CN101455704A - 一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种药物，是一种预防和治疗骨质疏松症的中药组合物，本发明还涉及该中药组合物的制备方法，属于医药技术领域。本发明主要由骨碎补(25～40)％、淫羊藿(20～35)％、怀牛膝(10～25)％、杜仲(10～25)％和鹿角片(5～15)％制成。其制备工艺为按配方称取各原药材骨碎补、淫羊藿、怀牛膝、杜仲和鹿角片，怀牛膝醇提、过滤得滤液I和药渣，将药渣与骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片用水煎煮，过滤得滤液II，合并滤液，浓缩制成含有活性组分的药液。本发明提供的中药组方副作用小，对原发性骨质疏松症具有较好的预防和治疗效果。

Description

一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物，是一种预防和治疗骨质疏松症的中药组合物，本发明还涉及该中药组合物的制备方法，属于医药技术领域。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis，简称OP)，是由于全身骨质及骨组织的微细结构的改变，致使骨强度减弱、骨脆性增加，极易发生骨折的系统性多病因骨骼疾病，属于中医“骨痿”、“骨痹”、“腰痛”、“骨枯”、“骨极”、“骨折”、“绝经前后诸症”、“虚劳”等范畴。研究表明，美国、欧洲和日本大约有7500万人不同程度地患有骨质疏松症，我国也有数千万的患者，尤其是绝经后妇女发病率更高，所以现代中医学家常将此症归为“绝经前后诸症”。随着社会人口老龄化，骨质疏松的发病率在继续增加，由此给家庭和社会带来沉重的负担。因此，骨质疏松症的有效预防与治疗已引起世界医学界的广泛重视。近年来，国内外对骨质疏松症的研究均非常重视，中医药防治骨质疏松症的研究也取得了不少成果，其着重于整体调节，调动内因，作用于多个环节，最终达到纠正机体激素失衡和负钙平衡的功效，疗效得到了充分肯定。

检索发现，申请号为02135700.5和200310112783.4的中国专利申请分别公开了两种治疗骨质疏松症的中药及其制备方法，前者主要由一定配比的玄驹、骨碎补、淫羊藿、续断、人参、川芎、生牡蛎、怀牛膝配制而成，后者主要由淫羊藿、骨碎补、炒杜仲、首乌、怀牛膝、土鳖虫配制而成。其配药成分均较为复杂，有一定副作用，药效有待进一步提高。

发明内容

本发明目的是提供一种预防和治疗骨质疏松症的中药，其副作用小，对原发性骨质疏松症具有较好的预防和治疗效果。

本发明的另一个目的是提供该中药的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物，每份中药组合物主要由下列重量比的原药材制成：骨碎补(25～40)％、淫羊藿(20～35)％、怀牛膝(10～25)％、杜仲(10～25)％和鹿角片(5～15)％。

优选用量为：骨碎补(25～35)％、淫羊藿(20～30)％、怀牛膝(15～25)％、杜仲(15～25)％和鹿角片(5～10)％。

最佳用量为：骨碎补31％、淫羊藿21％、怀牛膝21％、杜仲21％和鹿角片6％。

本发明中各原药材来源如下：

骨碎补为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根茎，拉丁名为Rhizoma Drynariae，产地四川。

淫羊藿为小薜科植物箭叶淫羊藿Epimedium segittatum(Sitb.et Zucc.)Maxim.的地上部分，拉丁名为Herba Epimedii，产地陕西。

怀牛膝为苋科多年生药用草本植物。别名：对节草、山苋菜等，以干燥根入药，拉丁名为Radix Achyranthis Bidentatae，产地河南。

杜仲为杜仲科植物杜仲的树皮，拉丁名为Cortex Eucommiae原植物杜仲Cortex Eucommia ulmoides Oliv，产地湖北。

鹿角别名斑龙角(《本草纲目》)，为鹿科动物梅花鹿或马鹿已骨化的老角。处方名鹿角片，拉丁名为Corun Cervi，产地吉林。

本发明的另一个目的通过以下技术方案实现：

一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取各原药材骨碎补25～40％、淫羊藿20～35％、怀牛膝10～25％、杜仲10～25％和鹿角片5～15％备用；

(2)将所述重量配比的怀牛膝加乙醇回流提取2次，每次0.5～3小时，过滤得滤液I和药渣，备用；

(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)中得到的药渣加水煎煮两次，第一次加水量为所述骨碎补、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步骤(2)中得到的药渣总重量的9～11倍量，第二次加水量为所述骨碎补、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步骤(2)中得到的药渣总重量的7～9倍量，每次煎煮0.5～3小时，过滤得滤液II，备用；

