CN101437945A

CN101437945A - 肥胖相关肽的微生物肠内递送

Info

Publication number: CN101437945A
Application number: CNA2007800158437A
Authority: CN
Inventors: 彼得·罗捷斯
Original assignee: Actogenix NV
Current assignee: Intrexon Actobiotics NV
Priority date: 2006-05-02
Filing date: 2007-05-02
Publication date: 2009-05-20
Also published as: EP3255149A2; RU2008147398A; WO2007128757A3; WO2007128757A2; JP2009535380A; EP3255149A3; EP2016178A2; EP2016178B1; AU2007247137A1; BRPI0711119A2; WO2007128757A8; US20090074734A1; CA2649932A1

Abstract

本发明涉及肥胖相关肽的微生物递送。更具体地，本发明涉及经遗传修饰的酵母和/或乳酸细菌用于递送神经肽和/或肽激素的用途，所述神经肽和/或肽激素在刺激或抑制食物摄入和/或能量平衡中起作用。

Description

肥胖相关肽的微生物肠内递送

技术领域

背景技术

进食障碍例如神经性厌食症、神经性贪食症和狂食症(Binge eatingdisorder)影响很大一部分人群。肥胖是最常见的代谢疾病之一并且是公众健康的最大威胁之一，这是由于与之相关的许多并发症例如糖尿病、高血压和心血管疾病所致。

考虑到世界范围的体重超重的增加，对食物摄入和能量消耗的神经-激素控制成为重要的医学课题。最近，已发表了关于肥胖相关肽及其在体重控制中可能应用的研究，所述肽对食物摄入具有刺激或抑制作用(Broberger，2005；Konturek等，2005；Stanley等，2005)。

肥胖相关肽通常在中枢神经系统中有活性。在医疗情况下，通常通过胃肠外注射施用所述化合物。但是，肥胖相关肽的作用是平衡的暂时移动；在大多数情况下，需要至少每天注射来稳定疾病。此种形式的施用对于患者来说非常不便，已经进行了对其它施用方式(例如经鼻、口腔、直肠或口服)的深入研究。尤其口服施用更容易且更好地被患者所接受。但是口服施用的主要缺点是肥胖相关肽需要穿过胃肠道，但在此处它们通常由于胃的高酸度而失活，并且被胃肠道中存在的蛋白水解酶所消化。这使得，即使是为了进行肠内递送而被装入胶囊的蛋白质也是相当低效的，需要以高剂量递送。为了克服这一问题，已提出了一些吸收增强剂。这样的吸收增强剂例如描述于WO 02/28436、WO 04/104018和WO 05/112633等中，其被描述为用于肥胖相关肽(例如胰岛素、胰高血糖素样肽-1和YY肽)的口服递送。

尽管递送增强剂可用于某些情况，但是稳定所述肥胖相关肽所需的联合微囊包封、以及使用所述增强剂来提高所述肥胖相关肽生物利用度使得所述药物的配制变得复杂。

肠内微生物递送是本领域技术人员已知的，已描述于一些专利申请中(WO 97/14806、WO 00/23471、WO 01/02570等)。但是，截至目前，成功的应用限于在破损的肠内局部递送肽。本领域中没有提示微生物递送可用于全身性递送可能需要穿过血脑屏障的化合物(例如肥胖相关肽)，并且没有关于在完好的肠中摄入肽的可用数据。我们令人惊奇的发现，与用于肠内递送的传统微囊化不同，当使用借助细菌或酵母的微生物递送时，不需要使用增强剂或递送辅助措施。更令人吃惊的是，微生物递送到完好肠道的蛋白质的生物利用度似乎比直接递送的蛋白质(例如通过胃内注射递送的蛋白质)更高。

发明内容

本发明的第一方面是经遗传修饰的生物用于肥胖相关肽的肠内递送的用途。

在一个实施方案中，所述经遗传修饰的生物可以是细菌，优选非病原性和非侵害性细菌，更优选革兰氏阳性菌，再优选乳酸细菌。在另一个实施方案中，所述经遗传修饰的生物可以是酵母，优选非病原性和非侵害性酵母。因此，优选地，所述经遗传修饰的生物选自：乳酸细菌和酵母。乳酸细菌包括但不限于：乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、肉杆菌属(Carnobacterium spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp)、片球菌属(Pediococcus spp.)、酒球菌属(Oenococcusspp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)和明串珠菌属(Leuconostoc spp.)；酵母包括但不限于：酿酒酵母属(Saccharomyces spp.)、汉逊酵母属(Hansenula spp.)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces spp.)、裂殖酵母属(Schizzosaccharomyces spp.)、接合酵母属(Zygosaccharomyces spp.)、毕赤酵母属(Pichia spp.)、红曲霉属(Monascus spp.)、地霉属(Geotrichumspp.)和亚罗酵母属(Yarrowia spp.)。

一个优选实施方案是经遗传修饰的生物的用途，其中所述经遗传修饰的生物选自：乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、肉杆菌属(Carnobacteriumspp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp)、片球菌属(Pediococcus spp.)、酒球菌属(Oenococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)和明串珠菌属(Leuconostoc spp.)；更优选选自乳杆菌属(Lactobacillus spp.)和乳球菌属(Lactococcus spp.)；再优选选自乳球菌属(Lactococcus spp.)；最优选是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。另一个优选实施方案是经遗传修饰的生物的用途，其中所述经遗传修饰的生物选自：酿酒酵母属(Saccharomyces spp.)、汉逊酵母属(Hansenula spp.)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces spp.)、裂殖酵母属(Schizzosaccharomycesspp.)、接合酵母属(Zygosaccharomyces spp.)、毕赤酵母属(Pichia spp.)、红曲霉属(Monascus spp.)、地霉属(Geotrichum spp.)和亚罗酵母属(Yarrowia spp.)；更优选选自酿酒酵母属(Saccharomyces spp.)和毕赤酵母属(Pichia spp.)；再优选选自酿酒酵母属(Saccharomyces spp.)；最优选选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

