CN101475948B

CN101475948B - 合成苏云金素的基因簇

Info

Publication number: CN101475948B
Application number: CN2009100605304A
Authority: CN
Inventors: 孙明; 喻子牛; 阮丽芳; 陈守文; 刘晓艳; 彭东海
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2009-01-19
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2029-01-19
Also published as: WO2010081282A1; CN101475948A; US20120015404A1

Abstract

本发明属于农业微生物基因工程技术领域。具体涉及一种苏云金芽胞杆菌中负责苏云金素合成的基因簇的制备及其应用。所述的基因簇包含thuA，thuB，thuC，thuD，thuE，thuF，thuG，thu1，thu2，thu3，thu4共11个基因，这些基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码苏云金素生物合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2-12所示。本发明所提供的基因及其编码的蛋白质可以用来作为农药杀虫剂库新型核苷类先导化合物，为杀虫剂的开发提供新型靶标；在实际应用中，通过结构改造也将会得到一系列新型高效低毒杀虫剂。

Description

合成苏云金素的基因簇

技术领域

本发明涉及的是一种核苷类的杀虫毒素及其生物编码基因，具体涉及一种合成(编码)苏云金素的基因簇，该基因簇来源于苏云金芽胞杆菌CT-43菌株中，属于农业微生物基因工程技术领域。

技术背景

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阳性细菌。它区别于蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)的主要特征是在形成芽胞的同时，在菌体内的一端或两端能形成具蛋白质性质的一个、两个，乃至多个菱形、方形或不规则形的杀虫晶体蛋白(lnsecticidal crystal proteins，ICPs)组成的伴胞晶体，占细胞干重的25-30％左右(喻子牛，苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白及其基因的研究与应用，《李阜棣等主编，生命科学和土壤学中几个领域的研究进展》，北京：农业出版社，1993，170-179页)。晶体蛋白对节肢动物门中鳞翅目、双翅目、鞘翅目等9个目的500多种昆虫，线形动物门中的动植物寄生线虫，扁形动物门中的吸虫，原生动物门中疟原虫和滴虫，以及癌细胞等有害种类有毒杀活性，但是对脊椎动物没有毒性(Schnepf E，Bacillus thuringiensis and its pesticidalcrystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62：775-806；Pigott C R，Role of receptors in Bacillusthuringiensis crystal toxin activity.Microbiol Mol Biol Rev，2007，71：255-281)。苏云金芽胞杆菌是目前世界上产量最大、应用最广，唯一能与化学农药竞争的杀虫剂，它具有杀虫效果高，对人畜安全无毒，不污染环境，不杀伤害虫天敌和有益生物，能保持生态平衡，害虫难以产生抗药性，在农业、林业等害虫的可持续控制中发挥重要的作用，已广泛用于防治农业害虫、林业害虫、贮藏害虫和医学昆虫。

苏云金素是由某些苏云金芽胞杆菌产生的小分子量杀虫活性物质(大小为701kDa)，具有广谱性、低毒性、热稳定性好、降解慢等特点。苏云金素亦称β-外毒素、蝇因素、热稳定外毒素，是核苷类物质，由腺苷、核糖、葡萄糖、别粘酸和磷酸组成，其分子比为1∶1∶1∶1。由于结构的差异，苏云金素有多种类似物。苏云金素是DNA依赖性的RNA聚合酶的酶抑制剂，与ATP竞争酶的结合位点，从而造成害虫的死亡。

最早发现苏云金素是由苏云金芽胞杆菌苏云金亚种产生，在细菌的营养生长阶段产生，于24小时内达到最高峰。目前已知，苏云金素主要存在于苏云金芽胞杆菌血清型H1菌株中。已报道能产生苏云金素的血清型还有H4ac、H5、H7、H8至H12等八种。最近随着苏云金素提纯方法、毒理试验的进一步深入，发现纯品苏云金素自身无致突变性，表明苏云金素将是一种非常有潜力的新型杀虫素。

研究已知：苏云金素具有广谱的杀虫活力，对鳞翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、等翅目等都有不同程度的活性，对蚜虫，线虫和螨类的活性作用也有报道。当家蝇幼虫食入时，其半致死量为0.5微克/毫升；当注射大蜡螟幼虫时，其半致死量为0.005微克/克。曾将其与几种常用农药进行比较，苏云金素的毒力是DDT对大腊螟幼虫注射毒力的1000倍；但对埃及伊蚊(Aedes aegypti)的毒力则不如E605；苏云金素对三种食叶昆虫：猿叶虫(Phaedon cochleariae)、菜蛾(Plutella maculipennis)和大菜粉蝶(Pieris brassicae)的活性超过E605，与商品药剂具有相似的基础活性。Toledo等(Toledo J，Toxicity ofBacillus thuringiensis beta-exotoxin to three species of fruit flies(Diptera：Tephritidae).J Econ Entomol 1999，92：1052-6)发现苏云金素对三种果蝇(Anastrepha ludens、A.obliqua和A.serpentina)三龄幼虫LC50值分别为0.641、0.512和0.408μg/cm²。Tsuchiya等(Tsuchiya S，Assessment of the efficacy of Japanese Bacillusthuringiensis isolates against the cigarette beetle，Lasioderma serricorne(Coleoptera：Anobiidae).InvertebrPathol，2002，81：122-126)研究发现，从日本分离的2652株苏云金芽胞杆菌有28株对cigarette beetle有杀虫活性，进一步研究发现杀虫活性物质存在于液体培养物上清中，并且经100℃处理10分钟后，杀虫活性被完全保留。张继红等(张继红，苏云金杆菌δ-内毒素、芽胞及苏云金素A对棉铃虫毒性及拒食性的比较，昆虫学报，2000，43：85-91)发现低浓度苏云金素A虽然对棉铃虫无明显急性致死效应，但对棉铃虫的生长发育有不可恢复的抑制作用，即使在测试的最低浓度，初孵幼虫的体重在12日内都没有明显的增长。在二十世纪七八十年代，国际上将含有苏云金素的苏云金芽胞杆菌制剂作为一种广谱的杀虫素。前苏联地区目前仍广泛使用有苏云金素的苏云金芽胞杆菌制剂，1999年俄罗期科学院开发了用于防治蚜虫和红蜘蛛等害虫的细菌性杀虫剂(即双毒杆菌)。

随着人们生活水平的提高，对无公害农副产品、绿色食品的需求越来越强烈。此外，欧美日等发达国家的贸易壁垒，也要求我国扩大无公害绿色农药的应用普及。因此，发展绿色、环保农业是促进农产品出口的重要途径。发展绿色、环保农业的基础是开展生物防治，作为生物防治重要工具的微生物农药，具有对人、畜及害虫天敌极少或完全没有毒害的特点，不污染环境、维护生态平衡，保持农业、林业的可持续发展。在当前直接应用的生物源农药中，抗生素杀虫剂扮演极其重要的角色。国际市场中阿维菌素、多杀菌素分别为第一和第三大宗产值的微生物农药。苏云金素作为具有广谱、低毒、热稳定性好等优良特性的新型杀虫素，将具有广阔的市场前景。自二十世纪九十年代中期我国引入阿维菌素生产技术和产品以来，阿维菌素的生产和应用迅猛发展，仅2001年我国产值就达5.8亿元。随着阿维菌素的普及应用，害虫的抗药性也急剧提高，迫切需要研制理想的替代性杀虫剂。

此外，苏云金素的成功开发具有重要意义。在理论上讲，将给农药杀虫剂库增添新型核苷类先导化合物，为杀虫剂的开发提供新型靶标；在实际应用中，通过结构改造也将会得到一系列新型高效低毒杀虫剂，为我国高度农药的替换增添品种。

目前，有关苏云金素的研究主要集中于对其发酵效价的提高、回收、纯化的研究以及毒性试验。Espinasse(Espinasse S，Correspondence of high levels of beta-exotoxin I and the presence of cry1B in Bacillusthuringiensis.Appl Environ Microbiol，2002，68：4182-6)等发现菌株携带cry1B和vip2基因和菌株高产苏云金素有关。高穗生等从通过菌种紫外诱变，得到苏云金素高产菌株UV1-3，其产量为出发菌株苏云金芽胞杆菌达明斯达特亚种(B.t subsp.darmstadiensis HD199的1.73倍。Tzeng等(Tzeng YM，Penicillin-G enhancedproduction of thuringiensin by Bacillus thuringiensis subsp.darmstadiensis.Biotechnol Prog，1995，11：231-4)考察了青霉素G对HD199产苏云金素的影响，表明青霉素G促进细胞释放苏云金素，苏云金素发酵单位可达2600mg/L，提高表达量2-10倍。Huang等(Huang TK，Cultivation of Bacillus thuringiensis in an airliftreactor with wire mesh draft tubes.Biochem Eng J 2001，7：35-39)在一种带有两个金属网眼通风管的气升式反应器中生产苏云金素，在生产过程中通过控制通风量和使用消泡剂，使苏云金素的产量比应用传统的培养方法增加了70％。Wu等(Wu WT，Effect of shear stress on cultivation of Bacillus thuringiensis for thuringiensinproduction，Appl Microbiol Biotechnol，2002，58：175-177)采用塔式生物反应器，通过调整搅拌和通气状态，发酵单位提高43％。由此可见，通过广泛菌种筛选、诱变育种、发酵工艺改进等措施可大幅度提高苏云金素的产率，这是目前提高菌株生产苏云金素能力的主要措施。

迄今为止，有关苏云金素编码基因簇的研究国内外还尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，获得一种合成(或称之为编码，在本发明中“合成”和“编码”一词同义，下同)苏云金素的基因簇，该基因簇来源于苏云金芽胞杆菌CT-43菌株，所述的基因簇可以合成(编码)所述的苏云金素，具有广谱的杀虫活力，对鳞翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、等翅目等都有不同程度的活性，对蚜虫，线虫和螨类尤其是线虫具有较高的杀虫活性。

本发明提供一种来源于苏云金芽胞杆菌CT-43菌株中的能够合成苏云金素的生物合成酶的编码基因簇，它包含thuA，thuB，thuC，thuD，thuE，thuF，thuG，thu1，thu2，thu3，thu4共11个基因，它们的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。这些基因位于基因簇核苷酸序列位置分别是：thuA位于1-363位碱基处，其长度为363个碱基对，编码120个氨基酸，编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶；thuB位于基因簇核苷酸序列的364-681位碱基处，长度为317个碱基对，编码105个氨基酸，编码解旋酶；thuC位于基因簇核苷酸序列的2617-4344位碱基处，长度为1727个碱基对，编码575个氨基酸，编码磷酸转运酶；thuD位于基因簇核苷酸序列的4661-5278位碱基处，长度为617个碱基对，编码205个氨基酸，编码UDP-葡萄糖脱氢酶；thuE位于基因簇核苷酸序列的7987-8673位碱基处，长度为686个碱基对，编码228个氨基酸，编码莽草酸激酶；thuF位于基因簇核苷酸序列的8670-9797处，长度为1127个碱基对，编码375个氨基酸，编码糖苷转移酶；thuG位于基因簇核苷酸序列的10957-11637位碱基处，长度为680个碱基对，编码226个氨基酸，编码氨基葡萄糖异构酶。共有负责苏云金素生物编码的2个脱氢酶基因，1个解旋酶基因，1个磷酸转运酶基因，1个激酶基因，1个糖苷转运酶基因，1个异构酶基因获得确认，并提供这些基因所编码酶的氨基酸序列(见SEQ ID NO：2-12所示)。

