CN101491575A - 一种用于治疗异位性皮炎的中药提取物及其颗粒剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗异位性皮炎的中药提取物及其颗粒剂。制备所述中药提取物的原料质量配比如下：当归10～30份，苍术10～30份，黄芩20～50份，防己10～30份，柴胡10～30份。本发明提取物选择临床有效方剂，全方是以补血养血、健脾祛风中药为主药，辅以疏肝解郁，清热利湿，祛风止痒之中药经科学加工而成，经临床研究表明，治疗AD疗效显著；皮炎净颗粒毒性很低，临床拟用剂量安全，对实验动物的中枢神经系统、呼吸系统和心血管系统等方面均无明显的兴奋和抑制作用，是一种安全、稳定的纯中药复方制剂，并有望开发成为安全有效的治疗AD的新药；且该制剂工艺稳定，参数规范合理，适于工业化大生产。

Description

一种用于治疗异位性皮炎的中药提取物及其颗粒剂

(一)技术领域

本发明涉及一种用于治疗异位性皮炎的中药提取物及其颗粒剂。

(二)背景技术

异位性皮炎(atopic dermatitis.AD)，具有产生高免疫球蛋白(IgE)倾向，易伴发哮喘、过敏性鼻炎的一种变态性、炎症性皮肤病。具有病程长，反复发作，冬重夏轻，瘙痒显著等特点。随着工业化进程的迅猛发展，AD在各个国家的患病率正呈现逐渐上升的趋势，尤其是在发达的国家。

现代医学研究表明AD的发病机理与I型和IV型变态反应有关。从免疫细胞生物学的角度研究表明，AD患者皮肤T辅助1型细胞(Th1)与T辅助2型细胞(Th2)平衡失调，Th2细胞占优势，表皮内细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等增多，而IL-2、IFN-γ等减少，血清总IgE升高，导致I型超敏反应发生，同时接触的外界过敏原与表皮内的朗格汉斯细胞结合又可激发Th2细胞主导的IV型迟发型超敏反应，从而产生临床症状。而皮肤表面寄生的金葡菌、糠秕孢子菌、白色念珠菌等以分泌超抗原的方式加剧病情。在治疗上常是内服抗组胺类药物、皮质类固醇激素等药，外用含皮质激素类软膏。但长期使用抗组胺类药、皮质激素会引发一些副作用。

目前临床治疗AD主要采用的是综合治疗。以抗组胺药为主，加外用皮质激素或糠馏油、煤焦油等，以镇静抗炎止痒。但效果并不满意，虽然一时能控制和缓解病情，但不能根治，停药后复发率极高。而且抗组胺药的反复使用会出现耐药性，皮质激素的长期使用会引起皮肤变薄，毛细血管扩张，多毛，色素沉着等一系列的不良反应。且现有免疫调节剂疗效尚难以肯定。

中医中药以其疗效确切，副作用小，强调整体调节，辨证论治，在AD的治疗方面显示出一定的优势。但目前还是处在复方煎剂辨证治疗上，有报道采用雷公藤糖浆和“787”胶囊(主要成分含蛇毒)对AD有一定的疗效，但缺乏促使AD痊愈的作用。综上所述，中医药强调整体调节、辨证论治，在治疗AD方面显示出一定的优势。因此开发治疗AD中药具有广泛的前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种用于治疗异位性皮炎的中药提取物及其颗粒剂。

本发明采用的技术方案是：

一种用于治疗异位性皮炎的中药提取物，由质量配比如下的原料提取得到：

当归    10～30份

苍术    10～30份

黄芩    20～50份

防己    10～30份

柴胡    10～30份；

所述的中药提取物包括挥发油提取物和水提取物，所述的分别按如下方法制备：

(1)挥发油提取物：称取配方量的当归和苍术，加入5～10倍质量的水浸渍后，于挥发油提取器中回流提取6～10小时，过滤，当归、苍术残渣备用，挥发油提取液冷却用乙醚萃取1～3次，得到乙醚萃取液，除去萃取液中的乙醚和水，得到挥发油；当归、苍术为本方的君药，两者挥发油含量极高，是其重要的药理活性成分。为了充分发挥两者挥发油的效用，将两者挥发油共同提取。

(2)水提取物：将当归、苍术残渣与黄芩、防己和柴胡混合，加入水浸没，浸渍后，回流提取1～3次，每次1～2小时，得到水提取液过滤去除滤渣，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10，加入95％乙醇至乙醇体积含量为40～60％，静置12～24小时，过滤去除杂质，浓缩，得到浸膏干燥，得到浸膏粉末。

本处方主要由苍术、当归、黄芩、柴胡、防己等组成。方中苍术性温，味辛、苦，有健脾燥湿，祛风湿的作用，“治痰湿留饮......及脾湿下流，浊沥带下，滑泻肠风”(《本草纲目》)。苍术、当归为主药，以健脾养血兼祛风，辅以黄芩、柴胡、防己以清热利湿祛风止痒，苍术与柴胡合用达到既疏肝解郁理脾，又健脾除湿去风的作用。当归与苍术合用起到疏达气机，和血理血作用。柴胡配黄芩为透达半表之邪，清泄半里之热；配当归则疏肝解郁，活血和血，使气机条达，郁滞渐消。以上诸药合用达到既健脾补血补其本，又清热利湿活血泻其实，祛风止痒治其标。所谓“治湿先健脾”，“治风先治血，血行风自灭”。诸药合用共奏健脾养血，清热化湿，祛风止痒之功，达到补虚泻实，标本兼治的目的。经临床研究表明，治疗AD疗效显著。

中医理论认为，AD属于“顽湿”范畴，是先天禀赋不足，脾胃虚弱，又饮食失调，食入腥腻动风之品，蕴湿化热动风所致。湿热侵袭肌肤则起红斑、丘疹、渗出，风盛则痒。湿热之邪留恋不清，日久伤阴耗血，致血虚风燥或久病必瘀，肌肤失养，形成粗糙肥厚皮损。故AD有湿热内盛和脾虚血燥之分。而儿童成人型AD既有湿热内蕴又有脾虚血燥，而以脾虚血燥为主。

皮炎净颗粒具有深厚的临床积淀，主要由苍术、当归、黄芩、柴胡、防己等组成，方中苍术、当归为主药，以健脾养血兼祛风，辅以黄芩、柴胡、防己以清热利湿祛风止痒，苍术与柴胡合用达到既疏肝解郁理脾，又健脾除湿去风的作用。当归与苍术合用起到疏达气机，和血理血作用。柴胡配黄芩为透达半表之邪，清泄半里之热；配当归则疏肝解郁，活血和血，使气机条达，郁滞渐消。以上诸药合用达到既健脾补血补其本，又清热利湿活血泻其实，祛风止痒治其标。所谓“治湿先健脾”，“治风先治血，血行风自灭”。诸药合用共奏健脾养血，清热化湿，祛风止痒之功，达到补虚泻实，标本兼治的目的。

现代研究发现：当归含有阿魏酸和多种中性油、酚性油、酸性油成份，并含有较丰富的VitB12和VitA。其中阿魏酸有很强的抗氧化和清除自由基作用，从而降低PG环氧化酶而减弱PG合成。阿魏酸可抑制花生四烯酸生成TXB2并抑制磷二酯酶，升高血小板cAMP水平，从而起到抗炎活血作用。当归水煎液对急慢性炎症，均有显著抑制作用。

苍术含有挥发油1.5％。含较多的苍术素、B-桉油醇、茅术醇，含少量苍术酮、B-芹油烯、榄香油、芹烷二烯(Selina-4(14).7(11)-di-ene-8-one)。其中二烯酮、苍术烯酮内酯(Atractylenolide)I、II、III有较强抗炎作用。苍术水溶液在抗炎方面和挥发油作用相近，且对结核杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯叶杆菌和绿脓杆菌有明显灭菌作用。

黄芩含有黄芩苷、黄芩苷元、汉黄芩苷元等成分，具有很强而广泛的抗变态反应和抗炎作用。其机理：(1)能抑制抗原与IgE结合；(2)能升高cAMP水平，从而抑制肥大细胞脱颗粒释放组胺；(3)通过抑制花生四烯酸环化加氧的连锁反应，而抑制白三烯生成；(4)通过提高cAMP水平而抑制前列腺素的合成。所以黄芩同时具有抗I型和IV型变态反应的作用。此外，黄芩具广谱的抗菌作用和利尿作用。