(4)合并滤液I和滤液II，浓缩制成药液。还可以根据需要添加以下步骤：

(5)所述滤液浓缩后，在80～90℃下干燥，制成粉末状的中药组合物。

(6将所述活性组分与常用辅料混合，制成固体制剂。

以上中药组合物还可以根据需要利用制药常规方法制成临床上适用的剂型，如液体制剂等。

本发明原药材选用骨碎补和淫羊藿组合，其中骨碎补补肾活血，主治肾虚腰痛，《本草从新》云其疗“骨痿”效佳，为君药；淫羊藿补肾阳、坚筋骨，《本草备要》载其能“补命门，益精气，坚筋骨”，为臣药；怀牛膝“走而能补”，《别录》认为“牛膝益精、填骨髓，除腰脊痛。”既活血化瘀，又能补肝肾、强筋骨，善治腰膝酸痛、下肢无力等症。杜仲补肝肾、强筋骨，《本经》记载：杜仲“主腰脊痛，补中，益精气，坚筋骨”。鹿角片入肝、肾经，温补肝肾、强筋骨、兼有活血之效，《本草纲目》记载：鹿角“生用则散热行血，消肿辟邪；熟用则益肾补虚，强精活血”。现代药理研究表明：应用⁴⁵Ca同位素示踪法证明，骨碎补有促进骨对钙的吸收作用，提高血钙与血磷水平，有利于骨钙化和骨盐形成，骨碎补提取物对小鸡骨发育生长有显著促进作用，对组织培养中的鸡胚骨原基的Ca、P沉积有明显促进作用。淫羊藿不但具有补阳药的激素样作用，而且可促进成骨细胞的生长，抑制破骨细胞的功能。怀牛膝与淫羊藿配伍，有提高维甲酸致骨质疏松模型动物骨密度作用。杜仲有促进成骨细胞增殖、调节成骨细胞代谢的作用(参考文献[i])。值得一提的是，实验研究表明，鹿角可明显增加正常小鼠血清钙含量浓度(参考文献[ii])。将鹿角片与怀牛膝、杜仲共为佐药，可以具有显著的补益肝肾、兼有活血之效。因此本发明提供的中药组方副作用小，对原发性骨质疏松症具有更好的预防和治疗效果。

具体实施方式

实施例一

按本发明技术方案所制得的中药组合物对去卵巢大鼠骨质疏松模型促骨形成的作用

本实验拟通过建立大鼠绝经后骨质疏松症模型，借助现代病理组织学检查、双能X线骨密度测定仪、生物化学、分子生物学等方法与手段，系统观察中药组合物对绝经后骨质疏松症的作用途径及作用机理，初步探索该药防治绝经后骨质疏松症的机理(如促进骨形成等)，为临床防治绝经后骨质疏松症提供科学、合理的实验依据。

1.主要实验材料

1.1实验动物：

清洁级SD大鼠，雌性，3月龄，150～200g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK(沪)2007-0005；实验环境合格证号：SYXK(苏)2007-0026。

1.2主要试剂：

苯甲酸雌二醇：天津金耀氨基酸有限公司提供，批号0609131；血清雌二醇放射免疫分析药盒：北京市福瑞生物工程公司提供，批号070920；血清骨钙素放免药盒：北京市福瑞生物工程公司提供，批号070915；碱性磷酸酶检测试剂盒：南京建成生物工程研究所提供，批号071007；血清钙试剂盒：南京建成生物工程研究所提供，批号071008；大鼠胰岛素样生长因子(IGF-I)定量酶联检测试剂盒：上海森雄科技实业有限公司提供，批号0804121；其他试剂均为市售分析纯产品。

1.3主要仪器：DPX-NT型双能x射线骨密度仪(LUNAR，美国)；METTLER PB303-N电子天平，上海产；SN-695B型智能放免γ测量仪，上海原子核研究所日环仪器一厂；752s型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；三洋MDF-382E超低温冰箱，日本产；隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；Axioskope 2生物荧光显微图像分析系统，德国ZEISS产；XHF-1高速分散器，上海金达生化仪器厂；台式高速离心机，上海医用分析仪器厂；HH-60型快速恒温数显水箱，常州国华电器有限公司。