本发明还提供了包括包含SEQ ID NO：1中thu1位于基因簇核苷酸序列的2010-2315位碱基处，长度为305个碱基对，编码101个氨基酸，编码多糖聚合蛋白；thu2位于基因簇核苷酸序列的5790-7475位碱基处，长度为1685个碱基对，编码非核糖体肽/聚酮编码酶结构域；thu3位于基因簇核苷酸序列的10125-11060位碱基处，长度为935个碱基对，编码蛋白DUF894；thu4位于基因簇核苷酸序列的12015-12446位碱基处，长度为431个碱基对，编码143个氨基酸，编码甲基转移酶。

由SEQ ID NO：2-12定义的苏云金素生物编码酶对应于苏云金素生物编码的每一个编码步骤和后修饰过程以及调节、转运过程。

本发明还提供了还提供了从至少携带有部分SEQ ID NO：1重组载体中，或从微生物文库中分离苏云金素生物编码基因的途径。

本发明还提供了有效分离纯化苏云金素的途径。

本发明还提供了得到至少包含部分SEQ ID NO：1中核苷酸序列的重组DNA载体的途径。

本发明还提供了产生至少包含部分SEQ ID NO：1中核苷酸序列的重组DNA载体转化进入宿主细胞的途径，此宿主细胞不产苏云金素。

本发明还提供了获得在质粒上有苏云金素生物编码基因被中断的微生物突变体的途径，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO：1的互补序列可依据DNA碱基互补原则随时得到。SEQ ID NO：1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的酶切相应的DNA或使用其它合适的技术随时得到。包含发明所提供序列或多个序列的DNA片段或基因可随时得到。通过本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法，从其它生物体得到与苏云金素生物编码基因相似的基因。

本发明所提供的核苷酸片段可用来从苏云金芽胞杆菌CT-43或其它菌种中分离具有生物活性的结构域。例如，非核糖体肽/聚酮编码酶结构域和修饰基因的生物活性位点可以通过聚合酶链式反应(PCR)，酶切位点或其它合适的方法得到。

本发明提供的核苷酸序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相应的DNA分子。

包含本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通过打断苏云金素生物编码的一个或几个编码步骤而得到新的苏云金素衍生物。

包含本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆DNA可用来从苏云金芽胞杆菌CT-43基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含有本发明中的部分序列以及以前临近区域未克隆的DNA。

本发明所提供的核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入或置换，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，或通过紫外线或化学试剂。

本发明所提供的核苷酸序列可以通过序列的不同部分或其它来源的同源序列进行直接进化(DNAshuffling)。

包含本发明的序列或部分序列的克隆基因可以通过合适的表达系统在外源宿主中表达以得到修饰的苏云金素或更高的生物活性或更高的产量。这些外源宿主包括大肠杆菌，芽胞杆菌，酵母，植物或动物等。

包含本发明的核苷酸序列或至少部分序列的修饰基因，转运基因或糖基转移酶基因可以用来构建衍生库或组合库。

含有本发明的核苷酸序列或至少部分序列的一个片段或几个片段可以克隆到改造后的细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)或柯斯载体(Cosmid)或表达载体或其它类型的载体，以应合适的需要。

含有本发明的核苷酸序列或至少部分序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过蛋白质组技术了解它们在宿主代谢链中的角色。

包含本发明的SEQ ID NO：2-12中所示的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某个或某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化蛋白动力学特征或其它致力于得到的性质。

通过合适的技术缺失，连接本发明中的SEQ ID NO：2-12中所示的氨基酸序列可以得到新的蛋白或酶，进而产生新的相关联的产物。

本发明具有实质性特点和显著的进步，本发明所提供的SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列可用于产生预期的基因工程杀虫素或用于提高基因工程杀虫素的产量。本发明所提供的SEQ ID NO：2-12中所示的氨基酸序列可用来分离需要的蛋白质并可以用于抗体制备。本发明所提供的SEQ ID NO：2-12中所示的氨基酸序列提供了预测非核糖体肽/聚酮编码酶三维结构的可能，进而为改造或改善蛋白活性提供依据。本发明所提供的基因及其所编码的蛋白质，相应的抗体或核苷可以用来查找和发展应用于医药、工业、农业的化合物或蛋白。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明制备的编码苏云金素的基因簇的核苷酸序列；

序列表SEQ ID NO：2-12是本发明制备的编码苏云金素的基因簇的氨基酸序列；

图1：为负责苏云金素生物编码的整个thuABCDEFG基因簇的结构。包括结构基因，修饰基因，转运基因和组装基因等，负责苏云金素的生物编码及外运；

图2：为苏云金素化学结构示意图；

图3：为苏云金素质谱图，苏云金素分子量为701；

图4：为含有cry1B基因的质粒pBMB0558图谱；

图5A：为苏云金芽胞杆菌CT-43菌株上清液中的苏云金素HPLC检测图；

图5B：为苏云金芽胞杆菌异源表达株BMB0542上清液中的苏云金素HPLC检测图；

图6：为苏云金素编码途径图；

图7：为苏云金素组装途径图；

具体实施方式

实施例1苏云金素生物合成(编码)基因簇的定位

1.苏云金芽胞杆菌CT-43菌株质粒消除突变株的筛选

苏云金芽胞杆菌CT-43菌株来源于申请人已经发表的苏云金芽胞杆菌菌株(孙明，喻子牛.苏云金芽胞杆菌中华亚种CT-43菌株伴胞晶体蛋白的特性.微生物学报，1996，36：303-306)利用逐级升温培养的方法消除质粒，具体步骤如下，共获得了6株质粒消除的突变株，分别命名为CT-43-1c，CT-43-7，CT-43-5，CT-43-55，CT-43-62，BMB0806(董纯明等，苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究，应用与环境生物学报，2007，13：526-529)，其中CT-43-1c和CT-43-7丢失了130kDa和65kDa杀虫晶体蛋白，但是依然可以产生苏云金素；CT-43-5，CT-43-55和CT-43-62丢失了140kDa杀虫晶体蛋白，不能产生苏云金素；BMB0806是无晶体突变株，不产生苏云金素，由此可见，菌株CT-43中140kDa杀虫晶体蛋白与苏云金素的产生有一定的关系。

质粒消除具体操作方法：将苏云金芽胞杆菌菌株CT-43在LB(蛋白胨1％；酵母粉0.5％；NaCl 1％；pH 7.0-7.2)平板上划线分离单菌落。取单菌落接种于LB培养液，在30℃培养至对数生长中期，以1/100接种量(v/v)转接于SCG(0.1％Vatamin free casamino acids；0.5％葡萄糖；0.2％(NH₄)₂SO₄；1.4％K₂HPO₄；0.5％KH₂PO₄；0.1％柠檬酸钠；0.02％MgSO₄；pH 7.0-7.2)培养液中，在42℃以200r/min的转速培养，每隔12h转接1次，连续转接10次后，梯度稀释涂布SCG平板，置42℃培养。从中取单菌落点种于SCG平板上，在42℃温箱中培养。每隔48h取其菌落的边缘部分点种于下一个SCG平板，同时抽提质粒并用电泳检查质粒谱带。将部分经过42℃处理后的菌株，点种于SCG平板上继续升温至44℃培养，每隔48h取其菌落的边缘部分点种于下一个SCG平板，同时抽提质粒并用电泳检查质粒谱带。

2.cry1B基因在CT-43菌株质粒消除突变株中的分布

对苏云金芽胞杆菌菌株CT-43及其突变株进行了菌株中是否含有cry1B基因的检测实验，结果表明，菌株的苏云金素高产表型和cry1B基因的存在直接相关。用cry1B基因的特异引物，以菌株CT-43及其上面所述的突变株的总DNA为模板进行扩增发现，野生型菌株CT-43、突变株CT-43-1c和CT-43-7能够扩增出cry1B的条带，而突变株CT-43-5、CT-43-55和CT-43-62则为阴性扩增结果。推测cry1B基因位于野生型菌株CT-43的一个内生大质粒上，且该质粒可能与苏云金素的编码密切相关。

根据cry1B基因的序列(NCBI No：X06711来源于Bt thuringiensis HD-2)设计引物对cry1B-1和cry1B-2进行PCR扩增。引物对的DNA序列如下：

cry1B-1：5’-CTTCATCACGATGGAGTA-3’

cry1B-2：5’-CATAATTTGGTCGTTCTG-3’

PCR反应体系为：10×buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl，10μmol/L引物各0.4μl，Taq酶1U，CT-43总基因组DNA 1μl，补加灭菌去离子H₂O至20μl。

PCR扩增反应程序为：第1步94℃预变性5min；第2步94℃变性1min，第3步55℃复性1min，第4步72℃延伸1.5min；第5步转到第2步继续运行28个重复；第6步72℃延伸5min。

3.cry1B基因所在的大质粒的定位

抽提苏云金芽胞杆菌菌株CT-43及其突变株和HD-2的质粒并以cry1B基因的PCR纯化产物为探针进行地高辛标记的Southern blot杂交实验。结果显示野生株CT-43、突变株CT-43-1c及CT-43-7的含有cry1B基因的大质粒和HD-2的75MDa的大质粒有较高的同源性，而CT-43-5、CT-43-55、CT-43-62和BMB0806则没有杂交信号，结合以上所述的苏云金素的产生情况，初步将与苏云金素的编码相关的基因定位在含有cry1B基因的大质粒上，命名此大质粒为pBMB0558。

苏云金芽胞杆菌质粒抽提步骤：

(1)将苏云金芽胞杆菌菌株CT-43过夜活化，按1/100(v/v)的接种量转接至5mL新鲜的LB培养液中，于30℃以200r/min振荡培养到对数生长中期；

(2)离心(12000r/min，30sec)收集所有菌体，以STE(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris·HCl[pH 8.0]，1mmol/L EDTA)洗涤菌体1次；

(3)加200μL溶液I(50mmol/L蔗糖，25mmol/L Tris·HCl[pH 8.0]，10mmol/L EDTA)悬浮菌体，再加50mg/mL的溶菌酶20μL，冰浴放置1h以上；

(4)加400μL新鲜配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％十二烷基硫酸钠即SDS)，轻缓混匀后置冰浴上5min-10min；

(5)加300μL溶液III(50mol/L KAc 60mL，冰乙酸11.5mL，去离子水28.5mL)，混匀后置冰浴上放5min；

(6)以12000r/min离心5min，吸取上清液到一个新的Eppendorf管，用苯酚/氯仿/异戊醇溶液(25∶24∶1，v/v/v)抽提2次；

(7)上清液中加入2倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，于室温下静置5min-10min后，以12000r/min离心5min，弃上清液，再用70％乙醇离心洗涤沉淀1次；

(8)真空干燥沉涤，用10-30μLTE溶液(1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris·HCl[pH 8.0])溶解沉淀，加入10mg/mL的RNase溶液1-2μL，混匀后置37℃0.5h以上，即为制备的质粒DNA溶液。

