CN101477049A - 一种检测中药材抗流感病毒活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种检测中药材抗流感病毒活性的方法，属于对中药材生物活性进行检测的技术领域。本发明所述的方法包括流感病毒神经氨酸酶(NA)原酶液的制备和中药材样品的制备，通过设置样品测试组、背景对照组和酶活性对照组来获得荧光检测样品，根据化合物4－methylumbelliferyl－D－N－acetylneuraminate(MUNANA)是NA的特异性底物，在NA作用下的产物7－Hydroxy－4－methylcoumarin(4MU)在355nm入射波长激发下，可以产生460nm荧光，如果反应体系中加入能够抑制NA活性的药物，则随着荧光产物4MU生成的减少，所检测到的荧光强度会相应减弱，从而该药物的NA抑制活性就能通过荧光强度的变化被表征的原理，对中药材的抗流感病毒活性进行测定。

Description

一种检测中药材抗流感病毒活性的方法

技术领域：

本发明涉及对中药材生物活性检测方法技术领域，具体涉及一种检测中药材中抗流感病毒生物活性的方法。

背景技术：

流感病病毒神经氨酸酶(NA)是影响流感病毒复制、感染和致病的关键酶，NA抑制药可以通过抑制NA活性而有效地控制流感症状和疾病的传播，NA活性可以通过检测荧光的变化被表征，NA活性荧光检测法已发展为抗流感病毒药物的筛选和活性评价的重要方法，但其多用于西药、植物药的单体成分的抗流感病毒活性检测和评价，该方法尚无用于在中药材的抗病毒活性筛选和评价中的报道。

当前，板蓝根等清热解毒类中药抗流感病毒活性检测和评价常采用整体动物试验、病毒感染细胞试验、红细胞凝集试验等，采用的观测手段和方法则主要是肉眼观测、光学显微镜观察、物理称重、常规生化指标检测等，结果表现形式以状态描述、定性、半定量为主，因此无法达到测量结果精密度高、重复性好以及样品在检测时性质稳定的要求。

且由于原NA活性检测方法主要用于化学单体的活性检测，背景干扰较小，酶活性对照组以及背景对照组并未加入被测样品，而对检测结果的准确性影响较小，但由于板蓝根等中药化学成分复杂，背景干扰大，无法直接将原NA活性检测方法直接应用于板蓝根、黄芩、金银花、连翘等清热解毒类中药以及它们所含活性成分的抗流感病毒活性检测。

发明内容：

化合物MUNANA(4-methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid)是NA的特异性底物，在NA作用下的产物4-甲基-7羟基香豆素(4M，7-Hydroxy-4-methylcoumarin，C10H803)在355nm入射波长激发下，可以产生460nm荧光，采用荧光检测器测定该波长荧光强度(Fluorescence Intensity)的变化，可以灵敏地反应NA活性；同样，如果反应体系中加入能够抑制NA活性的药物，则随着荧光产物4MU生成的减少，所检测到的荧光强度会相应减弱，从而该药物的NA抑制活性就能通过荧光强度的变化被表征。

针对传统方法中对板蓝根等清热解毒类中药抗流感病毒活性检测和评价方法的缺点以及原NA活性检测方法无法直接应用于中药材以及中药中特定成分的检测的缺点，本发明结合某些中药具有抑制NA活性的作用，化合物MUNANA是NA的特异性底物，MUNANA与NA的反应产物具可发出荧光的特点提出了一种新的检测方法。

本发明公开了一种新检测中药材抗流感病毒活性的方法。

本发明的技术方案如下：

一种检测中药材抗流感病毒活性的方法，它包括以下步骤：

a、NA原酶液的制备：用含1g·L^-1牛血清白蛋白和5mg·L^-1胰酶的细胞维持液将流感病毒稀释10倍后加入到MDCK单层细胞的细胞培养瓶中，于37℃、5％ CO₂条件下培养2天后，于-70℃冻存，反复冻融2次后在4℃、800g·min^-1条件下离心10min，取上清液，加入0.1％(W/V)NP_-40，分装置-70℃保存备用；

b、中药材样品的制备：将中药材粉碎后，加8-10倍量的溶媒进行提取后过滤，取滤液，回收溶媒获得提取物，将所得提取物溶解后微孔滤头除菌，备用；

c、设置样品测试组：将上述步骤a和b中获得的物质以1:1的比例进行混合后，室温下作用30min后加入相同体积的MUNANA，37℃下孵育60min后加入终止液终止反应；