2.实验方法

2.1中药组合物的制备：

原料药选取如下：

骨碎补片：产地四川，购自江苏省盱眙县中药饮片厂，批号060801；

淫羊藿：产地陕西，购自南京康怡中药饮片有限公司，批号070310；

怀牛膝：产地河南，购自南京药业股份有限公司中药饮片厂，批号070106；

盐炒杜仲：产地湖北，购自南京康怡中药饮片有限公司，批号070310；

鹿角片：产地吉林，购自江苏省盱眙县中药饮片厂，批号061002。

按最佳的原药材配比值的制备步骤如下：

(1)按每份中骨碎补31％、淫羊藿21％、怀牛膝21％、杜仲21％和鹿角片6％的比例称取各原药材，备用；

(2)将所述重量配比的怀牛膝加70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，过滤得滤液I和药渣，备用；

(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)中药渣加水煎煮两次，第一次加水量为10倍量，第二次加水量为8倍量，每次煎煮1.5小时，过滤得滤液II，备用；

(4)合并滤液I和滤液II，浓缩制成药液。

2.2绝经期大鼠模型的建立

参照文献方法[谢雁鸣，赵晋宁，丁会，等.强骨胶囊抗去势大鼠骨质疏松症的实验研究[J].中国医药科技，2000，7(3)：151-152.1]，取体重150～200g的清洁级雌性SD大鼠50只，禁食12h(不禁水)，于腹部剪毛，形成约3×5cm的去毛区，以碘酒消毒后，用10％的水合氯醛按0.3ml/100g的剂量腹腔注射麻醉。其后沿腹中线向下做纵行切口，长约2～3cm，切开皮肤后，即可见位于两侧肾脏外下方呈粉红色的卵巢及紧密相连的子宫角，结扎并切断子宫角，将卵巢摘除。缝合腰肌及皮肤。另取10只SD大鼠，仅从两侧卵巢旁边切除少许脂肪组织，不作卵巢摘除，作为伪手术组。术后连续肌注青霉素(40万单位/只)3d以预防感染，正常饲养3个月后，造成大鼠骨质疏松模型。

2.3分组及给药方法

将上述模型大鼠随机分为5组，即模型组(Model)，阳性药组(EB)，中药组合物高、中、低剂量组(H-JGP，M-JGP，L-JGP)，每组10只。另设伪手术组(Control)10只。阳性药组采用苯甲酸雌二醇(EB)注射液，肌注给药，3日1次，每次0.276mg/kg；高、中、低剂量组均灌胃给药，剂量分别为17.6、8.8、4.4g生药/kg·d-1。模型组及伪手术组灌胃给予等量消毒饮用水，连续给药3个月。

3.指标检测

3.1骨密度测定

给药结束后，每组取8只大鼠，以10％水合氯醛腹腔麻醉后，用双能x射线骨密度仪测量大鼠股骨和腰椎的骨密度(bonemineraldensity，BMD)。

3.2生化指标测定

3.2.1样品采集方法

上述大鼠，最后一次灌胃给药后1小时，以10％水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉采血，室温下静置1h后离心，3000r/m，离心10分钟，取血清，-20℃下保存。

3.2.2血清骨钙素(s-BGP)的测定

本试剂盒利用放射免疫分析法进行测定。用浓度分别为1、2、4、8、16ng/mL的BGP标准品作出标准曲线。取100μL样品血清，依次加入100μL抗血清，100μL 125I-BGP，摇匀，4℃下放置24h，加入500μL的分离剂，混匀，室温放置15-20min，4℃3500rpm离心20min，吸弃上清液，γ计数器上测定沉淀的放射性计数(cpm)，由标准曲线计算样品浓度。

3.2.3血清雌二醇(s-E2)的测定

本试剂盒利用放射免疫分析法进行测定。在均相竞争抑制反应中采用平衡法，对血清样品进行直接测定。测定中，标准品、样品等中的E2与125I-E2竞争限量抗体的结合位。当被测物中的E2的浓度高时，剩余的抗体结合位就少，从而与抗体结合的125I-E2就少，反之结合就多。利用免疫分离剂分离出抗原-抗体复合物，并测定复合物中的放射性技术。125I-E2的结合量与样品中E2的浓度呈函数关系，通过数据处理可求出样品中E2的含量。用浓度分别为0、5、20、50、100、250、500pg/mL的E2标准品作出标准曲线。取100μL样品血清，依次加入100μL 125I-E2，100μL抗体，混匀，37℃下温育2h，加入500μL的分离剂，混匀，室温放置15min，3500rpm离心15min，吸弃上清液，γ计数器上测定沉淀的放射性计数(cpm)，由标准曲线计算样品浓度。

