CN101500436B - 用于皮肤和毛发的番茄红素异构体的稳定和生物可利用的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过在溶剂中长时间加热番茄、番茄部分、其衍生物、或在溶剂中的番茄提取物而制备富含顺‑番茄红素(Z‑异构体)的稳定组合物的方法。

Description

用于皮肤和毛发的番茄红素异构体的稳定和生物可利用的组 合物
本发明涉及包括至少一种含番茄红素材料的初级组合物(primarycomposition)，其中所述的含番茄红素材料富含具有提高的稳定性和生物利用率的番茄红素化合物Z-异构体，并涉及形成所述组合物的方法。本发明还涉及在食品、在食物增补剂(foodsupplement)、在化妆制品或在药物制品中含有所述初级组合物的口服组合物。
技术背景
类胡萝卜素的吸收是一个复杂过程，其涉及从食物微观结构基质释放、溶解至混合的胶束中、肠摄取、掺入乳糜微粒、分布至组织、肝脏摄取并再分泌至VLDL，其中VLDL逐步转化成LDL。
来自食物源的番茄红素吸收得到广泛记载。来自食物如番茄和番茄汁的番茄红素生物利用率是相当低的。迄今，番茄酱(tomato paste)是生物可利用的番茄红素的最知名食物源。番茄含有处于全E构型的约大于90％的番茄红素。
含有大量番茄红素的番茄提取物以含油树脂(oleoresin)的形式可商业地获得，不过在人类中这些来源的番茄红素的生物利用率相当有限。在浓缩的番茄提取物中，番茄红素主要以结晶形状存在，已经提出此为降低番茄红素生物利用率的主要因素之一。
迄今，大部分的市售番茄红素源表现出与初始番茄极相似的异构体分布图(isomeric profile)或仅显示Z-异构体的略微增加，无论所述番茄红素源是衍生物(如沙司)或提取物。已知众多加工法例如热加工法促进异构化。Shi等在食品加工工程杂志(Journal of Food Process Engineering)2003，25，485-498中证实Z异构体的增加可以通过加热番茄沙司(tomatosauces)而实现。然而，某些番茄红素异构体不是稳定的并且易于反回异构化(retro-isomerisation)。根据文献，5-Z是优势番茄红素异构体中最稳定的，随后是全-E、9-Z和13-Z。因此，基于异构化番茄红素的产物的稳定性取决于其番茄红素异构体分布图并且因此可以通过影响这种分布图的技术工艺法加以调整。
已知番茄红素的热异构化作用改善其自食物基质的生物利用率。然而，仍没有研究各种番茄红素异构体的生物利用率。就稳定性而言，可以推断基于番茄红素的产物的生物利用率取决于其番茄红素异构体分布图并且因此可以通过技术措施加以调整。
已经存在提出技术措施及配方以改善番茄红素生物利用率的专利。例如，WO2005/075575提供了有效提高番茄红素的生物利用率的富含Z-异构体的初级组合物。
EP 1103579披露了用于通过回流乙醇提取番茄红素的方法：该方法短时间地实施(30分钟)，从而没有明显的异构化出现。实际上，想要天然的全-Z番茄红素作为终产物。
WO 96/13178披露了用于制备稳定的番茄红素浓缩物的方法：然而，没有观察异构化对稳定性的影响，而相反，所披露方法通过使用低于50℃的温度持续几分钟，例如10分钟，而尝试避免异构化。
EP 1201762涉及含有番茄红素的产物，其中番茄红素处于其天然的全反形式。由于任何热加工法(溶解和浓缩)以最短的可能时间实施(小于1小时)，故没有发生明显的异构化。
KR 2005006592披露了制备具有提高的抗氧化活性的番茄红素-锌络合物。在溶剂不存在下应用加热以破坏植物材料的细胞壁。未长时间加热(prolonged heating)并且无异构化发生。
WO 03/079816披露了用于制备具有高含量番茄红素的番茄提取物的方法，其中提取法在室温实施。
US 5,837,311和WO 97/48287披露了用于制备含油树脂的方法，其中所述含油树脂具有高含量的番茄红素和令人满意的稳定性。后一特征通过含油树脂自身中存在的磷脂及甘油酯获得。没有提到番茄红素的异构体组成及其对稳定性的影响。实施热提取法以使番茄红素的产率最大化，但是该方法持续时间不超过1.2小时。仅在任何溶剂不存在下实施对番茄的加热预处理以提高果肉-浆液分离。
WO 2005/075575解决了提高番茄油树脂(tomato oleoresins)中顺-异构体含量的问题：异构化尤其通过短时间热处理获得。然而，获得的产物含有大量不稳定的13-顺异构体。
EP 0937412披露用于制备精细分开的粉状类胡萝卜素制备物的方法，所述方法包括在溶剂存在下持续极短时间(5秒)的加热步骤。
US 5,858,700涉及用于分离和纯化番茄红素晶体的方法，该方法的特征是水解杂质如甘油酯和磷酸酯。水解在高温实施，但持续短于2小时，之前任选地是使用回流溶剂的提取步骤，不过总是持续短暂时间以防止番茄红素降解。
US 6,235,315披露稳定的粉状番茄红素制剂，其特征在于番茄红素具有某种程度的结晶度和最低可能的异构化程度。
