGF-β，胰岛素样生长因子和骨形态发生蛋白。

按照本发明，将包含编码异源蛋白的核苷酸序列的基因构建体导入ADAS细胞。即对细胞进行遗传改变以便导入其表达在哺乳动物中具有治疗作用的基因。按照本发明的某些方面，可以对来自所治疗的哺乳动物或另一种哺乳动物的ADAS细胞进行遗传改变以取代缺陷基因和/或导入其表达对所治疗的哺乳动物具有治疗作用的基因。

就将基因构建体导入细胞的所有情况而言，同种异体基因可操作地与在细胞中实现该基因表达所需的调节序列连接。这类调节序列一般包括启动子和聚腺苷酸化信号。

优选将基因构建体作为表达载体提供，它包括可操作地与必需调节序列连接的异种蛋白的编码序列，使得当将该载体转染入细胞时，所述的编码序列由该细胞表达。所述的编码序列可操作地与在细胞中表达该序列所必需的调节元件连接。编码蛋白质的核苷酸序列可以为cDNA，基因组DNA，，合成的DNA或其杂种或RNA分子，诸如mRNA。

基因构建体包括编码可操作地与调节元件连接的有益蛋白的核苷酸序列并且仍然可以作为起作用的胞质分子，起作用的附加型分子存在于细胞中，或可以整合入细胞的染色体DNA。可以将外源性遗传物质导入细胞，其中它仍然作为质粒形式的单独遗传物质保留。或者，可以将可整合入染色体的线性DNA导入细胞。当将DNA导入细胞时，可以加入促进DNA整合入染色体的试剂。用于促进整合的DNA序列的也可以包括在DNA分子中。或者，可以将RNA导入细胞。

用于基因表达的调节元件包括：启动子，起始密码子，终止密码子和聚腺苷酸化信号。优选这些元件在本发明的细胞中为可操作的。此外，优选这些元件可操作地与编码蛋白质的核苷酸序列连接，使得核苷酸序列可以在细胞中得到表达且由此可以产生蛋白质。一般将起始密码子和终止密码子视为编码蛋白质的核苷酸序列的组成部分。然而，优选这些元件在细胞中起作用。类似地，所用的启动子和聚腺苷酸化信号必需在本发明的细胞中起作用。用于实施本发明的启动子的实例包括，但不限于在许多细胞中具有活性的启动子，诸如巨细胞病毒启动子，SV40启动子和逆转录病毒启动子。用于实施本发明的启动子的其它实例包括，但不限于组织-特异性启动子，即在某些组织中，而不在其它组织起作用的启动子；还有一般在使用或不使用特异性或一般增强子序列在细胞中表达的启动子。在某些实施方案中，使用使用或不使用增强子序列在细胞中以组成型方式表达基因的启动子。如果合适或需要，在这类实施方案中提供增强子序列。

可以使用本领域技术人员易于利用的众所周知的技术转染本发明的细胞。可以用标准方法将外源性基因导入细胞，其中细胞表达基因编码的蛋白质。在某些实施方案中，通过磷酸钙沉淀转染，DEAE葡聚糖转染，电穿孔，显微注射，脂质体介导的转移，化学品介导的转移，配体介导的转移或重组病毒载体转移转染细胞。

在某些实施方案中，重组腺病毒载体用于将具有所需序列的DNA导入细胞。在某些实施方案中，逆转录病毒用于将具有所需序列的DNA导入细胞。在某些实施方案中，标准CaPO₄，DEAE葡聚糖或脂质载体介导的转染技术用于将所需的DNA掺入分裂的细胞。标准抗生素抗性选择技术可以用于鉴定和选择转染的细胞。在某些实施方案中，通过显微注射将DNA直接导入细胞。类似地，众所周知的电穿孔或粒子轰击技术可以用于将异种外源DNA导入细胞。通常将第二种基因共转染或与治疗基因连接。第二种基因通常为可选择抗生素抗性基因。可以通过使细胞在杀伤不吸收可选择基因的细胞的抗生素中生长选择转染的细胞。在大部分情况中，如果两种基因不连接且共转染，那么在抗生素处理下存活的细胞中存在两种基因并且表达它们。

应理解本文所述的方法可以按照许多方式进行并且可以进行各种修改及其变型，这些修改和变型为本领域众所周知的。还可以理解不应将作为细胞类型之间的作用方式或相互作用的任何理论视为以任何方式来限定本发明，而提供它们使为了更完整地理解本发明的方法。

ADAS细胞的治疗作用

除ADAS细胞可以沿不同的细胞谱系分化外，本发明还涉及ADAS细胞在诱导T细胞增殖方面缺乏免疫原性特征。这种特征为显示存在接受者免疫细胞免疫排斥的可能性降低。此外，已经证实ADAS细胞不会刺激混合淋巴细胞反应中的异体移植PBMC。

在本发明的某些实施方案中，必需或需要在启动使用ADAS细胞的细胞/基因疗法前对哺乳动物实施免疫抑制。因此，本发明中包括使用异体移植乃至异种ADAS细胞移植。

ADAS细胞在治疗骨疾病，病症或疾患中的应用提供了额外的优点，即可以在无需免疫抑制剂的情况下将ADAS细胞导入接受者。认为成功移植细胞需要在不诱导接受者产生移植物排斥免疫应答的情况下供体细胞的持久移植物植入。一般而言，为了预防移植物排斥反应，使用非特异性免疫抑制剂，诸如环孢菌素、甲氨蝶呤、类固醇和FK506。以每日为基础给予这些活性剂，并且如果终止给药，那么通常发生移植物排斥。然而，在使用非特异性免疫抑制剂中不需要的后果在于它们通过抑制免疫应答的所有方面起作用(全面免疫抑制)，由此接受者对感染和其它疾病的易感性显著增加。

本发明提供了治疗骨疾病，病症或疾患的方法，通过将未分化或分化的ADAS细胞导入接受者来进行，而不需要免疫抑制。因此，植入ADAS细胞的接受者发生感染和其它疾病，包括与免疫抑制疗法相关的癌症相关疾患的易感性降低。

本发明包括将异体移植或异种ADAS细胞，否则就是遗传上不同于接受者的ADAS细胞给予入接受者以便对该接受者提供有益性。本发明提供了使用ADAS细胞治疗骨疾病，病症或疾患的方法，在将细胞给予接受者时不需要使用免疫抑制剂。

在另一个实施方案中，可以从任何哺乳动物种类的脂肪组织中分离本发明中使用的ADAS细胞，包括，但不限于人，小鼠，大鼠，猿，长臂猿，牛。优选ADAS细胞分离自人，小鼠或大鼠。更优选ADAS细胞分离自人。

在体外培养期后，将ADAS细胞给予哺乳动物。按照诱导ADAS细胞在体外分化的方式培养ADAS细胞。然而，优选将ADAS细胞以未分化状态植入接受者，并且植入的ADAS细胞分化以便在体内表达至少一种骨细胞特征。

可以使用本领域公知的技术，诸如即美国专利US5,082,670和US5,618,531(各自引入本文作为参考)中所述的那些方法将本发明的ADAS细胞植入哺乳动物，或植入体内的任何其它合适的部位。可以使用本领域众所周知或即将研发的技术植入本发明的细胞。本发明包括将细胞植入，移植，输注，否则就是导入哺乳动物，优选人的方法。

对哺乳动物给予的ADAS细胞数量与例如脂肪组织处理后的细胞产率相关。可以保留细胞总数的部分以便随后使用或冷藏。此外，递送的剂量取决于将细胞递送至哺乳动物的途径。ADAS细胞的剂量在宽限内改变并且可以在每种具体的情况至针对个体需要进行调整。所用细胞的数量取决于接受者的体重和病情，给药次数和/或频率和其它本领域技术人员公知的变量。该数量可以根据实现所需治疗效果的的数量级调整。

