CN101486966A - 一种动物细胞贴壁培养的生物反应器和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种动物细胞贴壁培养的生物反应器及细胞贴壁培养方法，生物反应器设有搅拌旋转轴和纤维绳，纤维绳为细胞贴壁培养载体；纤维绳张紧固定装置与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳安装在纤维绳张紧固定装置上。本发明由于纤维绳为培养载体，动物细胞附着在纤维绳上生长。由于搅拌旋转轴带动张紧固定装置上的纤维绳在生物反应器内旋转，可以使得贴在纤维上的细胞与反应器内的培养基进行充分的物质交换，使得细胞生长代谢的营养得到充足的供应。此外，附着在纤维上的细胞可以更方便地通过消化剂洗脱下来，从而通过管道接种到更大的生物反应器继续进行增殖培养，达到线性放大的大规模细胞培养的目的。

Description

一种动物细胞贴壁培养的生物反应器和方法

技术领域

本发明涉及动物细胞的贴壁培养技术，尤其涉及的是，一种动物细胞贴壁培养的生物反应器和方法。

背景技术

如图1所示，美国专利号为5501971的专利中，使用了一种固定床篮式搅拌系统固定聚酯切片培养贴壁动物细胞培养的技术：通过将聚酯切片载体固定在生物反应器的固定床篮式搅拌系统中，成堆积状，将细胞接种于生物反应器的罐体102中进行增殖培养；例如，固定载体篮103平放在罐内的固定位置，聚酯切片载体104堆积在所述固定载体篮103上，通过搅拌轴101旋转促进液体流动。如一个5L的生物反应器，可以装载150g左右聚酯切片，装入5L培养基，接种一定量的细胞进生物反应器，控制反应器的各种参数如温度、溶氧、pH等，细胞将附着在纤维表面生长并分裂增殖，增殖后的细胞可以接种病毒感染细胞进行疫苗的生产，分泌型细胞可直接分泌蛋白药物。

但是，其使用存在以下缺点。

1、其小型生物反应器中的使用可以实现生产的需要，但是在更大的生物反应器中，由于堆积的聚酯切片载体过多，则载体的堆积体积变大，外部的培养基进入内部载体的时间将变长，营养成分大部分被外部载体上的细胞消耗，内部的细胞获得的营养很少，也就是动物细胞在反应器内生长环境存在不均一的情况，因此内部的载体的利用率降低，从而造成单位载体实现的产量降低的情况。

2、无法实现生物反应器的线性放大。由于使用的聚酯切片是固定于生物反应器内固定床篮式搅拌系统内不动的，而聚酯切片载体之间相互堆积，即使使用了消化剂，细胞已经脱离聚酯切片载体表面，但是由于流体在聚酯切片载体中的流速过慢，细胞无法从聚酯切片载体装置中游离出来，因此无法采集到反应器内的细胞。所以只能使用转瓶或者方瓶等培养出来的细胞接种到生物反应器中，而无法实现从一个小的生物反应器接种到大生物反应器的过程。而用转瓶培养种子细胞的劳动量过大，无法实现更大规模生物反应器接种的要求。因此，很多生物制品生产厂家需要购买多台这样的反应器进行生产。这样的结果是劳动量大，容易染菌，生产效率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞生长均一，可以方便实现线性放大的动物细胞贴壁培养的生物反应器和培养方法。

本发明的技术方案如下：

一种动物细胞贴壁培养的生物反应器，设有搅拌旋转轴，设有一根或一根以上的纤维绳，纤维绳张紧固定装置；纤维绳为细胞贴壁培养载体；纤维绳张紧固定装置与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳安装在纤维绳张紧固定装置上。

装配生物反应器，将纤维绳张紧固定装置在搅拌旋转轴上，将纤维绳通过纤维绳张紧固定装置张紧。在生物反应器中加入培养液，接种种子细胞，搅拌轴在电机带动下转动，动物细胞在反应器中生长，由于纤维绳为动物细胞贴壁生长的载体，动物细胞附着在纤维绳上生长。由于搅拌旋转轴带动张紧固定装置上的纤维绳在生物反应器内旋转，可以使得贴在纤维上的细胞与反应器内的培养基进行充分的物质交换，使得细胞生长代谢的营养得到充足的供应。此外，附着在纤维上的细胞与现有的篮式堆叠的聚酯切片载体相比，可以更方便地通过消化剂洗脱下来，从而通过管道接种到更大的生物反应器继续进行增殖培养，达到线性放大的大规模细胞培养的目的。