3.2.4血清总碱性磷酸酶(s-ALP)的测定

对硝基苯磷酸二钠法检测血清总碱性磷酸酶的含量。碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。标准管加入50μL的0.1mg/mL酚标准液，样品管加入50μL样品血清，空白管加入50μL去离子水，各管依次加入500μL缓冲液，500μL基质液，充分混匀，37℃水浴中放置15min，加入1.5mL的显色剂，立刻混匀，采用紫外分光光度计测量，检测波长520nm，1cm光径比色，空白管调零，测定各管的吸光度值，并根据公式a计算酶含量(100mL血清在37℃与基质作用15min产生1mg酚为1个金氏单位)。

公式a

3.2.5血清钙(s-Ca)的测定

血清中钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝(MTB)结合，生成蓝色络合物。通过比色与同样出里的钙标准进行标准，可计算出钙的含量。标准管加入50μL的2.5mol/L钙标准液，样品管加入50μL样品血清，空白管加入50μL去离子水，各管依次加入1mLMTB试剂，2mL碱性溶液，充分混匀，静置15min，采用紫外分光光度计测量，蒸馏水调零，检测波长610nm，1cm光径比色，测各管的吸光度值，根据计算公式b得出结果。

公式b

3.2.6血清胰岛素样生长因子-I(s-IGF-I)的测定

采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定血清中胰岛素样生长因子-1的含量。按照试剂盒操作说明书的方法，用抗大鼠IGF-I单抗包被于酶标板上，标准品中的大鼠IGF-I与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠IGF-I抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在酶标仪492nm处测OD值，大鼠IGF-I浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中大鼠IGF-I浓度。

3.2.7骨组织形态计量学的观察

取尾椎以上5、6节处腰椎骨，放入10％甲醛溶液中固定24h以上，EDTA脱钙，H-E染色，切片。在显微镜下观察骨组织形态结构的变化并测量骨小梁面积。采用Image-Pro P1us 6.0(Media Cybernetics公司)图象分析软件计算平均骨小梁面积百分比(TS％)、平均骨小梁宽度(WAT)和单位面积(361800μm)骨小窝数量。

4.结果

4.1对骨密度的影响

骨密度测定结果表明：与正常对照组比较，模型组腰椎骨和股骨密度明显降低，表明骨质疏松模型形成。与模型组比较，苯甲酸雌二醇组腰椎骨和股骨密度有显著升高(P<0.01)，中药组合物高、中、低剂量组的骨密度也均有显著性升高(P<0.05～0.01)。见表1。

 

组别	腰椎骨(g/cm2)	股骨(g/cm2)	腰+股骨(g/cm2)
				伪手术组	0.345±0.040**	0.374±0.018**	0.720±0.057**
模型组	0.203±0.038	0.308±0.029	0.510±0.025
				雌二醇组	0.316±0.059**	0.349±0.023**	0.665±0.078**
高剂量组	0.282±0.069*	0.361±0.025**	0.643±0.076**

 

中剂量组	0.262±0.043*	0.343±0.012*	0.605±0.046**
				低剂量组	0.292±0.041**	0.346±0.031*	0.639±0.059**

表1中药组合物对去势大鼠骨密度的影响(

±s，n＝8)注：与模型组比较，*：P<0.05，**：P<0.01。

4.2对血清学指标的影响

与正常组比较，模型组的血清E2显著降低血清ALP(金氏单位/ml)显著性升高(P<0.05～0.01)。与模型组比较，苯甲酸雌二醇组的血清E2显著升高(P<0.01)，苯甲酸雌二醇组血清ALP有显著性降低(P<0.01)；中药组合物各剂量组的血清E2水平比模型组明显升高(P<0.05～0.01)，接近正常动物水平；而血清ALP有显著性降低。见表2。

 

组别	s-E2(pg/ml)	s-ALP(U/ml)
			伪手术组	9.016±3.496**	8.728±3.258**
模型组	4.160±2.599	17.469±4.365
			雌二醇组	606.436±164.874**	8.490±4.825**
高剂量组	12.596±4.243**	14.510±4.488
			中剂量组	6.902±2.449*	10.504±3.654**
低剂量组	6.753±1.924*	8.033±2.999**

表2中药组合物对去势大鼠血清E₂、ALP含量的影响(

±₅，n＝10)