柴胡中的柴胡粗皂甙具有抗渗出，降低毛细血管通透性，抑制炎症介质的释放、白细胞游走和结缔组织增生等许多炎症过程。柴胡皂甙的抗炎作用与强的松龙相似。

防己中的粉防己碱，具有较强的抗炎与抗过敏作用，既是过敏介质的拮抗剂，又是过敏介质的阻释剂。

优选的，制备所述中药提取物的原料质量配比如下：

当归    20份

苍术    20份

黄芩    31.4份

防己    20份

柴胡    20份。

本处方用药量较大，试验表明一个处方量(当归20g，苍术20g，黄芩31.4g，防己20g，柴胡20g)的提取浸膏为27g。若采用胶囊剂、片剂、丸剂，则制剂体积较大，给包装、携带和服用带来不便，颗粒剂既保持了汤剂吸收快、显效迅速的特点，又克服了汤剂服用前临时煎煮、久置易霉败变质、不便携带的缺点。而且颗粒剂易溶解、易吸收，生物利用度优于片剂，且制备工艺比片剂、胶囊剂简单，工艺成本较低，所以本处方优选剂型为颗粒剂。

本发明还涉及一种用于治疗异位性皮炎的颗粒剂(即下文所称皮炎净颗粒)，制备所述颗粒剂的中药原料质量配比如下：当归10～30份，苍术10～30份，黄芩20～50份，防己10～30份，柴胡10～30份，制备所述颗粒剂的方法包括：

(1)挥发油提取物：称取配方量的当归和苍术，加入5～10倍质量的水浸渍后，于挥发油提取器中回流提取6～10小时，过滤，当归、苍术残渣备用，挥发油提取液冷却用乙醚萃取1～3次，得到乙醚萃取液，除去萃取液中的乙醚和水，得到纯挥发油；

(2)水提取物：将当归、苍术残渣与黄芩、防己和柴胡混合，加入水浸没，浸渍后，回流提取1～3次，每次1～2小时，得到水提取液过滤去除滤渣，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10，加入80％～98％乙醇至乙醇体积含量为40～60％，静置12～24小时，上清液过滤去除杂质，浓缩，得到浸膏干燥，得到浸膏粉末。

(3)挥发油包合提取：称取β-环糊精，加入水，β-环糊精与水的用量比例为6～10g∶100mL，加热至完全溶解，降温，搅拌得到β-环糊精水溶液；取取步骤(1)所得的挥发油，用等体积无水乙醇稀释，得到挥发油的乙醇溶液；将挥发油的乙醇溶液于30～50℃搅拌下滴入β-环糊精水溶液中，使挥发油、β-环糊精与水的用量比例为1mL∶6～10g∶100mL，滴加完毕后搅拌1～3小时，冷藏18～24小时，过滤、干燥，得β-环糊精包合物；

(4)取步骤(2)所得的浸膏粉末加入步骤(3)所得的β-环糊精包合物，搅拌均匀，制粒，干燥，得到所述治疗异位性皮炎的颗粒剂。

优选的，所述的挥发油提取物按如下方法制备：称取配方量的当归和苍术，加入5～10倍质量的水浸渍0.5～2小时，于挥发油提取器中回流提取6～10小时，过滤，当归、苍术残渣备用，提取液冷却后，用乙醚萃取1～3次，得到乙醚萃取液，萃取液加无水硫酸钠脱水，过滤取滤液水浴挥干乙醚，得到挥发油。

优选的，所述的水提取物按如下方法制备：将提取挥发油后的当归、苍术残渣与黄芩、防己和柴胡混合，加入10～15倍质量的水，浸渍0.5～2小时后，回流提取1～3次，每次1～2小时，得到水提取液过滤去除滤渣，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10，加入95％乙醇至乙醇体积含量为40～60％，静置12～24小时，上清液过滤去除杂质，浓缩，得到浸膏干燥，得到水提取物浸膏粉末。

优选的，制备所述颗粒剂的中药原料质量配比如下：当归20份，苍术20份，黄芩31.4份，防己20份，柴胡20份；制备所述颗粒剂的方法如下：

(1)当归、苍术挥发油提取：称取配方量的当归和苍术，加入8倍质量的水浸渍0.5小时，于挥发油提取器中回流提取8小时，提取液冷却后，用乙醚萃取3次，合并得到乙醚萃取液，萃取液加无水硫酸钠脱水，过滤取滤液水浴挥干乙醚，得到挥发油；

(2)当归、苍术的挥发油包合：称取β-环糊精，加入水，β-环糊精与水的用量比例为6g∶100mL，加热至完全溶解，降温至40℃，得到β-环糊精水溶液；取挥发油，用等体积无水乙醇稀释，得到挥发油的乙醇溶液；将挥发油的乙醇溶液于40℃搅拌下滴入β-环糊精水溶液中，使挥发油、β-环糊精与水的用量比例为1mL∶6～10g∶100mL，滴加完毕后搅拌3小时，冷藏24小时，过滤、干燥，得粉状β-环糊精包合物；

(3)水提取物的提取：将步骤(1)提取挥发油后的当归、苍术残渣与防己、柴胡和水燀过的黄芩混合，加入12倍质量的水，浸渍0.5小时后，回流提取2次，每次1小时，得到水提取液过滤去除滤渣，滤液浓缩至相对密度为1.10，加入95％乙醇至乙醇体积含量为50％，静置12小时，取上清液过滤去除杂质，浓缩，得到浸膏干燥，得到水提取物浸膏粉末；

(4)取步骤(3)得到的浸膏粉末加入步骤(2)制得的β-环糊精包合物，搅拌均匀，喷85％乙醇制软材，制粒机制粒，干燥，得到所述治疗异位性皮炎的颗粒剂。

经药理学试验验证，皮炎净颗粒对小鼠中枢神经系统无兴奋或抑制作用，对家猫心血管系统无明显的兴奋或抑制作用，对家猫呼吸提供业无明显的呼吸兴奋或抑制作用，证实该制剂是安全可靠的。

经半数致死量(LD₅₀)测定的预试验结果表明，各剂量组经灌胃给药后，均未引起小鼠死亡，未能测出半数致死量(LD₅₀)；最大给药量试验以皮炎净颗粒最大浓度(0.70g/ml)，小鼠最大灌胃体积(0.4ml/10g)，1天3次，灌胃给药，测得小鼠最大给药量为84g/kg(生药量116.76g/kg)，相当于临床成人日用剂量的365倍。按体重计算，小鼠1d最大给药量相当于成人临床日用剂量的100倍以上则上较为安全，表明皮炎净颗粒毒性低。灌胃给药后小鼠在活动、毛发、饮水、粪便及精神状态等方面正常；隔天称取体重发现有不同程度增长，给药组与对照组比较无显著性差异；观察期内无一例死亡，处死后解剖观察脑、心、肝、脾、肺、肾等脏器未发现异常。

因此皮炎净颗粒无明显药理和毒理反应，通过灌胃给药无法测出LD₅₀，故该制剂安全可靠，在临床用药上有一定的安全性。

本发明的有益效果主要体现在：本发明中药提取物选择临床有效方剂，全方是以补血养血、健脾祛风中药为主药，辅以疏肝解郁，清热利湿，祛风止痒之中药经科学加工而成，经临床研究表明，治疗AD疗效显著；皮炎净颗粒毒性很低，临床拟用剂量安全，对实验动物的中枢神经系统、呼吸系统和心血管系统等方面均无明显的兴奋和抑制作用，是一种安全、稳定的纯中药复方制剂，并有望开发成为安全有效的治疗AD的新药；且该制剂工艺稳定，参数规范合理，适于工业化大生产。

(四)附图说明

图1为不同辅料制粒的时间-吸湿率曲线图；

图2为不同糊精用量制粒的时间-吸湿率曲线图；

图3为颗粒剂制备工艺流程图；

图4为实施例6实验流程图；

图5为各组SD大鼠血清的IgE含量；

图6为各组SD大鼠血清IFN-γ含量；

图7为各组SD大鼠血清IL-4含量；

图8为各组SD大鼠血清IFN-γ/IL-4值。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：提取工艺研究

(1)当归、苍术的挥发油提取及包合工艺的研究

试剂与药材：

甲醇                    杭州化学试剂有限公司            批号20060214

无水乙醇                上海化学试剂公司                批号20060117

乙醚                    杭州化学试剂有限公司            批号20031105

正丁醇                  杭州高晶精细化工有限公          批号20060223

β-环糊精               上海伯奥生物科技有限公司        批号060123

黄芩苷对照品            中国药品生物制品检定所          批号110715-200514

当归(产地甘肃)          浙江中医药大学中药饮片厂        批号070116

苍术(产地辽宁)          浙江中医药大学中药饮片厂        批号061202

柴胡(产地河北)          浙江中医药大学中药饮片厂        批号061206

黄芩(产地内蒙古)        浙江中医药大学中药饮片厂        批号061213

防己(产地浙江)          浙江中医药大学中药饮片厂        批号061208

仪器：

电子天平                奥豪斯国际贸易(上海)有限公司    型号AR2130

超声波清洗器            上海超声波仪器厂                型号CQ-50

电子恒温水浴锅          上海东星建材试验设备有限公司    型号DZKW-4

台式干燥箱              重庆试验设备厂                  型号DGB/20-002A

恒温加热磁力搅拌器      巩义市英峪予华仪器厂            型号DF-101S

分析电子天平            上海天平仪器厂                  型号DHS20-1

超导热风干燥箱          杭州华迪机械有限公司            型号CD-100L

挥发油测定器            上海玻璃仪器厂                  型号5ml

旋转蒸发仪              瑞士BUCHI公司                   型号R-200

电子天平                日本岛津                        型号AEG-220

Waters-510高效液相色谱仪       Waters-484紫外检测器；    GS型色谱工作站

1.当归、苍术的挥发油提取工艺的研究

1.1考察指标的选择

当归、苍术为本方的君药，两者挥发油含量极高，是其重要的药理活性成分。为了充分发挥两者挥发油的效用，将两者挥发油共同提取。一般以挥发油总重量为考察指标，故将其作为挥发油提取工艺的评价指标。