作为本发明的改进，纤维绳固定装置由纤维绳固定悬挂件和纤维张紧件构成；纤维绳固定悬挂件由挂件固定联接部和挂件纤维固定部构成；挂件固定联接部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定安装在挂件纤维固定部上，纤维绳的另一端固定安装在纤维张紧件上。

作为本发明的具体化，纤维绳为聚酯纤维，纤维绳的横截面为四边形、三角形、椭圆形、圆形、一字形、星形、半圆形、月牙形、S形或多边形的任意一种。

作为本发明的具体化，纤维绳固定悬挂件为悬挂杆件构成的悬挂框架，悬挂框架分为悬挂框架固定部和悬挂杆纤维固定部，悬挂框架固定部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定在悬挂杆纤维固定部上；悬挂框架为平面框架，所述的框架由圆环、直杆、带杆件的圆环、方框、三角形、多边形等任意一种或组合构成；所述杆件的横截面为三角形、椭圆形、圆形、一字形、星形、半圆形、月牙形、S形或多边形的任意一种。

作为本发明的具体化，纤维绳固定悬挂件为悬挂板，悬挂板分为悬挂板固定部和悬挂板纤维固定部，悬挂板固定部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定在悬挂板纤维固定部上；所述的悬挂板为圆板、椭圆板、方板、三角板、多边形板、圆盘的任一形状，所述的悬挂板纤维固定部为开设有悬挂板上的小孔、缝隙、凸部或凹槽的任意一种。

作为本发明的具体化，纤维张紧器为一坠件，坠件上设有坠件纤维固定部，纤维一端固定在纤维固定部上；坠件纤维固定部为小孔、缝隙、凸部或凹槽的任意一种。

作为本发明的具体化，纤维张紧件为杆件构成的张紧框架，张紧框架分为张紧框架固定部和张紧杆纤维固定部，张紧框架固定部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定在张紧杆纤维固定部上；所述的张紧框架为平面框架，所述的框架由圆环、直杆、带杆件的圆环、方框、三角形、多边形等任意一种或组合构成；所述杆件的横截面为三角形、椭圆形、圆形、一字形、星形、半圆形、月牙形、S形或多边形的任意一种。

作为本发明的具体化，纤维绳固定张紧件为张紧板，张紧板分为张紧板固定部和张紧板纤维固定部，张紧板固定部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定在张紧板纤维固定部上；所述的张紧板为圆板、椭圆板、方板、三角板、多边形板、圆盘的任一形状，所述的张紧板纤维固定部为开设有张紧板上的小孔、缝隙、凸部或凹槽的任意一种。

一种动物细胞贴壁培养的方法，使用带有旋转搅拌轴生物反应器，搅拌轴生物反应器设有一根或一根以上的纤维绳，纤维绳张紧固定装置；所述的纤维绳为细胞贴壁培养载体；所述的纤维绳张紧固定装置与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳安装在纤维绳张紧固定装置上；培养的具体步骤为：

A、加入适量培养液，接种种子细胞到反应器中；

B、动物细胞在生物反应器中生长；生物反应器旋转轴转动，动物细胞进入细胞培养维持期；

C、附着在纤维绳上的细胞生长；

D、动物细胞培养成熟进行收获成熟细胞。

作为本发明的培养方法的改进，在以C步骤之后，D步骤之前增加如下步骤：

E、细胞培养成熟时，排出培养液；

F、将纤维绳上的细胞洗脱经管道进入下一级的大容积生物反应器；

G、在大容积生物反应器中重复B、C步骤，进行细胞培养。

采用改进后的培养方法，可以有效地实现动物细胞贴壁培养的线性放大培养。

采用本发明的技术方案，具体的应用到利用动物细胞贴壁培养生产的疫苗、蛋白药物等生物制品的生产上，解决了细胞在反应器内载体上生长环境的均一性，以及实现了贴壁动物细胞培养的生物反应器的线性放大，提高了生产效率。