WO 03/090554披露具有高含量番茄红素和预定黏度与含糖量的浓缩的番茄衍生物。所述方法是物理方法并且没有使用溶剂。在圆番茄上实施加热1-6分钟以使果肉更容易分离。
Mayer-Miebach等“胡萝卜的热加工法：相对于抗氧化潜力的番茄红素稳定性和异构化(Thermal processing of carrots：lycopene stability andisomerisation withregard to antioxidant potential)”国际食品研究(FoodResearch International)，Elsevier Applied Science，Barking，GB，第38卷，第8-9号，2005年10月，第1103-1108页，研究了冻干胡萝卜中番茄红素异构化与温度的关系。作者的结论是仅全-反异构体对长时间加热是稳定的，从而导致顺-异构体减少。
因此，事实上，现有技术没有提供番茄红素的异构化方法，其中所述的异构化方法包括在有机溶剂中长时间加热，从而允许获得具有高的生物利用率及稳定的异构体组成的产物。
发明概述
已发现各种Z-番茄红素异构体的稳定性是彼此不同的；尤其，13-Z番茄红素的稳定性比5-Z或9-Z或全-E异构体的稳定性低得多。因此，本发明的初级组合物必须尽可能低地具有13-Z异构体水平以表现最佳的稳定性。也已经证实番茄红素的一些Z异构体(例如5-Z和9-Z)增强了含有番茄红素的组合物的生物利用率。因此，初级组合物必须主要含有5-Z异构体或9-Z与5-Z异构体的组合以提供改善的生物利用率和生物效力。
因此，本发明的第一目的是提供这样的初级组合物，其具有富含番茄红素Z异构体的特定混合物的至少一种含番茄红素材料，所述的含番茄红素材料含有比13-Z异构体的重量百分数大的选自5-Z、9-Z和其组合的异构体的重量百分数。
在一个实施方案中，本发明提供在食品、在食物增补剂、在化妆制品或在药物制品中含有所述初级组合物的口服组合物。
在一个实施方案中，本发明提供所述初级组合物作为用于口服施用的食品中的添加剂，其中所述食品如营养组合物、食物增补剂、宠物食品、化妆制品或药物制品。
在一个实施方案中，本发明提供制造所述初级组合物或含有该初级组合物的食物增补剂、化妆制品或药物制品的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供如上所述的初级组合物的用途，用于制备意在改善皮肤健康、尤其用于皮肤的光保护或用于保护皮肤组织抵抗老化的口服组合物、化妆品组合物或药物组合物。
在一个备选的实施方案中，本发明提供所述初级组合物的用途，用于制备预防或治疗心血管疾病或癌症的口服组合物、化妆品组合物或药物组合物。
本发明的优势是提供含有显示较高稳定性、生物利用率和生物效力的番茄红素Z异构体的组合物。
其它特点和优势在本文中描述，并且将从以下详细描述和附图显而易见。
附图简述
图.在消费含有25mg总番茄红素的标准餐后，TRL的血浆番茄红素/甘油三酯的曲线下面积(AUC)，其中所述的总番茄红素来自番茄酱(全-E番茄红素)或富含5-Z番茄红素的番茄油树脂(5-Z含油树脂)或富含13-Z番茄红素的番茄油树脂(13-Z含油树脂)或富含9-Z和13-Z番茄红素的番茄油树脂(9-Z与13-Z含油树脂)。
发明详述
本发明总体上涉及提供健康益处的组合物。更具体地，本发明涉及可以用来改善皮肤和毛发的有益营养组合物和有关所述组合物的方法。
本发明现在使消费者能够从天然产物中获得改良的组合物。所述初级组合物提供处在特别高的生物可利用形式和/或生物有效形式的番茄红素。
在优选的实施方案中，本发明提供具有如此异构体比例的番茄提取物或其衍生物，其中所述的异构体比例与目前可获得的产品中天然存在的异构体的比例不同。具体地，本发明涉及这样的提取物或衍生物，其E异构体含量不高于番茄红素总含量的60％、优选E异构体含量不高于番茄红素总含量的40％(HPLC法)。
在一个实施方案中，本发明提供含有Z异构体的特定组合的初级组合物。优选地，在本发明初级组合物中的Z/E异构体比例应当高于1。
此外，该组合优选地富含5-Z和9-Z并且匮乏13-Z。在优选的实施方案中，5-Z和9-Z的量大于番茄红素总含量的30％、优选大于40％、最优选大于50％。另外，13-Z的量小于番茄红素总含量的10％、优选小于番茄红素总含量的5％、最优选小于3％。例如通过增加特定的5-Z和9-Z异构体和/或减少13-Z异构体，可以获得生物可利用性更大及生物有效性更高的稳定形式的初级组合物。另外，本发明的提取物或衍生物在常见贮藏条件下是稳定的并且不发生反回异构化。在普通保护条件下(避光和避氧)，番茄红素总含量和E异构体含量保持恒定。E异构体含量不升高，即便提取物保持在室温下也是如此。
这种分布图(即低量的番茄红素13-Z异构体)可以例如通过利用在固体基质如粘土上催化番茄红素异构化或通过长时间加热而获得。
在一个实施方案中，含番茄红素的材料可以例如为提取物、浓缩物或含油树脂的形式。在本说明书中，术语“含油树脂”应当理解为意指含番茄红素材料的脂类提取物，所述的脂类提取物可能包括其它类胡萝卜素、甘油三酯、磷脂、生育酚、生育三烯酚、植物甾醇和其它较不重要的化合物。已经出人意料地发现可以通过降低13-Z异构体含量使异构化的番茄油树脂中番茄红素的反回异构作用最小化。