1.2正交因素水平的确定

因当归、苍术所含挥发油易被水蒸汽蒸馏，且密度均小于1.0，故采用水蒸汽蒸馏法。为了确定最佳的提取工艺，对加水量(A)、浸泡时间(B)、回流时间(C)等分别进行考察研究，并以挥发油总重量为考察指标进行工艺优选。根据文献报道及预试验的结果，挥发油提取工艺的因素水平设置见表2。对回流时间因素的水平设置，本研究作了回流8h和回流9h的单因素考察，以确定回流时间因素的最高水平。

回流时间的单因素考察：称取4个处方量的药材(当归80g，苍术80g)，共六份，粉碎，过2号筛，加相当于药材重量8倍的水浸泡1.5h，前三份用挥发油提取器连续回流提取8h，后三份用挥发油提取器连续回流提取9h，提取液冷却后，用2mL乙醚萃取3次，合并乙醚萃取液，40℃以下回收乙醚，加无水硫酸钠2g脱水，过滤，转移至称量瓶中，60℃水浴挥干乙醚得纯挥发油，称重。结果见表1。

表1回流时间单因素考察结果

通过对表1试验结果分析，前三份提取的挥发油含量平均值为1.41g，后三份提取的挥发油含量平均值为1.42g，回流9h与回流8h比较，挥发油的提取率提高了1.00％，从节约能源考虑，回流时间因素最高水平设置为回流8h，最终因素水平表确定见表2。

表2：挥发油提取因素水平表

1.3挥发油提取方法的确定

本实验根据单因数考察、文献及联系生产实际，确定加水量(A)、浸泡时间(B)、回流时间(C)三个因素为3个考察因素，每个因素设置3个水平，以挥发油总重量为考察指标，用L₉(3⁴)正交表进行实验设计优选。具体实验方法：称取4个处方量的药材(当归80g，苍术80g)，共9份，粉碎，过2号筛，按L₉(3⁴)正交设计试验表安排试验，见表3，以不同倍数加水量，不同浸泡时间，不同回流提取时间分别对挥发油进行提取，提取液冷却后，用2mL乙醚萃取3次，合并乙醚萃取液，40℃以下回收乙醚，加无水硫酸钠2g脱水，过滤，转移至称量瓶中，60℃水浴挥干乙醚得纯挥发油，称重。试验结果见表3，方差分析见表4。

1.4结果与数据处理

表3：挥发油提取正交试验表

表4：挥发油提取方差分析表

由直观分析可知(见表3)，A取A₂，B取B₁，C取C₃，最佳提取工艺为A₂B₁C₃。由方差分析结果可知(见表4)：C因素对提取率有显著性差异，A、B两因素对提取率无显著性差异。主次顺序为C＞B＞A。C因素中，C₃＞C₂＞C₁，选择C₃，结合直观分析(见表3)，A、B因素对提取率无显著性差异，A取A₂，B取B₁，故结合生产实际确定最优提取工艺条件为：药材浸泡1h，加8倍量水，加热回流提取8h。

1.5验证试验

按最佳提取工艺A₂B₁C₃验证试验，重复5次，所得数据结果见表5。

表5：验证试验结果(n＝5)

结果	1	2	3	4	5
						挥发油总重量(g)平均值(g)RSD(％)	1.46	1.49	1.481.481.02	1.47	1.48

(2)当归、苍术的挥发油包合工艺的研究

2.1考察指标的选择

为了充分发挥当归、苍术两味挥发油的效用，增加挥发油在制剂中的稳定性，减少不良气味，实验中将两味挥发油共同提取，进行β-环糊精包合，以包合物收得率、挥发油包合率、综合评分作为指标来客观评价包合工艺的优劣。

2.2正交因素水平的确定

为了确定当归、苍术的，我们对影响环糊精包合较明显的工艺条件：挥发油(ml)与β-环糊精(g)的投料配比(A)、包合温度(B)、包合时间(C)三个因素进行考察研究，每个因素设置3个水平，对包合物收得率、挥发油包合率进行综合评分优选挥发油的包合工艺。根据文献报道及预试验的结果，包合工艺的因素水平设置见表6。

表6：挥发油包合因素水平表

2.3挥发油包合方法的确定

本实验确定挥发油(ml)与β-环糊精(g)的投料配比(A)、包合温度(B)、包合时间(C)三个因素为考察因素，每个因素设置3个水平，采用L₉(3⁴)正交表实施实验；对包合物收得率、挥发油包合率进行综合评分，优选挥发油的包合工艺。具体实验方法：称取20个处方量的药材(当归400g，苍术400g)，按挥发油最佳提取工艺提取。所得挥发油包合采用饱和水溶液法，平行取9份，按L₉(3⁴)正交设计试验表安排试验，试验结果见表7，方差分析见表8。

2.3.1饱和水溶液法

称取一定量的β-环糊精，置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水100ml，加热使之完全溶解，降至规定温度下，用恒温磁力搅拌器搅拌。精密移取挥发油1ml于试管中，用无水乙醇稀释，使挥发油∶无水乙醇体积比为1∶1。将挥发油的醇溶液缓慢滴入锥形瓶中，边滴加边搅拌，搅拌至规定时间，冷藏24h，取出，滤过，干燥6h(50℃以下)，得粉状包合物，称重，即得包合物实际量。

2.3.2包合物收得率、包合率、综合评分的确定

包合物收得率、包合率、综合评分的测定：

包合物收得率＝包合物实际重量/[β-环糊精量(g)+挥发油加入量(g)]×100％

挥发油包合率＝[包合物中实际挥发油量(g)/挥发油加入量(g)]×100％

包合物收得率评分＝包合物收得率×30

挥发油包合率评分＝挥发油包合率评分×70

综合评分＝包合物收得率评分+挥发油包合率评分

挥发油包合率权重系数定为0.7，包合物收得率作为次要筛选指标，权重系数定为0.3。按上述公式计算综合评分。

测定包合物中含挥发油重量按挥发油提取方法及条件提取包合物内的挥发油至挥发油提取完全，同法分离，称重。

2.4结果与数据处理

表7：正交试验方案与结果

表8：挥发油包合方差分析表

方差来源	偏差平方和	自由度	F比	F(0.05)值	显著性
						ABC	8.5153.1134.10	222	5.07031.6320.31	191919	＜0.1＜0.05＜0.05

D(误差)(％)

1.68

由直观分析可知(见表7)，A取A₁，B取B₂，C取C₃，最佳包合工艺为A₂B₁C₃。由方差分析结果可知(见表8)，包合时间、包合温度对包合率有显著性差异，β-环糊精与油的配比对包合率无显著性差异。主次顺序为B＞C＞A。B因素中，B₂＞B₃＞B₁，选择B₃；C因素中，C₃＞C₂＞C₁，选择C₃。结合直观分析(见表7)，A因素对包合率无显著性差异，A选择A₁，故结合生产实际确定最优提取工艺条件为：A₁B₂C₃，即挥发油与β-环糊精配比为1∶6，包合温度为40℃，磁力搅拌时间为3h。

2.5验证试验

按最佳提取工艺A₁B₂C₃验证试验，重复5次，所得数据结果见表9

表9：验证试验结果(n＝5)

结果	1	2	3	4	5
						综合评分(g)平均值(g)RSD(％)	83.35	83.38	83.3483.361.41	83.36	83.37

3.小结与讨论

3.1本实验采用正交试验法对当归、苍术挥发油的提取及β-环糊精包合工艺进行了研究，并分别按最佳工艺进行了3批验证试验，结果挥发油重量平均值为1.48，RSD＝1.02％；综合评分平均值为83.36％，RSD＝1.41％。以上数据与正交试验结果一致，说明该工艺稳定可行。包合物制备时，考察了冷藏时间对β-环糊精包合效果的影响。结果表明，冷藏24h包合率及包合物收得率均较冷藏12h明显增加，而24h以后趋于稳定，故冷藏时间确定为24h。