按照如上所述的方法抽提苏法转移带正电的尼龙膜。用引物cry1B-1/cry1B-2从菌株CT-43中扩增cry1B基因，通云金芽胞杆菌CT-43及其突变株CT-43-1c，CT-43-7，CT-43-5，CT-43-55，CT-43-62，BMB0806和苏云金芽胞杆菌HD-2(Levinson B L，Kasyan K J，Chiu S S，Currier T C，Gonzalez J M.Identification ofbeta-exotoxin production，plasmids encoding beta-exotoxin，and a new exotoxin in Bacillus thuringiensis by usinghigh-performance liquid chromatography.J Bacterial，1990，172：3172-3179)的质粒，常规电泳(0.8％凝胶，电泳时间4-5h，125V，4℃)分离染色体和大小不同的质粒，毛细管过地高辛标记探针。具体操作步骤参照萨姆布鲁克等在《分子克隆实验指南》第三版，中译本，科学出版社，北京，2002年版所报道的方法。

实施例2：cry1B基因所在的大质粒pBMB0558的克隆

1.苏云金芽胞杆菌菌株CT-43基因组BAC文库的构建

(1)外源DNA片段的制备

挑取菌株CT-43单菌落接于5mL灭过菌的LB培养基中，28℃培养过夜。次日按1％的接种量转接于100mL去离子水配的灭菌LB培养基中，28℃培养3-4h，使OD₆₀₀达到0.2。10000rpm离心，收集菌体于干净无菌的50mL离心管中，用与培养液等体积的TE缓冲液洗涤2次。用TE25S缓冲液配制1％的低熔点琼脂糖凝胶，冷却至50℃，将菌体重悬于2mL凝胶中。用50℃凝胶将凝胶菌悬液按照2倍，4倍，6倍，8倍，10倍分别稀释。各个稀释度分别浇灌模具，制备菌体凝胶包埋块。

将包埋块浸在TE25S缓冲液中，加终浓度2mg/mL的溶菌酶，4℃处理24h，去细胞壁。除掉TE25S缓冲液，用NDS洗涤包埋块，10mL/次，洗涤3次。将包埋块浸在NDS缓冲液(0.5M EDTA，100mM Tris-Cl，1％SDS，pH 8.0)中，加入终浓度1mg/mL的蛋白酶K，放于50℃水浴锅中处理48h，去蛋白。除掉NDS缓冲液，用常用的T₁₀E₁₀缓冲液(10mMTris-Cl，10mMEDTA，pH 8.0，121℃、30min灭菌)洗涤3次，然后将包埋块转入另一个50mL的离心管中，用含0.1mM PMSF的T₁₀E₁₀缓冲液洗涤5次，每次10mL、1h，并置冰上操作。洗涤好的包埋块可以直接酶切，或置4℃保存7天以上，或浸泡于70％的乙醇中置-20℃保存2个月以上。

脉冲电泳(1％凝胶，起始脉冲1，终止脉冲25，电压6V/cm，转换角度120°，电泳时间24h)检测包埋块DNA的含量，选取稀释度合适的包埋块。用无菌去离子水配制1倍的Buffer M，每个包埋块用500μL1倍的Buffer M浸泡，置冰上2h。除掉1倍的Buffer M，更换新鲜的1倍的Buffer M，每块包埋块分别用0.2U、0.5U、1U、2U、5U、10U HindIII的酶量设置500μL的酶切体系，置冰上30min，然后37℃温育30min。酶切后用0.5M的EDTA终止反应。脉冲电泳检测酶切产物的大小，确定反应体系及目标片段(75-100kb)的泳动位置。放大反应体系，脉冲电泳，在凝胶上对应的位置切取目标片段。将含有目标片段的凝胶通过透析袋电泳(TAE缓冲液，电压6V/cm，电泳时间2h)回收目标DNA，存于-20℃保存待用。

(2)BAC载体的制备

接种含有BAC质粒的大肠杆菌于LB培养基中，加终浓度30μg/mL的氯霉素，37℃培养过夜。收集菌体，小量碱法抽取质粒。抽提的BAC载体用限制性内切酶HindIII完全酶切。酶切后的反应体系65℃处理10min，使酶失活。在已有的体系中按照1μg质粒加5U CIAP的酶量添加碱性磷酸酶，37℃温育1h，然后用终浓度1倍的上样缓冲液终止反应。

脉冲电泳(1％凝胶，起始脉冲1，终止脉冲15，电压4.5V/cm，转换角度120°，电泳时间18h)检测去磷酸化后的载体。溴化乙啶(EB)染色的时候只切取一部分凝胶染色，用干净的刀片在凝胶上切刻，标下载体(11.4kb)的位置。在另外没有染色的凝胶上对应位置切下含有载体的凝胶，通过透析袋电泳(TAE缓冲液，电压6V/cm，电泳时间2h)回收载体。回收的载体按照1μgDNA用1U T4DNA连接酶的量设置连接体系，16℃连接过夜。脉冲电泳分离样品，切取含有载体(11.4kb线状DNA)的凝胶，透析袋电泳回收，存于-20℃待用。

(3)大肠杆菌电转化感受态细胞的制备

接种大肠杆菌菌株DH10B单菌落于5mL SOB培养基(每L培养基中含有20g蛋白胨，5g酵母粉，0.5g NaCl，250mM KCl和10mM MgCl₂；Luo M Z，Wing R A.An improved method for plant BAC libraryconstruction.In：Grotewold E eds.，Methods in Molecular Biology.Totowa，NJ：Humana Press，2003)中，37℃培养过夜。按照1％接种量将培养好的DH10B菌株转接于100mL SOB培养基中，37℃培养3h左右，使OD600值达到0.6。将培养液迅速置冰上冷却，然后4℃，4000rpm离心10min收集菌体。用10％预冷的甘油洗涤菌体3次，第一次用与培养基等体积的甘油，后2次一半体积。菌体重悬于2mL 10％预冷的甘油中，分装成50μL每管，速冻，保存于-70℃备用。以上操作需在严格无菌条件的下于4℃恒温室完成。感受态细胞涂布含有终浓度12.5μg/mL氯霉素的LB平板，检测细胞是否被污染。

(4)连接与转化

用制备的BAC载体连接λDNA HindIII酶切片段，电击转化(电压12.5kv/cm)制备的大肠杆菌菌株DH10B感受态细胞，检测载体和感受态细胞的效率。按照外源与载体摩尔比10∶1的比例设置连接体系，16℃连接过夜。用去离子水配制含有0.1M葡萄糖的1％的凝胶，熔胶，制备带有可容纳50μL液体的凹槽的凝胶柱。将连接体系置于凹槽中，4℃放置2h，除去连接体系中的盐份。取2μL的连接产物与50μL感受态细胞混合，电击转化(电压2.5kv/cm)，然后迅速加入预热的SOC培养基(100ml SOB培养基中加入1M葡萄糖20ml；Luo MZ，Wing R A.An improved method for plant BAC library construction.In：GrotewoldE eds.，Methods in Molecular Biology.Totowa，NJ：Humana Press，2003)，37℃恢复培养40min。在含有12.5μg/mL氯霉素的LB平板表面涂布X-gal和IPTG(每个直径9cm的平皿涂布和)，将恢复培养液涂布平板，37℃培养16h。挑取白色单菌落，保存。

(5)文库的筛选与保存

随机挑取白色单菌落，接种于5mL LB培养基中，添加终浓度12.5μg/mL的氯霉素，37℃培养过夜。收集菌体，小量减法提取质粒。限制性内切酶NotI和HindIII分别酶切BAC转化子，脉冲电泳检测插入片段的长度。将插入片段大小合适，阳性率高的批次的转化子大量挑取，于含有20％的甘油和12.5μg/mL的氯霉素的LB培养基中，用细胞培养板96孔板(200μL培养液/孔)静置培养24h。培养好的菌悬液用液氮速冻，然后置-80℃保存。

2.pBMB0558的重叠连锁群的构建

将筛到的含有cry1B基因的单BAC克隆子进行BamHI和NotI的单切和双切，酶切产物跑脉冲电泳，通过脉冲电泳图中酶切片段的大小及相互位置的判断利用软件进行重叠连锁群图谱的绘制。

3.pBMB0558的测序

根据重叠连锁图，选出两个可以足够覆盖整个pBMB0558质粒的BAC克隆子进行亚克隆文库的构建并测序。

4.pBMB0558序列的拼接与生物信息学分析

利用DNAStar 7.0进行序列的拼接，并通过PCR进行缺口的填补。通过GenBank数据库进行比较分析，发现在该质粒上存在一个约12kb的基因簇，命名为thuABCDEFG。

实施例3：thuABCDEFG基因簇的异源表达

1.含有thuABCDEFG基因簇的BAC克隆子的异源表达

将含有基因簇thuABCDEFG的BAC克隆子pBMB0542(插入外源约23kb)电转进苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171(李林，杨超，刘子铎，李阜棣，喻子牛.苏云金芽胞杆菌无晶体突变株的逐级升温筛选及转化性能.微生物学报，2000，40：85-90)中，HPLC和MS验证苏云金素的产生情况，结果显示产生的苏云金素的产量约为野生株苏云金芽胞杆菌CT-43的三分之一。

本发明获得的可以产生苏云金素的重组的苏云金芽胞杆菌BMB0542(Bacillus thuringiensis BMB0542)已于2009年1月8日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO M209011号。

2.苏云金素的分离纯化方法(有机溶剂萃取法)：

(1)接种产苏云金素的苏云金芽胞杆菌CT-43菌株单菌落于5ml LB中30℃，200rpm培养过夜。

(2)按照1％的接种量(1ml/100ml)转接于25ml LB中30℃，200rpm继续培养24小时。

(3)取100ul发酵上清液，加入丙酮900ul，使其终浓度为90％，充分混匀，12000rpm 6分钟离心。

(4)离心得到的沉淀烘干后重新溶于100ul去离子水中，加入乙腈67ul，使其终浓度为40％，充分混匀，12000rpm 6分钟离心。

(5)丢弃离心得到的白色沉淀，在上清液中再次加入乙腈，使其终浓度达到90％，12000rpm 6分钟离心收集沉淀并烘干，此时会变成黄褐色沉淀。

(6)将沉淀溶于25-50ul流动相，用滤膜过滤后取20ul用于HPLC的进样。

高压液相色谱(HPLC)法：将经过纯化的苏云金素或样品用WATERS 2487高效液相色谱仪检测。色谱柱：安捷伦C-18柱(规格25cm×4.6mm，5μm)，进样量，20μl；检测波长260nm；流动相为50mM KH₂PO₄加5％甲醇(用磷酸调pH至3.0)；流速1mL/min；苏云金素的保留时间约为8.0min。

3.重组的苏云金芽胞杆菌BMB0542的菌学特征及遗传特性描述：

生物学特性：菌体直杆状，营养体呈链状或单生，革兰氏染色阳性，芽胞呈圆柱状或近似椭圆，偏端生，芽胞囊不膨大，在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落圆形，边缘平滑，菌苔丰满呈蜡质状，生长温度10-45℃，最适生长温度26-32℃，适宜pH 6.8-7.4，兼性嫌氧，在含1％NaCl的牛肉蛋白胨培养基中生长，伴胞晶体呈菱形。在发酵培养中，培养时间达到24个小时，上清液中的苏云金素产量最高。

遗传学特性：本发明是以苏云金芽胞杆菌天然菌株CT-43为出发菌株得到的基因工程菌，含有负责苏云金素合成的基因簇。经继代培养，各个基因能够在工程菌中稳定存在，表达正常，对受体菌的生长无重大影响