可以将约10⁵-约10¹³个ADAS细胞/100kg体重给予个体。在某些实施方案中，给予约1.5 x 10⁶-约1.5 x 10¹²个细胞/100kg体重。在某些实施方案中，给予约1 x 10⁹-约5 x 10¹¹个细胞/100kg体重。在其它实施方案中，给予约4 x 10⁹-约2 x 10¹¹个细胞/100kg体重。在其它实施方案中，给予约5 x 10⁸细胞-约1 x 10¹⁰个细/100kg体重。

可以将ADAS细胞以约0.01-约5 X 10⁶个细胞/ml的浓度悬浮于合适的稀释剂中。注射溶液用合适的赋形剂为那些与ADAS细胞和接受者在生物性和生理学上相容的物质，诸如缓冲盐水溶液或其它合适的赋形剂。可以按照符合适当无菌性和稳定性的标准方法配制，生产并且储存给药用组合物。

还可以按照公知的包囊技术，包括微囊化将细胞包囊(参见，例如，美国专利US 4,352,883；US4,353,888；和US5,084,350，将它们引入本文作为参考)或粗微囊化(参见，例如美国专利US 5,284,761；US5,158,881；US4,976,859；和US4,968,733；和国际公开号WO92/19195；WO 95/05452，将所有这些文献引入本文作为参考)并且用于递送生物活性分子。就粗微囊化而言，可以改变装置中的细胞数量；优选每一装置包含10³-10⁹个细胞，最优选约10⁵-10⁷个细胞。可以将几种微囊化装置植入哺乳动物。粗微囊化和植入细胞的方法为本领域众所周知的并且描述在例如美国专利US 6,498,018中。

本发明细胞对哺乳动物的给药方式可以根据几个因素的不同而改变，包括所治疗疾病的类型，哺乳动物的年龄，细胞是否分化，细胞其中是否具有导入的同种异体DNA等。可以通过直接注射或通过本领域中用于对患有特定骨疾病或病症的哺乳动物给予化合物的任何其它方式导入细胞。

可以将ADAS细胞以各种方式给予入宿主。给药方式包括，但不限于血管内、大脑内、非肠道、腹膜内、静脉内、硬膜外、脊柱内、胸骨内(intrastemal)、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内或肌内。优选将细胞用于脊柱融合术操作。

组合物

本发明还提供了用于植入哺乳动物的基质，其中该基质包含本发明的ADAS细胞。该基质还可以包括，但不限于ADAS细胞，ADAS细胞裂解物，ADAS细胞条件培养基和由ADAS细胞产生的胞外基质。

该基质还可以包含一种或多种生物活性因子或用其处理，包括，但不限于：抗细胞凋亡剂(即红细胞生成素、血小板生成素、胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II、肝细胞生长因子、胱天蛋白酶抑制剂)；抗炎剂(即p38 MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类药物、IL-6和IL-I抑制剂和非类固醇消炎药)；免疫抑制/免疫调节剂；mTOR抑制剂；抗增殖剂；皮质类固醇(即泼尼松龙、氢化可的松)；抗血栓形成剂；和抗氧化剂。生物活性因子的存在可以促使ADAS细胞增殖和/或分化。

本发明在某些方面中进一步提供了使需要的哺乳动物骨组织再生的方法，通过对哺乳动物给予包含DAS细胞，基质，ADAS细胞裂解物，本发明的ADAS-产物(即ADAS细胞分泌的分子)或其任何组合的组合物来进行。照此，本发明包括药物组合物，其中该组合物可以用于治疗骨病。例如，所述的骨病包括，但不限于骨折、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育不良，脊柱侧凸，骨质疏松症，骨软化，软骨病，纤维性骨炎，肾性骨营养不良和佩吉特骨病。优选本发明提供了用于促进脊柱融合术后骨融合的组合物和方法。

在一个非限制性实施方案中，制备直接对部位给药的包含本发明细胞的制剂，其中需要在给药部位上产生新骨。例如，可以将本发明的细胞悬浮于注射用水凝胶溶液中。或者，可以使包含细胞的水凝胶溶液硬化，例如在塑模中硬化，以便形成具有分散于其中的细胞的基质，此后将其植入，或一旦基质已经硬化，就可以培养细胞，以便在植入前使细胞以有丝分裂方式扩充。水凝胶为有机聚合物(天然或合成的)，它通过共价键，离子键或氢键交联成截留水分子的三维开放晶格结构以便形成凝胶。可以用于形成水凝胶的材料的实例包括：多糖类，诸如藻酸及其盐，肽类，聚膦腈类(polyphosphazines)和聚丙烯酸酯类，它们通过离子方式交联；或嵌段共聚物，诸如分别根据温度或pH交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。

在某些实施方案中，这些聚合物至少部分可溶于带有电荷的侧基的水溶液，诸如水，缓冲盐溶液或水醇溶液或其一价离子盐。带有可以于阳离子反应的酸性侧基的聚合物的实例为聚(磷腈)，聚(丙烯酸)，聚(甲基丙烯酸酯)，丙烯酸与甲基丙烯酸的共聚物，聚(乙酸乙烯酯)和磺酸化聚合物，诸如磺酸化聚苯乙烯。还可以使用具有通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例为羧酸基团，磺酸基团，卤化(优选氟化)醇基，酚OH基团和酸性OH基团。

带有可以与阴离子反应的碱性侧基的聚合物的实例为聚(乙烯基胺)，聚(乙烯基吡啶)，聚(乙烯基咪唑)和一些亚氨基取代的聚磷腈类。这些聚合物的铵或季铵盐还可以由主链氮或侧链亚氨基形成。碱性侧基的实例为氨基和亚氨基。

其它聚合物的实例为，但不限于聚-α-羟基酯类，聚二噁烷酮，富马酸丙烯酯，聚乙二醇，聚原酸酯类，聚酐类和聚氨基甲酸酯类，聚-L-乳酸，聚-乙醇酸和聚-乳酸-共-乙醇酸。

使用支架的ADAS细胞移植

将本发明的细胞接种在三维支架上或接种入三维支架并且植入体内，其中接种的细胞在框架内增殖并且在体内形成与哺乳动物细胞协同的置换组织。

在本发明的某些方面中，支架包含ADAS细胞的胞外基质，细胞裂解物(例如可溶性细胞级分)或其组合。在某些实施方案中，支架包含由本发明细胞分泌的胞外基质蛋白。或者，胞外基质为选自藻酸钙、琼脂糖、纤维蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素A、硫酸皮肤素和骨基质明胶的外源性材料。在某些方面中，基质包含天然或合成的聚合物。

本发明包括生物相容性支架，网格结构，自我-装配结构等，无论是否为生物可降解的，是液体还是固体。这类支架为基于细胞的疗法，手术修补，组织改造和伤口愈合领域中公知的。优选用细胞，胞外基质，条件培养基，细胞裂解物或其组合预处理(例如接种(seeded)，接种(inoculated)，接触)支架。在本发明的某些方面中，细胞附着于支架上。可以将接种的支架按照本领域中公知的任何方式导入哺乳动物体内，包括，但不限于植入，注射，手术结合，使用其它组织植入，注射等。可以将本发明的支架制成体内组织或器官形状和/或大小。例如，但绝不限于，可以设计支架，使得支架结构支持接种的细胞，而不会随后降解；从接种时开始支持细胞，直到由宿主组织改造组织移植物；并且使接种的细胞附着，增殖并且发育成具有支持其自身的足够机械完整性的组织结构。