在一个实施方案中，含番茄红素的材料可以是提取物、浓缩物或含油树脂，其从植物或植物材料、微生物、酵母或动物源产物中获得、提取、富集或纯化。如下所述，该材料还受到处理以增加番茄红素的Z异构体含量。
若番茄红素源是植物来源，则该植物来源可以是蔬菜、叶、花、果实和植物的其它部分。在优选的实施方案中，番茄红素源是番茄(即完整番茄、番茄提取物、番茄果肉、番茄果泥、番茄皮，带有或不带种子)。例如通过如此方式可获得合适的植物或蔬菜浓缩物，即通过干燥或冻干新鲜收割的植物或蔬菜或相应的根、果实或其种子并随后任选地磨碎或轧碎干燥的材料。获得上文所提及的植物或蔬菜的提取物的合适方法是本领域已知的。可以例如通过用水或用一种或多种食品级溶剂或用水与一种或多种食品级溶剂的混合物提取新鲜收割或加工的植物或蔬菜或相应的根、果实或其种子而获得植物或蔬菜提取物。优选地，本发明的提取物和浓缩物可以是脂质的或水质的。因为类胡萝卜素是脂溶性的，故用水提取将除去不想要的水溶性成分，例如，糖、氨基酸、可溶性蛋白和/或有机酸。
若含番茄红素的材料从微生物获得，可以使用产生番茄红素的任何微生物，尤其是益生微生物，例如乳酸细菌。另外，动物源的产物可以来自例如鲑鱼(salmon)、虾(shrimp)、磷虾(krill)或肝提取物或乳部分(milk fraction)。在本说明书中，术语“乳部分”应当理解成意指乳的任何部分。
在一个备选实施方案中，含番茄红素的材料可以是含油树脂。用于从以上提及的植物或蔬菜获得含油树脂的合适方法是本领域熟知的。例如，含油树脂可以使用食品业、化妆品或药物容许的溶剂通过脂质提取法(lipidic extraction)获得。通过常规方法制备的含油树脂具有约0.05％至50％重量的番茄红素含量。番茄红素的全-E异构体含量通常高于Z-异构体含量，例如，番茄红素的Z/E异构体在所选番茄油树脂中的比例是约7∶93。
含油树脂是用于获得本发明初级组合物的优选初始材料，因为它们含有也使所述组合物稳定的其它类胡萝卜素或抗氧化剂如维生素E。可以改善含油树脂中番茄红素化合物的生物活性和稳定性，尤其在异构化过程期间并且也可以提高初级组合物中Z番茄红素的产率。
含番茄红素的材料优选地包括胡萝卜素和叶黄素例如玉米黄素、虾青素、β-隐黄素、辣椒红素、角黄素、叶黄素和其衍生物例如酯。番茄红素化合物已经受到处理以增加初级组合物中的Z异构体部分。
为了获得这种异构体分布图，提取物、浓缩物或含油树脂形式的含番茄红素材料通过使用中性、酸性或碱性固体催化剂(例如粘土、沸石、分子筛、离子交换剂)进行异构化以产生具有高Z/E比例的混合物。旨在富集番茄红素Z-异构体的固体催化剂的使用不污染和危害食物，因为该催化剂可以方便地通过简单的过滤或离心法除去。另外，固体催化剂与其它常用手段(例如热、光和辐射引发剂)的组合可以进一步增强几何异构化。
在另一个实施方案中，本发明的提取物或衍生物可以从番茄、番茄部分(如果皮)、衍生物(如沙司和浓缩物)或提取物开始进行制备。异构化通过在溶剂中长时间加热而实施。鉴于可以从“发明背景”部分所讨论的现有技术获得相反的教导这一角度来看，这种研究结果是令人惊讶的。
尤其，当使用番茄或其衍生物作为原材料时，它们可以用能够提取番茄红素的溶剂处理。随后加热所得的提取物，除去溶剂，因此回收异构化的提取物。
在另一方面，当使用提取物或衍生物作为原材料时，将其溶解在溶剂中，将混合物加热合适的时间，随后除去溶剂，因此回收异构化的提取物。可以用于异构化步骤的溶剂是烃、氯化烃、酯、酮、醇；尤其是C3-C10脂族烃、C1-C3氯化溶剂、C3-C6酯、C3-C8酮和C1-C8醇；更尤其地是己烷、四氯化碳、乙酸乙酯、丙酮和丁醇.在50-150℃、优选在温度60-130℃实施在溶剂中的异构化。异构化时间是4至240小时、优选是10至180小时。
初级组合物中的Z/E异构体比例可以增加至至少20∶80、优选地20∶80至95∶5，更优选地30∶70至90∶10。在优选的实施方案中，(5Z+9Z)/E比例高于1，并且部分地除去13Z。
在一个实施方案中，本发明提供了粉末、液体或凝胶形式的包含番茄红素化合物的初级组合物，该初级组合物比单独的番茄红素化合物具有更好的生物利用率和/或生物效力。另外，当选择粉末形式时，该初级组合物可以为高度水分散性组合物形式。在这种情况下，粉末是在室温可分散于水中的。该初级组合物也提供这样的类胡萝卜素，其在脂类和有机溶剂中处于特别高的可溶性形式、较不易于结晶并具有更低的聚集倾向。