实施例4：

苏云金素编码途径和组装途径

1.thuABCDEFG基因簇的生物信息学分析

在thuABCDEFG中，thuA编码的蛋白与Buchnera aphidicola str.Sg(Schizaphis graminum)的6-磷酸葡萄糖-1-脱氢酶有31％的一致性(identity)；thuB编码的蛋白与Roseovarius sp.HTCC2601中的天冬氨酸、谷氨酸、乙内酰脲解璇酶家族蛋白有36％的一致性；thuC编码的蛋白与Shigella sonnei Sd197中的磷酸转移酶有97％的一致性；ThuD蛋白与Bacillus halodurans C-125中的核糖脱氢酶有73％的一致性，该酶属于尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖脱氢酶家族，主要起催化依赖于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的醇直接变成酸的氧化作用；ThuE蛋白与Beijerinckia indica subsp.indica ATCC 9039中的莽草酸激酶有31％的一致性；ThuF蛋白与Streptococcus pyogenes MGAS10394中的糖苷转移酶有43％的一致性，该酶可以将糖转移到一系列的底物上如纤维素、磷酸长醇和磷壁酸；ThuG蛋白与Escherichia coli B171的N-酰基-D-葡萄糖胺-2-异构酶有98％的一致性，主要介导N-乙酰神经氨酸生物编码中的异构化作用，催化机制是通过ATP调控的核苷的加减作用。

在基因簇中，除了thuA到thuG外，还有4个ORFs。其中thu1编码的蛋白与Rhodopseudomonas palustrisCGA009的多糖聚合蛋白有32％的一致性；thu2蛋白与Myxococcus xanthus DK 1622的非核糖体肽编码酶有35％的一致性；thu3蛋白Streptococcus pyogenes MGAS10394的大环内酯流通蛋白有36％的一致性；thu4蛋白则与Salmonella enterica subsp.enterica serovar Javiana str.GA_MM04042433的依赖于S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶蛋白有55％的一致性。

如图1所示，本发明序列列表中序列描述：

SEQ ID NO：1为包括11个开放读码框架的12,446bp的核苷酸序列，它们是负责苏云金素生物编码的基因thuA，thuB，thuC，thuD，thuE，thuF，thuG，thu1，thu2，thu3和thu4。

SEQ ID NO：2为thuA基因(SEQ ID NO：1中核苷酸1-363)编码的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3为thuB基因(SEQ ID NO：1中核苷酸364-681)编码的解旋酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4为thuC基因(SEQ ID NO：1中核苷酸2617-4344)编码的磷酸转运酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5为thuD基因(SEQ ID NO：1中核苷酸4661-5278)编码的UDP-葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6为thuE基因(SEQ ID NO：1中核苷酸7987-8673)编码的莽草酸激酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7为thuF基因(SEQIDNO：1中核苷酸8670-9798)编码的糖苷转移酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8为thuG基因(SEQ ID NO：1中核苷酸10957-11637)编码的氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9为thu1基因(SEQ ID NO：1中核苷酸2010-2315)编码的多糖聚合蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10为thu2基因(SEQ ID NO：1中核苷酸5790-7475)编码的非核糖体肽/聚酮编码酶结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11为thu3基因(SEQ ID NO：1中核苷酸10125-11060)编码的DUF894的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12为thu4基因(SEQ ID NO：1中核苷酸12015-12446)编码的甲基转移酶的氨基酸序列。

以下进一步对本发明详细描述：

由于苏云金素具有广谱的杀虫活力，对鳞翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、等翅目等都有不同程度的活性，对蚜虫，线虫和螨类尤其是线虫具有较高的杀虫活性，本发明克隆了负责苏云金素生物编码的基因簇，通过构建苏云金芽胞杆菌CT-43的基因组和质粒BAC文库，克隆了含有苏云金素基因簇的大质粒pBMB0558，测序获得109,464bp的连续核苷酸序列，其中12,446bp属于苏云金素编码基因簇的核苷酸序列。序列分析是使用Clone 5软件和美国国家生物信息中心的Conserved DomainDatabase search及其提供的世界范围内的Blast引擎。

SEQ ID NO：1中的1-363，364-681，2617-4344，4661-5278碱基是负责苏云金素前体物阿洛糖二酸编码的基因序列，各基因的核苷酸序列与相应的氨基酸序列如表1所示：

表1：负责苏云金素前体物阿洛糖二酸编码的核苷酸与氨基酸序列

SEQ ID NO：1中的7987-8673，8670-9797，10957-11637碱基是负责苏云金素前体物组装的基因序列，各基因的核苷酸序列与相应的氨基酸序列如表2所示：

表2：负责苏云金素前体物组装的核苷酸与氨基酸序列

SEQ ID NO：1中的2010-2315，5790-7475，10125-11060碱基是负责苏云金素前体物悬挂和延伸的基因序列，各基因的核苷酸序列与相应的氨基酸序列如表3所示：

表3：负责苏云金素前体物悬挂和延伸的核苷酸与氨基酸序列

SEQ ID NO：1中的12015-12446碱基是负责苏云金素编码后修饰的基因序列，其核苷酸序列与相应的氨基酸序列如表4所示：

表4：负责苏云金素编码后修饰的核苷酸与氨基酸序列

悬挂和延伸模块1中的结构域在Thu2的位置如表5所示：

表5：悬挂和延伸模块1中的结构域

苏云金芽胞杆菌CT-43中苏云金素编码基因簇中各基因在编码中的功能如表6所示：

表6：苏云金素编码基因簇中各基因在编码中的功能

以下的应用实例阐明了得到和应用本发明所提供序列和要素的途径。这些实施例只是用作说明而并不限制本发明的应用范围。通过基因工程分子操作基因簇中的一些基因序列，可以得到序列改变的衍生的基因工程菌株，或利用本发明得到携带苏云金素生物编码的DNA片段。

2.苏云金素编码途径和组装途径

根据以上实验数据综合生物信息学的分析，获得了苏云金素的编码途径。主要包括阿洛糖二酸的生物编码和苏云金素的组装过程。组装过程类似于抗生素编码途径中的非核糖体肽\聚酮编码途径，需要一个特殊的酰基载体蛋白，但是苏云金素的组装又与已经报道的非核糖体肽编码途径、聚酮编码途径或者非核糖体肽\聚酮杂合途径有所不同，功能区域中的ACP蛋白来源于聚酮编码途径，但是腺苷酰化区域(A-domain)和缩合区域(C-domain)却来自于非核糖体肽编码途径，故苏云金素的组装过程是一个集合了非核糖体肽和聚酮编码途径的功能模块的类非核糖体肽\聚酮编码途径。

在此途径中，也与常规抗生素的链的延伸方向有所不同，而是仅仅将阿洛糖二酸悬挂在酰基载体蛋白上，之后在不同的酶的作用下对阿洛糖二酸先进行糖苷化反应，再在此基础上继续添加腺苷，形成没有加磷酸基团的苏云金素的前体物腺苷葡萄糖阿洛糖二酸。基因簇中的甲基转移酶对于苏云金素的组装途径可能也起到了一定的修饰作用，以保护编码的前体物不被细胞内的各种酶类降解。

序列表

<110>华中农业大学

<120>合成苏云金素的基因簇

<130>

<141>2009-01-14

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>12446

<212>DNA

<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(12446)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(12015)..(12446)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(10125)..(11060)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(5790)..(7475)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(2010)..(2315)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(10957)..(11637)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(8670)..(9797)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(7987)..(8673)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(4661)..(5278)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(2617)..(4344)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(364)..(681)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1)..(363)

