CN101451141A - 激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5 - Google Patents

Abstract

一种生物技术领域的激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5，该基因序列为SEQ ID NO.1，序列长度为3717bp，基因上的酶切位点与avrBs3/PthA家族基因相同，102bp重复单元在基因内重复数为19.5；无毒基因avrxa5编码1238个氨基酸，氨基酸的序列为SEQ ID NO.2，由102bp编码的34个氨基酸重复单元在该蛋白中重复19.5次。本发明获得的avrxa5基因基因可作为水稻抗白叶枯病抗病育种的基因资源，将基因导入水稻白叶枯病菌PXO99^A菌株后，可使含xa5抗病基因的水稻产生抗病性反应，使白叶枯病菌难以有效侵染水稻。

Description

激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的基因，具体是一种激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5。

背景技术

水稻白叶枯病由水稻黄单胞菌(Xan thomonas oryzae pv.oryzae)引起，是我国水稻生产上重要的三大病害之一，常造成水稻减产5％-25％，严重时会导致水稻绝收，严重制约着我国水稻的安全生产。白叶枯病菌与水稻互作符合“基因-对-基因”关系，即在病原菌中存在一个无毒基因，则在水稻中存在一个匹配的抗病基因。白叶枯病菌中的无毒基因可以激发水稻中的抗病基因活性，从而使水稻产生抗病性。目前为止，在水稻白叶枯病菌中已经鉴别和明确无毒基因功能的基因有：avrXa7，avrXa10和avrXa27，它们分别对应水稻中的抗病基因是Xa7，Xa10和Xa27，但只有Xa27抗病基因被鉴别出来。avrXa7、avrXa10和avrXa27都属于水稻白叶枯病菌中的avrBs3/PthA家族。白叶枯病菌中的无毒基因具有植物抗病育种价值，而且具有分离和鉴别水稻抗病基因的功能，发掘可使水稻产生抗病性的水稻白叶枯病菌中无毒基因具有重要的科学价值和实践价值。

经对现有技术的文献检索发现，未发现与水稻隐性抗病基因xa5对应的无毒基因avrxa5有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5。本发明的无毒基因avrxa5可以激发含有xa5基因的水稻产生对白叶枯病的抗病性。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及的激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5具体是：

本发明涉及的无毒基因avrxa5，其序列为SEQ ID NO.1，序列长度为3717bp，基因上的酶切位点与avrBs3/PthA家族基因相同，102bp重复单元在基因内重复数为19.5。

所述无毒基因avrxa5编码1238个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.2，由102bp编码的34个氨基酸重复单元在该蛋白中重复19.5次。

所述无毒基因avrxa5在含有xa5基因的水稻上可激发产生对白叶枯病的抗病性。

本发明将水稻白叶枯病菌JXOIII菌株的基因组DNA通过EcoRI部分酶切，构建在pUFR034载体上获得了JXOIII基因文库，以avrBs3/PthA家族基因的保守EcoRI-BamHI片段为探针，Southern杂交筛选JXOIII基因文库，获得了含有avrBs3/PthA家族基因的阳性克隆。将阳性克隆逐一导入到水稻白叶枯病菌PXO99A菌株中，在水稻近等基因系成株期水稻上逐一剪叶接种相应的接合子，15天后调查白叶枯病发病情况。调查发现，p46克隆能够使PXO99^A菌株在含有xa5抗病基因的IRBB5水稻上由亲和性互作转变为非亲和性互作，确定p46克隆中含有avrxa5基因。经过亚克隆、BamHI酶切分析和Southern杂交验证，获得了p4B亚克隆。将p4B克隆导入PXO99^A菌株，剪叶接种IRBB5水稻，发现该亚克隆仍能够使PXO99^A菌株在含有xa5抗病基因的水稻品种表现为非亲和互作关系，确认p4B亚克隆中含有一种能够激发水稻产生抗病反应且对应xa5基因的无毒基因avrxa5。序列测定分析后发现，p4B中含有avrxa5基因，符合avrBs3/PthA家族基因的基本特征。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：将本发明获得的avrxa5基因导入水稻白叶枯病菌PXO99^A菌株中，可使含xa5抗病基因的水稻产生抗病性反应，白叶枯病菌不能侵染含有xa5抗病基因的水稻，从而有效防治白叶枯病菌对水稻的危害。