注：与模型组比较，*：P<0.05，**：P<0.01。

与伪手术组比较，模型组的血清BGP显著性升高(P<0.05～0.01)，血清Ca2+有升高趋势，血清中IGF-I含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较，苯甲酸雌二醇组的血清Ca2+有所降低，但无统计学显著性差异(P>0.05)；血清BGP有显著性降低(P<0.01)，IGF-I含量则显著升高(P<0.05)；而中药组合物中、低剂量组的血清Ca2+、BGP有显著性降低，IGF-I含量也显著升高(P<0.05)。见表3。

 

组别	s-Ca(mmol/L)	s-BGP(ng/ml)	s-IGF-I(pg/ml)
				伪手术组	1.850±0.191	3.013±0.377*	95.081±25.206**
模型组	2.017±0.247	3.939±1.264	64.053±21.818
				雌二醇组	1.826±0.400	2.460±0.445**	89.387±38.014*
高剂量组	2.025±0.191	3.040±1.102	85.756±36.601
				中剂量组	1.582±0.372**	2.706±0.751*	88.932±33.081*
低剂量组	1.681±0.129**	2.770±0.485*	91.532±31.238*

表3中药组合物对去势大鼠血清Ca、BGP和IGF-I含量的影响(

±s，n＝10)

注：与模型组比较，*：P<0.05，**：P<0.01。

4.3骨组织形态计量学观察

骨形态计量学指标表明，与伪手术组相比，模型组大鼠股骨骨小梁面积百分比(TS％)，骨小梁平均宽度(WAT)和骨小窝数量明显降低(P<0.01)；中药组合物各剂量组骨小梁面积百分比和骨小梁平均宽度较模型组大鼠均有明显提高(P<0.05～0.01)。中药组合物各剂量组的骨小窝数与模型组比较，没有统计学差异，见表4。

 

组别	TS％	WAT(μm)	骨小窝数量
				伪手术组	39.02±5.13**	50.01±5.21**	9.36±1.43**
模型组	25.09±7.22	44.68±5.29	4.45±1.13
				雌二醇组	34.46±10.93*	48.98±4.96**	4.55±0.93
高剂量组	30.05±4.77*	47.46±5.47*	4.55±0.82
				中剂量组	35.34±5.54**	47.92±4.71**	5.18±0.98
低剂量组	32.68±5.46**	49.40±5.08**	4.82±1.16

表4中药组合物对去势大鼠骨形态学计量指标的影响(

±s，n＝10)

注：与模型组比较，*：P<0.05，**：P<0.01。

5.结论：

中药组合物对骨质疏松模型大鼠有明显的治疗作用，而调节雌激素平衡、抑制骨钙流失或增加骨对钙的吸收、抑制ALP的活性和BGP水平，增加血清中IGF-I的含量，是其主要的作用机理，反映了中医复方多靶点、综合调理作用的优势和特色。以下为中药组合物含药血清对成骨细胞的作用研究

本研究从体外培养成骨细胞观察中药组合物含药血清对成骨细胞增殖、分化和矿化能力的影响，并初步探讨了对成骨细胞细胞凋亡的保护作用。为中药组合物防治骨质疏松的机制研究提供实验依据。

1.主要实验材料

1.1实验动物：出生3日内的清洁级SD大鼠乳鼠12只，购自江苏省中医药研究院动物中心。

1.2药物与试剂：噻唑蓝(MTT)，Sigma产品；DMEM培养基，Gibco产品；新生牛血清，Gibco产品；胰蛋白酶，Amresco，南京博全科技有限公司分装；II型胶原酶，Gibico分装，Lot 200905；碱性磷酸酶检测试剂盒：南京建成生物工程研究所提供，批号071007；Tris(三羟甲基氨基甲烷)，购自南京博全科技有限公司，Lot013BE504；Triton X-100，Amresco分装，Lot 010T0405；β-甘油磷酸钠，购自南京博全科技有限公司，批号200908；茜素红，购自广东光华化学厂有限公司，批号20050808；抗坏血酸，购自上海试四赫维化工有限公司，批号0611101；苯甲酸雌二醇，天津金耀氨基酸有限公司提供，批号0609131；Vybrant凋亡分析试剂盒，购自联科生物技术有限公司，Lot 52398A；肿瘤坏死因子-α，购自联科生物技术有限公司，Lot 070473