肥胖相关肽是本领域技术人员已知的，其包括但不限于：1)野灰蛋白相关肽(Agouti-related peptide)，2)胰淀素(Amylin)，3)食欲抑制素(Anorectin)，4)蛙皮素(Bombesin)，5)脑源性神经因子，6)降钙素基因相关肽，7)胆囊收缩素(Cholecystokinin)，8)可卡因-和安非他命-调节转录物肽，9)睫状神经营养因子，10)促肾上腺皮质激素释放激素，11)强啡肽(Dynorphin)，12)β-内啡肽，13)肠抑制素(Enterostatin)，14)促胰岛素分泌肽(Exendin)，15)甘丙肽(Galanin)，16)甘丙肽样肽，17)抑胃肽，18)生长激素释放肽(Ghrelin)，19)胰高血糖素样肽-1，20)生长激素释放激素，21)下丘泌素/食欲素(Hypocretin/orexin)，22)胰岛素，23)胰岛素样生长因子-I，24)胰岛素样生长因子-II，25)白介素-1，26)YY肽，27)瘦蛋白，28)黑色素聚集激素(Melaninconcentrating hormone)，29)胃动素，30)神经调节肽B(Neuromedin B)，31)神经调节肽U，32)神经肽B，33)神经肽K，34)神经肽S，35)神经肽W，36)神经肽Y，37)神经降压肽(Neurotensin)，38)催产素，39)催乳素释放肽，40)阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin)和来源于其的黑皮素(melanocortin)，41)生长抑素(Somatostatin)，42)促甲状腺素释放激素，43)尿皮质素(Urocortin)，44)VGF，45)26RFa，46)载脂蛋白A-IV，47)泌酸调节肽(Oxyntomodulin)，48)胰腺多肽(Pancreaticpolypeptide)，49)胃泌素释放肽，50)神经调节肽，51)葡萄糖依赖性促胰岛素多肽，52)肥胖抑制素(Obestatin)和53)生长激素片段(hGH_177-191)。

因此，在经遗传修饰生物用于肠内递送肥胖相关肽的用途的一个实施方案中，所述肥胖相关肽选自上文1)至53)所列的肽。在另一个实施方案中，所述肥胖相关肽选自上文1)至45)所列的肽。

在另一个实施方案中，所述肥胖相关肽选自上文1)至21)和23)至53)所列的肽，或者选自上文1)至21)和23)至45)所列的肽。在另一个实施方案中，所述肥胖相关肽选自上文1)至24)和26)至53)所列的肽，或者选自上文1)至24)和26)至45)所列的肽。在又一个实施方案中，所述肥胖相关肽选自上文1)至40)和42)至53)所列的肽，或者选自上文1)至40)和42)至45)所列的肽。在又一个实施方案中，所述肥胖相关肽选自上文1)至21)、23)、24)、26)至40)和42)至53)所列的肽，或者选自上文1)至21)、23)、24)、26)至40)和42)至45)所列的肽。

上文所列的肥胖相关肽及其生理作用是本领域技术人员公知的，本领域技术人员可在具体情况下选择合适的肽用于递送。例如，当目的是减少食物摄入和/或减轻体重时，可递送减少食欲、减少营养吸收和/或增加营养分解代谢等的肥胖相关肽；当目的是增加食物摄入和/或增加体重时，可递送增加食欲、增加营养吸收和/或增加营养储藏等的肥胖相关肽。

在一个示例性的非限制性实施方案中，当目的是减少食物摄入和/或体重时，所递送的肥胖相关肽可以选自上文2)至10)、13)、14)、16)、17)、19)、22)至27)、29)至33)、35)、37)至43)、46)、47)、49)至53)所列的肽；或者，在另一个实施方案中，可选自上文2)至10)、13)、14)、16)、17)、19)、23)、24)、26)、27)、29)至33)、35)、37)至40)、42)、43)、46)、47)、49)至53)所列的肽。已知，当通过本发明经遗传修饰生物递送时，选自这些组的肥胖相关肽可显示出相当强的厌食作用。优选地，所述肥胖相关肽是YY肽(PYY)或促胰岛素分泌肽，甚至更优选是PYY或促胰岛素分泌肽-4。

在另一个示例性的非限制性实施方案中，当目的是增加食物摄入和/或体重时，所递送的肥胖相关肽可以选自上文1)、11)、12)、15)、18)、20)、21)、28)、36)、44)、45)和48)所列的肽。现已认识到，当通过本发明经遗传修饰生物递送时，选自此组的肥胖相关肽可显示出相当强的促进食欲作用。

如已记载的，令人惊奇的是，可以通过经遗传修饰的生物高效递送上述肥胖相关肽。实际上，大多数这些肽在肠内是非常不稳定的。另外，由于其肽本质，无法预料到这些肽可以穿过完好的肠(其包括物理屏障和生物化学屏障，例如上皮细胞衬层、粘膜层和腔及上皮降解性酶，它们保护生物体不被蛋白质或肽毒素、病原或者抗原等进入)有效地进入生物体。同样，截至到目前，微生物递送的成功证据主要集中于肽在破损肠中的局部递送，而不是穿过完好肠的粘膜(下)递送。

甚至更加令人惊奇的是，绝大多数所递送的肽是通常在中枢或外周神经系统中或神经内分泌组织中合成和/或发挥其作用的(神经)肽。完全没有预料到，当通过本发明经遗传修饰的生物进行肠内递送时，这些(神经)肽在相关组织中仍能发挥其生理作用。例如，通常在中枢或外周神经系统中或神经内分泌组织中合成和/或发挥其作用的来自上述列表的优选肽包括上述1)至3)、5)至12)、14)至16)、18)至21)、26)至28)、30)至40)、42)至45)、52)和53)所列的肽，尽管并不限于这些。

在一个实施方案中，本发明的经遗传修饰生物可递送一种肥胖相关肽。但是，还可考虑，所述经遗传修饰生物可递送两种或更多种不同的如上文所定义的肥胖相关肽(例如2种、3种、4种或更多种，优选2种或3种，更优选2种)。例如，在一个实施方案中，所述生物可递送两种或更多种不同的如上文所定义的促食欲肽。在另一个实施方案中，所述生物可递送两种或更多种不同的如上文所定义的厌食肽。

应理解，当通过所述经遗传修饰生物递送两种或更多种不同的肥胖相关肽时，所述肽可以在受试者中实现加和或协同的生理作用，例如食物摄入和/或体重的加和或协同性降低或增加。在一个优选实施方案中，所述经遗传修饰生物可递送两种或更多种在受试者中实现协同生理作用的肥胖相关肽。作为优选的但非限制性的实例，本发明的经遗传修饰生物可递送PYY和促胰岛素分泌肽，更优选PYY和促胰岛素分泌肽-4，这两者可一起协同作用，使得当一起递送时所实现的厌食作用明显强于单独递送时所观察到的单独作用的加和。