附图说明

图1为现有技术的示意图；

图2是本发明的一种实施方式的示意图；

图3是本发明的框架的一种实施方式的结构示意图；

图4是本发明的框架的第二种实施方式的结构示意图；

图5是本发明的框架的第三种实施方式的结构示意图；

图6是本发明的框架的第四种实施方式的结构示意图；

图7是本发明的悬挂板的一种实施方式的结构示意图；

图8是本发明的张紧板的一种实施方式的结构示意图；

图9是本发明的坠子的一种实施方式的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

如图2所示，本发明提供了一种动物细胞贴壁培养的生物反应器，是一种具有旋转搅拌轴的生物反应器。设有搅拌旋转轴201；设有多根的纤维绳204，纤维绳为聚酯纤维，是动物细胞贴壁培养载体；纤维绳的横截面为四边形、三角形、椭圆形、圆形、一字形、星形、半圆形、月牙形、S形或多边形的任意一种；纤维绳张紧固定装置由纤维绳固定悬挂件203和纤维张紧件205构成；纤维绳固定悬挂件由挂件固定联接部206和挂件纤维固定部207构成；挂件固定联接部206与搅拌旋转轴201固定联接，纤维绳204一端固定安装在挂件纤维固定部上，纤维绳204的另一端固定安装在纤维张紧件205上。

实施例2

作为其他的实施方式，纤维绳204固定悬挂件为悬挂杆件构成的悬挂框架，悬挂框架分为悬挂框架固定部301和悬挂杆纤维固定部302，悬挂框架固定部301与搅拌旋转轴201固定联接，纤维绳204一端固定在悬挂杆纤维固定部302上；所述的悬挂框架为平面框架，如图3所示，所述的框架由圆环和直杆组合构成；如图4所示所述，框架由三角形和直杆组合构成；如图5所示所述，框架由四边形和直杆组合构成；如图6所示所述，框架直杆构成；所述杆件的横截面为三角形、椭圆形、圆形、一字形、星形、半圆形、月牙形、S形或多边形的任意一种。

与悬挂框架一样，纤维张紧件205为杆件构成的张紧框架，张紧框架分为张紧框架固定部305和张紧杆纤维固定部306，张紧框架固定部305与搅拌旋转轴201固定联接，纤维绳204一端固定在张紧杆纤维固定部306上；张紧框架为平面框架，如图3所示，所述的框架由圆环和直杆组合构成；如图4所示所述，框架由三角形和直杆组合构成；如图5所示所述，框架由四边形和直杆组合构成；如图6所示所述，框架直杆构成；杆件的横截面为三角形、椭圆形、圆形、一字形、星形、半圆形、月牙形、S形或多边形的任意一种。

实施例3

如图7所示，纤维绳固定悬挂件为悬挂板210，悬挂板为圆板，分为悬挂板固定部211和悬挂板纤维固定部212，悬挂板固定部211与搅拌旋转轴201固定联接，纤维绳一端固定在悬挂板纤维固定部212上；悬挂板纤维固定部212为开设有悬挂板上的小孔213。

悬挂板除为圆板以外，还可以为椭圆板、方板、三角板、多边形板、圆盘的任一形状，所述的、缝隙、凸部或凹槽的任意一种。

同样，张紧件可以与图8所示的悬挂板的结构一样。张紧板为圆板310，分为张紧板固定部311和张紧板纤维固定部312，张紧板固定部311与搅拌旋转轴201固定联接，纤维绳一端固定在张紧板纤维固定部312上；张紧板纤维固定部为开设有张紧板上的小孔313。