在本发明的另一个实施方案中，初级组合物可以单独地或与其它活性化合物组合地使用，其中所述活性化合物例如是维生素C、维生素E(生育酚和生育三烯酚)、类胡萝卜素(胡萝卜素、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄素等)、泛醌(例如CoQ10)、儿茶素(例如表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate))、含有多酚和/或二萜(例如咖啡豆醇(kawheol)和咖啡醇)的咖啡提取物、菊苣(chicory)提取物、银杏(Ginkgobiloba)提取物、富含原花色素的葡萄或葡萄籽提取物、香辛料提取物(例如迷迭香)、含有具备抗氧化活性的异黄酮和相关植物雌激素和其它类黄酮源的大豆提取物、脂肪酸(例如n-3脂肪酸)、植物甾醇、益生纤维、益生微生物、牛磺酸、白藜芦醇、氨基酸、硒和谷胱甘肽前体或蛋白质，例如乳清蛋白。
初级组合物可以额外地包含一种或多种的乳化剂、稳定剂和其它添加剂。在食品领域中相容的乳化剂例如是磷脂、卵磷脂、失水山梨醇聚氧乙烯醚单硬脂酸酯或三硬脂酸酯、单月桂酸酯、单棕榈酸酯、单油酸酯或三油酸酯；甘油单酯或二酯。可以添加任何类型在食品行业、在化妆品或在药物中已知的稳定剂。可以添加在食品行业、在化妆品或在药物中已知的香料、着色剂和任何其它合适的添加剂。可以根据初级组合物的最终用途添加这些乳化剂、稳定剂和添加剂。
在一个备选实施方案中，本发明提供在食品、在食物增补剂、在宠物食品、在化妆制品或在药物制品中包含上文所述初级组合物的口服组合物。
在优选的实施方案中，用于人类消费的食物组合物可以由所述初级组合物增补。这种食物组合物可以例如是营养完全的配方食品(nutritionalcomplete formula)、奶产品、冷冻或贷架稳定的饮料、矿泉水、液体饮料、汤、膳食补充剂(dietary supplement)、代用餐(meal replacement)、营养棒(nutritional bar)、糖果、乳产品或发酵乳产品、酸乳、乳粉(milkbased powder)、肠营养产品(enteral nutrition product)、婴儿配方食品、婴儿营养产品、谷物产品或基于发酵谷物的产品、冰淇凌、巧克力、咖啡、烹调用的产品如蛋黄酱、番茄浆(tomato puree)或沙拉酱或者宠物食品。
为了用在食物组合物中，可以将该初级组合物添加至以上提及的食品或饮料中，从而获得约0.001至50mg的在初级组合物中所含番茄红素的日摄入量。优选地考虑每日约5至20mg的日摄入量。
口服施用的营养补充剂可以于胶囊、明胶胶囊、软胶囊、片、糖衣片、丸、糊或锭、树胶或可饮用溶液或乳液、糖浆或凝胶中，具有约0.001％-100％初级组合物的剂量，它们可以用水直接服用或通过其它方式服用。这种补充剂也可以包含甜味剂、稳定剂、添加剂、香料或着色剂。用于化妆目的的补充剂可以额外地包含对皮肤有活性的化合物。应当理解该补充剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生。
在另一个实施方案中，可以施用含有所述初级组合物的药物组合物用于预防性治疗和/或治疗性治疗，其量足以治愈或至少部分地阻止疾病和其并发病的症状。在本说明书中，足以实现该目的的量定义为“治疗有效量”。对此有效的量将取决于疾病的严重程度和患者的体重及总体状况。
在预防性应用中，本发明的初级组合物可以施用至易感特定疾病或存在患特定疾病风险的患者。这种量定义为“预防有效量”。在该用途中，精确的量也取决于患者健康状况和体重。
在一个备选的实施方案中，本发明的初级组合物可以随可药用的载体一起施用，载体的性质随施用模式如肠胃外、静脉内、口服或局部(包括眼用)途径的不同而不同。可以使用多种赋形剂产生想要的制剂，其中所述的赋形剂包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠纤维素、碳酸镁。药物组合物可以是片剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、干燥口服补充剂、湿式口服补充剂。
优选地，对于人类而言，本发明的药物组合物可以包含用于每日施用的如上所述量的初级组合物，从而番茄红素的量是约0.01mg-100mg。当每日向宠物施用时，番茄红素的量可以是约0.01mg-100mg。
将理解的是基于自身知识，技术人员将选择适宜的成分和植物制剂形式以在考虑施用途径下将活性化合物靶向到目的组织，例如皮肤、结肠、胃、肾脏或肝脏，其中所述的施用途径可以是注射、局部应用、鼻内施用、通过植入的或经皮持续释放系统而施用等。
在另一个实施方案中，本发明提供包含上文所述初级组合物的化妆品组合物。该化妆品组合物可以配制在例如洗液、香波、霜膏、防晒剂、日晒后霜(after-sun cream)、抗老化霜和/或油膏中。优选地，初级组合物的含量可以是化妆品组合物的10-10％-10％重量。更优选地，化妆品组合物包含10-8％-5％重量的番茄红素。可以局部施用的化妆品组合物可以额外地包含可用在化妆品中的脂肪或油，例如在华盛顿CTFA工作组《化妆品成分手册》(Cosmetic Ingredients Handbook，Washington)中提到的那些脂肪或油。
本发明的化妆品组合物也可以包括任何其它合适的化妆活性成分。所述组合物额外地包含结构剂(structuring agent)和乳化剂。其它赋形剂、着色剂、芳香剂或遮光剂也可以添加到化妆品组合物中。将理解本发明的化妆产品会含有技术人员已知的不同成分的混合物，从而确保目的物质快速进入皮肤并且防止其在贮藏期间降解。