1.3主要仪器：SW-CJ-2FD医用型净化工作台，苏净集团安泰公司生产；HJ-3数显恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司生产；BB6220三气培养箱，德国Heraeus公司生产；Axiovert 200倒置显微镜，德国ZEISS公司生产；Tecan Sunrise酶标仪，奥地利生产；FACSCantoTM Flow Cytometer(流式细胞仪)，美国BD公司生产；400R型高速冷冻离心机，Heraeus公司生产；MM-1微量振荡仪，江苏泰州医疗器械厂生产；

2.含药血清的制备

取SD大鼠15只，随机分成5组，即空白血清组sControl(给予同体积消毒饮用水)、苯甲酸雌二醇血清组sEB和中药组合物高剂量血清组H-sJGP(32g生药/kg)、中药组合物中剂量血清组M-sJGP(16g生药/kg)、中药组合物低剂量血清组L-sJGP(8g生药/kg)，每组3只。每日两次间隔12小时，连续给药3天。末次给药后于0.5h、1h、2h眼眶后静脉丛取血，3000rpm离心10min，分离血清，将同组的血清混合，经56℃灭活30min，0.22μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存备用[雷晓明，田松.壮骨止痛胶囊含药血清对大鼠成骨样细胞增殖分化影响的实验研究.天津中医药，2004，21(3)：237-239i]。

3.观察指标

3.1细胞增殖率的测定(MTT比色法)

取第3代的成骨细胞，以2×105个/ml接种于96孔培养板，24h后更换不含血清的DMEM培养基，每孔分别加入不同浓度的含药血清10μl，分别继续培养48h后，每孔加入5mg/mL的MTT10μL，于37℃、含5％CO2、饱和湿度的培养箱内孵育4h后，弃去孵育液，每孔加入100μL DMSO终止反应，室温(22℃)15min，振荡混匀。待沉淀完全溶解后，在微孔振荡器震荡15min，待沉淀完全溶解后，在波长490nm处，于酶标仪上测定光密度OD值。

3.2碱性磷酸酶活力的测定

取第3代的成骨细胞，以4×105个/mL接种于96孔培养板，24h后更换不含血清的DMEM培养基，每孔分别加入不同浓度的含药血清10μl，继续培养48h后，去除培养液，PBS洗三次，加入0.1％的TritonX-100裂解液200μL，裂解12h，轻轻吹打细胞1min，取50μL细胞裂解液转移至另一96孔板，用PBS做空白调零。各孔加入碱性磷酸酶试剂盒中新鲜配置的底物100μL在三气培养箱孵育。酶标仪检测，波长为405nm。

根据公式c计算ALP值：

公式c

3.3矿化结节计数

将培养第3代的成骨细胞以1×105个/mL的密度接种于6孔板上，次日换液，并分别加入10％的不同浓度的含药血清，每2日换液1次，并加药和矿化诱导剂，每孔加入矿化诱导剂，培养20日后，形成矿化结节，倒去培养基，用PBS洗2次，然后用95％乙醇固定10min，0.1％茜素红染色，37℃下放置30min，水冲洗。以橘红色结节边界清晰，直径>200μm为矿化结节的计数标准。在低倍镜下对各孔作矿化结节计数(矿化结节数/视野)。

3.4成骨细胞凋亡实验

将培养第3代的成骨细胞以1×105个/mL的密度接种于6孔板上。次日后换液，并加入不同浓度的药液。培养3日后，加入细胞凋亡诱导剂TNF-α，剂量为20ng/mL，诱导24h。弃去培养液，用PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化，轻轻吹打，将细胞悬液移至离心管离心。把得到的细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液(binding buffer)中以1×106细胞/mL的浓度重悬。吸取100μL的细胞(1×105)至试管中。加入适量的荧光标记的annexin V试剂和PI。混匀后避光室温下孵育15分钟。孵育后加入400μL染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析(实验必须在一小时内完成)。

4.实验结果

4.1中药组合物含药血清对成骨细胞增殖的影响

与对照组比较，不同采血时间的中药组合物含药血清对成骨细胞的增殖均没有明显的作用，说明中药组合物含药血清不能够促进成骨细胞的增殖作用。结果见表5。

 

组别	0.5h	1h	2h
				空白血清组	0.237±0.019	0.237±0.019	0.237±0.019
雌二醇血清组	0.228±0.017	0.213±0.021	0.209±0.014
				中药组合物高剂量组	0.253±0.029	0.249±0.023	0.241±0.038
中药组合物中剂量组	0.262±0.024	0.253±0.025	0.237±0.013
				中药组合物低剂量组	0.231±0.010	0.247±0.025	0.219±0.021