可以将本发明的支架与任何一种或多种本文另外处所述刺激组织形成，否则就是促进或改善本发明实施的生长因子，细胞，药物或其它成分联用。可以对接种在支架上的ADAS细胞进行遗传改造以表达生长因子或药物。

在另一个优选的实施方案中，将本发明的细胞接种在支架上，在所述的支架中，材料展示出多孔性和模拟真骨特征的生物力学强度的特定物理特性，由此促进最终结构的稳定性和代谢物和细胞营养物的进出。即该材料应提供结构支持并且可以形成宿主血管化和细胞迁移可能发生的支架。在优选的实施方案中，首先将ADAS细胞与载体物质混合，此后施用于支架上。合适的载体包括，但不限于藻酸钙、琼脂糖、I、II、IV型或其它胶原蛋白同种型、纤维蛋白、聚-乳酸/聚-乙醇酸、透明质酸盐衍生物、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、淀粉、多糖类、糖类、蛋白聚糖类、合成聚合物、磷酸钙和陶瓷制品(即羟磷灰石、磷酸三钙)。

可以修饰三维构架的外表面以便改善细胞附着或生长和组织分化，诸如通过对结构进行血浆涂敷或添加一种或多种蛋白质(例如胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白类、糖胺聚糖类(例如硫酸肝素、软骨素-4-硫酸酯、软骨素-6-硫酸酯、硫酸皮肤素、硫酸角质素)、细胞基质和/或其它材料，诸如，但不限于明胶、藻酸盐、琼脂和琼脂糖来进行。

在某些实施方案中，重要的是在培养物中重新建立见于体内的细胞微环境，使得本发明的细胞在植入体内前生长至一定程度。此外，可以在接种细胞前，过程中或之后将生长因子，成骨诱导剂和血管生成因子加入到培养基中，以便在植入哺乳动物后由ADAS细胞引起分化和组织形成。

ADAS细胞的治疗应用

本发明包括将ADAS细胞给予哺乳动物，包括人以便治疗疾病的方法，其中导入ADAS细胞提供治疗缓解。可以将本发明的细胞单独或作为与其它细胞和/或本文另处所述的生物活性因子的混合物给予。可以与本发明ADAS细胞联合给予的细胞包括，但不限于其它多能或多能性细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨衬细胞、干细胞和骨髓细胞。可以在给予哺乳动物前即刻或不久将不同类型的细胞与ADAS细胞混合，或在给予哺乳动物前将它们彼此共同培养一段时间。

本领域技术人员易于理解可以将ADAS细胞植入哺乳动物，由此在接受来自周围环境的信号和暗示时，细胞在体内分化成由相邻细胞环境指定的成熟细胞。优选ADAS细胞分化成展示出骨细胞的至少一种特征的细胞。或者，ADAS细胞可与自在体外分化成所需细胞类型并且可以对有此需要的哺乳动物给予分化的细胞。

本发明还包括将移植ADAS细胞与其它治疗操作联用以便治疗骨病。优选所述的细胞用于促进脊柱融合术后的骨融合。可以将ADAS细胞与其它，即遗传修饰的和非遗传修饰的对哺乳动物发挥有益作用细胞共同植入。因此，正如本领域技术人员可以理解的，一旦以本文提供的教导武装起来，就可以将本文披露的方法与其它治疗操作联用。

可以将ADAS细胞与其它有益药物或生物分子(生长因子，营养因子)联用。当将ADAS细胞与其它活性剂一起给予时，可以将它们在单一药物组合物中或在单独的药物组合物中与其它活性剂同时或依次(在给予其它活性剂之前或之后)给予。可以共同给予的生物活性因子包括，但不限于抗细胞凋亡剂(即红细胞生成素、红细胞生成素、胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II、肝细胞生长因子、胱天蛋白酶抑制剂)；抗炎剂(即p38 MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类药物、IL-6和IL-I抑制剂和非类固醇消炎药)；免疫抑制/免疫调节剂；mTOR抑制剂；抗增殖剂；皮质类固醇(即泼尼松龙、氢化可的松)；抗血栓形成剂；和抗氧化剂。

本发明包括对哺乳动物给予作为未分化细胞，即作为在生长培养基中培养的ADAS细胞。或者，可以在接触在刺激分化成所需表型，例如成骨表型的条件的培养物中后给予ADAS细胞。

可以通过手术方式植入，注射，递送(例如借助于导管或注射器)本发明的细胞，否则就是直接或间接对有修复或增大需要的部位给予本发明的细胞。可以借助于基质细胞(例如三维支架)给予所述的细胞。可以将这些细胞与常用药学上可接受的载体一起给予。本发明细胞或其成分的给药途径(例如胞外基质，细胞裂解物，条件培养基)包括肌内、眼部、非肠道(包括静脉内)、皮下、口服和鼻部给药。非肠道给药的具体途经包括，但不限于肌内、皮下、腹膜内、大脑内、心室内、脑室内、鞘内、脑池内、脊柱内和/或脊柱周围给药途径。优选将这些细胞用于脊柱融合术操作。

可以将本发明的细胞单独或与用于修复骨创伤和缺陷的组合物的混合导入。这类组合物包括，但不限于骨形态发生蛋白质、羟磷灰石/磷酸三钙颗粒(HA/TCP)、明胶、聚-L-赖氨酸和胶原蛋白。例如，可以将本发明的细胞与脱钙骨基质(DBM)或其它基质合并成复合成骨性(以其自身正确的方式形成骨)以及骨诱导性的。

为了促进植入细胞的分化、存活或活性，可以加入本文另外处所述的额外生物活性因子。例如，生物活性因子可以包括，但不限于骨形态发生蛋白，血管内皮生长因子，成纤维细胞生长因子和具有骨传导和/或骨诱导性能力的其它生长因子。为了促进移植骨组织的血管化和存活，可以单独或与内皮细胞或其前体组合加入血管生成因子，诸如VEGF、PDGF或bFGF。

或者，可以对移植的ADAS细胞进行遗传修饰以便表达这类生长因子，抗氧化剂，抗炎剂或血管生成因子。

药物组合物

本发明范围内还包括ADAS细胞-产物，包括，但不限于ADAS细胞自身分泌的胞外基质，ADAS细胞细胞裂解物(例如可溶性细胞级分)和ADAS细胞条件培养基。照此，就给予包含ADAS细胞的组合物而言，本发明包括包含下列成分中的至少一种的药物组合物：ADAS细胞，由此产生的胞外基质，其细胞裂解物，或ADAS条件培养基。本发明的药物组合物优选包括药学上可接受的载体或赋形剂。优选将该药物组合物用于治疗如本文定义的骨病。

本发明的药物组合物可以包含在药学上可接受的载体中的同源或同种异体ADAS细胞群，本文基质或其细胞裂解物或其条件培养基。用于本发明细胞的药学上可接受的载体包括合适的有机或无机载体物质，它们不会与本发明的细胞或其组成或成分产生有害反应。就它们是生物相容性的来说，合适的药学上可接受的载体包括水，盐溶液(诸如林格液)，醇类，油，明胶和碳水化合物，诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯类、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。可以给这类制品灭菌，且如果需要，与助剂，诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂混合。适用于本发明的药物载体为本领域公知的并且，例如描述在PharmaceuticalSciences(17.sup.th Ed.，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.)和WO96/05309中，将这些文献各自引入本文作为参考。

作为另一个实例，可以将本发明的细胞单独，在药学上可接受的载体中给予或接种在本文另外处所述的基质上或其中，可以将这些细胞用于修复或替代受损或破坏的骨组织，用于增大存在的骨组织，用于导入新的或改变的组织或用于修饰人造假体。

当以半固体或固体装置给予细胞时，手术植入体内精确位置一般为合适的给药方式。就以液体或流体药物组合物的形式给予细胞而言，可以对多个全身位置给予细胞(即广泛扩散地受侵害区域)，从其中它们迁移至特定的位置(即通过对化学信号做出反应)。