3.2本试验曾对方中含挥发油的药材当归、苍术、柴胡进行挥发油提取，加水适量浸泡1h后，提取8h。结果显示，柴胡含挥发油比例较低，当归、苍术含挥发油比例较高。且据文献报道柴胡挥发油抗炎作用不明显，提取意义不大，故放弃柴胡挥发油提取，仅对当归、苍术挥发油进行合提。

3.3含挥发油的中药制剂中，过去将挥发油喷洒到颗粒上，但长期放置后，会因制剂表面的挥发油不断挥发含量降低而影响药效。而采用包合技术，使挥发油包裹到β-环糊精形成的空腔结构中避免了挥发油在贮藏时挥发，保证药效稳定。

3.4本试验中，皮炎净颗粒中挥发油包合最佳工艺为A₁B₂C₃。在包合过程中，挥发油包合率、包合物收得率是衡量包合效果的主要指标。挥发油包合率越高，其包合效果越好，可作为工艺主要筛选指标，但收得率在大生产中也有很重要的意义，在β-环糊精量和挥发油投入量一定的情况下，得率可作为次要筛选指标。故综合考虑，挥发油包合率权重系数定为0.7，包合物收得率权重系数定为0.3。在本实验中同时考虑了β-环糊精量和挥发油投料量，得出该最佳工艺条件适合于大生产。

(3)当归、黄芩、苍术、防己、柴胡药材的水提工艺研究

1.考察指标的选择

当归为本方的君药，其中含的阿魏酸可作为评价指标，但文献报道，阿魏酸含量较低，且经多次预试验发现其灵敏度低、重现性差。黄芩中的黄芩苷具有很强而广泛的抗变态反应和抗炎作用，且含量较高，重现性好，可作为水提工艺的评价指标。故最终选取黄芩苷含量、药液的浸膏得率、综合评分作为水提工艺的评价指标。

2.正交因素水平的确定

当归、黄芩、苍术等各味药的主要有效成分为水溶性成分，宜采用水提法，为了确定最佳的提取工艺，我们对加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)进行了考察，并对黄芩苷含量、药液的浸膏得率进行综合评分优选水提工艺。水提工艺的因素水平设置见表11。对于C因素的水平设置，本研究作了提取3次和提取4次的单因素考察，以确定C因素的最高水平。

提取次数的单因素考察：称取1份处方量的药材(当归20g，苍术20g，黄芩31.4g，防己20g，柴胡20g)，共六份，加相当于药材重量8倍的水浸泡0.5h，回流提取1.5h，前三份对药材提取3次，后三份对药材提取4次，合并提取液，过滤，浓缩至500mL，精密移取1mL，转移至50mL棕色量瓶中，加蒸馏水至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤，分别测定其中黄芩苷的含量，结果见表10。

表10：提取次数单因素考察结果

通过对表10试验结果分析，前三份黄芩苷的含量平均值为14.63mg/g，后三份黄芩苷的含量平均值为15.06mg/g，提取4次与提取3次比较，黄芩苷的含量提高了2.9％，从节约能源考虑，提取次数因素最高水平设置为提取3次，最终因素水平表确定见表11。

表11：试验因素水平表

3.水提方法的确定

本实验根据单因数考察、文献及联系生产实际，确定加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)三个因素为3个考察因素，每个因素设置3个水平，采用L₉(3⁴)正交表实施实验；对黄芩苷含量、药液的浸膏得率进行综合评分优选水提工艺。具体实验方法：准确称取一个处方量的五味药材(当归20g，苍术20g，黄芩31.4g，防己20g，柴胡20g)，共9份，当归、苍术两味药材挥发油提取后药渣与其他三味药材混合(黄芩先用水燀)，按照L₉(3⁴)正交表安排试验，见表12，浸泡0.5h，以不同倍数加水量，不同回流提取时间，不同提取次数，分别进行提取，合并提取液，过滤，浓缩至500mL，精密移取1mL，转移至50mL棕色量瓶中，加蒸馏水至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤，分别测定，试验结果见表12，方差分析见表13。

3.1黄芩苷含量的测定

3.1.1供试液的制备

精密移取各试验号下的浓缩液1mL，并转移至50mL棕色量瓶中，加蒸馏水至刻度。0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试液。

3.1.2对照品的制备

精密称取黄芩苷标准品4.5mg，溶解，用50％甲醇溶液定容至50ml容量瓶中，制成每1ml含0.09mg的溶液，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液1、2、4、6、8ml各置10ml棕色容量瓶中，加50％甲醇溶液定容，摇匀，制成系列浓度的标准溶液。另取黄芩苷标准品2mg，加50％甲醇溶液，作为定位用对照品溶液。

3.1.3阴性对照品的制备

准确称取一份处方量的药材不含黄芩(当归20g，苍术20g，防己20g，柴胡20g)，按样品溶液制备方法(表12试验号1)制备，精密移取浓缩液1mL，并转移至50mL棕色量瓶中，加蒸馏水至刻度。0.45μm微孔滤膜过滤，即得阴性对照品溶液。

3.1.4色谱条件

Waters-510高效液相色谱仪；Waters-484紫外检测器；GS型色谱工作站；25μl微量进样器。色谱柱为大连伊利特Hypersil BDS C18色谱柱(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶2d)，柱温为25℃，流速：1.0mL/min。紫外检测波长280nm，理论板数不低于2500。

3.1.5检测方法

精密吸取供试品溶液15μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，吸取0.09g/ml黄芩苷对照品溶液10μL、20μL注入色谱仪，记录峰面积，以进样量的对数与峰面积的对数作外标两点法标准曲线，通过标准曲线计算样品中黄芩苷含量。

3.2浸膏得率测定

精密量取各试验号下的浓缩液25mL，置恒重蒸发皿中水浴蒸干(蒸干水分)，105℃烘3h，移至干燥器中冷却30min，迅速精密称重，计算浸膏得率，称量，计算，即得。计算公式如下：浸膏得率(％)＝煎液总体积(mL)×干浸膏重(g)/药材量(g)×取样体积(mL)×100％。

3.3综合评分的确定

黄芩苷含量评分、浸膏得率评分、综合评分的测定：

黄芩苷含量评分＝黄芩苷含量/最大黄芩苷含量×0.5×100

浸膏得率评分＝浸膏得率/最大浸膏得率×0.5×100

综合评分＝黄芩苷含量评分+浸膏得率评分

黄芩苷含量、浸膏得率是水提正交试验两个评价指标，采用综合评分法进行数据分析，黄芩苷含量、浸膏得率权重系数均为0.5。按上述公式计算综合评分。

4.结果与数据处理

表12：正交试验方案与结果

表13：方差分析表

由直观分析可知(见表12)，A取A₃，B取B₂，C取C₁，最佳提取工艺为A₃B₂C₁。由方差分析可知(见表13)，加水量(A)和提取时间(C)对提取效率影响很大，有显著性差异，提取次数对提取效率影响不大，无显著性差异，且各因素对提取率影响的大小顺序为加水量(A)＞提取时间(C)＞提取时间(B)。直观分析显示(见表12)，A因素对提取效率的影响，3水平比1水平、2水平高出较多，因此，A因素选择3水平为最佳条件；B因素对提取效率影响不大，应选择最低水平，即提取1小时；C因素对提取效率的影响随着水平的提高而显著增加，结合节约能源考虑，应选择2水平。因此，水提工艺的最佳条件应为A₃B₁C₂，即加12倍量的水提2次，每次1小时。

5.验证试验

准确称取一份处方量的五味药材(当归20g，苍术20g，黄芩31.4g，防己20g，柴胡20g)，按正交最佳工艺提取，平行提取三份，提取液过滤，浓缩成500mL的浸膏，按正交样品的前处理方法处理，测定其中黄芩苷的含量，浸膏得率。结果见表14。

表14：验证试验结果

实验号	浸膏得率(％)	黄芩苷(mg/g)
			123平均值	40.4140.3940.4240.41	26.2125.4325.1725.60

从表14试验结果可知，黄芩苷的含量，浸膏得率三次试验的平均值分别为25.60mg/g、40.41％，略高于9个正交试验中的最高含量。说明所筛选的提取工艺可行。

6.小结与讨论

6.1本制剂中当归、黄芩、苍术等各味药的主要有效成分为水溶性成分，在文献检索的基础上，又以实验证明，并最终确定了水提法。通过正交试验法，以黄芩苷含量、药液的浸膏得率为评价指标进行综合评分优选水提工艺，确定了该处方的最佳提取工艺。最佳条件为A₃B₁C₂，即加12倍量的水提2次，每次1h。