也应当理解本发明的概念可以同样适用于在目前所用药物中起辅助作用的辅佐疗法。因为本发明的初级化合物可以与食物材料一起容易地施用，故可以使用含有大量所述初级组合物的专用临床食品。应当明白当阅读本说明书连同附带的权利要求时，技术人员将针对本文中提到的备选实施方案构思多种不同的替代方案。
本发明还涉及初级组合物或者上文所述的口服组合物或化妆品组合物用于制备产品的用途，其中所述的产品意图保护皮肤组织抗衰老、尤其用于抑制胶原酶并增强胶原合成而抑制对皮肤和/或粘膜的损伤。实际上，如上所述初级组合物的使用例如可以增强番茄红素化合物在体内的生物利用率和延缓皮肤衰老。该初级组合物也可以用于预防或治疗敏感性、干性或反应性皮肤，或用于改善皮肤密度或结实度、用于改善皮肤光保护、用于预防或治疗心血管疾病或病症和癌症。它们还具有对伴侣动物毛发和被毛的特别的益处，如改善毛发或被毛密度、纤维直径、颜色、油性(oilness)、光泽度并有助于预防毛发或被毛丢失。
本发明初级组合物对人或宠物皮肤的积极效果可以通过使用常规方法例如最小红斑量法(minimal erythemal dose(MED))、比色法、经表皮失水率法、DNA修复法、白细胞介素和蛋白聚糖产生测量法、或胶原酶活性法、屏障功能法(barrier function)或细胞更新法或超声回声深度记录器(ultrasonic echograph)进行测量。
实施例
实施例1：研究番茄红素异构体的稳定性
在有机溶剂和在番茄提取物中评价番茄红素异构体的稳定性
材料
富含番茄红素的番茄油树脂获自Indena s.p.a.(意大利，米兰)。其番茄红素总含量等于9.1％，其中全-E和5-Z异构体分别占93.5％和6.5％。通过加热番茄油树脂在乙酸乙酯中(1∶10w/w)的混悬液1小时或48小时而制备两种异构化含油树脂。在室温冷却后，将混悬液离心并且通过在减压下蒸馏而除去所回收上清液中的乙酸乙酯。
二-叔丁基-羟基-甲苯(BHT)和N-乙基二异丙胺来自Fluka AG。全部溶剂均是HPLC级并且无需纯化即可用。
分离纯的番茄红素异构体
通过HPLC分离后收集含有相应峰的级分(见下文实验条件)而从异构化番茄油树脂(进行了1小时加热)中分离到纯的5-Z、9-Z、13-Z和全-E番茄红素。在两次连续HPLC运行期间收集各峰并且合并相应的级分。
番茄红素分析
总番茄红素的量通过反相HPLC在C18预装柱(ODS Hypersil，5μm，20×4mm；HewlettPackard，Geneva，Switzerland)和C18柱(Nova pak，3.9μm i.d.×300mm长度，Millipore，Volketswil，Switzerland)。在室温在无梯度条件下用由乙腈/四氢呋喃/甲醇/乙酸铵1％(533.5∶193.6∶53.7∶28，wt/wt/wt/wt)组成的流动相进行分离。流动相流速是1.5mL/分钟。
通过正相HPLC根据Schierle等(Schierle，J.，Bretzel，W.，Bühler，I.，Faccin，N.，Hess，D.，Steiner，K.，Schuep，W.(1997).Food.Chem.59：459)描述的方法确定番茄红素异构体分布图。将异构化含油树脂的样品溶解在含有50ppm BHT的正己烷并且在EppendorfLab离心机中以最大速度离心。所得的上清液立即通过HPLC进行分析。所用的HPLC系统是1100系列Hewlett-Packard型号，配备有紫外-可见光光电二极管阵列探测器。同时获得在470nm、464nm、346nm和294nm处的数据。使用三个Nucleosil 300-5柱(4mm内径×250mm长度，Macherey-Nagel)的组合分离样品(10μL)。在室温在无梯度条件下用由正己烷与0.15％N-乙基二异丙胺组成的流动相进行分离。流速是0.8mL/分钟。根据文献数据鉴定番茄红素Z-异构。
基于HPLC峰的表面积，使用与全-E番茄红素相同的消光系数计算番茄红素异构体的量。因此，在含有Z-异构体的产物中的番茄红素浓度被略微低估，因为已知Z-异构体的消光系数低于全-E异构体的消光系数。
稳定性试验的条件
在正己烷中和在番茄油树脂中研究番茄红素异构体的稳定性，其中所述的番茄油树脂通过在乙酸乙酯中加热4小时加以异构化。为此目的，将纯的番茄红素异构体在正己烷中于室温避光贮存33日，并且异构化的番茄油树脂在室温避光保存55日。在贮藏期间在各种时间间隔上测量总番茄红素浓度和番茄红素异构体分布图。
结果
番茄红素异构体在正己烷中的稳定性
在表1中报道了纯的番茄红素异构体在贮藏期间在正己烷中于室温在避光下的稳定性试验的结果。全部异构体，即包括的全-E异构体在贮藏期间发生几何异构化。13-Z是稳定性较低的异构体：而小于50％的5-Z、9-Z和全-E番茄红素在贮藏33日后被转化，多于80％的13-Z番茄红素在该时段期间转化成其它异构体。另外，与其它Z-异构体相比，13-Z番茄红素的转化途径是不同的：13-Z异构体主要转化成全-E异构体，而5-Z和9-Z异构体在贮藏期间于正己烷中主要转化成其它Z-异构体。