张紧板除为圆板以外，还可以为椭圆板、方板、三角板、多边形板、圆盘的任一形状，所述的缝隙、凸部或凹槽的任意一种。

实施例4

如图9所示，纤维张紧件为一坠件400，坠件上设有坠件纤维固定部401，纤维一端固定在纤维固定部401上；坠件纤维固定部为小孔。

同样，坠件纤维固定部401可以为缝隙、凸部或凹槽的任意一种。

实施例5

如图7、图8所示，所述装置包括两个圆盘，分别为悬挂板210、张紧板310，各圆盘一一对应的圆孔，悬挂板的结构如图7所示，悬挂板210上可以设置多个用于穿过纤维绳的圆孔213(即固定载体小洞)，该悬挂板可以通过固定部211固定在搅拌轴上。张紧板的机构如图8所示，张紧板为圆板310，分为张紧板固定部311和张紧板纤维固定部312，张紧板固定部311与搅拌旋转轴201固定联接，纤维绳一端固定在张紧板纤维固定部312上；张紧板纤维固定部为开设有张紧板上的小孔313。一条很长的纤维绳分别轮流穿过悬挂板和张子板对应的圆孔，穿孔的方式可以有很多种，本发明对此没有额外的限制，只需能够使所述纤维绳在各挂件之间呈绷紧状态固定设置即可。

实施例6

一种动物细胞贴壁培养的方法，使用带有旋转搅拌轴生物反应器，其特征在于所述的搅拌轴生物反应器设有十四根的纤维绳，纤维绳张紧固定装置；所述的纤维绳为细胞贴壁培养载体；所述的纤维绳张紧固定装置与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳安装在纤维绳张紧固定装置上；培养的具体步骤为

A、加入适量培养液，接种种子细胞到反应器中；

B、动物细胞在生物反应器中生长；生物反应器旋转轴转动，动物细胞进入细胞培养维持期；

C、附着在纤维绳上的细胞生长；

D、动物细胞培养成熟进行收获成熟细胞。

实施例7

一种动物细胞贴壁培养的方法，使用带有旋转搅拌轴生物反应器，其特征在于所述的搅拌轴生物反应器设有十根的纤维绳，纤维绳张紧固定装置；所述的纤维绳为细胞贴壁培养载体；所述的纤维绳张紧固定装置与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳安装在纤维绳张紧固定装置上；培养的具体步骤为：

A、加入适量培养液，接种种子细胞到反应器中；

B、动物细胞在生物反应器中生长；生物反应器旋转轴转动，动物细胞进入细胞培养维持期；

C、附着在纤维绳上的细胞生长；

E、细胞培养成熟时，排出培养液；

F、将纤维绳上的细胞洗脱经管道进入下一级的大容积生物反应器；

G、在大容积生物反应器中重复B、C步骤，进行细胞培养；

D、动物细胞培养成熟进行收获成熟细胞。

实施例8

1、准备两个实施例5的生物反应器，其中一个5L，另一个50L；

2、5L生物反应器圆盘开有130个小洞，两个圆盘之间距离为100mm，可装载13米纤维绳载体；

3、50L生物反应器圆盘开有300个小洞，两个圆盘之间的距离为250mm，可装载75米纤维绳载体；

4、将两个反应器装好载体后进行消毒；

5、加入适量培养基到5L生物反应器中，接种一定量的种子细胞到该反应器中，控制反应器的控制参数，如温度、溶氧、pH等，让细胞在5L生物反应器中进行生长增殖；

6、待细胞在5L生物反应器中生长到一定量时，利用胰酶等消化剂将细胞从5L反应器中洗脱下来；

7、加入适量的培养基到50L生物反应器中，将5L生物反应器中的细胞接种到50L生物反应器中；

8、细胞将会在50L生物反应器中继续进行生长增殖，这样便实现了线性放大的生产要求。

9、收获成熟细胞。

本发明涉及利用生物反应器进行大规模动物细胞的贴壁培养技术。例如，通过使用固定在生物反应器内搅拌轴上的两个开有多个小洞的圆盘固定由聚酯纤维制成的纤维绳载体，让细胞在纤维上附着生长，实现细胞的分裂增殖，同时本发明的技术可以实现动物细胞培养的线性放大，即将一个小体积生物反应器上增殖好的细胞洗脱下来接种到更大的生物反应器上继续进行增殖培养。附着在纤维上的细胞可以通过消化剂洗脱下来，接种到更大的生物反应器继续进行增殖培养，达到大规模细胞培养的目的。同样，贴壁生长于纤维载体表面上的细胞可以利用胰酶等消化剂很容易就洗脱下来。

Claims (10)