本申请中所用术语肽、蛋白质和多肽可相互替换。肽指氨基酸的聚合物，但不涉及所述分子的具体长度。此术语还包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化、酰胺化和乙酰化。

在天然肥胖相关肽是酰胺化的(例如胰高血糖素样肽-1)情况下，由经遗传修饰生物所产生的肽优选是非酰胺化的。

在本发明的一个进一步发展中，所述经遗传修饰生物可递送与本文所定义的肥胖相关肽相结合的结合分子。有利地，通过与内源性肥胖相关肽的结合，在受试者中结合分子可增加(激动剂)或降低(拮抗剂)所述内源性肥胖相关肽的生物学作用或生理作用。因此，本发明的一个方面提供了经遗传修饰生物用于肠内递送结合分子的用途，所述结合分子能够与本文所公开的肥胖相关肽结合。在一些优选实施方案中，受试者中被如此结合的肥胖相关肽的生物学作用或生理作用增加或降低。

在本发明的另一个发展中，所述经遗传修饰生物可递送与本文所公开的肥胖相关肽的内源性受体相结合的结合分子。有利地，通过结合所述内源性受体，所述结合分子可增加(激动剂)或降低(拮抗剂)所述受体的生物学活性，从而分别模拟相应肥胖相关肽的存在或缺乏。因此，本发明的一个方面提供了经遗传修饰生物用于肠内递送结合分子的用途，所述结合分子能够结合本文所公开的肥胖相关肽的内源性受体。在一些优选实施方案中，受试者中被如此结合的受体的生物学活性增加或降低。

在表述“结合分子”中的术语“分子”广义地指任何化学(例如无机或有机)、生化或生物学物质、分子或大分子(例如生物大分子)或者其组合或混合物。优选的结合分子可包括但不限于肽、多肽或蛋白质、肽模拟物、抗体及其片段和衍生物、适体(aptamer)、化学物质、碳水化合物、多糖等。

本文所使用的术语“结合”一般指分子实体之间(例如结合分子和肥胖相关肽之间)的物理结合，本文优选非共价物理结合。在一些优选实施方案中，所述结合分子能够结合所述肥胖相关肽或者肥胖相关肽之内源性受体的天然构象。

在一个优选实施方案中，结合分子能以高亲和力结合肥胖相关肽。如本文所使用的，当结合的亲和常数(K_A)为K_A>1×10⁴M^-1，优选K_A≥1×10⁵M^-1，更优选K_A≥1×10⁶M^-1(例如K_A≥1×10⁷M^-1)，还更优选K_A≥1×10⁸M^-1，又优选K_A≥1×10⁹M^-1(例如K_A≥1×10¹⁰M^-1)，最优选K_A≥1×10¹¹M^-1(例如K_A≥1×10¹²M^-1，K_A≥1×10¹³M^-1，K_A≥1×10¹⁴M^-1，K_A≥1×10¹⁵M^-1或者更高)时，此结合可被视为“高亲和”，其中K_A＝[结合伙伴1_结合伙伴2]/[结合伙伴1][结合伙伴2]。可以通过本领域已知的方法确定K_A，例如使用平衡透析法和Scatchard作图分析。

在一个优选实施方案中，结合分子与肥胖相关肽或者与肥胖相关肽之内源性受体的结合是特异性的。术语“特异性结合”反映了结合分子与相应的肥胖相关肽或者与肥胖相关肽之内源性受体结合比结合随机的不相关物质(例如另一种生物学物质)更容易的情况。例如，分别在结合分子以高亲和力结合给定肥胖相关肽(“肽1”)或者结合给定肥胖相关肽之内源性受体(“受体1”)的条件下，特异性结合所述肥胖相关肽(“肽1”)、或者特异性结合给定肥胖相关肽之所述内源性受体(“受体1”)的所述结合分子优选地表现出很少结合或不结合其它多肽(包括其它肥胖相关肽或其受体)。很少结合或不结合意为K_A≤1×10⁴M^-1，优选K_A≤1×10³M^-1，更优选K_A≤1×10²M^-1，再优选K_A≤1×10¹M^-1(例如K_A≤1M^-1)，最优选K_A<<1M^-1(例如K_A≤1×10^-1M^-1，K_A≤1×10^-2M^-1，K_A≤1×10^-3M^-1，K_A≤1×10^-4M^-1，K_A≤1×10^-5M^-1，K_A≤1×10^-6M^-1或更小)。

能增加肥胖相关肽的生物学或生理作用的、或者能增加肥胖相关肽之内源性受体的生物学活性的结合分子在本文中被称为“激活剂”或“激动剂”。能部分或完全降低肥胖相关肽生物学或生理作用的、或者能部分或完全降低肥胖相关肽之内源性受体生物学活性的结合分子在本文中被称为“抑制剂”或“拮抗剂”。通常，本文所用的肥胖相关肽的生物学和生理作用指在受试者中的促食欲或厌食作用。肥胖相关肽受体的生物学活性可以指例如活化受体对下游信号途径的作用，例如对其活化或抑制，或者对细胞膜电位等的作用。

结合分子与肥胖相关肽的结合可增强或降低所述肽在受试者中的生理作用所凭借的任何和所有机制都包括在本发明之内。例如但不作为限制，这些激活剂或抑制剂可以分别增加或降低肥胖相关肽的稳定性；降低或促进肥胖相关肽的降解或周转；增加或降低肥胖相关肽与其相应受体、靶细胞或组织的相互作用；等等。

结合分子与肥胖相关肽之内源性受体的结合可增强或降低所述受体在受试者中生物学活性所凭借的任何和所有机制都包括在本发明之内。通常，激动剂的结合会激活所述受体，即这些激动剂可模拟肥胖相关肽与其相应受体的结合。通常，拮抗剂可以以非生产性方式结合受体，即这样的结合不活化所述受体，并且可优选地阻止各自肥胖相关肽与其受体的结合和/或任何所述受体的同时激活，例如以竞争性或非竞争性方式。