表1：纯的番茄红素异构体在正己烷中于贮藏期间在室温的稳定性。
番茄红素异构体在番茄油树脂中的稳定性
在表2中报道了在乙酸乙酯中加热48小时的番茄油树脂中番茄红素异构体的稳定性试验的结果。
表2：番茄红素异构体在异构化番茄油树脂中在贮藏期间于室温的稳定性(n＝2)。
贮藏时间(日) 总番茄红素(mg/g) 13-Z％ 9-Z％ 全-E％ 5-Z％
0 055.6±3.0 17.4±0.4 32.7±0.7 18.7±0.6 12.0±0.4
3 56.6±0.8 12.4±0.1 31.4±0.3 25.6±0.5 13.0±0.1
5 58.7±0.4 9.5±0.0 30.6±0.5 30.6±0.6 14.0±0.4
7 59.2±0.1 7.3±0.2 30.9±0.7 32.9±0.3 14.4±0.2
11 59.3±0.8 5.2±0.1 29.4±0.0 36.5±0.1 15.0±0.1
17 60.1±0.9 3.3±0.4 29.0±0.4 38.9±0.4 15.4±0.4
20 58.8±0.9 2.9±0.3 29.2±0.4 39.9±1.3 15.2±0.6
34 51.3±7.7 2.2±0.1 30.0±0.1 40.1±0.7 14.1±1.0
47 53.9±1.2 1.9±0.6 30.0±0.3 41.4±0.7 14.6±1.3
番茄红素总含量在贮藏期间在室温是稳定的。然而，番茄红素异构体分布图明显改变，13-Z番茄红素含量下降并且全-E番茄红素增加。9-Z和5-Z番茄红素的含量在贮藏时间期间维持稳定。
结论
两个稳定性试验已经证实13-Z番茄红素的稳定性比5-Z或9-Z或全-E异构体的稳定性低得多。因此，具有低水平13-Z番茄红素的异构化番茄油树脂应当显示番茄红素异构体分布图的良好稳定性。
实施例2：具有提高的生物利用率的异构化番茄油树脂
目的：
本研究的目的是研究多种Z-番茄红素异构体在人类中的生物利用率。为阐明特定Z-番茄红素异构体在人类中的生物利用率，已经使番茄油树脂富集不同的Z-番茄红素异构体，达到约60％的总番茄红素含量，即一种番茄油树脂富含5-Z番茄红素，另一种番茄油树脂富含13-Z番茄红素并且最后一种番茄油树脂富含9-Z番茄红素与13-Z番茄红素的混合物。
材料和方法
受试者
30名健康人登记参与本项研究。招收标准是受试者应当是非素食者和非吸烟者并且他们没有代谢疾病如糖尿病；高血压；肾脏、肝脏或脾脏疾病；或溃疡。受试者具有正常血脂血，即他们具有小于5.0的血浆胆固醇对HDL胆固醇比例以及小于1.5mmol/L的血浆三酰基甘油(TAG)浓度。因为研究期间抽取大量的血液，因此要求受试者具有大于13g/dL的血液血红蛋白浓度。如果受试者在本研究开始前3个月至本研究结束时使用改变胆固醇的药物或接受低血脂治疗或服用维生素和矿物质补充剂或者已经做过重大胃肠道手术；剧烈运动如跑马拉松和每日消费多于2玻璃杯葡萄酒(3dL)、多于2杯啤酒(3dL)或多于1玻璃杯(小玻璃杯)烈性酒，则本研究排除该受试者。30名志愿者中的27位完成4个食后测试(post-prandial test)。三位志愿者出于以下原因在结束前放弃试验：不可获得性、与眼伤有关的医学治疗、与消费油腻餐食有关的恶心。受试者年龄是24±1岁，体重是70±1kg并且身体质量指数(body mass index；BMI)是22.5±0.3kg/cm2。
方案经马赛伦理委员会(法国马赛)批准。受试者接受关于背景和研究设计的信息并且在参与之前提供书面的知情同意书。他们可在任何时间自由退出本研究。
研究设计
本研究是双盲、随机化、4时期、4处理交叉临床试验，具有最小3周的清除期。在禁食过夜后，受试者抵达马赛大学临床药理学和治疗试验中心(Clinical Pharmacology andTherapeutic Trial Center of University ofMarseille)并且消费标准餐，所述的标准餐由掺入与(用200mL自来水烹煮的)70g粗小麦面粉(wheat semolina)混合的40g花生油的25mg番茄红素组成。此外，他们消费40g面包、60g煮鸡蛋的蛋白、含有5g白糖的125g酸奶并饮用330mL水(Aquarel，Nestlé)。该标准餐提供842千卡(3520kJ)热量，具有以下营养组成：蛋白质(11.7％)、糖类(39.3％)和脂类(49.0％)。在15分钟内吃完该饮食。在随后六小时不允许吃其它食物，不过允许受试者在吸收后(post-absorption)的最后3小时期间饮用至多一瓶水(330ml)(Aquarel，Nestlé)。
番茄红素补充剂
测试四种不同番茄产物，对其中每种提供25mg总番茄红素。这些产物由以下物质组成：
●含有大部分处于全-E构型的番茄红素的番茄酱(Thomy，Switzerland)。
●富含5-Z番茄红素的番茄油树脂
●富含13-Z番茄红素的番茄油树脂