本发明中所涉及的菌株JXOIII和PXO99^A已在文献《Wu Xiaomin，Li Yurong，Zou Lifang，and Chen Gongyou.2007.Gene-for-gene relationships betweenrice and diverse avrBs3/pthA avirulence genes in Xanthomonas oryzae pv.oryzae.Plant Pathology，56(1)：26-34》中公开。

附图说明

图1为avrxa5基因图谱和结构示意图；

图2为avrxa5基因克隆示意图；

图3为avrxa5基因在水稻上激发产生褐色过敏反应能力的测定；

图4为avrxa5基因在水稻上激发抗病性的能力测定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

步骤一，水稻白叶枯病菌avrxa5基因的克隆

水稻白叶枯病菌JXOIII菌株在含有xa5抗病基因的水稻IRBB5上表现为非亲和性互作。本研究以JXOIII为目标菌株，提取其基因组DNA，通过EcoRI部分酶切后构建于载体pUFR034载体上，获得了JXOIII基因文库。图1中，以avrBs3/PthA家族基因保守的NLS区域DNA片段为探针，Southern杂交筛选JXOIII基因文库，获得了含有avrBs3/PthA家族基因的阳性克隆。图1中，B代表BamHI酶切位点，P代表PstI酶切位点，S代表SphI酶切位点；纵隔表示102bp重复单元，该单元在avrxa5基因中重复19.5次；LZ代表亮氨酸拉链结构域；NLS代表核定为信号，1，2，3表示NLS有3个；AD代表酸性转录激活域。将阳性克隆逐一导入到水稻白叶枯病菌PXO99^A菌株中，在水稻近等基因系成株期水稻上逐一剪叶接种相应的接合子，15天后调查白叶枯病发病情况。调查发现，p46克隆能够使PXO99^A菌株在含有xa5抗病基因的水稻品种IRBB5上由亲和性互作转变为非亲和性互作，如图4所示，确定p46克隆中含有对应xa5的无毒基因。

步骤二，水稻白叶枯病菌avrxa5基因的分离

对P46克隆中的1B-5B的5个BamHI条带进行回收，分别连接到经BamHI酶切的pUAV45K(B)载体上，获得了相应的克隆p1B、p2B、p3B、p4B和p5B，如图2A所示。如图2B所示，BamHI酶切和Sorthern杂交结果显示，p1B和p4B克隆中含有avrBs3/PthA家族的基因。图2中，图2A为样品1-8经BamHI酶切后的琼脂糖电泳图，图2B为对应样品的Southern杂交图。M为DNA Marker，泳道1为p46，泳道2为p1B，泳道3为p2B，泳道4为p3B，泳道5为p4B，泳道6为p5B，泳道7为pUFR034，泳道8为pUAV45K。

步骤三，水稻白叶枯病菌avrxa5基因的功能鉴别

为了证实上述2个克隆对含有xa5抗病基因的水稻具有激发抗病性的功能，本研究将p1B和p4B克隆分别导入PXO99^A菌株中，获得了接合子PXO99^A(p1B)和PXO99^A(p4B)。用无针头注射器将上述接合子注射接种到苗龄为15天的含有xa5的IRBB5水稻和含有Xa5的IR24水稻上。褐色过敏反应为抗病反应，水浸症状为感病反应。

图3A为avrxa5基因在水稻上产生水浸症状能力的测定，接种的菌株分别为：1为菌株PXO99^A，2为菌株JXOIII，3为菌株PXO99^A(p46)，4为菌株PXO99^A(p1B)，5为菌株PXO99^A(p4B)，6为菌株PXO99^A(pUFR034)。IR24为含有Xa5基因的水稻品种，IRBB5为含有xa5基因的水稻品种。