可以理解，促食欲肽(例如生长激素释放肽、黑色素等)或其受体的激动剂和/或厌食肽(例如GLP-1、PYY和泌酸调节肽)或其受体的拮抗剂的递送会对食物摄入和/或体重具有刺激作用，而促食欲肽或其受体的拮抗剂和/或厌食肽或其受体的激动剂的递送会减少食物摄入和/或体重。

在一个特别优选的实施方案中，本文所涵盖的结合分子可以是抗体。

如本文所使用的，术语“抗体”广义地指任何免疫结合物质，不论其是天然的或者部分或全部经改造的。该术语具体地涵盖完整抗体，包括单价和/或单特异性抗体以及由至少两个完整抗体形成的多价(例如2-、3-或更多价)和/或多特异性抗体(例如双或更多特异性的抗体)，另外还包括表现出特异性结合目的抗原(例如给定的肥胖相关肽或其受体，或者本文所公开的给定酶)的抗体片段，以及这些抗体片段的多价和/或多特异性复合物。术语“抗体”还包括任何包括至少一个能够与目的抗原上表位特异性结合的互补决定区(CDR)的多肽。在一个实施方案中，所述抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白同种型类别或其亚类中的任一种，优选IgG免疫球蛋白类别或其亚类。

在一些情况下，例如在某些来源于骆驼(camelid)或基于骆驼免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子中，完整的免疫球蛋白分子可以只包括重链而没有轻链(参见，例如Hamers-Casterman等1993.Nature 363：446-448；WO 94/04678)。在这些免疫球蛋白中，重链可变区(被称为VHH)形成整个CDR。这些包含VHH结构域或其功能性部分或者基本上由其构成的天然不含轻链的重链免疫球蛋白分子以及其功能性片段和/或衍生物，也包括在本文所用术语“抗体”中，并构成了一个优选实施方案。产生双价或多价单结构域抗体(即VHH多肽构建物)的方法公开于WO 96/34103中。

抗体的另一些优选实施方案包括但不限于嵌合抗体(参见，例如US4,816,567和Morrison等1984.PNAS 81：6851-6855以作为指导)，灵长类化抗体和人源化抗体(参见，例如Jones等1986.Nature 321：522-525；Riechmann等1988.Nature 332：323-329；和Presta 1992.CurrOp Struct Biol 2：593-596以作为指导)。

在另一些实施方案中，本发明可利用抗体片段，其可显示出例如下列优点：更小的尺寸，更容易递送，不含效应子结构域等。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv片段；双功能抗体；三功能抗体；单链抗体分子；和由抗体片段所形成的多价和/或多特异性抗体。上述名称Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv等旨在表示其本领域中固有的含义。

依靠进一步解释，抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，其每个具有一个抗原结合位点)和剩余的“Fc”片段。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原结合位点的F(ab’)2片段。典型的Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段由于在重链CH1结构域的C端添加了几个残基而不同于Fab片段，其中包括来自抗体铰链区的一个或多个Cys残基。

也构成一个优选实施方案的“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。此区域基本上由处于紧密非共价连接的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在此构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用在VH-VL二聚体的表面限定了抗原结合位点。所述6个高变区作为整体为所述抗体赋予了抗原结合特异性。但是，甚至单可变结构域VH或VL(即只包含对抗原有特异性的三个高变区的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力比完整结合位点要低(“单结构域抗体”)。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段构成另一个优选实施方案，包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链上。优选地，所述Fv多肽还包含使得scFv能够形成用于抗原结合所需结构的VH和VL结构域之间的多肽接头(参见例如Plückthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994以用于指导)。

另外，术语“Fv”还涵盖其另外的功能性(即特异性抗原结合)片段。这些片段的实例包括但不限于：仅仅包含Fv的重链片段的“迷你抗体(minibody)”，包含抗体重链可变区的小片段单元的“微抗体(microbody)”(参见PCT/IL99/00581)，具有轻链片段的类似体(similarbody)，以及具有轻链可变区之功能单元的类似体。应理解，Fv分子的片段可以是基本上圆形或者成环的多肽。

可以借助于例如通过多肽接头将两个scFv分子进行遗传性偶联来构建包含scFv分子的双价和/或双特异性抗体，其构成了另一个优选实施方案(参见例如US 5,091,513和US 5,637,481)。当此接头含有异源二聚化双螺旋时，形成四价的双特异性抗体。

“双功能抗体(diabody)”也代表了一个优选实施方案，其指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链(VH-VL)上包含与轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用短到不允许在同一链上两个结构域之间相互配对的接头，所述结构域被迫与另一条链上的互补结构域配对产生两个抗原结合位点。相比于母体scFv分子，双价双功能抗体显示出显著降低的解离速率(Koff)。双功能抗体在例如EP 404,097、WO 93/11161和Hollinger et al.1993(PNAS90：6444-6448)中有更全面的描述。双特异性或更多特异性的双功能抗体的产生描述于例如WO 02/02781中。

VH和VL结构域之间的接头变短至<1-2埃可促使形成三聚分子，即三功能抗体(triabody)，其也构成一个优选实施方案。所述三功能抗体的结构可用作设计和构建三价和/或三特异性抗体片段(例如通过将三个不同抗体A、B和C的重链和轻链V结构域相连形成两种不同链的VHA-VLB、VHB-VLC和VHC-VLA)的蓝图。三功能抗体可结合相同分子上的三个不同或相同的表位，导致了非常高的表观亲和性。

本领域技术人员会理解，抗体可包含一个或多个氨基酸缺失、添加和/或替换(例如保守替换)，条件是这些改变保留了其与各个抗原的结合。抗体还可包含对其组成氨基酸残基的一个或多个天然或人工修饰(例如糖基化等)。

在另一个优选实施方案中，本文所预期的结合分子可以是肥胖相关肽的显性失活变体。本文所使用的“显性失活变体”意为下述突变，即所述突变产生不利地影响相应的正常野生型肥胖相关肽的功能并由此影响其生物学或生理作用的肽或蛋白质。

在另一个实施方案中，本文所涵盖的结合分子可诱导或抑制内源性肥胖相关肽的主动分泌。

本发明的结合分子(例如肥胖相关肽的抗体和显性失活变体)可容易地在本发明微生物中表达，其具有显著降低成本的好处，并且没有生产能力的限制。用于细菌递送抗体的示例性但非限制性的方法已经公开于例如WO 2007/025977。