其它实施方案包括通过给予包含ADAS细胞成分(例如细胞裂解物或其成分)或产物(例如胞外基质，天然或通过遗传修饰产生的营养和其它生物因子，来自ADAS培养物的条件培养基)的药物组合物进行的治疗方法。此外，这些方法可以进一步包含给予如本文另外处所述的其它活性剂。

还可以将ADAS细胞与促进，控制，否则就是指导指定治疗作用的添加剂一起施用。类似地，可以通过支持和/或指导植入细胞的命运将细胞与有利于体内组织改造的生物相容性基质一起施用。

在将ADAS细胞给予入哺乳动物前，可以使用质粒，病毒或可变载体策略，用所关注的核酸稳定或在那是转染或转导细胞。在进行遗传操作后给予细胞，使得它们表达指定促进由细胞提供的治疗反应的基因产物。

本发明的ADAS细胞可以用于治疗需要修复或替代因一般发生组织疾病或创伤或衰竭产生的骨组织的哺乳动物。治疗可能需要使用本发明的细胞以便产生新的骨组织。例如，可以将未分化或成骨分化-诱导的细胞用于治疗骨病，包括代谢和非代谢性骨病。骨病的实例包括，但不限于骨折、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育不良、脊柱侧凸、骨质疏松症、骨软化、软骨病、纤维性骨炎、肾性骨营养不良和佩吉特骨病。

脊柱融合术

正如本文所述，背痛仍然是主要的公共健康问题，尤其是在老年人中。持续性和严重性的背痛通常导致虚弱和残疾。这种疼痛与脊柱椎间盘异常紧密相关。基于本发明披露的内容，可以通过在盘内修补受损组织治疗变性的盘。本发明的ADAS细胞可以用于刺激骨发育且由此在变性的不同阶段修补椎间盘。

然而，通常有必要除去至少部分受损和/或机能障碍性背部成分。例如，当盘变断裂时，可以实施椎间盘切除手术操作以便除去断裂的盘并且彼此融合除去的盘之间的两根椎骨。脊柱融合术是一个过程，通过该过程构成脊柱的椎骨中的两根或多根与愈合成单一密质骨的骨移植物和内部装置(诸如杆体)彼此融合。脊柱融合术可以消除椎骨之间的反常运动，且由此减轻对神经末梢的压力。此外，脊柱融合术可以用于治疗，例如因创伤导致的脊椎骨损伤；椎骨之间缓冲盘的突出和变性(有时称作打滑的盘或椎间盘脱出)；异常弯曲(诸如脊柱侧凸或脊柱后凸)；和因感染或肿瘤导致的弱或不稳定脊柱。本发明包括用于改善脊柱融合术操作的成功率的组合物和方法。

由于已经证实本发明的ADAS细胞在体内形成骨，所以ADAS细胞可以用于取代常用于脊柱融合术的骨移植物的位置。特别地，ADAS细胞可以用于刺激两根相邻椎骨之间以及相邻横突之间(脊柱侧面上横突间空间内)的骨形成(椎体内)。

本发明的ADAS细胞在治疗脊柱病症中具有许多应用，包括促进椎间盘修复中富含蛋白聚糖的基质产生，产生用于横突间脊柱融合术中椎体间的骨和产生用于长骨骨折愈合的骨。本发明基于ADAS细胞可以用于促进脊柱融合术中的骨融合的发现。

当椎间盘断裂时，可以实施椎间盘切除手术操作以便除去断裂的椎间盘并且彼此融合除去的椎间盘之间的两根椎骨。有关用于融合椎骨的典型实施方法的详细描述披露在美国专利US 6,033,438和US5,015,247中，将这些文献的内容完整地引入本文作为参考。

通常用区段融合治疗关节盘变性，由此融合椎体间空间的前和后脊柱成分。重要的是认为在考虑融合技术时机械应力压迫在前或2后成分上。前运动区段成分(椎体和关节盘)在脊柱内的指定水平上具有约80％的压迫力。椎体和关节盘的后1/3代表脊柱轴向压迫的中心点。这些机械力对评价何种类型的融合对指定病理学情况具有最佳临床效果而言是关键性的。本发明提供了脊柱融合术，其中ADAS细胞用作骨替代物的来源。

在一个实施方案中，本发明包括对哺乳动物实施一种或多种脊柱融合术的方法，包括通过经注射器，导管或套管将有效量的ADAS细胞给予入哺乳动物的一个或多个合适的椎体间空间，以便有利于单或多个水平的脊柱融合术。将ADAS细胞置于在生理条件下，即体内细胞分化和形成骨的时间内。ADAS细胞的操作促进了脊柱融合术中的骨融合。

在另一个实施方案中，本发明包括用于对哺乳动物实施一种或多种脊柱融合术的方法，包括通过与相邻椎骨接合在至少一个合适的椎体间空间的后部分中放置选自杆体和椎弓根螺钉或板和椎弓根螺钉的金属植入物；将有效量的ADAS细胞注入椎体间空间的前部；并且使ADAS细胞分化成展示出骨细胞的至少一种特征的细胞且由此在体内形成骨。

本发明包括通过对椎体间空间使用前部途径，后部途径或后外侧途径实施脊柱融合术的方法。后外侧途径(单侧或双侧)降低了前部途径中的手术发病率，但在马尾周围操作和脱离椎管中的神经根时要谨慎。椎体间空间的后部入口和可视化比前部途径的更受限，但许多脊柱外科医师经历过如何处理这些情况的训练。

如本文另外处所述，ADAS细胞还可以包含一定量适合于促进骨生长的一种或多种活性的生物活性剂，诸如生长因子，骨形态发生蛋白或其药物载体。

ADAS细胞可以提供治疗或结构有益性的一种机制在于通过将其自身或其子代掺入新生成的，现存的或修复的组织或组织成分。例如，ADAS细胞和/或其子代可以掺入新生成的骨其它结构或功能组织，且由此产生或促进治疗或结构改善。ADAS细胞可以提供治疗或结构有益性的另一种机制在于通过表达和/或分泌促进指定组织或组织成分的结构或功能生成，保留，恢复和/或再生的分子，例如生长因子。

ADAS细胞还可以用于与其它细胞或装置组合，诸如递送因子，药物，化学品或其它活性剂的合成或生物支架，材料或装置，所述的因子，药物，化学品或其它活性剂如本文进一步所述的改变或强化细胞的相关特征。

按照在此披露的本发明，可以在从哺乳动物中采集脂肪组织后迅速将ADAS细胞递送到哺乳动物中。例如，可以在处理脂肪组织并且获得ADAS细胞的组合物后即刻给予细胞。最终，递送的时间选择取决于哺乳动物可利用性和加工脂肪组织所需的处理时间。在另一个实施方案中，用于递送的定时相对较长，只要如本文所述的对重新输注给哺乳动物的细胞进行额外的修饰，纯化，刺激或其它操作。给予哺乳动物的细胞数量可以与例如脂肪组织处理后的细胞产率相关。可以保持细胞总数以便随后使用或冷藏。

下列实施例进一步解释了本发明的方面。然而，决不用来限定如本文所述的本发明的教导或披露内容。

实施例

现在参照下列实施例来描述本发明。提供这些实施例的目的仅在于解释，但本发明并不限于这些实施例，而是包括作为本文提供教导的结果显而易见的所有变化形式。

进行下列实验以便确定ADAS细胞对脊柱融合术结果的作用。例如，同源和同种异体ADAS细胞对脊柱融合术的影响。本文的结果表明ADAS细胞为成骨性的并且促使脊柱融合术的改善。基于本发明披露的内容，ADAS细胞可以用于治疗哺乳动物，包括，但不限于创伤受害者，缺乏适当数量的成骨细胞的骨质疏松哺乳动物和具有非愈合性骨折的哺乳动物。