表5不同采血时间的中药组合物含药血清对成骨细胞增殖的影响(

±s，n＝6)

注：与对照组比较，^*：P<0.05，^**：P<0.01。

与对照组比较，不同给药浓度的中药组合物含药血清对成骨细胞的增殖均没有促进作用。给药浓度为5％时，因血清浓度较低，得到的OD值偏低。给药浓度为10％时，对成骨细胞的增殖也没有明显的作用。给药浓度为15％时，中低剂量组对成骨细胞不仅没有增殖作用，反而有明显的抑制作用(P<0.05)。给药浓度为20％时，各剂量组对成骨细胞都没有增殖作用，而都有明显的抑制作用(P<0.05)。结果表明，给药浓度为15％以上时，对成骨细胞有抑制作用，给药浓度以10％为宜。结果见表6。

 

组别	5％	10％	15％	20％
					空白血清组	0.177±0.019	0.237±0.019	0.256±0.029	0.336±0.048
雌二醇血清组	0.158±0.017	0.228±0.017	0.184±0.035*	0.197±0.038**
					中药组合物高剂量组	0.164±0.012	0.253±0.029	0.229±0.037	0.241±0.028**
中药组合物中剂量组	0.160±0.011	0.262±0.024	0.225±0.018*	0.274±0.031*
					中药组合物低剂量组	0.176±0.009	0.231±0.010	0.220±0.025*	0.257±0.071*

表6中药组合物含药血清不同给药浓度对成骨细胞增殖的影(

±s，n＝6)

注：与对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01。

4.2中药组合物含药血清对成骨细胞ALP活力的影响

中药组合物含药血清各剂量组对成骨细胞ALP活力均有增强的作用，在各时间点，随着剂量的增加，碱性磷酸酶的含量逐渐升高；中药组合物中、低剂量组明显高于空白对照组及高剂量组(P<0.05～0.01)。在中药组合物高、中、低剂量组中，给药后1h血清组达到药效顶点，比各剂量给药后0.5h、2h得到的含药血清，对促进ALP活力的作用更强。表明给药后1h采血比较适宜。根据实验结果，低剂量给药1h后得到的含药血清对成骨细胞ALP活力的增强作用最强(P<0.01)。结果见表7。

 

组别	0.5h	1h	2h
				空白血清组	6.062±0.594	6.062±0.594	6.062±0.594
雌二醇血清组	6.277±0.854	6.373±0.612	6.134±0.946
				中药组合物高剂量组	6.642±0.596	7.014±0.965	6.849±0.722
中药组合物中剂量组	7.174±0.974*	7.344±0.843*	7.179±0.996*
				中药组合物低剂量组	7.119±0.627*	7.671±0.516**	7.071±0.775*

表7中药组合物含药血清对成骨细胞ALP活力的影响(

±s，n＝6)

注：与对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01。

4.3中药组合物含药血清对成骨细胞形成矿化结节的影响

中药组合物含药血清各剂量组对成骨细胞形成矿化结节均有促进作用，但中低剂量组的促进作用与对照组比较有显著的差异(P<0.05)，说明中药组合物含药血清具有促进成骨细胞矿化结节形成的作用。结果见表8。

 

组别	结节数
		空白血清组	2.000±0.577
雌二醇血清组	1.857±0.690
		中药组合物高剂量组	2.571±0.535

 

中药组合物中剂量组	2.857±0.690*
		中药组合物低剂量组	2.857±0.690*

表8中药组合物含药血清对成骨细胞形成矿化结节的影响

(

±s，n＝6)

注：与对照组比较，^*：P<0.05，^**：P<0.01。

4.4细胞凋亡实验

在流式细胞仪上机测定的结果表明，阳性药组能稍微降低TNF-α诱导的成骨细胞凋亡的凋亡率，但没有统计学差异。中药组合物中、低剂量对成骨细胞的凋亡率均有降低，以低剂量降低的作用比较明显(P<0.05)。结果见表9。

 

组别	凋亡率(％)
		空白对照组	0
模型对照组	13.70±1.41
		雌二醇血清组	8.4±1.70
中药组合物高剂量组	13.00±1.13
		中药组合物中剂量组	8.95±1.34
中药组合物低剂量组	5.75±0.78*

表9中药组合物含药血清对TNF-α诱导的成骨细胞凋亡的影响

(

±s，n＝4)