1、一种动物细胞贴壁培养的生物反应器，设有搅拌旋转轴，其特征在于设有一根或一根以上的纤维绳，纤维绳张紧固定装置；所述的纤维绳为细胞贴壁培养载体；所述的纤维绳张紧固定装置与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳安装在纤维绳张紧固定装置上。

2、如权利要求1所述的生物反应器，其特征在于所述的纤维绳固定装置由纤维绳固定悬挂件和纤维张紧件构成；纤维绳固定悬挂件由挂件固定联接部和挂件纤维固定部构成；挂件固定联接部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定安装在挂件纤维固定部上，纤维绳的另一端固定安装在纤维张紧件上。

3、如权利要求2所述的生物反应器，其特征在于所述纤维绳为聚酯纤维，纤维绳的横截面为四边形、三角形、椭圆形、圆形、一字形、星形、半圆形、月牙形、S形或多边形的任意一种。

4、如权利要求3所述的生物反应器，其特征在于所述的纤维绳固定悬挂件为悬挂杆件构成的悬挂框架，悬挂框架分为悬挂框架固定部和悬挂杆纤维固定部，悬挂框架固定部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定在悬挂杆纤维固定部上；

所述的悬挂框架为平面框架，所述的框架由圆环、直杆、带杆件的圆环、方框、三角形、多边形等任意一种或组合构成；所述杆件的横截面为三角形、椭圆形、圆形、一字形、星形、半圆形、月牙形、S形或多边形的任意一种。

5、如权利要求3所述的生物反应器，其特征在于所述的纤维绳固定悬挂件为悬挂板，悬挂板分为悬挂板固定部和悬挂板纤维固定部，悬挂板固定部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定在悬挂板纤维固定部上；

所述的悬挂板为圆板、椭圆板、方板、三角板、多边形板、圆盘的任一形状，所述的悬挂板纤维固定部为开设有悬挂板上的小孔、缝隙、凸部或凹槽的任意一种。

6、如权利要求1至5所述任一的生物反应器，其特征在于所述的纤维张紧器为一坠件，坠件上设有坠件纤维固定部，纤维一端固定在纤维固定部上；坠件纤维固定部为小孔、缝隙、凸部或凹槽的任意一种。

7、如权利要求1至5所述任一的生物反应器，其特征在于所述的纤维张紧件为杆件构成的张紧框架，张紧框架分为张紧框架固定部和张紧杆纤维固定部，张紧框架固定部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定在张紧杆纤维固定部上；

所述的张紧框架为平面框架，所述的框架由圆环、直杆、带杆件的圆环、方框、三角形、多边形等任意一种或组合构成；所述杆件的横截面为三角形、椭圆形、圆形、一字形、星形、半圆形、月牙形、S形或多边形的任意一种。

8、如权利要求1至5所述任一的生物反应器，其特征在于所述的纤维绳固定张紧件为张紧板，张紧板分为张紧板固定部和张紧板纤维固定部，张紧板固定部与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳一端固定在张紧板纤维固定部上；

所述的张紧板为圆板、椭圆板、方板、三角板、多边形板、圆盘的任一形状，所述的张紧板纤维固定部为开设有张紧板上的小孔、缝隙、凸部或凹槽的任意一种。

9、一种动物细胞贴壁培养的方法，使用带有旋转搅拌轴生物反应器，其特征在于所述的搅拌轴生物反应器设有一根或一根以上的纤维绳，纤维绳张紧固定装置；所述的纤维绳为细胞贴壁培养载体；所述的纤维绳张紧固定装置与搅拌旋转轴固定联接，纤维绳安装在纤维绳张紧固定装置上；培养的具体步骤为

A、加入适量培养液，接种种子细胞到反应器中；

B、动物细胞在生物反应器中生长；生物反应器旋转轴转动，动物细胞进入细胞培养维持期；

C、附着在纤维绳上的细胞生长；

D、动物细胞培养成熟进行收获成熟细胞。

10、如权利要求9所述的动物细胞贴壁培养的方法，其特征在于：在以C步骤之后，D步骤之前增加如下步骤：

E、细胞培养成熟时，排出培养液；

F、将纤维绳上的细胞洗脱经管道进入下一级的大容积生物反应器；

G、在大容积生物反应器中重复B、C步骤，进行细胞培养。

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