实施例1：脊柱融合术中自体移植骨的替代物

超过75％的美国人口患有背痛。在某些情况中，潜在的医学疾病可能促成背痛。它们包括脊柱侧凸、椎管狭窄、关节盘变性疾病、传染过程、肿瘤和创伤。就1％的人群而言，背痛由此是严重性的，迫使他们发生终生残疾；另有1％的人口因背痛而在有限时间期限内成为残疾。使用保守疗法治疗具有背痛的大部分哺乳动物；然而，当诸如卧床休息和药物疗法这类方式失败时，临床医师通常建议实施脊柱融合术。这种手术的目的在于在两根或多根相邻椎骨之间形成异位骨，使它们彼此“融合”成坚固结构。椎骨关节的固定化减轻了离开脊髓的神经根上的压力和产生的疼痛感。外科医师对腰椎使用后外侧途径(poster lateral approach)，从而导入了在两椎体之间具有机械支持的骨移植物或骨诱导性材料以便形成异位骨(图1)。

由于不希望受到任何特定理论约束，所以认为用于脊柱融合术的＂理想＂移植物材料可以提供下列特性：机械支持性(材料在恢复期过程中稳定脊柱/手术部位)；骨传导性(材料有利于向内成长和其上相邻骨的整合)；骨诱导性(材料补充和刺激从并非天然可以进行的细胞形成骨不使其生长)；和成骨性(材料包含自身能够形成新骨的细胞)。

目前，用于脊柱融合术修复的“金标准”为自体骨，其通常采集自个体的髂嵴。外科医师将哺乳动物自身的骨植入需要的部位。然而，这远非完美的解决方案。在30％的哺乳动物中，供体部位在手术后发生感染，青肿，破碎或疼痛。实际上，当哺乳动物需要自体移植骨进行多种脊柱融合术时，髂嵴可能无法提供足够的材料。哺乳动物的基本健康状况进一步影响脊柱融合术的结果。具有因糖尿病，吸烟或年龄导致的骨质疏松症或血管功能不全的哺乳动物展示出减少的新骨形成和脊柱融合部位上的骨不连接(Whang等，2003，Spine J.3：155-65)。因此，对脊柱融合术中的自体移植骨的替代物存在需求。

尽管存在可利用的可替代材料，但是它们均面临常用的局限；尚无一种展示出成骨能力。可以对来自尸体的异体移植骨灭菌，储存并且根据需要用于手术室。可以使这些材料预成形以便具体应用，或将其粉碎，使它们作为糊剂施用于手术部位；然而，异体移植物可以产生炎症，引起免疫应答并且已经在有限数量的病例中成为感染源(Whang等，2003，Spine J.3：155-65)。因为将异体移植骨灭菌，所以它不再包含形成有活力的天然骨的细胞(成骨细胞，骨细胞)并且缺乏成骨性。在临床试验中，异体移植骨次于多级脊柱融合术中的自体移植骨(Whang等，2003，Spine J.3：155-65)。陶瓷材料，诸如羟磷灰石和磷酸三钙(HA/TCP)为骨传导性的并且促进新骨形成。然而，它们缺乏成骨性和骨诱导性，从而限制了其应用。尽管骨诱导性生长因子，诸如骨形态发生蛋白(BMP)为商购的(来自Sofamor/Medtronics的Infuse^TM)，但是它们需要存在脊柱融合部位内存在成骨细胞以便促进新骨形成(Whang等，2003，Spine J.3：155-65)。成骨细胞的发育具有改善这些可替代脊柱融合术材料中任何种的结果的潜能。

大量动物种类用作临床前期脊柱融合术试验中的模型。它们包括大鼠，兔，狗，绵羊，山羊和非人的灵长类(Khan等，2004，Biomaterials 25：1475-85；Liebschner等，2004，Biomaterials25：1697-714；Sandhu等，2001，Eur.Spine J.10：S122-31)，其中大鼠(Boden等，1998，Spine 23：2486-92；Cui等，2001，Spine26：2305-10；Wang等，2003，J.Bone Joint Surg.Am.85-A：905-11)和兔(Khan等，2004，Biomaterials 25：1475-85；Kruyt等，2004，Biomaterials 25：1463-73)因动物大小和成本的原因而已经用于“概念验证”研究。在每一种类中，外科医师可以对腰椎使用与用于治疗其它哺乳动物类似的后外侧途径。兔更常用于脊柱融合术可行性研究(Khan等，2004，Biomaterials 25：1475-85)，部分原因在于动物的大小和脊柱融合术在兔中的比例与在人中观察到的结果类似的经证实的观察结果。然而，兔与大鼠模型相比存在模型缺陷。不同于大鼠，其中可利用充分表征的近交品系，实验室兔未展示出同源性或同基因型单体型。因此，不可能按照常规方式将细胞从一只兔移植到另一只兔中，而没有排斥风险。大鼠后外侧脊柱融合术模型已经用于成功地证实骨形态发生蛋白7在胶原蛋白支架中存在时的骨诱导性作用(Salamon等，2003，J.Spinal Disord.Tech.16：90-5)。几组使用了成功评价骨髓基质细胞对脊柱融合的成骨作用的大鼠模型(Boden等，1998，脊柱23：2486-92；Cui等，2001，Spine 26：2305-10；Wang等，2003，J.Bone Joint Surg.Am.85-A：905-11)。与单独的支架相比，骨髓基质细胞植入后4-9周内，他们实现了脊柱融合的具有统计学显著性的改善。每一研究使用n＝4-8只动物的组。

设计下列实验是为了评价脊柱融合术操作中ADAS细胞的作用。

ADAS细胞的分离

从雄性Fischer大鼠中采集皮下脂肪组织(8-10周龄，n＝25，产生约3克组织/大鼠)。按照公布的方法制备ADAS细胞(Aust等，2004，Cytotherapy 6：7-14；Halvorsen等，2001，Metabolism 50：407-413；Sen等，2001，Journal of cellular Biochemistry 81：312-319)。简言之，切碎脂肪组织，洗涤并且悬浮于等体积的包含1％牛血清清蛋白和0.1％胶原酶I型(Worthington Biochemical，Lakewood NJ)的磷酸缓冲盐水中。在37℃下通过搅拌(50rpm)进行60分钟消化后，在室温下以1200rpm将混悬液离心5分钟并且使基质血管级分细胞沉淀。以0.1克组织消化物/cm²的密度在“基质培养基”(补充了10％胎牛血清(Hyclone，Logan UT)和1％抗生素/抗霉菌剂的DMEM/F-12Ham′s培养基中铺板。将细胞在加湿5％ CO₂孵育箱中孵育3-6天，直到它们达到75％的汇合率。产生约为25-30 X 10⁴个细胞/cm²。此时，通过用胰蛋白酶/EDTA消化收集ADAS细胞并且以5 X 10³个细胞/cm²的平板密度传代。使细胞扩充达2代以便获得>6千万个细胞(表1)。如(Halvorsen等，2001，Tissue Eng.7：729-41；Hicok等，2004，Tissue Engineering 10：371-380)中所述使用标准测定法在1-3周诱导期内对细胞在体外评价成骨和脂肪形成能力。可以将细胞冷藏在液氮中，此后使用。

为了从组织学上跟踪细胞，在使用携带表达β-半乳糖苷酶的LacZ基因的逆转录载体在初始传代的过程中标记细胞以便提供可追踪标记。逆转录载体的稳定整合降低了标记在植入过程中丢失的风险。这种方法常用于追踪植入的细胞。