d、设置背景对照组：将步骤b中获得的中药材样品与MUNANA以2:1进行混合后用buffer补足至相同体积；

e、设置酶活性对照组：将步骤c中获得的NA原酶液与MUNANA以2:1进行混合后，待反应结束后加入与原酶液同样体积的样品溶液；

f、将步骤c、d、e获得的反应液用荧光酶标检测仪进行检测后，按下式获得抑制率I；

g、对步骤b中中药材样品的剂量和步骤f中抑制率I的数据用量反应平行线测定法进行处理，获得中药材样品的生物效价。

上述的方法，其中在所述步骤a之后还包括用MUNANAN对NA原酶液中NA活性的标定步骤。

上述的方法，其中所述步骤b中的中药材样品的原料为板蓝根、黄芩、金银花或连翘等中的一种。

上述的方法，其中所述步骤b中的溶媒为水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或缓冲液中的一种。

上述的方法，其中所述步骤b中的提取方法为选自加热回流提取、超声波提取或冷浸搅拌提取中的一种，所述加热回流提取步骤为两次提取过程，第一次加10倍量溶媒提取60min，第二次加8倍量溶媒提取30min，合并2次提取液；所述超声波提取的步骤为加10倍量溶媒超声60min，过滤取滤液；所述冷浸搅拌提取的步骤为加10倍量溶媒常温或低温下搅拌，过滤取滤液。

由于采用了上述的技术方案，本发明的检测方法相对于传统的检测方法具有以下优点：

1、在本发明的检测方法中首次以体外检测NA活性的方法来表征中药抗病毒活性，通过荧光检测的手段克服了现有技术中检测中药抗病毒方法中以肉眼或光学显微镜观察的缺点，具有灵敏和高通量的优点。

2、现有酶活性标定方法主要是基于红细胞凝集试验，其准确性和重复性较差。本发明的检测方法中改进了酶活性标定方法，以化学性质稳定的底物MUNANA为参比，提高了标定的准确性并具备了可溯源性。

3、现有的NA活性检测方法主要用于化学单体的活性检测，背景干扰较小，酶活性对照组以及背景对照组并未加入被测样品，而对检测结果的准确性影响较小。但由于板蓝根等中药化学成分复杂，背景干扰大，在结果处理时必须充分扣除假阴性和假阳性干扰才能保证结果的准确性和可靠性，因此在本发明的检测方法中对于加样方法和背景扣除方法进行了改进，利用酶促反应可以人为终止的特点，在酶活性对照组的反应体系中在酶促反应结束后加入了被测样品，可以最大程度的扣除样品本身所带来的荧光干扰，提高了检测结果的真实性。

附图说明：

1、图1为板蓝根NA抑制作用量效关系曲线；

2、图2为图1中抑制率转换成几率单位后，对数剂量与几率单位的线性关系。

具体实施方式：

为使本发明的内容更易被了解，下面以板蓝根为例对本发明专利申请作进一步说明：

一、材料：

1、药材与试剂：

板蓝根药材，均为来源于十字花科(Cruciferae)植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根；

阳性对照药：达菲胶囊(Oseltamivir phosphate Capsules)，批号：B1212，Roche pharma(Schweiz)公司；

NA底物：4-methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid(MUNANA，Sigma公司)；

NP-40(Fluka公司)；DMEM(GIBCO公司)；CaCl₂(北京化工厂)；其余为分析纯。

2、主要仪器

FLUOstar OPTIMA荧光酶标检测仪，德国BMG公司；II型生物安全柜，NUAIRE产品；恒温CO₂细胞培养箱，MCO-15AC，日本SANYO公司；CK40-F200倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；96孔荧光酶标板，美国COSTAR公司；