本发明的经遗传修饰生物可递送能够特异性结合一种肥胖相关肽(单特异性)或者两种或更多种不同肥胖相关肽(双特异性或更多特异性)的一种结合分子，例如优选其仅仅结合一种肥胖相关肽。本发明的经遗传修饰生物可递送能够特异性结合肥胖相关肽之一种内源性受体(单特异性)或者相同或不同肥胖相关肽的两种或更多种内源性受体(双特异性或多特异性)的一种结合分子，例如优选其仅仅结合一种受体。

作为替代，本发明的经遗传修饰生物可递送两种或更多种不同的结合分子，例如两种、三种、四种或更多，优选两种或三种，更优选两种，所述结合分子可以能够结合相同的肥胖相关肽或受体，或者可结合两种或更多种不同的肥胖相关肽或受体。

在本发明的又一个改进形式中，经遗传修饰的生物可递送催化受试者胃肠道中营养物分解的内源性酶的抑制剂。因此，本发明的一个方面提供了经遗传修饰生物用于肠内递送催化受试者胃肠道中营养物分解的酶的抑制剂之用途。

应了解，递送负责分解营养物的胃肠道酶的抑制剂可降低受试者肠道中营养物的利用度和摄入，由此降低总的热量摄入。这可以有利地降低受试者的总体重。

在一个优选实施方案中，所述酶催化选自下列的营养物的分解：多糖、寡糖、二糖、蛋白质、多肽、肽和脂类。在又一个优选实施方案中，所述酶催化脂类的分解，更优选是甘油三酯。

因此，在一个优选实施方案中，所述酶可以选自：胰腺蛋白酶(优选胰蛋白酶和糜蛋白酶)、胰腺脂酶和胰腺淀粉酶。在又一个优选实施方案中，所述酶是胰腺脂酶。

在一些示例性实施方案中，所述抑制剂可以是特异性结合所述酶(例如胰腺脂酶)的拮抗性抗体，或者可以是这些酶的显性失活变体。在另一个示例性实施方案中，胰腺脂酶的抑制剂可以是利普司他汀(lipstatin)(Weibel et al.1987.J Antibiot(Tokyo)40：1081-5)。

应了解，在本发明中所述经遗传改造生物可递送a)肥胖相关肽，或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子，或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子，或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。作为替代，所述经遗传修饰生物可递送上述a)、b)、c)和d)中任意两个或全部的组合。

当组合递送时，所递送物质可产生加和或协同效应，优选协同效应。因此，本发明的一个方面提供了经遗传修饰生物用于肠内递送下列项的用途：a)肥胖相关肽，和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子，和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子，和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。

本发明的另一个方面是经遗传修饰生物作为药物用于生产如前所述以下项的用途：a)肥胖相关肽，和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子，和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子，和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。

如本文所使用的，产生如前段所述的a)和/或b)和/或c)和/或d)的经遗传修饰生物意思是指分别转化了至少编码上述a)和/或b)和/或c)和/或d)的DNA的宿主生物，由此得到了所述经遗传修饰生物。产生如上所述a)和/或b)和/或c)和/或d)意思是指当用作药物时所述经遗传修饰生物分别产生如上所述的a)和/或b)和/或c)和/或d)，即一旦所述经遗传修饰生物被递送进肠中，所述经遗传修饰生物就至少产生如上所述a)和/或b)和/或c)和/或d)。可以直接通过测定局部肠产物浓度(例如在动物模型中)来判定所述产生，或者可通过血液中产物的增加或测定所递送的如上所述a)、b)、c)或d)对身体的作用来间接判定。

本发明的另一个方面是根据本发明的产生如前所述下列项的经遗传修饰生物在制备用于治疗肥胖和/或糖尿病和/或进食障碍(例如神经性厌食症、神经性贪食症和狂食症)的药物中的用途：a)肥胖相关肽，和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子，和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子，和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。

本发明的又一个方面是在有此需要的受试者中预防或治疗肥胖和/或糖尿病和/或进食障碍(例如神经性厌食症、神经性贪食症和狂食症)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的产生如前所述下列项的经遗传修饰生物：a)肥胖相关肽，和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子，和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子，和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。

术语“受试者”涵盖特别是人和动物。所述动物可优选的是哺乳动物，例如家养动物、农场动物、动物园动物、体育用动物、宠物和实验动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛类、乳牛；灵长类例如猿、猴、红毛猩猩(orang-utans)和黑猩猩；犬科动物例如狗和狼；猫科动物例如猫、狮子和虎；马科动物例如马、驴和斑马；食用动物例如乳牛、猪和绵羊；有蹄动物例如鹿和长颈鹿；啮齿动物例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。

术语“治疗有效量”指有效治疗受试者(例如人类或动物)中疾病或病症(即获得期望的局部或全身效果和表现)的治疗物质或组合物的量。尽管没有给定本发明每个实施方案的准确剂量，但是一旦给予了本发明，很容易知道这对本领域技术人员是显而易见的。可以通过在施用预定数量细胞之后使用公知方法(例如ELISA或Biacore)测定所递送蛋白质的血清浓度水平来根据个案分别具体确定其剂量。对所递送重组蛋白质的动力学特征及半衰期的分析提供了足够的信息，使得允许确定所述经遗传修饰生物的有效剂量范围。

可以以至少10⁴集落形成单位(colony forming unit，cfu)至10¹²cfu/天，优选10⁶至10¹²cfu/天，最优选10⁹至10¹²cfu/天的有效量/单位剂量来递送产生如前所述下列项的微生物：a)肥胖相关肽，和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子，和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子，和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。根据Steidler等(2000)所述方法或通过ELISA，例如10⁹cfu的所递送分子分泌到至少1ng至1μg；本领域技术人员可计算相对于任何其它剂量cfu的结合分子的范围。

在一些优选实施方案中，在以上述cfu剂量施用所述微生物的情况下，所述微生物表达所递送分子的水平可达到所述微生物总细胞蛋白质的≥0.1％，例如所述微生物总细胞蛋白质的≥0.5％，更优选≥1％，例如≥2％、≥3％或≥4％，更优选≥5％，例如≥6％、≥7％、≥8％或≥9％，再优选≥10％，例如≥15％或者甚至≥20％，这通过例如SDS-PAGE和考马斯或银染色来测定。

可以以至少10fg至100μg/天，优选1pg至100μg/天，最优选1ng至100μg/天的剂量递送a)肥胖相关肽，和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子，和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子，和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。