如图3A所示，3天后发现，与JXOIII菌株和PXO99^A(P46)一样，PXO99^A(p4B)可在IRBB5的水稻上形成褐色过敏反应，而PXO99^A(p1B)与同PXO99^A一样仅能形成水浸(water soaking)症状。在含有显性抗病基因Xa5的水稻IR24上，无论是JXOIII菌株还是以PXO99^A为遗传背景的接合子，则表现为水浸症状，如图3A所示，表明p4B中的无毒基因不是对应Xa5基因而是对应xa5基因。

图3B为水稻白叶枯病菌在水稻IRBB5上生长能力的测定，图3B中，a为菌株PXO99^A(pUFR034)，b为菌株JXOIII，c为菌株PXO99^A(p46)，d为菌株PXO99^A(p1B)，e为菌株PXO99^A(p4B)。如图3B所示，和JXOIII菌株一样，接合子PXO99^A(p46)和PXO99^A(p4B)在水稻组织中的生长能力显著下降，这表明含有xa5基因的水稻因被激活了抗病性从而阻止了病菌的生长，进而标明对应xa5基因的无毒基因为avrxa5基因。

为了进一步明确avrxa5在成株期水稻上的无毒基因功能，本研究将上述菌株和接合子通过剪叶接种方式，分别接种在含有xa5隐性基因和含有Xa5显性抗病基因的水稻IRBB5和IR24上。图4A为含有xa5隐性基因的水稻品种IRBB5；图4B为含有Xa5显性抗病基因的水稻品种IR24。相应的水稻白叶枯病菌剪叶接种成株期水稻，根据病斑长度确定avrxa5基因激发水稻产生抗病性的能力，相应的接种菌株分别为：1为菌株PXO99^A，2为菌株JXOIII，3为菌株PXO99^A(p46)，4为菌株PXO99^A(p1B)，5为菌株PXO99^A(p4B)，6为菌株PXO99^A(pUFR034)，7为菌株PXO99^A(avrXa7)。

结果发现，如图4A所示，JXOIII菌株、PXO99^A(p46)和PXO99^A(p4B)均能在IRBB5上表现为非亲和性互作，病斑长度不超过0.5cm，而在IR24上表现为亲和性互作，病斑长度超过15cm，如图4B所示。这表明，p4B中的无毒基因激发了水稻IRBB5中抗病基因xa5的活性，从而导致IRBB5水稻产生了抗病性。

本发明获得的avrxa5基因导入水稻白叶枯病菌PXO99^A菌株中，可使含xa5抗病基因的水稻产生抗病性反应，使得白叶枯病菌不能侵染含有xa5抗病基因的水稻，从而有效防治白叶枯病菌对水稻的危害。

序列表

SEQ ID NO.1

<110>上海交通大学

<120>激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>3717

<212>DNA

<213>Xanthomonas oryzae pv.oryzae

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3717)

<220>

<221>misc_feature

<222>(866)..(2859)

<220>

<221>repeat_region

<222>(866)..(2859)

<223>19.5

<220>

<221>repeat_unit

<222>(866)..(967)

<223>

<400>1

<210>2

<211>1238

<212>PRT

<213>Xanthomonas oryzae pv.oryzae

<400>2

Claims (3)

1、一种激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5，其特征在于：该基因序列为SEQ ID NO.1，序列长度为3717bp，基因上的酶切位点与avrBs3/PthA家族基因相同，102bp重复单元在基因内重复数为19.5。

2、根据权利要求1所述的激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5，其特征是，该基因编码1238个氨基酸，氨基酸的序列为SEQ ID NO.2，由102bp编码的34个氨基酸重复单元在该蛋白中重复19.5次。

3、根据权利要求1所述的激发水稻产生抗病反应的无毒基因avrxa5，其特征是，该基因在含有xa5基因的水稻上可激发产生对白叶枯病的抗病性。

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