注：与对照组比较，^*：P<0.05，^**：P<0.01。

5.上述实施例三结果表明：

通过对成骨细胞矿化及成骨细胞增殖分化的研究，发现中药组合物含药血清加入成骨细胞培养体系后，不能促进成骨细胞增值，但可以刺激成骨细胞钙化和碱性磷酸酶活性，具有促进成骨细胞矿化和分化功能的作用。中药组合物含药血清还可部分保护TNF-α诱导的成骨细胞凋亡，是中药组合物防治骨质疏松的机制之一。说明中药组合物含药血清促进骨形成的作用。

实施例二

原药材的选取与实施例一相同，按优选的原药材配比值的制备步骤如下：

(1)按每份中骨碎补29％、淫羊藿25％、怀牛膝19％、杜仲20％和鹿角片7％的比例称取各原药材，备用；

(2)将所述重量配比的怀牛膝加70％的乙醇回流提取2次，每次1小时，过滤得滤液I和药渣，备用；

(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)中药渣加水煎煮两次，第一次加水量为9倍量，第二次加水量为7倍量，每次煎煮1小时，过滤得滤液II，备用；

(4)合并滤液I和滤液II，浓缩制成药液。

(5)将步骤(4)中含生药的药液在80～90℃下干燥，制成粉末状的中药组合物。

动物实验与实施例一类似，此处不再赘述。

实施例三

原药材的选取与实施例一相同，按可选的原药材配比值的制备步骤如下：

(1)按每份中骨碎补37％、淫羊藿30％、怀牛膝13％、杜仲12％和鹿角片8％的比例称取各原药材，备用；

(2)将所述重量配比的怀牛膝加70％的乙醇回流提取2次，每次2.5小时，过滤得滤液I和药渣，备用；

(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)中药渣加水煎煮两次，第一次加水量为11倍量，第二次加水量为9倍量，每次煎煮2.4小时，过滤得滤液II，备用；

(4)合并滤液I和滤液II，浓缩制成药液。

(5)根据需要将步骤(4)中的中药组合物与固体制剂中常规辅料混合，制成固体制剂，如片剂、胶囊剂等。

动物实验与实施例一类似，此处不再赘述。

参考文献

ⁱ饶华，胡金家，高书亮。成骨样细胞体外培养法筛选杜仲叶防治骨质疏松症的药效成份，解剖学研究，2004，26(2)：115-117.

ⁱⁱ赵向上，赵文静，旺建伟。鹿角的药理作用及临床应用研究进展，中医药信息，2008，25(2)：23-25.

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物，其特征在于主要由下列重量比的原药材制成：骨碎补25～40％、淫羊藿20～35％、怀牛膝10～25％、杜仲10～25％和鹿角片5～15％。

2.根据权利要求1所述预防和治疗骨质疏松的中药组合物，其特征在于各原药材采用优选用量：骨碎补25～35％、淫羊藿20～30％、怀牛膝15～25％、杜仲15～25％和鹿角片5～10％。

3.根据权利要求1所述预防和治疗骨质疏松的中药组合物，其特征在于：各原药材采用最佳用量：骨碎补31％、淫羊藿21％、怀牛膝21％、杜仲21％和鹿角片6％。

4.一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取各原药材骨碎补25～40％、淫羊藿20～35％、怀牛膝10～25％、杜仲10～25％和鹿角片5～15％备用；

(2)将所述重量配比的怀牛膝加乙醇回流提取2次，每次0.5～3小时，过滤得滤液I和药渣，备用；

(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)中得到的药渣加水煎煮两次，第一次加水量为所述骨碎补、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步骤(2)中得到的药渣总重量的9～11倍量，第二次加水量为所述骨碎补、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步骤(2)中得到的药渣总重量的7～9倍量，每次煎煮0.5～3小时，过滤得滤液II，备用；

(4)合并滤液I和滤液II，浓缩制成药液。

5.根据权利要求4所述的一种预防和治疗骨质疏松的中药的制备方法，其特征在于还包括以下步骤：

(5)所述滤液浓缩后，在80～90℃下干燥，制成粉末状的中药组合物。

6.根据权利要求5所述预防和治疗骨质疏松的中药组合物的制备方法，其特征在于还包括以下步骤：

(6)将所述活性组分与常用辅料混合，制成固体制剂。

7.根据权利要求6所述的预防和治疗骨质疏松的中药的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中乙醇回流提取的时间是1.5小时；所述步骤(3)中第一次加水量为10倍量，第二次加水量为8倍量，每次煎煮1.5小时。

8.根据权利要求7所述预防和治疗骨质疏松的中药组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的乙醇浓度为70％。