●富含9-Z与13-Z番茄红素的混合物的番茄油树脂
表3提供这四种番茄产物的番茄红素含量以及番茄红素异构体分布图。
表3：四种番茄产物中总番茄红素及全-E和Z-番茄红素异构体的总量
全-E(总番茄红素的％) 5-Z(总番茄红素的％) 9-Z(总番茄红素的％) 13-Z(总番茄红素的％) X＊-Z(总番茄红素的％)
番茄酱 94.9 4.1 nd 0.1 nd
5-Z 33.4 65.3 1.3 nd nd
13-Z 29.3 7.6 9.6 41.5 12.0
9-和13-Z 27.7 7.7 30.8 23.5 10.2
＊未鉴定的番茄红素异构体是从HPLC色谱图中相应的峰面积计算的未知番茄红素异构体的汇集物。
血样的收集
将空腹血液(Fasting blood)通过静脉穿刺术从肘前静脉抽取至含有EDTA/K3钾的真空管内，其中所述的真空管立即置于冰水浴内并用铝箔覆盖以避免暴露于光线。空腹血样在消费标准餐前即20分钟和5分钟前以及在吸收后2小时、3小时、4小时、5小时、6小时进行收集。含有血液的管避光保护，贮存在4℃并且随后在2小时内离心(10分钟，4℃，2800转/分钟)以分离血浆。添加抑制剂混合物(10μL/mL)(Cardin等，人血浆低密度脂蛋白的载脂蛋白B-100被组织和血浆激肽释放酶的降解(Degradation of apolipoprotein B-100of human plasma low densitylipoproteins by tissue and plasma kallikreins)，Biol Chem 1984；259：8522-8)。
血浆甘油三酯丰富的脂蛋白(TRL)的分离
在消费油腻饮食后，食物亲脂分子掺入乳糜微粒，后者分泌至血液中。脂蛋白基于其密度通过超速离心法分离。因为乳糜微粒(0.95g/ml)与VLDL(1.006g/ml)的密度非常相似，不可能将它们相互分开，将它们共同收集在称作甘油三酯丰富的脂蛋白(TRL)的级分中。然而，在食后状态下，这种血浆TRL级分主要含有从肠分泌的乳糜微粒，这是对小肠生物利用率的优异评估法。
带少量VLDL的主要含有乳糜微粒的甘油三酯丰富的脂蛋白(TRL)立即如下通过超速离心法分离：将6mL血浆用0.9％NaCI溶液覆盖并且在L7超速离心机(Beckman)中于SW41TI转头(Beckman)内，在10℃以32,000转/分钟超速离心28分钟。离心后立即将TRL等分分装并且在分析性测定前贮存在-80℃。番茄红素分析在10日内进行，并且三酰基甘油分析在30日内进行。
分析性测定
通过酶方法和比色法，使用商业试剂盒(Kit Bio-Mérieux)测定甘油三酯。
总番茄红素和番茄红素异构体分布图分别通过反相和正相HPLC方法确定(M.Richelle，K.Bortlik，S.Liardet，C.Hager，P.Lambelet，L.A.Applegate，E.A.Offord，J.Nutr.(2002)132，404-408)。番茄红素总含量计算为5-Z、9-Z、13-Z、x-Z和全-E-番茄红素异构体的总量。由于全部各种Z-番茄红素的精确值仍未知，故使用全-E番茄红素的消光系数定量番茄红素异构体。番茄红素异构体的分布图通过以百分数表述的各种番茄红素异构体对总番茄红素的比例确定。
统计分析
番茄红素生物利用率通过测量在TRL-时间曲线中的番茄红素浓度下的面积(AUC)进行评估。在0-6小时期间使用梯形法计算该面积(AUC(0-6小时))。数据显示为均值±SEM。基线浓度是在两份血浆样品中所测量浓度度的平均数，其中所述的血浆样品在消费含有来自番茄基质的25mg番茄红素的标准餐前收集。对于每位受试者和每个番茄红素处理，通过从每个吸收后时间点处所测量的浓度值减去基线浓度而进行AUC(0-6小时)的计算。若该值为负数，则认为它是零。
对于每个处理，若AUC0-6小时的分布在存在或不存在对数转换下是正态的(Skewness和Kurtosis检验)，则通过使用线性混合模型，以处理作为固定效应并且以受试者作为随机效应进行比较。
全部统计分析用SAS软件(版本8.2；SAS Institute，Cary，NC)进行。统计检验中的舍弃水平是5％。
结果
番茄红素生物利用率
因为四种番茄处理物诱导甘油三酯分泌程度的变异，故番茄红素生物利用率已经使用甘油三酯吸收率(AUC(0-6h))进行归一化。
归一化的番茄红素生物利用率在四种番茄处理物之间显著不同(图)。
出人意料地，来自富含5-Z番茄红素的番茄油树脂的番茄红素比来自其它三种处理物(即番茄酱、富含13-Z番茄红素的番茄油树脂以及富含13-Z和9-Z番茄红素的混合物的番茄油树脂)的番茄红素具有约2倍的更好生物可利用性(p＜0.0001)(图)。
而来自番茄酱与来自13-Z及9-Z混合物的番茄油树脂中的番茄红素具有相似的生物可利用性。
与番茄酱相比，以13-Z番茄红素存在的番茄油树脂中的番茄红素显示轻微但是显著较低的生物利用率(p＜0.03)。
结论