3、细胞系、病毒株及NA

MDCK细胞：军事医学科学院微生物传染病研究所提供。

流感病毒：A/PR8/34，国家疾病控制中心提供。

二、方法和步骤：

2.1 流感病毒神经氨酸酶的制备

2.1.1 MDCK细胞的复苏及传代

1)将冻存的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中并不停地摇动，使细胞冻存液快速融化。

2)用毛细吸管将其中的细胞悬液吸入事先准备好的离心管中，轻吹，使其混匀。

3)4℃，500g·min^-1，离心5min。

4)弃去上清液，加入5-10mL细胞生长液，用毛细吸管轻轻吹散，并移入细胞培养瓶中，摇匀，置37℃、5％ CO₂培养箱内培养。

5)每3天细胞传代一次。传代时将细胞培养瓶中的细胞生长液倒掉，加入PBS清洗2遍以清除细胞碎片和残留的细胞生长液。

6)加入2mL0.25％胰酶，37℃放置5-10分钟。

7)倒掉消化液，加入细胞生长液，用毛细吸管将瓶壁上的细胞轻轻吹下、吹散。

8)将细胞吸入离心管，500g·min^-1，离心5min。

9)倒掉上清液，加入6mL细胞生长液，用毛细吸管轻轻吹散，分成3瓶，加细胞生长液8mL，摇匀，置37℃、5％ CO₂培养箱内培养。

10)倒置显微镜下观察细胞生长状态。

2.1.2 病毒感染细胞和NA的制备

1)MDCK细胞生长成良好的单层细胞。

2)用细胞维持液(不含胎牛血清，含1g·L^-1的牛血清白蛋白和5mg·L^-1的胰酶)将A/PR8/34流感病毒鸡胚尿囊液做成10倍稀释并加入细胞培养瓶中。

3)置37℃、5％ CO₂培养箱内培养。约2天，待镜下观察细胞病变为“++++”后，放入-70℃冰箱中冻存。

4)反复冻融2次。

5)4℃，800g·min^-1离心10min，取上清，加入0.1％(W/V)NP_-40，分装后作为NA原液，置-70℃保存备用。

2.2 NA活性的标定

2.2.1 NA活性标定的意义及原理

意义：采用本方法检测和评价药物的抗病毒活性是基于检测NA活性在受药物干预前后的变化来表征的，因此必须保证在受药物干预前所用NA的活性的相对一致性才能保证检测结果的一致性和可比性。本方法是通过生物反应来制备NA，NA批次之间的活性存在一定的差异，所以有必要对NA的活性进行标定，以便于在各次试验中进行NA活性调整。

原理：由于NA与特异性底物MUNANA结合可以释放出荧光产物，通过检测荧光的强度可以反映出NA的活性，而特异性底物MUNANA是相对稳定的化学物质，且有固定来源(Sigma公司)，因此本研究以MUNANA为参比标定NA的活性。

2.2.2 标定方法及步骤

1)用Buffer(pH＝7.0)缓冲液稀释NA原液，稀释倍数：2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、40倍、80倍。

2)MUNANA浓度固定为0.02mM.

3)加样：96孔酶标板，每孔分别加入50μL MUNANA以及50μL不同浓度NA稀释液，每一NA浓度加样设复孔，结果计算时取平均值。

4)加样完毕，置37℃条件下反应30min立即检测。

5)检测参数：仪器FLUOstar OPTIMA荧光酶标检测仪，检测温度37℃，增益值固定为1576，激发波长355nm，发射波长460nm。

6)回归方程：以测得荧光值为纵坐标，NA稀释度的倒数为横坐标作图，取荧光值10000以上部分进行线性回归得到回归方程：y＝kx+b，R值应为0.99以上，否则调整重做。