可以从每天三次或两次至每两周一次的频率递送剂量单位，直至观察到治疗效果。但是应理解，可使用更高或更低的剂量以及其它施用方案。

因此在另一个方面，本发明还提供了包含如前所述产生下列项的经遗传修饰生物的药物组合物：a)肥胖相关肽，和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子，和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子，和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。

优选地，这些制剂包含治疗有效量的本发明所述经遗传修饰生物以及可药用载体，即一种或多种可药用载体物质和/或添加剂，例如缓冲剂、载体、赋形剂、稳定剂等。

本文所用的术语“可药用”与本领域相一致，意思是指与药物组合物其它成分相容且不对其接受者有害。

本发明的经遗传修饰生物可悬于用于施用给患有待治疗疾病的人或动物的药物制剂中。这些药物制剂包含但不限于本发明的活的经遗传修饰生物以及适于施用的介质。所述经遗传修饰生物可以在常用赋形剂存在下冻干，所述赋形剂例如乳糖、其它糖，碱金属和/或碱土金属硬脂酸盐、碳酸盐和/或硫酸盐(例如，硬脂酸镁、碳酸钠和硫酸钠)，高岭土、二氧化硅、香料和芳香剂。

可以胶囊剂、片剂、颗粒剂和粉剂的形式制备如此冻干的细胞，其中每种制剂都可通过口服途径施用。

作为替代，一些经遗传修饰生物可制备成在适当介质中的水悬液，或者冻干的经遗传修饰生物可在临用前悬于适当介质中，这样的介质包括本文所提及的赋形剂和其它赋形剂例如葡萄糖、甘氨酸和糖精钠。

对于口服施用，可制备抗胃溶(gastroresistant)口服剂型，此剂型还可包含提供宿主细胞受控释放的化合物，由此提供了其中所编码期望蛋白质的受控释放。例如，可用在胃中但不在肠中抵抗溶解或破坏的赋形剂(通常为聚合物、纤维素衍生物和/或亲脂性物质)薄层包被口服剂型(包括片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂)，由此允许穿过胃而利于在肠中崩解、溶解和吸收。

口服剂型可设计成允许宿主细胞及其重组蛋白的缓慢释放，例如受控释放、持续释放、延长释放、持续作用片剂或胶囊剂。这些剂型通常含有常规和公知的赋形剂，例如亲脂的、聚合物的、纤维素的、不溶的、可溶胀的赋形剂。受控释放制剂还可用于任何其它递送部位，包括肠、结肠、生物粘附或舌下递送(即口腔黏膜递送)和支气管递送。当本发明组合物通过直肠或阴道施用时，药物制剂可包括栓剂和软膏剂(cream)。在此情况下，所述宿主细胞可悬于还包括脂质的常用赋形剂的混合物中。前述的每种制剂都是本领域公知的，其描述于例如下述参考文献：Hansel et al.(1990，Pharmaceutical dosage forms and drugdelivery systems，5th edition，William and Wilkins)；Chien 1992，Noveldrug delivery system，2nd edition，M.Dekker)；Prescott et al.(1989，Noveldrug delivery，J.Wiley & Sons)；C azzaniga et al，(1994，Oral delayedrelease system for colonic specific delivery，Int.J.Pharm.i08：7′)。

上述方面和实施方案进一步得到下面实施例的支持，所述实施例在任何情况下都不应被认为是限制性的。

附图说明

图1：载体pYES2T-ppMF的质粒图

图2：pYES2T-hPYY的质粒图

图3：载体pT1NX的质粒图

图4：pT1dmpPYY(3-36)的质粒图

图5：pT1Exendin-4的质粒图

图6：用转化了pYES2T-hPYY的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(以SC-hPYY表示)处理对4小时食物摄入的作用。转化了空载体(pYES2T，invitrogen)的酿酒酵母表示为SC-YES2T。小鼠(对于SC-hPYY，n＝12；对于SC-YES2T，n＝11)是10周龄的，并接受6周的高脂肪饮食。

图7：用转化了pT1Exendin-4的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(以LL-Ex4表示)和转化了pT1dmpPYY(3-36)的乳酸乳球菌(用LL-PYY表示)处理对4小时食物摄入的作用。转化了空载体的乳酸乳球菌表示为LL-pTrex。小鼠是8周龄的，并接受4周的高脂肪饮食。

P值与LL-pTREX(n＝10)相比较

图8：LL-Ex4和LL-PYY处理对24小时体重增加的作用。小鼠是8周龄的，并接受4周的高脂肪饮食。质粒如图7中所示。

实施例

实施例的材料与方法

动物

以每笼5只安置雌性C57Bl/6小鼠(10-12周龄，25-30克)，在其中允许其适应环境最少1周，期间不进行处理。为它们提供高脂肪小鼠饲料和自来水，任其自由采食。在实验之前，动物适应其笼饲条件一周(每笼安置一只)，并接受两次胃内盐水接种以尽可能降低研究期间的应激。

合成基因PYY(人)的组装

使用如下寡核苷酸组装合成的针对乳酸乳球菌优化了密码子的人PYY(3-36)(氨基酸序列：IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY)

PYY(3-36)1S(ATCAAACCAGAAGCTCCAGG)，

PYY(3-36)2S(ATCAAACCAGAAGCTCCAGGTGAAGATGCTTCACCAGAAG)，

PYY(3-36)2AS(CTTCTGGTGAAGCATCTTCACCTGGAGCTTCTGGTTTGAT)，

PYY(3-36)3S(TGAAGATGCTTCACCAGAAGAACTTAACCGTTACTACGCT)，

PYY(3-36)4S(AACTTAACCGTTACTACGCTTCACTTCGTCACTACCTTAA)，

PYY(3-36)4AS(TTAAGGTAGTGACGAAGTGAAGCGTAGTAACGGTTAAGTT)，

PYY(3-36)5S(TCACTTCGTCACTACCTTAACCTTGTTACACGTCAACGTT)，

PYY(3-36)6S(CCTTGTTACACGTCAACGTTACTAACTAGTAGATCC)，

PYY(3-36)6AS(GGATCTACTAGTTAGTAACGTTGACGTGTAACAAGG)，

PYY(3-36)7S(ACTAACTAGTAGATC)，

PYY(3-36)-Spe-S(GTCAACGTTACTAACTAGTAGATCC)，和

PYY(3-36)-Spe-AS(GGATCTACTAGTTAGTAACGTTGAC)