这些结果表明番茄红素分子的构型显著影响胃肠道中番茄红素的运输并且因此显著影响吸收的番茄红素的量。来自富含5-Z番茄红素的番茄提取物的番茄红素生物利用率约两倍于来自番茄酱的番茄红素生物利用率。相反，存在于富含9-Z与13-Z番茄红素的混合物的番茄提取物中的番茄红素与番茄酱中存在的番茄红素具有相似的生物可利用性，而富含13-Z番茄红素的番茄油树脂提供生物可利用性略低的番茄红素。几位作者已经指出番茄产品中Z-番茄红素的存在与番茄红素生物利用率增加相关。这项研究首次证实番茄红素生物利用率的增强特异地与番茄红素构型相关，即5-Z番茄红素＞9-Z番茄红素＞13-Z。
实施例3：在乙酸乙酯中的提取和异构化
将52kg含有100ppm番茄红素的新鲜番茄切碎并均化。将水部分在减压下蒸馏除去以获得18kg番茄浓缩物。这种浓缩物用36L水饱和的乙酸乙酯提取；在提取期间，将混合物维持在室温，避光并搅拌2小时。随后提取物从番茄浓缩物中分离。以上所述方法对这种番茄浓缩物重复两次，总共使用108L溶剂。将合并的提取物在分液漏斗中用27L水洗涤。随后弃去水相而将有机相在减压下浓缩以获得具有10％w/v干残余物的混悬液；这种干残余物具有9.1％w/w的番茄红素总含量和0.46％w/w的Z异构体含量。将这种混合物在搅拌下回流(76℃)7日，随后在减压下浓缩至干燥。
获得46.8g最终提取物，其具有9％w/w的番茄红素总含量和5.59％w/w的Z异构体含量；特别地，E异构体含量是3.41％w/w并且13-Z异构体含量是0.16％w/w。该提取物的HPLC分布图在图中报告。
实施例4：在己烷中的提取和异构化
将10kg含有140ppm番茄红素的新鲜番茄切碎并均化。将水部分在减压下蒸馏除去以获得2.5kg番茄浓缩物。这种浓缩物用12.5L己烷提取；在提取期间，将混合物维持在室温，避光并搅拌2小时。随后提取物从番茄浓缩物中分离。以上所述方法对这种番茄浓缩物重复一次，总共使用25L溶剂。将提取物合并，并在减压下浓缩以获得具有10％w/v干残余物的溶液；这种干残余物具有9.1％w/w的番茄红素总含量和0.46％w/w的Z异构体含量。将这种混合物在搅拌下回流(69℃)6日，随后在减压下浓缩至干燥。获得16.5g最终提取物，其具有9.1％w/w的番茄红素总含量和5.62％w/w的Z异构体含量；特别地，E异构体含量是3.38％w/w并且13-Z异构体含量是0.18％w/w。
实施例5：在丁醇中异构化
将10kg含有90ppm番茄红素的新鲜番茄切碎并均化。将水部分在减压下蒸馏除去以获得3.4kg番茄浓缩物。这种浓缩物用7L水饱和的乙酸乙酯提取。在提取期间，将混合物维持在室温，避光并搅拌2小时。随后从番茄浓缩物中分离提取物。以上所述方法对这种番茄浓缩物重复两次，总共使用21L溶剂。将合并的提取物在分液漏斗中用5.3L水洗涤。随后抛弃水相而将有机相在减压下浓缩至干燥。具有7.8％w/w的番茄红素总含量和0.40％w/w的Z异构体含量的干残余物(9.8g)悬浮在98ml正丁醇中。将所述混合物保持在130℃于搅拌下持续4小时，随后在减压下浓缩至干燥。获得9.8g最终提取物，其具有6.35％w/w的番茄红素总含量和4.50％w/w的Z异构体含量；尤其，E异构体含量是1.85％w/w并且13-Z异构体含量是0.47％w/w。
实施例6：在固体催化剂上的异构化
材料
富含番茄红素的番茄油树脂获自Indena s.p.a.(意大利，米兰)。其番茄红素总含量等于9.1％，其中全-E和5-Z异构体分别占93.5％和6.5％。
方法
将番茄油树脂在乙酸乙酯(1∶100w/w)中的混悬液过滤并且在恒定搅拌下在室温与5％固体催化剂孵育2小时。将混合物在Eppendorf Lab离心机中以最大速度离心并且将一等份的上清液在N2下蒸发并且重悬于正己烷/BHT中。
番茄红素分析
总番茄红素的量和番茄红素异构体分布图分别通过反相和正相HPLC方法在实施例1中所述的分析条件下确定。
结果
在表4中报道了在室温使用固体催化剂使番茄油树脂异构化2小时的所述番茄油树脂中测量的番茄红素异构体分布图。
表4.使用固体催化剂异构化的番茄油树脂中的番茄红素异构体分布图
＊未知的番茄红素异构体
番茄红素在乙酸乙酯中于室温在Tonsil Optimum或Amberlyst 15存在下在2小时反应期间有效地进行异构化。借助两种催化剂，将大部分的番茄红素全-E异构体转化成Z-异构体。在已鉴定的番茄红素异构体中，主要地形成5-Z，随后分别是9-Z和13-Z；因此，13-Z异构体的浓度在异构化番茄油树脂中低于10％。

Claims (3)

1.对含番茄红素的提取物或衍生物进行异构化的方法，所述方法是在溶剂中长时间加热含番茄红素的提取物或衍生物而实施的，其中加热温度是50至150℃，且加热时间是4至240小时，以获得含有小于番茄红素总含量的10％重量的13-Z异构体的组合物。
2.权利要求1所述的方法，其中溶剂是C3-C10脂族烃、C1-C3氯化溶剂、C3-C6酯、C3-C8酮或C1-C8醇。
3.权利要求2所述的方法，其中溶剂选自己烷、四氯化碳、乙酸乙酯、丙酮、丁醇。
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