<223>

<400>1

atgggagtaa cttggactta tttcaaacaa tttgaaatcg tagaacatga agaaaatgat 60

tttaatgaga tgatacgata ttttgatcaa ggcgaattaa gatttactta cgcaacaagt 120

gggacattaa gagctgtata cgcaaattat ggaatacata ttccgatata tagtcaattt 180

gaacctccaa actcaaagaa attagaatta gtttctcctg aagatctagt tcatgcttgt 240

gaagatgcca taaaagtttt aaaagaagga attaacccag aatttaaggg ttttgatggt 300

gagaaaagtt tgctatggga attggatgat ctcgatggac gaaatggggg aagtaaacca 360

tagatggagg aattttatat gtgtatccca atagtagttc tagtagaata tgatttttat 420

aatgacggaa caggaagcaa agtctattta ttcaaagata tcaataatgc gataatattt 480

gctaaaagag aagcaaaaac atatctagaa gataatagcc ttactctaga agactttaaa 540

gggcaacatg atactctaga cattatggaa acaaatgata gttattattt caattcatgg 600

aatgataaaa attgtgataa atacaatatt gttgtctatg aacaagaatt taaagataaa 660

acaacgaaac taataaacta atcgatcctt tctttctcta aagctctcta tcactttttt 720

tcacctactt ttatagacca gctttgatgt aatcaacgaa tggtttagca agtaagaaga 780

ctactacgcc agcaccacag aataaaagac cttttttaaa tttaggtgca ttttgctcgt 840

caccttgcca aatcattaga ccacaaacta aaccaccaat aatgaatgcc caaataaatg 900

tactttgcat gtcagtaaat agcgtttgta ataaatgttg aattcgagta aacataattt 960

cactccctcc ttagaataag ttagtaagat cagataatac ctatttttaa ataaaataac 1020

caaaaagggt ataaaggatt gatttacaaa cccaattgcg atcttcaggc taaattatac 1080

ccttattacc ccaaataggc aataagggta taaaaatttt tataattttt atttctatta 1140

aaaataaaac cattattttc tcattaataa ggttctatat cagtttcgta ccgaaacctg 1200

ttgccgtata gtaattcgtc cttcccttca tgcaaggggc attaaatttt tgaatcattg 1260

tgtttcgttt atgctttcac gtcgctccgc aatttgcatt gtaagtttag caaatttcta 1320

cacttgtaaa agcccaactc aacatcaatt ctaaaaaatt taatactatt cccttgcatt 1380

ccgatcactt ctcattacgt ataaggcaac aggtaacaga gaaaaaccta tcaacactac 1440

tacgaaaaga ggaaatttta tgttcttatc acaattatct ttttatcaat tagagattaa 1500

aaacacatcc ccgaaagaag ctattacaag ctctacaact gaatcatttt atgcttatgg 1560

aagtgcatgg ttaaaagcct gtaatactat tagcaatttt ttacaacaaa acaattataa 1620

aaaagatgat ttaaatattg tattcaatga agacccaaag aatgaagttt atcgttatac 1680

ttggtcagga attcacaagt ctagtttcaa aaaacttgaa attactatta tttatactca 1740

attcgctgat acagaggact tttacagaga gtgtacatgc tgtaataaag ttatgtttga 1800

aggatattgt atacacgagg gactagaata tttttgttct gataaatgct tacatacaca 1860

atacacgcct gatgaatatg aggaaatgca tgaagatgat tatgcttact ggacagtatg 1920

gcttgaataa ttttgaattt caattatttt attcagaaag agaatcaaaa agaaactcat 1980

aataaattta tttagaattt attatggatt tatataaagt tcattttagg tttatttatt 2040

ttttgtaata aagattccat taatgaattc ccccactgcg atgcgccgct ggcggaagtt 2100

aaatctgacg aactggaacc actgccggtt tcactgacca atctgaatcc gcaaattatc 2160

cgcgcccgca ccgtgtgcag cggtagtgca ggcggcattc tgacgccgat ctcttcttta 2220

gatctcaatg cgctgggtaa tcttcccgca gccaaaggcg ttgacgccga gcaatccgca 2280

ctggaaaacg gcctgacgct ggtactgaaa aacattgagt ttcgtctgct ggatagcgac 2340

ggtgctacca gcgcgattct ggaagctcac cgatccctgg ctggcgatac ttccctgcgc 2400

gaacatttac tggcaggcgt cagcgccgga ttaagctgcg ccgaagcaat tgttgccagc 2460

gcgaatcact tttgcgaaga gttttcccgt tccagcagca gctacctgca agaacgtgcc 2520

ctggacgtac gcgacgtctg cttccagtta ctccagcaaa tctacggtga gcaacgcttc 2580

ccggcaccgg gcaaactgac gcagcccgcc atttgtatgg ctgatgaact gacccccagc 2640

cagttcctcg aactggataa aaatcacctc aaaggattgt tgctcaaaag cggcggcacc 2700

acctcacata cggtgatcct tgcccgttcg ttcaacattc caacgctggt tggtgtggat 2760

attgatgccc ttactccgtg gcagcaacaa acgatttata tcgacggcaa cgccggggcg 2820

attgtggttg agccagggga agccgtagct cgttattatc agcaagaagc ccgcgtacag 2880

gacgccctgc gtgagcaaca gcgtgtctgg ctgacccaac aagcccgtac cgctgacggt 2940

atccgcattg aaattgccgc taacatcgct cactccgtgg aagcgcaggc cgcattcggc 3000

aatggtgcgg aaggcgttgg tttgttccgc actgaaatgc tctatatgga tcgcaccagc 3060

gcaccgggcg aaagcgagtt gtacaacatt ttttgtcagg cgctggaatc cgccaacgga 3120

cgcagcatta ttgtgcgcac tatggacatt ggcggcgaca aacccgttga ttatctgaac 3180

attcccgcag aggcaaaccc gttcctcggt tatcgcgccg tgcgtattta tgaagagtac 3240

gcgtcgttgt ttaccacgca gctacggtcg atcctccgcg cctccgctca cggcagcctg 3300

aaaatcatga tcccgatgat ctcctcaatg gaagagatct tatgggtgaa agaaaaactg 3360

gcggaagcca aacagcaact acgtaacgaa cacattccgt ttgatgagaa aatccagctc 3420

ggcatcatgc tggaagtgcc gtcggtgatg ttcatcatcg atcaatgctg cgaagagatt 3480

gatttcttta gtattggtag taatgacctg acgcagtatc tgctggcggt ggatcgcgat 3540

aacgctaagg ttactcgtca ctacaacagc ctgaatccgg cattcttgcg ggcgctcgat 3600

tacgccgtgc aagcggtgca tcgccagggc aaatggattg gtctgtgcgg tgagctggga 3660

gcgaaaggtt ccgtgctgcc gttgctggtc ggcttagggc tggatgaact cagcatgagc 3720

gcaccatcaa ttccggcggc gaaagctcgg atggcgcaac ttgatagccg tgagtgccgc 3780

aagttgctca accaggcaat ggcctgccgt acttcgctgg aagtagaaca cctgctggcg 3840

caattccgca tgacccaaca agacgcaccg ctggtcaccg ccgagtgcat cacactggaa 3900

agcgactggc gcagcaaaga agaagtgctc aaaggcatga ccgataacct gctgctggcg 3960

ggccgctgcc gctatccgcg taaactggaa gccgacttgt gggcgcgcga ggccgttttc 4020

tctaccggtc tgggctttag ttttgccatt ccacacagca aatcagaaca cattgagcaa 4080

tccaccatca gcgtggcgcg tctgcaagcg ccggtgcgct ggggcgatga tgaagcgcaa 4140

ttcatcatta tgttaaccct gaacaaacac gctgcgggcg atcagcatat gcgcattttc 4200

tcgcgcctcg ctcgccgcat catgcacgaa gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 4260