6.2实验曾对药材进行水提法与醇提法提取，以黄芩苷含量为评价指标进行比较。试验结果表明，两种方法提取的黄芩苷含量相差不多。故从生产成本考虑，选取水提法。

6.3黄芩中的黄芩苷具有很强而广泛的抗变态反应和抗炎作用，且含量较高，重现性好，作为水提工艺的参考指标，具有一定的科学性。优选出的最佳工艺，经三次验证都有较好的重复性。

(4)当归、黄芩、苍术等药材醇沉除杂工艺研究

1.考察指标的选择

当归、黄芩、苍术等五味药，采用水提工艺，根据初步试验结果及文献报道，对其有效成分的性质以及工艺的可行性研究，确定了醇沉除杂工艺，并最终选取醇沉浓度、醇沉时间、相对密度三个指标作为醇沉工艺的评价指标。

2.单因素考察与结果

2.1对不同相对密度的考察

准确称取一份(当归20g，苍术20g，黄芩31.4g，防己20g，柴胡20g)的五味药材，按正交最佳工艺提取，平行提取五份，提取液过滤，浓缩成400mL的浸膏，合并煎液，用比重瓶测定相对密度，60℃分别测定相对密度为1.00，1.05，1.10，1.15，1.20，分别加乙醇至含醇量达60％，醇沉12h，回收乙醇，浓缩，测定黄芩苷含量。以黄芩苷、浸膏得率为指标，考察最佳相对密度。结果见表15。

表15：对不同相对密度的考察

相对密度	1.0	1.05	1.10	1.15	1.20
						黄芩苷(mg/g)浸膏得率(％)	25.5133.25	25.3431.84	25.1429.43	23.1228.76	23.0526.89

从表15试验结果可知，从黄芩苷含量看，相对密度为1.15时，含量明显降低；从浸膏得率看，各组无显著性差异，为了便于大生产省时、省力操作，选择水提部分浓缩相对密度为1.10。

2.2对不同醇沉浓度的考察

准确称取一份处方量的五味药材(当归20g，苍术20g，黄芩31.4g，防己20g，柴胡20g)，按正交最佳工艺提取，平行提取五份，提取液过滤，浓缩成相对密度为1.10后，加入乙醇使含醇量为30、40、50、60、70％，醇沉12h，回收乙醇，浓缩，测定黄芩苷含量。以黄芩苷、浸膏得率为指标，考察最佳醇沉浓度。结果见表16。

表16：对不同醇沉浓度的考察

醇沉浓度(％)	30	40	50	60	70
						黄芩苷(mg/g)浸膏得率(％)	25.8933.45	25.6932.19	25.3430.43	23.2328.76	12.6420.57

从表16试验结果可知，从黄芩苷含量看，醇沉浓度为60％时，含量明显降低；从浸膏得率看，各组无显著性差异，本着醇沉转移率高原则，结合大生产沉淀效果，综合考虑，水提工艺的最佳醇沉浓度为50％。

2.3对不同醇沉时间的考察

准确称取一份处方量的五味药材(当归20g，苍术20g，黄芩31.4g，防己20g，柴胡20g)，按正交最佳工艺提取，平行提取三份，提取液过滤，浓缩成相对密度为1.10后，加入乙醇使含醇量为50％，分别醇沉6h、12h、24h，回收乙醇，浓缩，按“6.1”项测定。以黄芩苷、浸膏得率为指标，考察最佳醇沉时间。结果见表17。

表17：对不同醇沉时间的考察

醇沉时间(h)	6	12	24
				黄芩苷(mg/g)浸膏得率(％)	25.4238.27	25.3430.43	25.3530.38

从表17试验结果可知，从黄芩苷含量看，各组无显著性差异；从浸膏得率看，醇沉6h得率较高，本着醇沉转移率高，出膏率低的最佳原则，结合大生产沉淀效果，综合考虑，水提工艺的最佳醇沉时间为12h。

3.小结与讨论

以水为溶剂提取药材中有效部位，经济易得，但是许多成分如淀粉、蛋白质等同时溶出，加入乙醇使无效成分沉淀，净化药液，缩小体积。本试验中，对醇沉浓度、醇沉时间、相对密度三个因素分别进行了考察，最佳条件为浓缩液相对密度为1.10，乙醇醇沉浓度50％，静置12h。

实施例2：干燥工艺研究

(一)仪器与设备

电子精密天平    奥豪斯国际贸易(上海)有限公司    型号AR2130

真空干燥箱      上海森信实验仪器有限公司        型号DZG-6050

旋转蒸发仪      瑞士BUCHI公司                   型号R-200

电子恒温水浴锅  上海东星建材试验设备有限公司    型号DZKW-4

电子天平        奥豪斯国际贸易(上海)有限公司    型号AR2130

电子天平        日本岛津                        型号AEG-220

超声波清洗器    上海超声波仪器厂                型号CQ-50

台式干燥箱      重庆试验设备厂                  型号DGB/20-002A

时温比重瓶      安徽省凤阳县玻璃厂              型号25ml

旋转蒸发仪      上海嘉鹏科技有限公司            型号RE-52

(二)实验方法与结果

1.提取与浓缩

准确称取一份处方量药材(当归20g，苍术20g，黄芩31.4g，防己20g，柴胡20g)，共三份，取其中当归、苍术粉碎，过2号筛，按挥发油最佳提取工艺提取后，药渣与其他三味药材混合(黄芩先用水燀)，共同提取，按水提最佳提取工艺，即加12倍量的水浸泡0.5h，提2次，每次1h。合并两次提取的浸膏，并浓缩至相对密度为1.10的浸膏，加95％乙醇至含醇量50％(v/v)，静置12h，过滤除杂，浓缩，备用。

2.对不同干燥工艺的考察

将浸膏采用常压蒸发干燥、减压蒸发干燥(0.08Mpa)、真空蒸发干燥法在60℃土1℃下干燥，以干燥物形状、色泽以及黄芩苷含量为考察指标。结果见表22。

表18：对不同干燥方法的考察

干燥方法	干燥时间	干燥物形状	干燥物色泽	黄芩苷(mg/g)
					常温干燥减压干燥真空干燥	48h20h8h	硬较疏松疏松	深褐棕黄色棕黄色	20.5621.7621.84

由表18试验结果可知，三种干燥方法中黄芩苷含量，各组无显著性差异，常压蒸发干燥速度慢，干燥物形状硬，色泽较深；减压蒸发干燥速度较快，干燥物形状较疏松；真空蒸发干燥最快，干燥物形状疏松，色泽较好。故最佳干燥方法采用真空干燥法。

(三)小结与讨论

3.1本制剂浸膏得率较高，从患者最小服用量考虑，要求辅料用量少，因此提取液需进一步浓缩干燥成粉末，以便制粒。实验中对不同干燥方法进行比较，并得出最佳干燥方法为真空干燥。

3.2真空干燥法具有干燥温度低，易将提取物干燥成干浸膏，避免氧化，有效成分损失少，适合于热敏感性物质的干燥，且设备简单，干燥费用也相对较低，故真空干燥法将提取物干燥成干浸膏条件符合大生产的要求。

实施例3：成型工艺研究

(一)实验仪器与材料

1.仪器

摇摆式制粒机        江苏泰兴制药机械二厂            型号WK-3

搅拌机              江苏泰兴制药机械二厂            型号GB-10

电热恒温鼓风干燥箱  上海一恒公司                    型号DHG-9140AAB104-N

分析电子天平        上海天平仪器厂                  型号DHS20-1

电子精密天平        奥豪斯国际贸易(上海)有限公司    型号AR2130

赛福智能人工气候箱  宁波海曙赛福实验仪器厂          型号PRX-280A

2.材料

乳糖                上海山浦化工有限公司            批号060808

糊精                上海恒信化学试剂有限公司        批号991120

可溶性淀粉          上海恒信化学试剂有限公司        批号060907

羧甲基淀粉钠        湖州展望化学药业有限公司        批号061216

(二)成型工艺方法与结果

1.对不同制粒乙醇浓度的考察

称取一份浸膏，干燥过的糊精(两者质量比为1∶1)，分别以75％、80％、85％、90％的乙醇为润湿剂，制粒，以软材情况、过筛难易、颗粒合格率以及颗粒的外观为考察指标。结果见表19。

表19对不同制粒乙醇浓度的考察

考察指标	75％	80％	85％	90％
					软材情况	轻微起团	不起团	不起团	不起团
过筛难易	能过筛	较易	较易	容易

颗粒合格率/％	90.2	93.5	95.8	88.2
					颗粒外观	粒度均匀但色泽较深有光泽，有硬心，溶解慢	粒度均匀，质地偏硬，色泽偏深，溶解较慢	粒度均匀质地松脆但不散，色泽偏深，易溶解	粒度不均偏细，颗粒松散，易溶解