表1：估计的ADAS细胞产率和扩充

 

传代	初始传代	二次传代
			ADAS细胞/gm	2.5×105	1.25×106
ADAS细胞/来自25只大鼠的脂肪组织(～75gm)	18.75×106	93.75×106

实施例2：体外ADAS细胞的骨生成

已经证实在有抗坏血酸，β-磷酸甘油，地塞米松和1，25二羟维生素D3存在下培养时，人ADAS细胞展示出成骨表型(Halvorsen等，2001，Tissue Eng.7：729-41)。在这些条件下，ADAS细胞使其胞外基质如使用用于磷酸钙沉积的茜素红或von Kossa染色阳性证实的矿化(图3)。

观察到在10-天期限内的人ADAS细胞骨发生伴随碱性磷酸酶活性增加。在培养期结束时，成骨细胞(矿化)展示出高于在对照条件下维持细胞3倍水平的碱性磷酸酶(图4)。同样，在成骨条件下骨钙素分泌水平存在时间依赖性增加。ADAS细胞表达大量与成骨细胞表型一致的基因标记，包括骨钙素，骨桥蛋白，骨形态发生蛋白(BMP)2和4和BMP受体IA，IB和II。

还证实ADAS细胞具有沿着多重谱系途经分化的潜能。作为对化学品和生长因子的特定混合物的反应，ADAS细胞可以在体外分化成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和神经元-和神经胶质-样细胞(图2)。

实施例3：ADAS细胞在体内为成骨性的

为了延长体外发现，将人ADAS细胞植入免疫缺陷SCID小鼠。使ADAS细胞加载在3cm³立方体的羟磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)支架上并且经皮下植入。在6-周期限后，采集植入物，固定，脱钙并且用苏木精/伊红或用人核抗原特异性抗体染色(图5)。基于H&E染色，观察到在有人ADAS细胞存在下形成与羟磷灰石/磷酸三钙支架相邻的新骨。基于使用人抗原特异性抗体的免疫荧光分析鉴定骨内的人细胞。在有单独的支架(无细胞)存在下，新骨不会形成并且未检测到人细胞。这些研究表明ADAS细胞能够在体内骨发生。

实施例4：可以通过异体移植方式植入ADAS细胞

下列实验用于提供有关ADAS细胞在脊柱融合模型中的异体移植的概念验证。已经证实ADAS细胞难以引起来自混合淋巴细胞反应中异体移植淋巴细胞的增殖反应。在不希望受到任何特定理论的约束的情况下，据认为ADAS细胞释放抑制对同种异体抗原的淋巴细胞免疫应答的因子。存在ADAS细胞延长了狒狒模型中皮肤移植物的存活且由此表明可以通过异体移植方式将成体干细胞植入以便组织改造应用。

使用犬模型，可以生成狗股骨干中临界大小的部分缺损。可以使用单独的羟磷灰石/磷酸三钙支架或其与自体或异体ADAS细胞的组合修复这些缺损；异体移植细胞就HLA-I和HLA-2抗原而言发生错配(表2)。移植物接受者未接受任何免疫抑制疗法。16周后处死动物并且可以将在有ADAS细胞存在下观察到的骨修复程度与单独的支架移植物(无ADAS细胞)比较。由于不希望受到任何特定理论的约束，所以认为在使用自体与异体ADAS细胞获得的修复之间未观察到显著性差异，也不存在对同种异体细胞的任何免疫应答的证据。这些实验用于证实组织改造的构建体中异体植入成体干细胞是切实可行的并且在某些情况中无需免疫抑制疗法。

表2：犬区段缺损中骨和陶瓷制品的组织形态测定分析**

 

植入物类型	陶瓷制品百分比	骨百分比
			异体MSC-陶瓷制品植入物(n＝4)	35±3％	49±12％#
自体MSC-陶瓷制品植入物(n＝6)	33±5％	42±5％#
			不含细胞的陶瓷制品	30±6％	25±12％

**陶瓷制品百分比为陶瓷制品占植入物总面积的百分比，且骨百分比为骨占多孔空间的百分比。将数值定为平均值±标准偏差。与不含细胞的植入物相比，差异为显著性的(p<0.05)(Arinzeh等，2003，J.Bone Joint Surg.Am.85-A：1927-35)。

实施例5：同源ADAS细胞对脊柱融合的作用

下列实验用于解决ADAS细胞体内为成骨性的且与合适的生物材料载体组合可以改善和加速动物模型中的脊柱融合的推定。表3概括了实验设计。使用同源ADAS细胞(来自相同品系大鼠的细胞)进行最初研究，以便模拟在人自体细胞移植物中存在的条件。通过除去与免疫应答和排斥相关的问题，这些实验集中在ADAS细胞在脊柱融合中的成骨能力。实验大鼠作为脊柱融合模型的这些实验以本领域中公知的方法为模式(Boden等，1995，Spine 20：412-20；Wang等，2003，J.BoneJoint Surg.Am.85-A：905-11；Cui等，2001，Spine 26：2305-10；Sandhu等，2001，Eur.Spine J.10 Suppl.2：S122-31；Wang等，2003，Spine J.3：155-65)。

手术操作和安乐死

如Cui所述对96只雌性Fischer大鼠实施单级横突间脊柱关节固定术(L4-L5)(Cui等，2001，Spine 26：2305-10)。用氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(7mg/kg)麻醉动物，剃刮，悬垂并且使用聚维酮碘和70％乙醇对其皮肤进行消毒。从L3-L5做中线后纵切口。沿棘突和与小面的侧面连接的层使骨膜隆起。使用骨钳除去小面并且用盐水溶液冲洗伤口。将动物随机分成n＝32的组。A组不接受治疗。B组接受单独的羟磷灰石/磷酸三钙(40mg)植入融合床。C组接受羟磷灰石/磷酸三钙(40mg)与2 X 10⁶个来源于Fischer大鼠的皮下脂肪组织的ADAS细胞(同源细胞)的组合植入融合床。在放置植入物后，封闭深筋膜和皮肤切口。在手术操作后监测为术后镇痛接受盐酸丁丙诺啡(0.1mg/kg)的动物的运动性和功能恢复达24小时。在手术操作后6和12周通过CO₂窒息处死来自每个组的16只动物的组。此时，采集血清样本和腰椎用于分析。

放射照像随访

在手术后和手术后6周间隔时对动物进行腰骶部脊柱的后前位的侧位射线照相。放射照像分析用于检测手术部位上腰椎中的异位骨形成和骨痂形成。对处死后剖离的样本进行显微计算机化断层摄(显微-CT)。可以使用本领域公知的方法测定新骨形成的结构和体积(Mankani等，2004，Radiology 230：369-76)。

脊柱融合术的手部触诊

在处死动物时，从动物中剖离L3-L5腰椎。触摸样本的L3-4和L4-5上的延长部分和弯曲部分。对有或没有任何运动存在下的样本分级。在任何方向上存在运动的那些样本接受“0”的评分，而认为那些在任何方向上没有运动的样本与“1”的评分“融合”(Cui等，2001，脊柱26：2305-10；Grauer等，2004，脊柱J.4：281-6)。

脊柱融合的生物力学测试

在测试前，清除所有的肌肉并且分开L4-5上的椎间盘，使得仅融合体连接两根椎骨。将铁k-丝(3.2mm)针放入定向于椎体的前后轴。以0.5cm/分钟的移位速率与通过k-丝施加的负荷进行单轴拉伸测试。用伸长计测定移位并且借助测力传感器测定负荷。根据计算机生成的负荷移位图测定断裂的峰值负荷。将刚度测定为负荷移位曲线上两点之间的线的斜率(在50％和75％负荷下断裂)。按照类似方式测试L3-4上的相邻区段。