agagtcgacc aagagaaaca gtatgttacc ttatattttt ggaaattgaa aacaggttat 4320

tattgtagct atcacaaata ctaaaaagtt aaatcaatca ataatagaca acactaactc 4380

tagtattata ttaatttatg attaatcaac gctgactgta tttccttgag actctaataa 4440

gacaggttta ttattaatat agaaaataaa gttggattta aatactataa aaaatatata 4500

gaattaagga gattgggata taaaacaaaa agatattgag ggtgtgctta ttgtgaaaat 4560

tacaatagca ggaataggat acgtaggact atctaatgcg attttattgt ctcaaaataa 4620

cgaagttata gcatttgata ttattcaaaa aaaagtagat atgataaatg ataaaaaatc 4680

tcctatttta gatgatgaaa ttgagaaatt tttagcaaca aaagaattaa atttaattgc 4740

aactaccgat agttacaaag catttaagga tgctgattat ttaattattg caacgccaac 4800

agattatgat ccagaaaaaa attcttttaa tacaaggacc gttgaaactg taattgctaa 4860

aatcttaaca attaatccag aagctataat gataattaaa tcaactgtac ccgtaggcta 4920

tacagaaaaa gtaaagcgaa agtttaaaac aagtaatatt attttttcac cagaattttt 4980

aagagagggt aacgctttat atgataactt atatccttca cgtataatcg ttggtgaaca 5040

gtctagtagg gctaaagtat ttgctgactt gttagtagaa ggagctgcta agaaagatat 5100

tcctgtctta tttacaaact caactgaagc agaagcgatt aaattgtttg ctaacacata 5160

tttagcaatg agagtggctt tttttaatga attagattca tatgcagaag taagaggatt 5220

acacacaaaa caaattatcg atattaaggg gaagttcaat tttaccttcc ccttttaaat 5280

attcagataa aaaatatagc gctcgtccct caacaaatag ttccaatggg ccttttactg 5340

ataggcagcg attatcagaa tcgaaagtaa cactagtaat ttcatcttga atgtaattta 5400

ttaatcccga tattttaatt gcttctactt ggttatgtgt attcaatccc aattcttttt 5460

gaatcgatga ctcaaattta ggaattcttt tgataggggg agatggagta acagctggat 5520

atacagatga atccttaaat aaagagaggt ttgtagtaat taatggggaa aaatattaca 5580

atactggcga tgtagtttca tgtaataaag atcaactata ctaccatgga agaaatgata 5640

gtcaaataca aattaacggt atacgtgtag aattaggtga aattgaatat ttacttgaaa 5700

aaatacatgg ggttcaacaa gcggttgttt tattttatca ggataaattg cttgcattta 5760

tcctgagttc taatttaaca attcatgata tgaaaaaaat ggctacttca gtacttgaaa 5820

ggtatatgtt tccaaatgat tatcatatca tcaagacgtt tccattgacc gaaaataata 5880

aagttgaccg aaaatcttta ttattttctt atgaagagag taagaaatcg gaaaaactaa 5940

tcattagtaa ggatatgaca gaatttgaag aggttttaag agataaagtc gctctaatac 6000

ttaatttacc aaaagagtta attggaaaag atagtgattt ctttgagtta ggtggagatt 6060

ccctagatgt atttcaatta cttttaaaat tagaagaaat gtatgaaaca gagctttctt 6120

tggagttaat ttatactaat cgaacattat ctaggattgc ttccgaagtt tcaaaattat 6180

taacaacaga aagagaagaa gtttttgaag aaaagctaca tgaggaagac tttaagctca 6240

tggaaaaaga aatcaacggt tatttattaa atgatgaata tcaaactact tatagctttg 6300

aaactataca ctcacaacgg gtttactatt ttgataattt taagagttca gtttcctttg 6360

attatagggt agatacttca tacgataagg aaacagtaat aaaagcaatt aaaactatta 6420

ttaatagcaa tgatttgatg agagctatgt taagggaaag tgattccaga ttagaattta 6480

aaattttaaa ttccattgat agttttccta tatttacatt aaatcgaaat gttgaaaaaa 6540

aatcatttat ccaaaaaatc gaatcaatag gagaaaactt ggtgtataag gctcgcaata 6600

atggtgggtt actcggtttt ttagccttac taatagataa atcagggtat acaatagttg 6660

gtgtgttaga tcatactatt gctgatatct catgtattaa tataattaaa aaaatgattg 6720

gtgaggaact aaatggctat tcaagtaaag aaaaggcaag ttataatgat ttctgttatg 6780

aggttagaga atataataca attgatagct taaaaaataa tgcatatcat aataatttac 6840

ttgctataag caaaaatgtg aatgatgtca acttaaataa gctaagtaaa agtttaaaat 6900

gttatgaaat agattatcct agccaaggtg attcttttcg gattataaat tttctttcat 6960

atgttatagg aaaaagatta ttagaaatcg tagatcgaga acaaattgta ataaaatcag 7020

tcattaacgg gcgagaaaat aagctttttg atttttcaac cacaatcggt gattttcatg 7080

gtagtttata tttaatttat tcaaaagatg aaaactatga acaatttacg aataaatctg 7140

aggggatatt cggaaaatac tacactaccc acccatacag accagggtat gcgtttggtt 7200

caaattaccc aagtaaaaca aaagaacaaa aaaaacttaa agatcagtgg aattcgattt 7260

caaatacctc aataaattat attggagaag tatcagatta cgaaaagagc tcttattatg 7320

atacaatcag caatgtcttt gataacttgg aaaaaataca agatttaatt tatgttacag 7380

cttttagtaa taataataaa ttaacggtat tcttaaataa aaatttaggc caactaaatt 7440

tccttgaaaa attgtactat ccaactttca tttaaatcat gaattgttaa attagaactc 7500

aggataaatg caagcaattt atcctgataa aataaaacaa ccgcttgttg aaccccatgt 7560

attttttcaa gtaaatattc aatttcacct aattctacac gtataccgtt aatttgtatt 7620

tgactatcat ttcttccatg gtagtatagt tgatctttat tacatgaaac tacatcgcca 7680

gtattgtaat atttttcccc attaattact acaaacctct ctttatttaa ggattcatct 7740

gtatatccag ctgttactcc atctccccct atcaaaagaa ttcctaaatt tgagtcatcg 7800

attcaaaaag aattgggatt gaatacacat aaccaagtag aagcaattaa aatatcggga 7860

ttaataaatt acattcaaga tgaaattact agtgttactt tcgattctga taatcgctgc 7920

ctatcagtaa aaggcccatt ggaactattt gttgagggac gagcgctata ttttttatct 7980

gaatatatgt ctgaatgctt acaggcttcc tacacaaata gtttattgat acatgcggca 8040

gccgtttatt caaaagaaaa agatagatca tatttgattt taggagaaaa agggtctggt 8100

aaaacaacat tgtcctttag attatgtcaa gaattaggat taagtcttat tggtaatgac 8160

ttagttcgta ttggatatga tgaaaatggt gaacttttta caaaagaagg aagtcgatgg 8220

ttcgatgtaa gagagacagc agtaaaggct gacgattata tgaataagtt agctactata 8280

ttatctgcta aatcggcaaa ttcatggaat aataaaacta gaatattacc agaagatcat 8340

tctatagaaa cccattttga gcaatcgaaa atagataaaa ttttaaatat tagaattgat 8400

ccttatcaaa attatttttc tgtttctcca tgggaagggg tacagagaaa tttaatactt 8460

catgaaaaaa taggtaggca tatatctggt caggctacac catttcaaga tgatcagggt 8520

aattatcttg gatcactacc aagcataaat cgtgataagg cttcattggt aagggataat 8580

atagttaagt gtatggtcaa tacaggaata actgaactat ttggtccgga cagtaaagca 8640

cttgcaacct ggtttaagga agaagtacta tgattgctat cggaattcca acttataatg 8700

aagcaaaaaa tatttctaaa cttactcaat taattgattg tgtagcagta aaaatagggc 8760

tagaaatagt tattattaat gcagacaata acagtccaga taatacggcc acaatattta 8820

catcagttaa aacattaaat aaaaaaatat ctgttgttac caaggaagtt ggtaaaggtt 8880

tcaatattaa agcaataatt gatattgtaa ataacctaga taattgtgaa ggttgcatat 8940

taattgatgg tgatattaca tctttttcag agtcttggct taaaaaattt attgaacttt 9000

taatagacaa agtagatttt gttgtaccta attattcaag gagttttcag gaagggaaca 9060

caacaaatca ctttgtttat ccattaatca attaccatac gaacggcaat tgcccaagac 9120

agccaatcgc tggtgatttt ggtttatcga aaaatttcat caaatttctt gtcaattctg 9180

tgcactggca caaatattgt tatggctatg gtattgatat atttcttact ttacatgctg 9240

tatataataa ttttcgaata gaggagatca atctagatag aaaagaacat aaccctagtt 9300

tcgggaaaat ggtagacatg tttgttgaag ttgcgagtag ttattatgaa acctccaaaa 9360

tcatatttga aagtaaaaag aaaaatggca ttttcaatac agcagtaata aaatctagta 9420

atccatcagt tttattttct cctaaaatat ttttaagcca agaggaaata ttaaagaaaa 9480

aagaggaagc taataaaata ttagcatcga aagagacaat attaaatatg agaaaagata 9540

ttgaaattaa tccatcagtt tgggtggaaa tattgcttgc tcatgagaaa aggataggac 9600

aggtagatag tcaattgctt gcaaaatcaa tattgccgta ttatttgtta cgtgttgtag 9660

actatttaca aaacatttct aatgtgaaag atgcagaact taatatcgaa aaggaaattg 9720

atttattgca attacaaaaa aatgaagctg tcaaatcaga tgttgaattt gatgtagatt 9780

ttataaacag tatttaaatt aaagattaat accttgtatt ttttaaaaat tcgaataact 9840

atccttttcc ttgaaaactt catcatacgg actatttgac tatcttattg taagatccaa 9900

atagtccgtt catcacttta aaatgataac attaaaaatt tgaattatag tgcaaatggt 9960

ttataattct tattctattt taatggcttc tatttgttga aaaatggagt aatttctcta 10020

tttcaaatta atttagagat gaattatgaa gcttaaattt ttcgatatcg gtatagtccc 10080

tccttcgctt gtttgttgta tcaaagctaa atgaactatt gggaatgatg aggagaataa 10140

atattgaaat tatttttaag ttggtaggag ggaacataat ggatcgttca aagaaaaatg 10200

gtatatatat gcttacgggt aaaacaacaa ataaaatagg taatgtaatt tttgattata 10260

taaataatgt attaatagct tctttaggaa caaaggcttc taacctttta gcactatatc 10320

aaagttctga aattattgta aatatattgt ttaatatgtt aggtggtgtt tttgcagatt 10380

taaaaaatag gaagaaaata attattataa cagatttaac tgcttcacta gcaacctttc 10440

tactctatct tttttgggat agtaaaaatt ccttattttt aattatttta ataaacattt 10500

tattggcgtt attgtattct tttaattccc ctgcatataa agctattgtt aaagatatac 10560

tgaaaacaga agatttaaat aaattcaatt catactctaa tgctttttca gaagtggttt 10620

ctgtattggg tcctttagtt gctataagta ccgtacatta ttttggattt aagacaggaa 10680

tgttaattaa tagtattagt tttcttattt ctgcttattg tgtaagtaga tttcaagtta 10740

taaattatgt gcagaaaaag aaaaagggta aagaaaaata tatggtagtt ctttcagatg 10800

gttttaaata tgttttgaag cagcgtaatg ttcttgaatt attaattgta tcttctttta 10860

ttaatttttt tctagcagga tataatttct ttttaccata tacaaatatt ttttctgaaa 10920

atcaaggtat ctatgcatcc attttaatta cagaatctat agggagtatt gttggggctc 10980

ttttaaatcg ataccgtcga cctcgagggg gtgcagcagg tgataaatat cctgtttgcc 11040

gtcccagact ttggtggtga ccttattgtc cgcatccagc tcctgccacc aggaaccatt 11100

ttcatagtcc atcaggtact taatgcagta ctcccaccat gtttgatacc aggtttcata 11160

ctggcgatcg ccagtgacgg tgtagagcgc gtaggccgta cccattgctt cgacgatagg 11220

ccaacgtaca cgttcgcgga ccaccggttt tccttcccag tcaacggtat aaacaatccc 11280

gtccgcgcca tcgggtgccc aggcatcgcg cacggtggcg ttaaacagac ctttggcatc 11340

ttctagcagc catgctggtg gttgttcgca acgggcttcc agggcagcat ggatgtgcag 11400

cattaaacgg ccccattcga tccagtggcc tggtgtacct ccgaacgcgc ggaagcgatg 11460

cgccgggtta tctttgttgt aatccggcag cggattccac tgggtatcga agtgttcgtt 11520

aacgcgataa tgattatttc tggcgacgtc gtggataatc acggaagcca cgcgaatcgc 11580

gcgatccagc cattttttgt tgtgagggac gtcataaaca atcaagaaag cttgcattgt 11640

gtggtgacgg tcttccagcc attcggctcc tgctgtattg aagcatacca ggctatttca 11700

atatcgctat gctgcggcag catttaaccc cttgtaattc attgccataa ttgatttaat 11760

tcacaaataa aactataaca tggtgaaatt aataaaaaaa cacagatgat ggggctagaa 11820

tttacacacc acttacccta aagctttatg actggtgggt tttgggagta tcaaatcggc 11880

ttgcatgggg atgtcctaca aaggaacacc ttcttccaca ctttctggaa catttaggta 11940

acaaccatct ggatattggt gttggaactg ggttttacct tactcacgta cctgagagta 12000

gtctgatatc tttaatggat ttgaacgaag ctagcctgaa cgcggcatct acaagggctg 12060

gggaatcaaa aattaaacat aaaattagcc atgatgtttt tgaaccttat cccgcggcgt 12120

tacatggtca atttgattcc atttccatgt cttaccttct tcactgcctg cctggaaata 12180

tatctacaaa aagctgtgta atacgcaatg cggcgcaggc cttaactgac gatggaactc 12240

tatacggagc cacaattctt ggcgatggag ttgtgcacaa tagcttcggt caaaaactga 12300

tgcgcattta caatcagaaa ggcatctttt caaacacaaa agattccgaa gaaggcttaa 12360

cacatatact ctcagagcat ttcgagaatg ttaaaaccaa ggttcaaggt actgtagtaa 12420

tgttttccgc ttcaggaaaa aaatag 12446

<210>2

<211>120

<212>PRT

<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(120)

<223>

<400>2

Met Gly Val Thr Trp Thr Tyr Phe Lys Gln Phe Glu Ile Val Glu His

1 5 10 15

Glu Glu Asn Asp Phe Asn Glu Met Ile Arg Tyr Phe Asp Gln Gly Glu

20 25 30

Leu Arg Phe Thr Tyr Ala Thr Ser Gly Thr Leu Arg Ala Val Tyr Ala

35 40 45

Asn Tyr Gly Ile His Ile Pro Ile Tyr Ser Gln Phe Glu Pro Pro Asn

50 55 60

Ser Lys Lys Leu Glu Leu Val Ser Pro Glu Asp Leu Val His Ala Cys

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ile Lys Val Leu Lys Glu Gly Ile Asn Pro Glu Phe Lys

85 90 95

Gly Phe Asp Gly Glu Lys Ser Leu Leu Trp Glu Leu Asp Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Arg Asn Gly Gly Ser Lys Pro

115 120

<210>3

<211>105

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(105)

<223>

<400>3

Met Glu Glu Phe Tyr Met Cys Ile Pro Ile Val Val Leu Val Glu Tyr

1 5 10 15

Asp Phe Tyr Asn Asp Gly Thr Gly Ser Lys Val Tyr Leu Phe Lys Asp

20 25 30

Ile Asn Asn Ala Ile Ile Phe Ala Lys Arg Glu Ala Lys Thr Tyr Leu

35 40 45

Glu Asp Asn Ser Leu Thr Leu Glu Asp Phe Lys Gly Gln His Asp Thr

50 55 60

Leu Asp Ile Met Glu Thr Asn Asp Ser Tyr Tyr Phe Asn Ser Trp Asn

65 70 75 80

Asp Lys Asn Cys Asp Lys Tyr Asn Ile Val Val Tyr Glu Gln Glu Phe

85 90 95

Lys Asp Lys Thr Thr Lys Leu Ile Asn

100 105

<210>4

<211>575

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(575)

<223>

<400>4

Met Ala Asp Glu Leu Thr Pro Ser Gln Phe Leu Glu Leu Asp Lys Asn

1 5 10 15

His Leu Lys Gly Leu Leu Leu Lys Ser Gly Gly Thr Thr Ser His Thr

20 25 30

Val Ile Leu Ala Arg Ser Phe Asn Ile Pro Thr Leu Val Gly Val Asp

35 40 45

Ile Asp Ala Leu Thr Pro Trp Gln Gln Gln Thr Ile Tyr Ile Asp Gly

50 55 60

Asn Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Pro Gly Glu Ala Val Ala Arg Tyr

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Glu Ala Arg Val Gln Asp Ala Leu Arg Glu Gln Gln Arg

85 90 95

Val Trp Leu Thr Gln Gln Ala Arg Thr Ala Asp Gly Ile Arg Ile Glu

100 105 110

Ile Ala Ala Asn Ile Ala His Ser Val Glu Ala Gln Ala Ala Phe Gly

115 120 125

Asn Gly Ala Glu Gly Val Gly Leu Phe Arg Thr Glu Met Leu Tyr Met

130 135 140

Asp Arg Thr Ser Ala Pro Gly Glu Ser Glu Leu Tyr Asn Ile Phe Cys

145 150 155 160

Gln Ala Leu Glu Ser Ala Asn Gly Arg Ser Ile Ile Val Arg Thr Met

165 170 175

Asp Ile Gly Gly Asp Lys Pro Val Asp Tyr Leu Asn Ile Pro Ala Glu

180 185 190

Ala Asn Pro Phe Leu Gly Tyr Arg Ala Val Arg Ile Tyr Glu Glu Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Phe Thr Thr Gln Leu Arg Ser Ile Leu Arg Ala Ser Ala