从表19试验结果可知，当乙醇浓度达到80％以上颗粒过筛较易，制成的软材不起团；但乙醇浓度为80％时，制成颗粒质地偏硬，而乙醇浓度为90％时，制成颗粒粒度不均偏细，颗粒松散，乙醇浓度为85％时，制成颗粒各项指标较好，质量较佳。故最佳制粒乙醇浓度为85％。

2.对不同辅料制粒的考察

取一份浸膏20g，各4份，分别加入乳糖、糊精、羧甲基淀粉钠、可溶性淀粉各20g，混合均匀，喷以适量85％乙醇制粒，干燥整粒。以辅料制得的颗粒的吸湿百分率、溶解性为指标，考察最佳辅料。结果分析见表20和图1。

颗粒吸湿百分率测定：将饱和NaCl溶液置干燥器中，并将干燥器置25℃恒温箱中放置24h，此时干燥器内的湿度为75％。将制好的颗粒于105℃下干燥至恒重，称取适量于干燥的称量瓶中，平铺成2mm厚，置干燥器中，每隔6h、12h、24h、36h、48h称重一次。

颗粒溶解性测定：按《中国药典》一部附录方法测定，称取整粒干燥好的颗粒10g，加200mL温开水搅拌5分钟，立即观察。颗粒全部溶解或呈混悬状为最佳。

表20：对不同辅料制粒的考察

由表20试验结果可知，四种辅料制成的颗粒溶解性全部符合要求，均在5min内溶解。图1是根据表20作出的不同辅料制粒的时间与吸湿率曲线图，由图1可知，四种辅料中乳糖、糊精对颗粒吸湿性的改善最佳，结合生产成本，糊精价格较低，因此辅料选择以糊精为好。

3.对不同辅料用量制粒的考察

称取一份干浸膏20g，分别加入3g、6g、9g、12g、15g、18g、21g、24g糊精，喷以适量85％乙醇制粒，以颗粒的成型率、吸湿率为指标，选择最佳的敷料用量。结果分析见表21，图2。

表21：对不同糊精用量制粒的考察

由表21试验结果可知，糊精用量从18g增至24g时，颗粒成型率达到92％以上，成型率较高；图2是根据表21作出的不同糊精用量制粒的时间与吸湿率曲线图，由图2可知，糊精的用量从18g增至24g时，颗粒吸湿率的改变不大，因此，从辅料的加入量最小原则考虑，糊精用量以18g为最佳。

4.制粒、干燥及整粒

真空干燥所得的浸膏粉末，加入浸膏重90％的糊精，充分搅拌均匀，喷以适量的85％乙醇，制软材，以摇摆式制粒机制粒。干燥，将所制的颗粒放入烘箱中，在40℃下干燥1h，然后升温至65℃，保持2h，即可。整粒，将烘好的颗粒强行过一号筛后，以五号筛筛去过细部分。

(三)小结与讨论

3.1选择合适的辅料是应用制粒技术制得高质量颗粒的关键。选择辅料时应考虑辅料对制剂的影响，包括成型性、稳定性以及生物效性等，故辅料应以最小用量和无不良影响为原则，也要考虑到成本，在充分满足制剂工艺要求、保证产品质量的前提下，通过预试，使辅料的用量减到最低限度。本研究中，由于本颗粒剂为水溶性颗粒剂，故不能用淀粉(不溶于水)。处方提取物吸湿性较大，需加入一定量的吸收剂才能制粒，经比较，乳糖、糊精降低颗粒吸湿性的效果较好，而且乳糖在热水中溶解性好，但价格太高，糊精价格较其它辅料便宜，制成的颗粒外观、溶解性、吸湿性都较其它辅料好，因此辅料选择以糊精为好。

3.2通过考察不同糊精用量对颗粒的吸湿性和成型率的影响，试验确定了糊精的最佳用量，以保证药效。

3.3乙醇浓度的选择对制粒过程至关重要，直接关系到成品的质量好坏，浓度过高则所制的颗粒质地松散，在包装储存过程中容易破碎成粉末，浓度过低更不利于制粒，首先，浓度偏低则乙醇的用量不好控制，少了起不到粘合作用，多了制粒过程中易起团结块，不能制粒，其次，所制颗粒质地偏硬，有硬心，在水中不易溶解。本实验中选择85％乙醇制粒，结果表明所制的颗粒质量较好，且成型率较高。

3.4制好的颗粒宜用程序升温法烘干。实验中发现加热温度直接升到65℃，易使颗粒结块。此外烘箱必需具备排气扇，以免烘箱内乙醇蒸汽浓度过高，引起爆炸。

实施例4：颗粒剂制备

处方：当归200g，苍术200g，黄芩628g，防己200g，柴胡200g

处方中当归、苍术粉碎，过2号筛，加8倍量的水，浸泡1.0h，水蒸气蒸馏提取8h，所得挥发油用β-环糊精包合，挥发油与β-环糊精配比为1∶6，包合温度为40℃，磁力搅拌时间为3h。冷藏24h，取出，用乙醚洗至淡黄色，滤过，干燥6h(50℃以下)，得粉状包合物。当归、苍术药渣与其他三味药材混合(黄芩先用水燀)得到混合物，共同提取，加质量为混合物质量12倍的水浸泡0.5h，提取2次，每次1h，合并两次提取的浸膏，并浓缩至相对密度为1.10的浸膏，加95％乙醇至含醇量50％，静置12h，过滤除杂，浓缩，真空干燥得干浸膏粉，加入浸膏干粉重90％的糊精，充分混匀，喷以适量85％的乙醇，制粒，干燥，整粒，分装，每袋7g。

颗粒剂含量质量标准：阿魏酸含量不得低于0.07mg/g，粉防己碱、防己诺林碱的总量不得低于0.25mg/g，黄芩苷含量不得低于10mg/g。经检测，前述制得颗粒剂符合上述标准。

实施例5：皮炎净颗粒剂稳定性检查

根据国家药品监督管理局《新药审批办法》有关的稳定性试验资料的要求，取按实施例4方法制备的三批供试品(批号：070210、070320、070401)，放入底部盛有NaCl饱和溶液(相对湿度75±5％)的干燥器置隔水式恒温培养箱(温度37±2℃)中三个月。在试验期间每一个月取样一次，考核指标为制剂通则检查、一般杂质检查及含量测定等项目，各检查与0月数据作比，均符合。第0月、第3月检测结果见表22、23。

表22：0个月皮炎净颗粒初步稳定性检测结果

-表示未检出

表23：3个月皮炎净颗粒初步稳定性检测结果

注：-表示未检出

本品三个批号的样品经连续三个月的留样观察，各项检测指标均符合药典标准及企标标准，样品放置三个月与0个月相比，各项检测指标未见明显变化，说明本品质量基本稳定。

实施例6：皮炎净颗粒对SD大鼠血清IgE、IFN-γ和IL-4的影响

涉及英文缩略词：

AD         异位性皮炎        atopic dermatitis

OVA        卵白蛋白          ovalbumin

IFN-γ     干扰素-γ         interferon-gama

IL-4       白细胞介素-4      interleukin-4

IgE        免疫球蛋白E       immnoglobuline

ELISA      酶联免疫吸附试验  enzyme linked immunosorbent assay

OD值       吸光度            absorbency

DXM        地塞米松          dexamethasone

Th cell    辅助T细胞         T helper cell

Th1 cell   1类辅助T细胞      T helper type1 cell

Th2 cell   2类辅助T细胞      T helper type2 cell

Min        分钟              minute

SD         标准差            standard deviation

1实验材料

Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)，60只，均为雄性，30只雌，34只雄，体重180～220克，浙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(沪)2007-0005。

皮炎净颗粒，为黄褐色颗粒，按实施例4方法制备，批号用070320。

卵白蛋白(OVA)，sigma公司，Grade V，Batch#：126k7009 EG 232-692-7

大鼠免疫球蛋白E(IgE)酶联检测试剂盒(进口分装，96孔)，浙大公司，批号：0801021

大鼠白细胞介素-4(IL-4)酶联检测试剂盒(进口分装，96孔)，浙大公司，批号：0801022

大鼠干扰素-γ(IFN-γ)酶联检测试剂盒(进口分装慰康，96孔)，浙大公司，批号：0801022

三氯化铝(AlCl3)，上海美兴化工有限公司，分析纯，批号：070601

氢氧化钠(NaOH)，枝江中星化工试剂有限公司，分析纯，批号：20070321

生理盐水，回音必集团(江西)东亚制药有限公司，批号：2007063018

醋酸地塞米松片(Dexamethasone，DXM)，浙江仙琚制业股份有限公司，批号：20070524

戊巴比妥钠，国营张家港市制药厂，批号：06122801

其它试剂均为国产分析纯。

WH-861型涡旋混合器，太仓市科教器材厂

HR-235BH冰箱，杭州华日电冰箱有限公司

MDF-U32V超低温冰箱，日本三洋(sanyo)