组织学分析

将腰椎样本(对每组的每个时间点而言n＝8)固定在福尔马林中48小时，在4℃下磷酸缓冲盐水中0.25M的乙二胺四乙酸中脱钙2周并且在37℃下的X-gal溶液(1mg/ml)中孵育16小时。将样本进行石蜡包埋，做横切片(5μm)并且用苏木精和伊红染色。使用Medivue(Nikon)软件分析来自每一样本的10个切片，以便对异位骨占据的每一植入物的平均百分比定量(±标准偏差)。

由于不希望受到任何特定理论约束，所以认为主要实现下列结果，ADAS细胞就可成功用于脊柱融合术：1)观察到在6和12周时间点时A组(无治疗)中有最少的融合证据(90％的动物中的人工控制融合评分为0，无异位骨X线照片影像且基于组织学和CT分析每个样本有10个切片中小于5％的手术部位面积被骨基质占据)；2)在6和12周时间点时在B和C组中检测动物组织学分析中的HA/TCP支架；3)在6和12周时间点时B组(单独的HA/TCP)中有最少的融合证据(90％的动物中的人工控制融合评分为0，无异位骨X线照片影像且基于组织学和CT分析每个样本有10个切片中小于5％的手术部位面积被骨基质占据)；4)基于组织学分析时的β-半乳糖苷酶活性或免疫检测的手术后检测C组中植入的ADAS细胞6周；和5)在6和12周时间点时，优于单独的支架(B组)或空白损害(A组)对照组的在有ADAS细胞(C组)存在下的脊柱融合术(90％的动物中的人工控制融合评分为“1”，在手术部位上有异位骨X线照片影像且基于组织学和CT分析每个样本有10个切片中大于30％的HA/TCP植入物面积被骨基质占据)。

将本实施例中所列的实验用于解决ADAS细胞在加速和改善大鼠模型中腰椎融合中的应用。

表3：实验设计概括

实施例6：异体移植ADAS细胞对脊柱融合的作用

下列实验用于解决可以使用生物材料支架以异体移植的方式植入ADAS细胞以便获得优于单独的生物材料支架的脊柱融合的推定。表4中概括了实验设计。已经证实能够植入骨髓衍生的MSC以便在没有明显免疫排斥的情况下修复骨缺陷(Arinzeh等，2003，J.Bone JointSurg.Am.85-A：1927-35)。本文披露的实验证实了异体移植ADAS细胞在腰椎融合模型中的应用。

选择Fischer和ACI近交品系用于下列基于文献中的在先研究的实验(Akahane等，1999，J.Bone Miner Res.14：561-8；Yoshikawa等，2000，J.Bone Miner Res.15：1147-57)。除非指定免疫抑制疗法，否则这些动物展示出组织相容性抗原错配和排斥成骨组织移植物(Akahane等，1999，J.Bone Miner Res.14：561-8；Yoshikawa等，2000，J.Bone Miner Res.15：1147-57)。

将来自ACI大鼠的分离的异体移植ADAS细胞用于植入Fischer大鼠腰椎脊柱融合体。本文的实验可以和与同源自体ADAS细胞相关的实验平行进行，由此能够进行对比分析。可以基于单向混合淋巴细胞反应和对获自各组的血清样品的流式细胞检测分析评价存在或不存在对异体移植ADAS细胞的免疫应答。

表4：实验设计概括

如本文另外处所述从雄性ACI大鼠(8-10周龄，n＝25，产生约3克组织/大鼠)中采集皮下脂肪组织。使用各代获得的细胞数量遵循表1中概括的估计值。使来自ACI大鼠的ADAS细胞进行与用于Fischer大鼠ADAS细胞相同的体外分析。如本文另外处所述进行手术和随后操作(即放射照像随访，脊柱融合术中的手部触诊)。HA/TCP植入物可以在100μl体积中包含约2 X 10⁶个细胞。

为了进行组织学分析，将腰椎样本固定在福尔马林中48小时，在4℃下磷酸缓冲盐水中0.25M的乙二胺四乙酸中脱钙2周并且在37℃下的X-gal溶液(1mg/ml)中孵育16小时。将样本进行石蜡包埋，做横切片(5μm)并且用苏木精和伊红染色。使用Medivue(Nikon)软件分析来自每一样本的10个切片，以便对异位骨占据的每一植入物的平均百分比定量(±标准偏差)。在有或没有浸润淋巴细胞存在下评价切片。由于不希望受到任何特定理论的约束，所以可以将针对全造血系抗体(抗-CD45)的抗体用于对细胞进行免疫组织化学染色，以便鉴定植入物内或周围任何免疫细胞。在每个样本10个切片中测定浸润淋巴细胞数量并且使用Medivue软件程序定量。

血清免疫应答

通过流式细胞计量术评价结合ACI品系ADAS细胞的血清抗体。将来自ACI大鼠的ADAS细胞从液氮储存中快速融化并且放入培养物中5天以便促进最大活力和表面抗原表达。通过胰蛋白酶消化收集细胞，在染色缓冲液(1x DPBS，5％ FBS，0.5％ BSA，0.1％叠氮化钠)中洗涤且重新悬浮于5 x 10⁶个细胞/ml中。将90μl细胞(5 x 10⁵个细胞)等分入2ml埃彭道夫管。向每支管中加入10μl未稀释的大鼠血清或按照1:10在染色缓冲液中稀释的血清而得到1:10和1:100的有效血清稀释液。将所有的管在冰上孵育30分钟，用洗涤缓冲液(1 X DPBS，0.5％ BSA和0.1％叠氮化钠)洗涤且然后重新悬浮于100μl染色缓冲液中。将山羊抗大鼠(IgG/IgM)FITC二次抗体以1:100的最终稀释液加入到所有管中。对照管接受仅含有二次抗体(阴性对照)或含有阳性对照Fischer抗-ACI大鼠血清的ACI ADAS细胞，所述的阳性对照Fischer抗-ACI大鼠血清是通过用ACI ADAS细胞对Fischer大鼠反复免疫接种产生的。在黑暗中的冰上将混悬液孵育15分钟并且如本文另外处所述用洗涤缓冲液洗涤两次。然后在获取前将细胞固定在200μl 1％低聚甲醛中并且将其在冰上的固定剂中孵育至少15分钟。需要20,000个结果用于流式细胞计量分析。基于平均荧光强度增加将结果表示为使用二次抗体染色的ACI细胞占单独二次抗体阴性对照的百分比。

单向混合淋巴细胞反应(MLR)

本测定法基于下列原理：如果在体内使T细胞接触ACI异型抗原，那么它们以较快的动力学速率对体外再刺激产生反应。可以通过MLR测定法评价接受者大鼠T细胞对异体移植ACI品系ADAS细胞活化。使用收集的肠系膜+宫颈LN细胞作为反应者细胞对各大鼠进行MLR测定。评价来自3组的每组8只动物：无治疗(A组)；仅支架(B组)；支架+异体移植细胞(D组)(表5)。通过在培养基中培养反应者细胞设定测定，所述的培养基含有照射的(5000R)同源Fischer脾刺激细胞或含有照射的异体移植ACI脾刺激细胞。作为对培养基或对同源脾细胞的反应的T细胞增殖代表了本底响应；一般从对异体移植细胞的反应中扣除同源反应，以便评价真实的增殖。作为阳性对照和阴性对照，使用照射的异体移植ACI(阳性)和同源Fischer(阴性)淋巴细胞设定测定；它们的异体移植与同源HLA1和2抗原的表达确保了反应者Fischer衍生的淋巴细胞的强劲增殖反应或无反应。使用每次处理一式三份孔的96孔平板进行MLR测定。以4 x 10⁵个细胞/孔将反应者细胞铺板并且将脾细胞刺激物以1 x 10⁵个细胞/孔铺板。所用的培养基为补充了非必需氨基酸，丙酮酸钠，2-巯基乙醇和抗生素/抗霉菌剂的Iscove改良的Dulbecco培养基+10％ FBS(Hyclone)。制备复制式培养平板用于在培养的第3和第7天采集。在第2或第6天用³H-胸苷(1uCi/孔)脉冲培养物，并且在随后的约1小时采集细胞用于闪烁计数。将结果报导为每分钟的计数(cpm)，它们反映出培养孔中T细胞增殖的程度。