7)NA活性的赋值：Y＝15000对应的稀释液(50μL)含100个活性单位NA。

2.3 样品溶液的制备

2.3.1 药材前处理：净选、干燥(50℃烘干)、粉碎成粉末(过《中国药典》规定4号筛)。

2.3.2 提取方法

1)加热回流法：分别加10倍、8倍量溶媒提取2次，首次60min，第二次30min。合并2次提取液，回收溶媒并浓缩，滤除沉淀备用或冷冻干燥成干燥提取物粉末。

2)超声提取：加10倍量溶媒超声60min，过滤取滤液，回收溶媒并浓缩过滤备用或冷冻干燥成干燥提取物粉末。

3)冷浸搅拌提取：加10倍量溶媒常温或低温下搅拌，过滤取滤液，回收溶媒并浓缩过滤备用或冷冻干燥成干燥提取物粉末。

2.3.3 提取用溶媒：水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、缓冲液。

2.3.4 样品溶液：将提取物溶解于蒸馏水(或缓冲液或生理盐水)微孔滤头除菌，配置成需要的浓度，冰箱保存备用。

2.4 加样及检测

2.4.1 加样方法

将反应设置在96孔荧光酶标板中进行。首先加入25μL稀释的原酶液和25μL样品溶液，室温下作用30min后加50μLMUNANA，37℃孵育60min后加入200μL终止液终止反应。为便于活性比较，同时设样品测试组(NA+样品+MUNANA)，背景对照组(样品+MUNANA，buffer补足至相同体积)，酶活性对照组(NA+MUNANA，反应终止后再加入同体积样品溶液)。

2.4.2检测

采用FLUOstar OPTIMA荧光酶标检测仪检测，温度37℃，增益调整90％，激发波长355nm，发射波长460nm。

2.5 结果处理

2.5.1 抑制率计算：将测得荧光值(取复孔的平均值)按以下公式计算样品对NA活性的抑制率(I)。

2.5.2 量效曲线图示：

以抑制率对样品浓度作图，以反映作用曲线的类型和线性关系，本研究测得板蓝根对照药材标准量效曲线图如图1所示，图1中板蓝根对NA的抑制率即反应率与板蓝根样品的加样量的对数剂量之间呈对称的“S”形曲线，这是一个典型的药理阳性反应曲线的类型；而图2中当反应率转换成几率单位后，对数剂量与几率单位呈线性关系，表明该反应的定量(效价测定)可以采用“量反应平行线法”。在4.88×10^-2～25mg·mL^-1剂量范围内，回归方程Y(几率单位)＝8.7259+1.2169×Log(D)，R＝1。

2.5.3 活性的表示与计算

1)半数抑制率(IC₅₀)表示法

根据I值以正规BLISS法(由DAS ver1.0软件统计完成)计算样品的半数抑制率以IC₅₀表示样品的作用强度(生物活性)。

结果表示形式：中间值±95％可信限范围。

2)生物效价表示法

以标准对照药材制备成标准提取物，对标准提取物分别进行化学成分标定和生物标定，赋予标准提取物抗流感病毒效价(PS)为1U·mg^-1。

根据生物检定平行线测定原理采用量反应的平行线测定法进行样品与对照品效价的对比检定。

i.根据预试验，通过比较对照品(S)与被检样品(T)的反应率估算被检品的效价(A_T)，在线性范围内调整被检样品浓度使与对照品活性接近，用概率单位(4·4)法在50％反应率上下设相同的浓度梯度。

ii.将检测所得反应率和浓度值分别输入DAS ver1.0软件得到对数剂量(x)、Expect probit(Y)、Working probit(y)、各反应点的权重(nw)。

iii.直线回归方程式的校正：由x、y、nw分别计算x，y，b将其值代入y＝y+b(x-x)，即可得S和T校正直线的回归方程。

x，y，b的计算公式： $\stackrel{\‾}{x}=\frac{\mathrm{\Σnwx}}{\mathrm{\Σnw}},$ $\stackrel{\‾}{y}=\frac{\mathrm{\Σnwy}}{\mathrm{\Σnw}},$ $b=\frac{\mathrm{\ΣSxy}}{\mathrm{\ΣSxx}},$

sxy＝∑nw(x-x)(y-y)，sxx＝∑nw(x-x)²，syy＝∑nw(y-y)²

iv.连续校正：将各x值代入上述回归方程，求得y值的第一次校正概率单位Y₁。比较Y与Y₁的差值，如果|Y₁-Y|>0.2，必须进行第二次校正。

v.可靠性检验：偏离直线检验 ${\mathrm{\χ}}^2=\mathrm{\ΣSyy}-\mathrm{\Σ}\left(\frac{{\left(\mathrm{Sxy}\right)}^2}{\mathrm{Sxx}}\right),$ f＝S_{剂量组 数}+T_剂量组数-4

偏离平行检验 ${\mathrm{\χ}}^2=\mathrm{\Σ}\left(\frac{{\left(\mathrm{Sxy}\right)}^2}{\mathrm{Sxx}}\right)-\frac{{\left(\mathrm{\ΣSxy}\right)}^2}{\mathrm{\ΣSxx}},$ f＝1