980-A型超声雾化器，上海医械专机厂(有限公司)

ZHZ5-2型水平离心机，北京医用离心机厂

SPX-150B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂

680型酶标仪，美国BIO-RAD公司

手术器械等。

2实验方法

2.1分组

将SD大鼠随机分成6组，分别为模型组、正常对照组、皮炎净颗粒低、中、高剂量组、阳性对照组(地塞米松)，每组各10只。各组SD大鼠均在相同条件下自由饮水、摄食。

2.2致敏

参照Santing等的方法，将卵白蛋白(OVA)2mg和氢氧化铝100mg溶于生理盐水1mL制成2mg/ml的凝胶。于实验的第1天，在每只大鼠两后足掌、腹股沟、腰、背、颈、腋窝共10点，每点0.05ml，皮下注射，同时腹腔注射0.5ml，共1ml；正常对照组仅用不含卵白蛋白(OVA)10％氢氧化铝凝胶1ml，注射容积和方法同上。第14天，各组以0.2％OVA 0.5ml腹腔注射，加强致敏；正常对照组以0.2％的生理盐水0.5ml代替。

2.3剂量设计及给药方法

实验第2天，各组开始按0.2ml/10g药量(体积/体重)灌胃给药。模型组与正常对照组灌胃给予生理盐水；皮炎净颗粒低、中、高剂量组分别用1.8g/kg、3.6g/kg、7.2g/kg的剂量灌胃给药，每天1次，共28天；阳性对照组于第21、23、25、27、29天灌胃给予地塞米松(0.5mg.kg^-1)，共5次。

2.4激发

实验第21d，给药后1小时，模型组、阳性对照组、皮炎净颗粒各组动物分批置于20cm×30cm×50cm的密闭玻璃质容器中，用1％OVA气雾吸入进行攻击，每次30分钟，以激发哮喘；正常对照组用生理盐水代替进行攻击。每天一次，直至第29天，共9次，以大鼠出现烦躁不安、呼吸急促、打喷嚏、口周发绀、腹肌抽搐、反应迟钝等表现，认为动物模型造模成功。

2.5取血

实验第30天，腹腔内注射戊巴比妥钠(30mg·kg^-1)麻醉，经腹腔主静脉取血。以3500r·min^-1速度，离心10分钟，分离血清，-80℃冰箱保存。

2.6检测

血清IgE、IL-4、IFN-γ含量测定均采用ELISA法，具体操作方法按试剂盒说明进行。

2.7统计

结果以均数±标准差(x±SD)表示，统计方法采用单因素方差分析进行组间比较，以最小显著差异法(LSD法)进行不同组别之间的两两比较(所用统计软件为SPSS 11.0)，以P＜0.05作为显著界限，P＜0.01作为极显著界限。

实验流程图参见图4。

3实验结果

3.1皮炎净颗粒对异位性皮炎大鼠血清IgE含量的影响

皮炎净颗粒对异位性皮炎大鼠血清IgE含量的影响，结果见表24、图5。

表24：各组异位性皮炎大鼠血清IgE值比较(x±SD，n＝10)

组别	动物数(只)	剂量(g·kg-1)	IgE(IU·mL-1)
				正常组	10	-	0.34±0.06
模型组	10	-	0.43±0.09△
				阳性组	10	DXM 5.0mg·kg-1	0.25±0.04**
低剂量组	10	1.8	0.30±0.03**
				中剂量组	10	3.6	0.28±0.05**
高剂量组	10	7.2	0.32±0.08*

注：△代表模型组与正常组比较，P＜0.05；

*代表高剂量组与模型组比较，P＜0.05；

**代表阳性组、低、中剂量组与模型组比较，Pp＜0.01。

从表24和图5可以看出：模型组SD大鼠的血清IgE含量高于正常组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明造模方法比较成功；阳性组(DXM，5.0mg·kg^-1)、皮炎净颗粒低剂量组(1.8g·kg^-1)与中剂量组(3.6g·kg^-1)SD大鼠的血清IgE含量极显著低于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)；皮炎净颗粒高剂量组(7.2g·kg^-1)SD大鼠的血清IgE含量低于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示皮炎净颗粒低、中、高剂量对治疗异位性皮炎具显著性疗效，能降低大鼠血清中IgE含量。

3.2皮炎净颗粒对异位性皮炎大鼠血清IFN-γ含量的影响

皮炎净颗粒对异位性皮炎大鼠血清IFN-γ含量的影响，结果见表25、图6。

表25：各组异位性皮炎大鼠血清IFN-γ值比较(x±SD，n＝10)

组  别

动物数(只)

剂量(g·kg-1)

IFN-γ(pg·mL-1)

正常组	10	-	47.64±6.86
				模型组	10	-	39.31±3.91△△
阳性组	10	DXM 5.0mg·kg-1	48.71±11.12*
				低剂量组	10	1.8	43.07±4.48
中剂量组	10	3.6	49.63±11.52*
				高剂量组	10	7.2	56.34±13.03**

注：△△代表模型组与正常组比较，IFN-γ含量降低，p＜0.01；

*代表阳性组、中剂量组与模型组比较，IFN-γ含量升高，p＜0.05；

**代表高剂量组与模型组比较，IFN-γ含量升高，p＜0.01。

IFN-γ为最具代表性的Th1类细胞因子之一。表25和图6结果表明，与正常组比较，异位性皮炎模型组血清中IFN-γ含量明显降低(P＜0.01)，提示病理状态下，Th1类细胞因子合成减少。给药后，皮炎净颗粒低剂量组(1.8g·kg^-1)与模型组比较变化不明显(P＝0.08＞0.05)；中剂量组(3.6g·kg^-1)和阳性组的IFN-γ含量均高于模型组(P＜0.05)；而高剂量组(7.2g·kg^-1)与模型组比较具极显著差异(P＜0.01)。皮炎净颗粒低、中、高剂量各组的血清IFN-γ含量升高程度与药物的浓度有一定的量效关系。结合表24，提示在异位性皮炎大鼠血清中，IFN-γ与IgE均呈显著负相关，说明IFN-γ为负向调控IgE合成的重要因素之一。

3.3皮炎净颗粒对异位性皮炎大鼠血清IL-4含量的影响

皮炎净颗粒对异位性皮炎大鼠血清IL-4含量的影响，结果见表26、图7。

表26：各组异位性皮炎大鼠血清IL-4值比较(x±SD，n＝10)

组别	动物数(只)	剂量(g·kg-1)	IL-4(pg·mL-1)
				正常组	10	-	61.01±5.24
模型组	10	-	74.76±15.60△
				阳性组	10	DXM 5.0mg·kg-1	61.64±8.33*
低剂量组	10	1.8	57.28±6.36*
				中剂量组	10	3.6	57.63±7.03*
高剂量组	10	7.2	66.22±6.90

注：△代表模型组与正常组比较，P＜0.05；

^*代表阳性组、低、中剂量组与模型组比较，P＜0.05。

表3和图3结果表明，与正常组比较，异位性皮炎模型组血清中IL-4含量明显增高(P＜0.05)，说明病理状态下，Th2类细胞因子合成增加。给药后，皮炎净颗粒高剂量组与模型组比较变化不明显(P＞0.05)；低、中剂量组和阳性组的IL-4含量均低于模型组(P＜0.05)。IL-4是最具代表性的Th2类细胞因子之一，在体内参与IgE的合成。结合表1，提示在异位性皮炎大鼠血清中，IL-4与IgE均呈显著正相关。实验结果与相关文献报道相一致，说明IL-4为正相调控IgE合成的重要因素之一。

3.4皮炎净颗粒对异位性皮炎大鼠血清IFN-γ/IL-4平衡的影响

皮炎净颗粒对异位性皮炎大鼠血清IFN-γ/IL-4平衡的影响，结果见表27、图8。

表27：各组异位性皮炎大鼠血清IFN-γ/IL--4值比较(x±SD，n＝10)

组别	动物数(只)	剂量(g·kg-1)	IFN-γ/IL-4
				正常组	10	-	0.78±0.13
模型组	10	-	0.55±0.12△△
				阳性组	10	DXM 5.0mg·kg-1	0.80±0.18**
低剂量组	10	1.8	0.76±0.11**
				中剂量组	10	3.6	0.87±0.20**
高剂量组	10	7.2	0.85±0.20**