表5：单向混合淋巴细胞反应

在不希望受到任何特定的理论约束的情况下，据信同种异体ADAS细胞成功用于脊柱融合术，只要获得下列结果：在6和12周时间点时A组(无治疗)中有最少的融合证据(90％的动物中的人工控制融合评分为0，无异位骨X线照片影像且基于组织学和CT分析每个样本有10个切片中小于5％的手术部位面积被骨基质占据)；在6和12周时间点时在B和D组中检测所有动物组织学分析中的HA/TCP支架；在6和12周时间点时B组(单独的HA/TCP)中有最少的融合证据(90％的动物中的人工控制融合评分为0，无异位骨X线照片影像且基于组织学和CT分析每个样本有10个切片中小于5％的手术部位面积被骨基质占据)；在6和12周时间点时B组(单独的HA/TCP)中有最少的融合证据(90％的动物中的人工控制融合评分为0，无异位骨X线照片影像且基于组织学和CT分析每个样本有10个切片中小于5％的手术部位面积被骨基质占据)；基于组织学分析时的β-半乳糖苷酶活性或免疫检测的手术后检测D组中植入的ADAS细胞6周；在6和12周时间点时，优于单独的支架(B组)或空白损害(A组)对照组的在有ADAS细胞(D组)存在下的脊柱融合术(90％的动物中的人工控制融合评分为“1”，在手术部位上有异位骨X线照片影像且基于组织学和CT分析每个样本有10个切片中大于30％的HA/TCP植入物面积被骨基质占据)；C和D组(ADAS细胞植入物)中的抗-ADAS抗体水平低于A和B组(无细胞处理)1.5倍的增加；和在比较A，B和D组时，在混合淋巴细胞反应中与单独的培养基或同源衍生的脾细胞相比，不存在由同种异体衍生的脾细胞刺激的反应者细胞增殖增强的证据。混合淋巴细胞反应阳性对照展示出至少10,000cpm的增殖反应。

实施例7：比较和对比脊柱融合模型中同源和同种异体ADAS细胞 的相对有效性

本文提供的披露内容提供了能够测定异体移植(HLA错配)和同源(HLA相容性)ADAS细胞是否在实现脊柱融合中展示出等效功能的数据。将实验设计概括在表6中。由于不希望受到任何特定的理论约束，所以认为基于实验同种异体MSC在狗中实现成功修复临界大小的骨缺陷的预先研究认为两种细胞群为等效的(Arinzeh等，2003，J.BoneJoint Surg.Am.85-A：1927-35)。同源和同种异体ADAS细胞的比较提供了显著的医学和商业内含。本文披露的公开内容提供了ADAS细胞在组织再生疗法中的应用。

表6：使用同种异体与同源ADAS细胞的脊柱融合术的比较

 

6和12周时的参数	同源(C组)	异体移植(D组)
			由基于组织学分析组成的植入物百分比	每个时间点N＝8	每个时间点N＝8
手工控制融合评分	每个时间点N＝16	每个时间点N＝16
			融合的放射照像测定	每个时间点N＝16	每个时间点N＝16
融合的生物力学测试	每个时间点N＝8	每个时间点N＝8

在不希望受到任何特定的理论约束的情况下，据信同种异体ADAS细胞与同源ADAS细胞在成功用于脊柱融合术方面相差无几，只要表6中的所有参数不表现出在同种异体与同源ADAS细胞组之间具有统计学显著性差异(p>0.05，优选p>0.30)。

将本文引述的每一和每篇专利，专利申请和公开文献披露的内容完整地引入本文作为参考。

尽管已经参照具体实施方案披露了本发明，但是显而易见，本领域技术人员可以在不脱离本发明确切精神和范围的情况下设计本发明的其它实施方案和变化形式。所附的权利要求旨在包括所有这类实施方案和等价变化形式。

Claims (25)

1.促进哺乳动物脊柱融合术后骨融合的方法，该方法包括对所述哺乳动物的脊柱给予分离的脂肪组织衍生的成体基质(ADAS)细胞，其中所述的ADAS细胞在体内分化成表达至少一种骨细胞特征的细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中在将所述细胞给予哺乳动物前将所述的ADAS细胞在体外培养一段时间而不被诱导分化。

3.权利要求1所述的方法，其中所述的ADAS细胞就所述的哺乳动物而言为同种异体的。

4.权利要求1所述的方法，其中所述的ADAS细胞诱导椎体间脊柱融合术的骨形成。

5.权利要求1所述的方法，其中所述的ADAS细胞诱导横突间脊柱融合术的骨形成。

6.权利要求1所述的方法，其中所述的ADAS细胞进一步包含生物相容性基质。

7.权利要求1所述的方法，其中所述的生物相容性基质选自藻酸钙、琼脂糖、纤维蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素A、硫酸皮肤素和骨基质明胶。

8.权利要求1所述的方法，其中所述的ADAS细胞为遗传修饰的。

9.权利要求1所述的方法，其中所述的ADAS细胞给予入哺乳动物脊柱的一个或多个椎体间空间。

10.权利要求1所述的方法，其中脊柱融合术在脊柱区段中进行，所述的脊柱区段选自颈段、胸段、腰段、腰骶和骶髂(SI)关节。

11.权利要求1所述的方法，其中通过一种途径将所述的ADAS细胞给予入一个或多个椎体间空间，所述的途径选自后部途径、后外侧途径、前部途径、前外侧途径和外侧途径。

12.权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。

13.对哺乳动物实施一种或多种脊柱融合术的方法，该方法包括对所述哺乳动物的脊柱给予分离的脂肪组织衍生的成体基质(ADAS)细胞，以便有利于单或多个水平的脊柱融合术。

14.权利要求13所述的方法，其中所述的ADAS细胞在体内分化成表达至少一种骨细胞特征的细胞。

15.权利要求13所述的方法，其中将所述的ADAS细胞在体外培养一段时间，在将所述细胞给予所述的哺乳动物前不会被诱导分化。

16.权利要求13所述的方法，其中所述的ADAS细胞就哺乳动物而言为同种异体的。

17.权利要求13所述的方法，其中ADAS细胞诱导椎体间脊柱融合术的骨形成。

18.权利要求13所述的方法，其中ADAS细胞诱导横突间脊柱融合术的骨形成。

19.权利要求13所述的方法，其中所述的ADAS细胞进一步包含生物相容性基质。

20.权利要求13所述的方法，其中所述的生物相容性基质选自藻酸钙、琼脂糖、纤维蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素A、硫酸皮肤素和骨基质明胶。

21.权利要求13所述的方法，其中所述的ADAS细胞为遗传修饰的。

22.权利要求13所述的方法，其中将所述的ADAS细胞给予入所述哺乳动物脊柱的一个或多个椎体间空间。

23.权利要求13所述的方法，其中脊柱融合术在脊柱区段中进行，所述的脊柱区段选自颈段、胸段、腰段、腰骶和SI关节。

24.权利要求13所述的方法，其中通过一种途径将所述的ADAS细胞给予入一个或多个椎体间空间，所述的途径选自后部途径、后外侧途径、前部途径、前外侧途径和外侧途径。

25.权利要求13所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。

Images