组装的hPYY-SpeI PCR片段长114bp，在琼脂糖中纯化，并用限制性酶SpeI消化。此PCR片段用于乳球菌构建物以及酵母构建物。

pYES2T-hPYY(3-36)的构建

在pYES2中，GAL1启动子被替换为TPI启动子加分泌信号ppMF、NaeI和AOXI终止子作为填充序列，得到pYES2T-ppMF(图1)。

用NaeI和XbaI消化所述pYES2T-ppMF。分离DNA片段，并与hPYY-SpeI PCR片段相连接。得到被称为pYES2T-hPYY的质粒，其含有编码人PYY(3-36)的基因(图2)。用pYES2T-hPYY连接混合物转化热感受态MC1061大肠杆菌细胞。

分泌hPYY的酿酒酵母的构建

将1微克的质粒pYES2T-hPYY(通过Qiagen midi plasmid kit，Hilden，Germany制备；从大肠杆菌菌株MC1061[pYES2T-hPYY]中得到)经电穿孔进入电感受态酿酒酵母INV Sc1细胞(Invitrogen^TM)中。

酿酒酵母INV Sc1细胞(Invitrogen^TM)是具有接合-α，his3Δ1，leu2-3，-112trp1-289和ura3-52基因型的菌株。将转化的酵母细胞接种于缺乏尿嘧啶(选择)的最小培养基(SD+CSM-U；0.67％无氨基酸酵母氮源(Difco，Detroit，MI)，2％葡萄糖(Merck，Darmstadt，Germany)和0.077％ CSM-URA(Bio101 Systems，Morgan Irvine，CA))上。在10毫升缺乏尿嘧啶的最小培养基(SD+CSM-U)中分别接种一个菌落的酿酒酵母菌株INV Sc1[pYES2T-hPYY]和载体对照INV Sc1[pYES2]，在有氧条件下30℃培养。16小时后，加入10毫升新鲜的缺乏尿嘧啶的最小培养基，32小时后离心(5分钟@2500 tmp)沉淀细胞，重悬于YPD培养基(YPD培养基：1％酵母提取物，Difco；2％葡萄糖，Merck；2％蛋白胨，Difco)中。16小时后离心沉淀细胞，并重悬于2毫升YP(不含葡萄糖的YPD)中。对于处理而言，每只小鼠通过胃内导管接受100微升此混悬液。

合成基因(促胰岛素分泌肽-4)的组装

使用如下寡核苷酸组装合成的针对乳酸乳球菌优化了密码子的促胰岛素分泌肽-4(Exendin-4)(氨基酸序列：

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)

Exendin4-1S(CACGGTGAAGGTACATTCAC)，

Exendin4-2S(CACGGTGAAGGTACATTCACATCAGATCTTTCAAAACAAA)，

Exendin4-2AS(TTTGTTTTGAAAGATCTGATGTGAATGTACCTTCACCGTG)，

Exendin4-3S(ATCAGATCTTTCAAAACAAATGGAAGAAGAAGCTGTTCGT)，

Exendin4-4S(TGGAAGAAGAAGCTGTTCGTCTTTTCATCGAATGGCTTAA)，

Exendin4-4AS(TTAAGCCATTCGATGAAAAGACGAACAGCTTCTTCTTCCA)，

Exendin4-5S(CTTTTCATCGAATGGCTTAAAAACGGTGGTCCATCATCAG)，

Exendin4-6S(AAACGGTGGTCCATCATCAGGTGCTCCACCACCATCATAA)，

Exendin4-6AS(TTATGATGGTGGTGGAGCACCTGATGATGGACCACCGTTT)，

Exendin4-7S(GTGCTCCACCACCATCATAA)，

Exendin4-Spe1S(GGTGCTCCACCACCATCATAACTAGTGC)，

Exendin4-Spe1-AS(GCACTAGTTATGATGGTGGTGGAGCACC).

所组装的Ex4-SpeI PCR片段长114bp，在琼脂糖中纯化，并用限制性酶SpeI消化。

pT1Exendin-4和pT1dmpPYY(3-36)的构建

在pTREX中，插入USP和spaX，得到pT1NX(图3)。

用NaeI和SpeI消化所述pT1NX。分离DNA片段并分别与Ex4-SpeI，以及Pyy-Spei PCR片段相连接。得到分别称为pT1dmpPYY(图4)和pT1Exendin-4(图5)的质粒。用pT1Exendin-4连接混合物转化感受态MG1363乳酸乳球菌细胞。

对于胃内接种，将保存混悬液在新鲜GM17(即添加了0.5％葡萄糖的M17，Difco Laboratories，Detroit，MI)中稀释1000倍，在30℃孵育。16小时后，当细胞达到2×10⁹菌落形成单位(CFU)/毫升的饱和浓度时，加入等体积的新鲜GM17，再在30℃下孵育1个小时。通过离心收获细菌，在不含葡萄糖的BM9培养基中浓缩10倍。对于处理而言，每只小鼠通过胃内导管接受100微升的此混悬液。

急性喂食研究

C57Bl/6小鼠在分开的笼中禁食16-18小时，可自由饮水。在实验日，t＝-2小时和t＝0小时时用100微升的下列菌胃内接种动物：用于酿酒酵母PYY测试的酿酒酵母YES2T(SC-YES2T，空载体对照)或SC-hPYY；用于乳球菌PYY测试的乳酸乳球菌pTREX(空载体)或乳酸乳球菌pT1dmpPYY；或者用于促胰岛素分泌肽测试的乳酸乳球菌pTREX(空载体)或乳酸乳球菌pT1exendin-4。t＝0小时之后立即将食物置于事先称重小鼠的笼中，在1、2、3和4小时时通过测量事先称重的食物与每个时间间隔结束时所剩食物的重量之间的差异来测定食物摄入(food intake，FI)。

实施例1：肠内酵母递送人PYY(3-36)对小鼠食物摄入的作用

通过测定给药后小鼠的食物摄入评价S.c[pYES2T-hPYY]的生物学效力。在给药后第一个4小时期间，用S.c[pYES2T-hPYY]处理的动物中食物摄入比给予安慰剂S.c[pYES2T]的动物低16％(图6)。此研究的结果证明通过S.c肠内递送PYY(3-36)的可行性，并为开发用于治疗进食障碍和/或肥胖的PYY(3-36)口服剂型提供了机会。