注：△△代表模型组与正常组比较，P＜0.01；

**代表阳性组、低剂量组、中剂量组、高剂量组与模型组比较，P＜0.01。

IFN-γ与IL-4分别为Th1和Th2类细胞分泌的具有代表性的细胞因子，在IgE异常生成而导致异位性皮炎发作的因素中均起着相反的作用，二者相互制约，达到一种平衡状态。表27和图8结果表明，模型组的IFN-γ/IL-4比值比正常组低(P＜0.01)，并且可以看出IFN-γ/IL-4的比值与IgE相关程度很高，更说明了由于Th2类细胞因子占优势而导致的IFN-γ/IL-4的失衡状态对IgE生成具有重要意义。给药后，皮炎净颗粒低、中、高剂量组和阳性组与模型组比较均具极显著差异(P＜0.01)。提示皮炎净颗粒可调节IL-4及IFN-γ之间失衡而导致IgE异常合成，进而抑制异位性皮炎的发生。

研究结果发现，异位性皮炎大鼠模型组血清IgE含量显著高于正常对照组，说明可以通过监测AD大鼠的血清IgE水平来从侧面了解其病情的变化。另一方面，给药后，低、中剂量组和阳性组的IgE含量均低于模型组(P＜0.01)；高剂量组与模型组比较(P＜0.05)。提示皮炎净颗粒低、中、高剂量对治疗异位性皮炎具显著性疗效，能有效降低大鼠血清中IgE含量，起到抗炎作用。

以Th2优势为特征的Th1/Th2细胞亚群失衡是AD研究中的另一热点。Th1以分泌IFN-γ、Th2分泌IL-4为特征。表25和图6结果表明，与正常组比较，异位性皮炎大鼠模型组血清中IFN-γ含量明显降低(P＜0.01)，提示病理状态下，Th1类细胞因子合成减少。给药后，皮炎净颗粒低剂量组与模型组比较变化不明显(P＞0.05)；中剂量组和阳性组的IFN-γ含量均高于模型组(P＜0.05)；而高剂量组与模型组比较具极显著差异(P＜0.01)。说明在皮炎净颗粒的作用下，Th1细胞分泌功能加强，所分泌的IFN-γ明显增加。

表26和图7结果表明，与正常组比较，异位性皮炎大鼠模型组血清中IL-4含量明显增高(P＜0.05)，说明AD存在以Th2型细胞因子表达过度、Th1型细胞因子表达不足为特征的Th1/Th2平衡失调。给药后，皮炎净颗粒高剂量组与模型组比较变化不明显(P＞0.05)；低、中剂量组和阳性组的IL-4含量均低于模型组(P＜0.05)。说明皮炎净颗粒还能够抑制过高的Th2型细胞因子。

从表27和图8可以看出，给药后，皮炎净颗粒低、中、高剂量组和阳性组与模型组比较均具极显著差异(P＜0.01)。提示皮炎净颗粒可调节IL-4及IFN-γ之间失衡而控制IgE合成，进而抑制异位性皮炎的发生，调节AD大鼠Th1/Th2的失衡状态，这就合理的解释了皮炎净颗粒治疗异位性皮炎的机理。由于皮炎净颗粒没有任何副作用，故应用于治疗AD的前景令人乐观。

Claims (6)

1.一种用于治疗异位性皮炎的中药提取物，制备所述中药提取物的原料质量配比如下：

当归    10～30份

苍术    10～30份

黄芩    20～50份

防己    10～30份

柴胡    10～30份

所述的中药提取物包括挥发油提取物和水提取物，所述的挥发油提取物和水提取物分别按如下方法制备：

(1)挥发油提取物：称取配方量的当归和苍术，加入5～10倍质量的水浸渍后，于挥发油提取器中回流提取6～10小时，过滤，当归、苍术残渣备用，挥发油提取液冷却用乙醚萃取1～3次，得到乙醚萃取液，除去萃取液中的乙醚和水，得到挥发油；

(2)水提取物：将当归、苍术残渣与黄芩、防己和柴胡混合，加入水浸没，浸渍后，回流提取1～3次，每次1～2小时，得到水提取液过滤去除滤渣，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10，加入95％乙醇至乙醇体积含量为40～60％，静置12～24小时，过滤去除杂质，浓缩，得到浸膏干燥，得到浸膏粉末。

2.如权利要求1所述的中药提取物，其特征在于制备所述中药提取物的原料质量配比如下：

当归    20份

苍术    20份

黄芩    31.4份

防己    20份

柴胡    20份。

3.一种用于治疗异位性皮炎的颗粒剂，制备所述颗粒剂的中药原料质量配比如下：当归10～30份，苍术10～30份，黄芩20～50份，防己10～30份，柴胡10～30份，制备所述颗粒剂的方法包括：

(1)挥发油提取物：称取配方量的当归和苍术，加入5～10倍质量的水浸渍后，于挥发油提取器中回流提取6～10小时，过滤，当归、苍术残渣备用，挥发油提取液冷却用乙醚萃取1～3次，得到乙醚萃取液，除去萃取液中的乙醚和水，得到挥发油；

(2)水提取物：将当归、苍术残渣与黄芩、防己和柴胡混合，加入水浸没，浸渍后，回流提取1～3次，每次1～2小时，得到水提取液过滤去除滤渣，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10，加入80％～98％乙醇至乙醇体积含量为40～60％，静置12～24小时，上清液过滤去除杂质，浓缩，得到浸膏干燥，得到浸膏粉末。

(3)挥发油包合提取：称取β-环糊精，加入水，β-环糊精与水的用量比例为6～10g∶100mL，加热至完全溶解，降温，搅拌得到β-环糊精水溶液；取步骤(1)所得的挥发油，用等体积无水乙醇稀释，得到挥发油的乙醇溶液；将挥发油的乙醇溶液于30～50℃搅拌下滴入β-环糊精水溶液中，使挥发油、β-环糊精与水的用量比例为1mL∶6～10g∶100mL，滴加完毕后搅拌1～3小时，冷藏18～24小时，过滤、干燥，得β-环糊精包合物；

(4)取步骤(2)所得的浸膏粉末加入步骤(3)所得的β-环糊精包合物，搅拌均匀，制粒，干燥，得到所述治疗异位性皮炎的颗粒剂。

4.如权利要求3所述的颗粒剂，其特征在于所述的挥发油提取物按如下方法制备：称取配方量的当归和苍术，加入5～10倍质量的水浸渍0.5～2小时，于挥发油提取器中回流提取6～10小时，过滤，当归、苍术残渣备用，提取液冷却后，用乙醚萃取1～3次，得到乙醚萃取液，萃取液加无水硫酸钠脱水，过滤取滤液水浴挥干乙醚，得到挥发油。

5.如权利要求3所述的颗粒剂，其特征在于所述的水提取物按如下方法制备：将提取挥发油后的当归、苍术残渣与黄芩、防己和柴胡混合，加入10～15倍质量的水，浸渍0.5～2小时后，回流提取1～3次，每次1～2小时，得到水提取液过滤去除滤渣，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10，加入95％乙醇至乙醇体积含量为40～60％，静置12～24小时，上清液过滤去除杂质，浓缩，得到浸膏干燥，得到水提取物浸膏粉末。

6.如权利要求1所述的颗粒剂，其特征在于：制备所述颗粒剂的中药原料质量配比如下：当归20份，苍术20份，黄芩31.4份，防己20份，柴胡20份；制备所述颗粒剂的方法如下：

(1)当归、苍术挥发油提取：称取配方量的当归和苍术，加入8倍质量的水浸渍0.5小时，于挥发油提取器中回流提取8小时，提取液冷却后，用乙醚萃取3次，合并得到乙醚萃取液，萃取液加无水硫酸钠脱水，过滤取滤液水浴挥干乙醚，得到挥发油；

(2)当归、苍术的挥发油包合：称取β-环糊精，加入水，β-环糊精与水的用量比例为6g∶100mL，加热至完全溶解，降温至40℃，得到β-环糊精水溶液；取挥发油，用等体积无水乙醇稀释，得到挥发油的乙醇溶液；将挥发油的乙醇溶液于40℃搅拌下滴入β-环糊精水溶液中，使挥发油、β-环糊精与水的用量比例为1mL∶6～10g∶100mL，滴加完毕后搅拌3小时，冷藏24小时，过滤、干燥，得粉状β-环糊精包合物；

(3)水提取物的提取：将步骤(1)提取挥发油后的当归、苍术残渣与防己、柴胡和水燀过的黄芩混合，加入12倍质量的水，浸渍0.5小时后，回流提取2次，每次1小时，得到水提取液过滤去除滤渣，滤液浓缩至相对密度为1.10，加入95％乙醇至乙醇体积含量为50％，静置12小时，取上清液过滤去除杂质，浓缩，得到浸膏干燥，得到水提取物浸膏粉末；

(4)取步骤(3)得到的浸膏粉末加入步骤(2)制得的β-环糊精包合物，搅拌均匀，喷85％乙醇制软材，制粒机制粒，干燥，得到所述治疗异位性皮炎的颗粒剂。

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