以上χ²值应小于

则P>0.05，S和T两条直线不显著地偏离直线和偏离平行，两者为平行线关系。

vi.效价计算：PT＝R·PS

首先求得S和T平行线之间平行于横轴的连线M， $M=\log R={\stackrel{\‾}{x}}_S-{\stackrel{\‾}{x}}_T-\frac{{\stackrel{\‾}{y}}_S-{\stackrel{\‾}{y}}_T}{b}.$

可信限：

$\mathrm{FL}={\stackrel{\‾}{x}}_s-{\stackrel{\‾}{x}}_T+\frac{M-{\stackrel{\‾}{x}}_S+{\stackrel{\‾}{x}}_T}{1-g}\±\frac{t}{b(1-g)}\sqrt{(1-g)\mathrm{\Σ}\left(\frac{1}{\mathrm{\Σnw}}\right)+\frac{{(M-{\stackrel{\‾}{x}}_S+{\stackrel{\‾}{x}}_T)}^2}{\mathrm{\Σ}{S}_{\mathrm{xx}}}}$

式中， $g=\frac{t^2}{b^2\mathrm{\Σ}{S}_{\mathrm{xx}}},$ t＝1.96

vii.结果形式：效价以P_T和FL％表示(P_T为效价中间值，FL％为结果的可信限率)。

三、检测过程的数据以及检测样品结果：

1、运算过程及结果的表示形式：

表1 数据的输入和中间运算过程

表2 结果表示

 

AT	偏离直线	偏离平行	R	FLR	FL平均	☆FL％	#PT
								21	0.997	0.456	0.996	0.771～1.337	0.283	28.43％	20.92

表1中的剂量是指酶活性对照组和板蓝根样品提取物溶液的实际剂量，以U(活性单位)·mL^-1表示，该部分数值直接输入计算机。其中的^△抑制率是指反应结束时测得的荧光值变化用公式

计算求得，该部分数值直接输入计算机。其余数值为按照统计原理设计的统计软件自动运算的中间及最终结果。

表2中的^#P_T为板蓝根样品的效价中间值，^☆FL％为结果的可信限率，表明该结果在一定范围内的可信程度，是检测得到的量值的一种科学的表述。

2、板蓝根样品的检测结果：

注：*可靠性检验：偏离直线P>0.05，偏离平行P>0.05，说明通过可靠性检验；^▲4批样品采自GAP基地；^△2批样品购自市场的陈货(可见虫蛀变质)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (5)

1、一种检测中药材抗流感病毒活性的方法，它包括以下步骤：

a、NA原酶液的制备：用含1g·L^-1牛血清白蛋白和5mg·L^-1胰酶的细胞维持液将流感病毒稀释10倍后加入到MDCK单层细胞的细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂条件下培养2天后，于-70℃冻存，反复冻融2次后在4℃、800g·min^-1条件下离心10min，取上清液，加入0.1％(W/V)NP_-40，分装置-70℃保存备用；

b、中药材样品的制备：将中药材粉碎后，加8-10倍量的溶媒进行提取后过滤，取滤液，回收溶媒获得提取物，将所得提取物溶解后微孔滤头除菌，备用；

c、设置样品测试组：将上述步骤a和b中获得的物质以1：1的体积比混合后，室温下作用30min后加入相同体积的MUNANA，37℃下孵育60min后加入终止液终止反应；

d、设置背景对照组：按步骤b中各溶液的体积比将步骤b中获得的中药材样品与MUNANA混合后用buffer补足至与步骤c相同的体积；

e、设置酶活性对照组：按步骤b中各溶液的体积比将步骤a中获得的NA原酶液与MUNANA混合后，待反应结束后加入样品溶液；

f、将步骤c、d、e获得的反应液用荧光酶标检测仪进行检测后，按下式获得抑制率I；

g、对步骤b中中药材样品的剂量和步骤f中抑制率I的数据用量反应平行线测定法进行处理，获得中药材样品的生物效价。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤a之后还包括用MUNANAN对NA原酶液中NA活性的标定步骤。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b中的中药材样品的原料为板蓝根、黄芩、金银花或连翘中的一种。

4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤b中的溶媒为水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或缓冲液中的一种。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤b中的提取方法为选自加热回流提取、超声波提取或冷浸搅拌提取中的一种。

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