实施例2：通过乳酸细菌肠内递送人PYY(3-36)和促胰岛素分泌肽-4对小鼠食物摄入的作用

通过测定给药后小鼠的食物摄入来评价LL-pT1-Exendin-4和LL-pT1dmpPYY(3-36)的生物学效力。在给药后第一个4小时期间，用LL-pT1-Exendin-4处理的动物中食物摄入比给予安慰剂LL-pTREX的动物低31％(图7)。在24小时研究中评价了胃内接种LL-pT1-Exendin-4对体重增加的作用。在此研究的第一个4小时期间，接受Ex4的组中体重增加几乎比安慰剂组低50％，而在研究结束时是18％(图8)。此研究的结果证明通过肠内递送Ex4的可行性，并为开发用于治疗进食障碍和/或肥胖的Ex4口服剂型提供了机会。

参考文献

-Broberger，C.(2005).Brain regulation of food intake and appetite：molecules andnetworks.J.Int.Med.258，301-327.

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<120>肥胖相关肽的微生物肠内递送

<130>AGX-012-PCT

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<141>2007-05-02

<150>EP 06113388.0

<151>2006-05-02

<160>26

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>34

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成密码子PYY

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>寡聚体PYY(3-36)1S

<400>2

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PYY(3-36)2S

<400>3

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PYY(3-36)2AS

<400>4

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PYY(3-36)3S

<400>5

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PYY(3-36)4S

<400>6

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PYY(3-36)4AS

<400>7

<210>8

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<212>DNA

<213>人工的

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<400>8

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PYY(3-36)6S

<400>9

<210>10

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PYY(3-36)6AS

<400>10

<210>11

<211>15

<212>DNA

<213>人工的

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<223>PYY(3-36)7S

<400>11

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

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<223>PYY(3-36)-Spe-S

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<210>13

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<212>DNA

<213>人工的

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<223>PYY(3-36)-Spe-AS

<400>13

<210>14

<211>39

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成密码子Exendin-4

<400>14

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Exendin4-1S

<400>15

<210>16

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

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<223>Exendin4-2S

<400>16

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Exendin4-2AS

<400>17

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Exendin4-3S

<400>18

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Exendin4-4S

<400>19

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

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<223>Exendin4-4AS

<400>20

<210>21

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<212>DNA

<213>人工的

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<223>Exendin4-5S

<400>21

<210>22

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Exendin4-6S

<400>22

<210>23

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Exendin4-6AS

<400>23

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Exendin4-7S

<400>24

<210>25

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Exendin4-Spel S

<400>25

<210>26

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Exendin4-Spel-AS

<400>26

Claims

1.经遗传修饰生物用于肠内递送下列项的用途：a)肥胖相关肽和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。

2.产生下列项的经遗传修饰生物用做药物的用途：a)肥胖相关肽和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。

3.产生下列项的经遗传修饰生物用于制备治疗进食障碍或肥胖的药物的用途：a)肥胖相关肽和/或b)能够结合肥胖相关肽的结合分子和/或c)能够结合肥胖相关肽之内源性受体的结合分子和/或d)催化胃肠(GI)道中营养物分解的酶的抑制剂。

4.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述经遗传修饰生物是酵母或乳酸细菌。

5.根据权利要求4的用途，其中所述经遗传修饰生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

6.根据权利要求4的用途，其中所述经遗传修饰生物是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

7.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述肥胖相关肽选自：野灰蛋白相关肽，胰淀素，食欲抑制素，蛙皮素，脑源性神经因子，降钙素基因相关肽，胆囊收缩素，可卡因-和安非他命-调节转录物肽，睫状神经营养因子，促肾上腺皮质激素释放激素，强啡肽，β-内啡肽，肠抑制素，促胰岛素分泌肽，甘丙肽，甘丙肽样肽，抑胃肽，生长激素释放肽，胰高血糖素样肽-1，生长激素释放激素，下丘泌素/食欲素，胰岛素，胰岛素样生长因子-I，胰岛素样生长因子-II，白介素-1，YY肽(PYY)，瘦蛋白，黑色素聚集激素，胃动素，神经调节肽B，神经调节肽U，神经肽B，神经肽K，神经肽S，神经肽W，神经肽Y，神经降压肽，催产素，催乳素释放肽，阿黑皮素原和来源于其的黑皮素，生长抑素，促甲状腺素释放激素，尿皮质素，VGF，26RFa，载脂蛋白A-IV，泌酸调节肽，胰腺多肽，胃泌素释放肽，神经调节肽，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽，肥胖抑制素和生长激素片段(hGH_177-191)。

8.根据权利要求7的用途，其中所述经遗传修饰生物是产生PYY的酿酒酵母菌株。

9.根据权利要求7的用途，其中所述经遗传修饰生物是产生促胰岛素分泌肽-4的乳酸乳球菌菌株。

10.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中所述结合分子与肥胖相关肽的结合增强所述肥胖相关肽在受试者中的生物学或生理作用。

11.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中所述结合分子与肥胖相关肽的结合降低所述肥胖相关肽在受试者中的生物学或生理作用。

12.根据权利要求1-6、10和11中任一项的用途，其中所述能够与肥胖相关肽结合的结合分子是抗体。

13.根据权利要求1-6和11中任一项的用途，其中所述能够与肥胖相关肽结合的结合分子是所述肥胖相关肽的显性失活变体。

14.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中所述结合分子与肥胖相关肽之内源性受体的结合增强所述受体在受试者中的生物学活性。

15.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中所述结合分子与肥胖相关肽之内源性受体的结合降低所述受体在受试者中的生物学活性。

16.根据权利要求14或15中任一项的用途，其中能够与肥胖相关肽之内源性受体结合的所述结合分子是抗体。

17.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中所述酶催化选自下列的营养物的分解：多糖、寡糖、二糖、蛋白质、多肽、肽和脂类，优选脂类，更优选甘油三酯。

18.根据权利要求1-6或17中任一项的用途，其中所述酶选自：胰腺蛋白酶(优选胰蛋白酶或糜蛋白酶)、胰腺脂酶和胰腺淀粉酶，更优选所述酶是胰腺脂酶。