210 215 220

His Gly Ser Leu Lys Ile Met Ile Pro Met Ile Ser Ser Met Glu Glu

225 230 235 240

Ile Leu Trp Val Lys Glu Lys Leu Ala Glu Ala Lys Gln Gln Leu Arg

245 250 255

Asn Glu His Ile Pro Phe Asp Glu Lys Ile Gln Leu Gly Ile Met Leu

260 265 270

Glu Val Pro Ser Val Met Phe Ile Ile Asp Gln Cys Cys Glu Glu Ile

275 280 285

Asp Phe Phe Ser Ile Gly Ser Asn Asp Leu Thr Gln Tyr Leu Leu Ala

290 295 300

Val Asp Arg Asp Asn Ala Lys Val Thr Arg His Tyr Asn Ser Leu Asn

305 310 315 320

Pro Ala Phe Leu Arg Ala Leu Asp Tyr Ala Val Gln Ala Val His Arg

325 330 335

Gln Gly Lys Trp Ile Gly Leu Cys Gly Glu Leu Gly Ala Lys Gly Ser

340 345 350

Val Leu Pro Leu Leu Val Gly Leu Gly Leu Asp Glu Leu Ser Met Ser

355 360 365

Ala Pro Ser Ile Pro Ala Ala Lys Ala Arg Met Ala Gln Leu Asp Ser

370 375 380

Arg Glu Cys Arg Lys Leu Leu Asn Gln Ala Met Ala Cys Arg Thr Ser

385 390 395 400

Leu Glu Val Glu His Leu Leu Ala Gln Phe Arg Met Thr Gln Gln Asp

405 410 415

Ala Pro Leu Val Thr Ala Glu Cys Ile Thr Leu Glu Ser Asp Trp Arg

420 425 430

Ser Lys Glu Glu Val Leu Lys Gly Met Thr Asp Asn Leu Leu Leu Ala

435 440 445

Gly Arg Cys Arg Tyr Pro Arg Lys Leu Glu Ala Asp Leu Trp Ala Arg

450 455 460

Glu Ala Val Phe Ser Thr Gly Leu Gly Phe Ser Phe Ala Ile Pro His

465 470 475 480

Ser Lys Ser Glu His Ile Glu Gln Ser Thr Ile Ser Val Ala Arg Leu

485 490 495

Gln Ala Pro Val Arg Trp Gly Asp Asp Glu Ala Gln Phe Ile Ile Met

500 505 510

Leu Thr Leu Asn Lys His Ala Ala Gly Asp Gln His Met Arg Ile Phe

515 520 525

Ser Arg Leu Ala Arg Arg Ile Met His Glu Glu Phe Glu Leu Gly Thr

530 535 540

Arg Gly Ser Ser Arg Val Asp Gln Glu Lys Gln Tyr Val Thr Leu Tyr

545 550 555 560

Phe Trp Lys Leu Lys Thr Gly Tyr Tyr Cys Ser Tyr His Lys Tyr

565 570 575

<210>5

<211>205

<212>PRT

<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(205)

<223>

<400>5

Met Ile Asn Asp Lys Lys Ser Pro Ile Leu Asp Asp Glu Ile Glu Lys

1 5 10 15

Phe Leu Ala Thr Lys Glu Leu Asn Leu Ile Ala Thr Thr Asp Ser Tyr

20 25 30

Lys Ala Phe Lys Asp Ala Asp Tyr Leu Ile Ile Ala Thr Pro Thr Asp

35 40 45

Tyr Asp Pro Glu Lys Asn Ser Phe Asn Thr Arg Thr Val Glu Thr Val

50 55 60

Ile Ala Lys Ile Leu Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ile Met Ile Ile Lys

65 70 75 80

Ser Thr Val Pro Val Gly Tyr Thr Glu Lys Val Lys Arg Lys Phe Lys

85 90 95

Thr Ser Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe Leu Arg Glu Gly Asn Ala

100 105 110

Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile Ile Val Gly Glu Gln Ser

115 120 125

Ser Arg Ala Lys Val Phe Ala Asp Leu Leu Val Glu Gly Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Asp Ile Pro Val Leu Phe Thr Asn Ser Thr Glu Ala Glu Ala Ile

145 150 155 160

Lys Leu Phe Ala Asn Thr Tyr Leu Ala Met Arg Val Ala Phe Phe Asn

165 170 175

Glu Leu Asp Ser Tyr Ala Glu Val Arg Gly Leu His Thr Lys Gln Ile

180 185 190

Ile Asp Ile Lys Gly Lys Phe Asn Phe Thr Phe Pro Phe

195 200 205

<210>6

<211>228

<212>PRT

<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(228)

<223>

<400>6

Met Ser Glu Cys Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Asn Ser Leu Leu Ile His

1 5 10 15

Ala Ala Ala Val Tyr Ser Lys Glu Lys Asp Arg Ser Tyr Leu Ile Leu

20 25 30

Gly Glu Lys Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ser Phe Arg Leu Cys Gln

35 40 45

Glu Leu Gly Leu Ser Leu Ile Gly Asn Asp Leu Val Arg Ile Gly Tyr

50 55 60

Asp Glu Asn Gly Glu Leu Phe Thr Lys Glu Gly Ser Arg Trp Phe Asp

65 70 75 80

Val Arg Glu Thr Ala Val Lys Ala Asp Asp Tyr Met Asn Lys Leu Ala

85 90 95

Thr Ile Leu Ser Ala Lys Ser Ala Asn Ser Trp Asn Asn Lys Thr Arg

100 105 110

Ile Leu Pro Glu Asp His Ser Ile Glu Thr His Phe Glu Gln Ser Lys

115 120 125

Ile Asp Lys Ile Leu Asn Ile Arg Ile Asp Pro Tyr Gln Asn Tyr Phe

130 135 140

Ser Val Ser Pro Trp Glu Gly Val Gln Arg Asn Leu Ile Leu His Glu

145 150 155 160

Lys Ile Gly Arg His Ile Ser Gly Gln Ala Thr Pro Phe Gln Asp Asp

165 170 175

Gln Gly Asn Tyr Leu Gly Ser Leu Pro Ser Ile Asn Arg Asp Lys Ala

180 185 190

Ser Leu Val Arg Asp Asn Ile Val Lys Cys Met Val Asn Thr Gly Ile

195 200 205

Thr Glu Leu Phe Gly Pro Asp Ser Lys Ala Leu Ala Thr Trp Phe Lys

210 215 220

Glu Glu Val Leu

225

<210>7

<211>375

<212>PRT

<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(375)

<223>

<400>7

Met Ile Ala Ile Gly Ile Pro Thr Tyr Asn Glu Ala Lys Asn Ile Ser

1 5 10 15

Lys Leu Thr Gln Leu Ile Asp Cys Val Ala Val Lys Ile Gly Leu Glu

20 25 30

Ile Val Ile Ile Asn Ala Asp Asn Asn Ser Pro Asp Asn Thr Ala Thr

35 40 45

Ile Phe Thr Ser Val Lys Thr Leu Asn Lys Lys Ile Ser Val Val Thr

50 55 60

Lys Glu Val Gly Lys Gly Phe Asn Ile Lys Ala Ile Ile Asp Ile Val

65 70 75 80

Asn Asn Leu Asp Asn Cys Glu Gly Cys Ile Leu Ile Asp Gly Asp Ile

85 90 95

Thr Ser Phe Ser Glu Ser Trp Leu Lys Lys Phe Ile Glu Leu Leu Ile

100 105 110

Asp Lys Val Asp Phe Val Val Pro Asn Tyr Ser Arg Ser Phe Gln Glu

115 120 125

Gly Asn Thr Thr Asn His Phe Val Tyr Pro Leu Ile Asn Tyr His Thr

130 135 140

Asn Gly Asn Cys Pro Arg Gln Pro Ile Ala Gly Asp Phe Gly Leu Ser

145 150 155 160

Lys Asn Phe Ile Lys Phe Leu Val Asn Ser Val His Trp His Lys Tyr

165 170 175

Cys Tyr Gly Tyr Gly Ile Asp Ile Phe Leu Thr Leu His Ala Val Tyr

180 185 190

Asn Asn Phe Arg Ile Glu Glu Ile Asn Leu Asp Arg Lys Glu His Asn

195 200 205

Pro Ser Phe Gly Lys Met Val Asp Met Phe Val Glu Val Ala Ser Ser

210 215 220

Tyr Tyr Glu Thr Ser Lys Ile Ile Phe Glu Ser Lys Lys Lys Asn Gly

225 230 235 240

Ile Phe Asn Thr Ala Val Ile Lys Ser Ser Asn Pro Ser Val Leu Phe

245 250 255

Ser Pro Lys Ile Phe Leu Ser Gln Glu Glu Ile Leu Lys Lys Lys Glu

260 265 270

Glu Ala Asn Lys Ile Leu Ala Ser Lys Glu Thr Ile Leu Asn Met Arg

275 280 285

Lys Asp Ile Glu Ile Asn Pro Ser Val Trp Val Glu Ile Leu Leu Ala

290 295 300

His Glu Lys Arg Ile Gly Gln Val Asp Ser Gln Leu Leu Ala Lys Ser

305 310 315 320

Ile Leu Pro Tyr Tyr Leu Leu Arg Val Val Asp Tyr Leu Gln Asn Ile

325 330 335

Ser Asn Val Lys Asp Ala Glu Leu Asn Ile Glu Lys Glu Ile Asp Leu

340 345 350

Leu Gln Leu Gln Lys Asn Glu Ala Val Lys Ser Asp Val Glu Phe Asp

355 360 365

Val Asp Phe Ile Asn Ser Ile

370 375

<210>8

<211>226

<212>PRT

<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(226)

<223>

<400>8

Met Gln Ala Phe Leu Ile Val Tyr Asp Val Pro His Asn Lys Lys Trp

1 5 10 15

Leu Asp Arg Ala Ile Arg Val Ala Ser Val Ile Ile His Asp Val Ala

20 25 30

Arg Asn Asn His Tyr Arg Val Asn Glu His Phe Asp Thr Gln Trp Asn

35 40 45

Pro Leu Pro Asp Tyr Asn Lys Asp Asn Pro Ala His Arg Phe Arg Ala

50 55 60

Phe Gly Gly Thr Pro Gly His Trp Ile Glu Trp Gly Arg Leu Met Leu

65 70 75 80

His Ile His Ala Ala Leu Glu Ala Arg Cys Glu Gln Pro Pro Ala Trp

85 90 95

Leu Leu Glu Asp Ala Lys Gly Leu Phe Asn Ala Thr Val Arg Asp Ala

100 105 110

Trp Ala Pro Asp Gly Ala Asp Gly Ile Val Tyr Thr Val Asp Trp Glu

115 120 125

Gly Lys Pro Val Val Arg Glu Arg Val Arg Trp Pro Ile Val Glu Ala

130 135 140

Met Gly Thr Ala Tyr Ala Leu Tyr Thr Val Thr Gly Asp Arg Gln Tyr

145 150 155 160

Glu Thr Trp Tyr Gln Thr Trp Trp Glu Tyr Cys Ile Lys Tyr Leu Met

165 170 175

Asp Tyr Glu Asn Gly Ser Trp Trp Gln Glu Leu Asp Ala Asp Asn Lys

180 185 190

Val Thr Thr Lys Val Trp Asp Gly Lys Gln Asp Ile Tyr His Leu Leu

195 200 205

His Pro Leu Glu Val Asp Gly Ile Asp Leu Lys Glu Pro Gln Gln Tyr

210 215 220

Ser Leu

225

<210>9

<211>101

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(101)

<223>

<400>9

Met Phe Phe Ser Thr Ser Val Arg Pro Phe Ser Ser Ala Asp Cys Ser

1 5 10 15

Ala Ser Thr Pro Leu Ala Ala Gly Arg Leu Pro Ser Ala Leu Arg Ser

20 25 30

Lys Glu Glu Ile Gly Val Arg Met Pro Pro Ala Leu Pro Leu His Thr

35 40 45

Val Arg Ala ArgIle Ile Cys GlyPhe Arg Leu Val Ser Glu Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ser Ser Ser Asp Leu Thr Ser Ala Ser Gly Ala Ser Gln

65 70 75 80

Trp Gly Asn Ser Leu Met Glu Ser Leu Leu Gln Lys Ile Asn Lys Pro

85 90 95

Lys Met Asn Phe Ile

100

<210>10

<211>561

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(561)

<223>

<400>10

Met Lys Lys Met Ala Thr Ser Val Leu Glu Arg Tyr Met Phe Pro Asn

1 5 10 15

Asp Tyr His Ile Ile Lys Thr Phe Pro Leu Thr Glu Asn Asn Lys Val

20 25 30

Asp Arg Lys Ser Leu Leu Phe Ser Tyr Glu Glu Ser Lys Lys Ser Glu

35 40 45

Lys Leu Ile Ile Ser Lys Asp Met Thr Glu Phe Glu Glu Val Leu Arg

50 55 60

Asp Lys Val Ala Leu Ile Leu Asn Leu Pro Lys Glu Leu Ile Gly Lys

65 70 75 80

Asp Ser Asp Phe Phe Glu Leu Gly Gly Asp Ser Leu Asp Val Phe Gln

85 90 95

Leu Leu Leu Lys Leu Glu Glu Met Tyr Glu Thr Glu Leu Ser Leu Glu

100 105 110

Leu Ile Tyr Thr Asn Arg Thr Leu Ser Arg Ile Ala Ser Glu Val Ser

115 120 125

Lys Leu Leu Thr Thr Glu Arg Glu Glu Val Phe Glu Glu Lys Leu His

130 135 140

Glu Glu Asp Phe Lys Leu Met Glu Lys Glu Ile Asn Gly Tyr Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asp Glu Tyr Gln Thr Thr Tyr Ser Phe Glu Thr Ile His Ser Gln

165 170 175

Arg Val Tyr Tyr Phe Asp Asn Phe Lys Ser Ser Val Ser Phe Asp Tyr

180 185 190

Arg Val Asp Thr Ser Tyr Asp Lys Glu Thr Val Ile Lys Ala Ile Lys

195 200 205

Thr Ile Ile Asn Ser Asn Asp Leu Met Arg Ala Met Leu Arg Glu Ser

210 215 220

Asp Ser Arg Leu Glu Phe Lys Ile Leu Asn Ser Ile Asp Ser Phe Pro

225 230 235 240

Ile Phe Thr Leu Asn Arg Asn Val Glu Lys Lys Ser Phe Ile Gln Lys

245 250 255

Ile Glu Ser Ile Gly Glu Asn Leu Val Tyr Lys Ala Arg Asn Asn Gly

260 265 270

Gly Leu Leu Gly Phe Leu Ala Leu Leu Ile Asp Lys Ser Gly Tyr Thr

275 280 285

Ile Val Gly Val Leu Asp His ThrIle Ala Asp Ile Ser CysIle Asn

290 295 300

Ile Ile Lys Lys Met Ile Gly Glu Glu Leu Asn Gly Tyr Ser Ser Lys

305 310 315 320

Glu Lys Ala Ser Tyr Asn Asp Phe Cys Tyr Glu Val Arg Glu Tyr Asn

325 330 335

Thr Ile Asp Ser Leu Lys Asn Asn Ala Tyr His Asn Asn Leu Leu Ala

340 345 350

Ile Ser Lys Asn Val Asn Asp Val Asn Leu Asn Lys Leu Ser Lys Ser

355 360 365

Leu Lys Cys Tyr Glu Ile Asp Tyr Pro Ser Gln Gly Asp Ser Phe Arg

370 375 380

Ile Ile Asn Phe LeuSer Tyr Val Ile Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ile

385 390 395 400

Val Asp Arg Glu Gln Ile Val Ile Lys Ser Val Ile Asn Gly Arg Glu

405 410 415

Asn Lys Leu Phe Asp Phe Ser Thr Thr Ile Gly Asp Phe His Gly Ser

420 425 430

Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Lys Asp Glu Asn Tyr Glu Gln Phe Thr Asn

435 440 445

Lys Ser Glu Gly Ile Phe Gly Lys Tyr Tyr Thr Thr His Pro Tyr Arg

450 455 460

Pro Gly Tyr Ala Phe Gly Ser Asn Tyr Pro Ser Lys Thr Lys Glu Gln

465 470 475 480

Lys Lys Leu Lys Asp Gln Trp Asn Ser Ile Ser Asn Thr Ser Ile Asn

485 490 495

Tyr Ile Gly Glu Val Ser Asp Tyr Glu Lys Ser Ser Tyr Tyr Asp Thr

500 505 510

Ile Ser Asn Val Phe Asp Asn Leu Glu Lys Ile Gln Asp Leu Ile Tyr

515 520 525

Val Thr Ala Phe Ser Asn Asn Asn Lys Leu Thr Val Phe Leu Asn Lys

530 535 540

Asn Leu Gly Gln Leu Asn Phe Leu Glu Lys Leu Tyr Tyr Pro Thr Phe

545 550 555 560

Ile

<210>11

<211>311

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(311)

<223>

<400>11

Met Met Arg Arg Ile Asn Ile Glu Ile Ile Phe Lys Leu Val Gly Gly

1 5 10 15

Asn Ile Met Asp Arg Ser Lys Lys Asn Gly Ile Tyr Met Leu Thr Gly

20 25 30

Lys Thr Thr Asn Lys Ile Gly Asn Val Ile Phe Asp Tyr Ile Asn Asn

35 40 45

Val Leu Ile Ala Ser Leu Gly Thr Lys Ala Ser Asn Leu Leu Ala Leu

50 55 60

Tyr Gln Ser Ser Glu Ile Ile Val Asn Ile Leu Phe Asn Met Leu Gly

65 70 75 80

Gly Val Phe Ala Asp Leu Lys Asn Arg Lys Lys Ile Ile Ile Ile Thr

85 90 95

Asp Leu Thr Ala Ser Leu Ala Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Phe Trp Asp

100 105 110

Ser Lys Asn Ser Leu Phe Leu Ile Ile Leu Ile Asn Ile Leu Leu Ala

115 120 125

Leu Leu Tyr Ser Phe Asn Ser Pro Ala Tyr Lys Ala Ile Val Lys Asp

130 135 140

Ile Leu Lys Thr Glu Asp Leu Asn Lys Phe Asn Ser Tyr Ser Asn Ala

145 150 155 160

Phe Ser Glu Val Val Ser Val Leu Gly Pro Leu Val Ala Ile Ser Thr

165 170 175

Val His Tyr Phe Gly Phe Lys Thr Gly Met Leu Ile Asn Ser Ile Ser

180 185 190

Phe Leu Ile Ser Ala Tyr Cys Val Ser Arg Phe Gln Val Ile Asn Tyr

195 200 205

Val Gln Lys Lys Lys Lys Gly Lys Glu Lys Tyr Met Val Val Leu Ser

210 215 220

Asp Gly Phe Lys Tyr Val Leu Lys Gln Arg Asn Val Leu Glu Leu Leu

225 230 235 240

Ile Val Ser Ser Phe Ile Asn Phe Phe Leu Ala Gly Tyr Asn Phe Phe

245 250 255

Leu Pro Tyr Thr Asn Ile Phe Ser Glu Asn Gln Gly Ile Tyr Ala Ser

260 265 270

Ile Leu Ile Thr Glu Ser Ile Gly Ser Ile Val Gly Ala Leu Leu Asn

275 280 285

Arg Tyr Arg Arg Pro Arg Gly Gly Ala Ala Gly Asp Lys Tyr Pro Val

290 295 300

Cys Arg Pro Arg Leu Trp Trp

305 310

<210>12

<211>143

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(143)

<223>

<400>12

Met Asp Leu Asn Glu Ala Ser Leu Asn Ala Ala Ser Thr Arg Ala Gly

1 5 10 15

Glu Ser Lys Ile Lys His Lys Ile Ser His Asp Val Phe Glu Pro Tyr

20 25 30

Pro Ala Ala Leu His Gly Gln Phe Asp Ser Ile Ser Met Ser Tyr Leu

35 40 45

Leu His Cys Leu Pro Gly Asn Ile Ser Thr Lys Ser Cys Val Ile Arg

50 55 60

Asn Ala Ala Gln Ala Leu Thr Asp Asp Gly Thr Leu Tyr Gly Ala Thr

65 70 75 80

Ile Leu Gly Asp Gly Val Val His Asn Ser Phe Gly Gln Lys Leu Met

85 90 95

Arg Ile Tyr Asn Gln Lys Gly Ile Phe Ser Asn Thr Lys Asp Ser Glu

100 105 110

Glu Gly Leu Thr His Ile Leu Ser Glu His Phe Glu Asn Val Lys Thr

115 120 125

Lys Val Gln Gly Thr Val Val Met Phe Ser Ala Ser Gly Lys Lys

130 135 140

Claims

1.来源于苏云金芽胞杆菌的能够合成苏云金素的基因簇，它是thuA，thuB，thuC，thuD，thuE，thuF，thuG，thu1，thu2，thu3和thu4共11个基因，它们的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，它们编码的苏云金素生物合成酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2-12所示，所述基因在基因簇中的顺序和位置分别是：

thuA位于基因簇核苷酸序列的1-363位碱基处，长度为363个碱基对，编码120个氨基酸，编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶；

thuB位于基因簇核苷酸序列的364-681位碱基处，长度为317个碱基对，编码105个氨基酸，编码解旋酶；

thuC位于基因簇核苷酸序列的2617-4344位碱基处；长度为1727个碱基对，编码575个氨基酸，编码磷酸转运酶；

thuD位于基因簇核苷酸序列的4661-5278位碱基处，长度为617个碱基对，编码205个氨基酸；编码UDP-葡萄糖脱氢酶；

thuE位于基因簇核苷酸序列的7987-8673位碱基处，长度为686个碱基对，编码228个氨基酸，编码莽草酸激酶；

thuF位于基因簇核苷酸序列的8670-9797位碱基处，长度为1127个碱基对，编码375个氨基酸，编码糖苷转移酶；

thuG位于基因簇核苷酸序列的10957-11637位碱基处，长度为680个碱基对，编码226个氨基酸，编码氨基葡萄糖异构酶；

在序列表SEQ ID NO：1中：

thu1位于基因簇核苷酸序列的2010-2315位碱基处，长度为305个碱基对，编码101个氨基酸，编码多糖聚合蛋白；

thu2位于基因簇核苷酸序列的5790-7475位碱基处，长度为1685个碱基对，编码561个氨基酸，编码非核糖体肽/聚酮合成酶结构域；

thu3位于基因簇核苷酸序列的10125-11060位碱基处，长度为935个碱基对，编码311个氨基酸，编码蛋白DUF894；

thu4位于基因簇核苷酸序列的12015-12446位碱基处，长度为431个碱基对，编码143个氨基酸，编码甲基转移酶。

2.一株产苏云金素的重组苏云金芽胞杆菌，该菌株是重组的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株BMB0542，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M209011。

3.权利要求1所述的合成苏云金素的基因簇在制备苏云金素中的应用。

4.权利要求2所述的重组的苏云金芽胞杆菌在制备苏云金素中的应用。