CN101432310A - 经修饰的多糖-脱乙酰壳多糖化合物的制备和用途以及hes-药物化合物的改进生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适合作为医药物质的载体的结合产品，以及涉及由其衍生的携带医药物质的化合物。本发明另外涉及用于制备这种结合产品和化合物的方法和装置。此外，本发明涉及包含这种结合产品和化合物的药物组合物，以及涉及其用于制备疾病治疗用不溶性药物的用途。

Description

经修饰的多糖-脱乙酰壳多糖化合物的制备和用途以及HES-药物化合物的改进生产方法
技术领域
本发明涉及适用作医药物质的载体的结合产品，以及由其得到的承载医药物质的化合物。本发明进一步涉及制备这种结合产品和化合物的方法和设备。另外，本发明涉及含有这种结合产品和化合物的药物组合物，及其在制备用于治疗疾病的不溶性药物中的应用。
背景技术
EP-A-1 230 935描述了向多糖中引入药物分子，然而，在每个多糖分子上所结合的药物分子的频率和这种分子的结合部位方面，是不均匀的。因此，观察到许多较小的药物分子与单个多糖分子集合，而其它的多糖分子仍保持实质上未被占据。在一方面，这实质上降低了所需的结合产品的收率，并且另一方面，分离所需的结合产品，即，从不需要的结合产品中分离与所需数目的被引入分子配合的多糖的工作非常繁重。如果进行的结合反应是其中药物要通过连接基分子结合到淀粉分子内，则可发生不希望的多糖自身的交联。
在特定情况下有可能避免这种交联，即，其中医药活性物质的一个分子刚好要与一个多糖分子彼此结合。这时，有可能将该医药物质结合到淀粉的末端葡萄糖单元的末端醛基上，如DE 102 09 822A1所述。
然而，当多个药物分子通过多价连接基分子被结合时，结合或置换的区域选择的可控性消失。医药物质与羟乙基淀粉(HES)的相应结合(被称作活性物质的HES化)，即，不同的HES变体与医药物质的化学结合，公开在DE 101 12 825 A1中，据述反应过程在含水溶液中进行。
在提到的方法中，或者是一个医药活性分子刚好与一个末端醛基结合，或者是未知数目的医药活性分子通过连接基非特异性地共价结合于羟乙基淀粉。
正如在药物的主要部分中，在羟乙基淀粉中，羟基主要用于结合，可使用双官能羧酸作为连接基。众所周知，二羧酸氯化物作为多糖的交联剂。当被二羧酸氯化物例如丙二酰氯酯化时，除了发生医药活性物质与多糖通过酯键的所需结合之外，还发生多糖的相互交联。
通过将医药物质结合于羟乙基淀粉，这种医药物质可被亲水化。另外，获得的药物-HES化合物具有胶体渗透活性，如羟乙基淀粉自身一样。
然而，希望有另外的可用于控制和特异性影响被结合的医药物质的活性的物理化学作用机制。
迄今为止，只有当使用复杂的蛋白质例如人白蛋白或实质上生物学惰性的聚合物化合物时才能够提供这种作用机制。
因此，本发明的目的是提供适用作医药物质的载体的化合物和由其得到的承载医药物质的化合物，其中所述化合物另外具有良好的水溶性，带有正和负电荷(偶极)的特定带电模式，和低的变态反应性和完全降解性。
本发明的目的通过结合产品(I)实现，该结合产品(I)由m个多糖X分子与一个多糖A分子组成，其中所述多糖A选自壳多糖或脱乙酰壳多糖，m是1-10,000的整数，并且X和A之间的连接基是胺和/或酰胺键。
本发明的另一个主题涉及权利要求36的装置，权利要求45的方法，权利要求61的药物组合物，以及权利要求62到64的本发明的化合物的用途。
附图说明
图1表示本发明装置的示例性实施方案的俯视图。
图2表示所述实施方案的剖视图。
图3表示用本发明装置制备的脱乙酰壳多糖薄膜。
图4表示在进行本发明的方法后的脱乙酰壳多糖薄膜。
发明内容
本发明涉及结合产品(I)，该结合产品(I)由m个多糖X分子与一个多糖A分子组成，其中所述多糖A选自壳多糖或脱乙酰壳多糖，m是1-10,000的整数，并且X和A之间的连接基是胺键和/或酰胺键。根据本发明，医药物质即药学活性化合物可与结合产品(I)共价结合。作为替代，医药物质可通过复合物形成与所述结合产品(I)聚结。
因此，结合产品(I)描述了结合于脱乙酰壳多糖或壳多糖的多糖化合物，其可用作载体，用于区域选择性代替分别与脱乙酰壳多糖或壳多糖结合的胶体。
根据本发明，“壳多糖”是指由(1→4)连接的2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖残基构成的直链多糖，其中低于40％的乙酰胺基被脱乙酰化形成胺基。脱乙酰壳多糖是水溶性的、完全或部分脱乙酰化的壳多糖衍生物，即，其由(1→4)连接的2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖和2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖残基组成。优选地，脱乙酰壳多糖的脱乙酰化程度为90％到40％，更优选为75％到60％，
具有较低脱乙酰化程度的脱乙酰壳多糖，即，具有较低比例的游离氨基的脱乙酰壳多糖，特别适合分离一个脱乙酰壳多糖分子上的多糖X分子，因为结合于脱乙酰壳多糖A的单独的多糖X分子之间的距离因此被有利地增大了。
根据本发明，多糖A包含至少10个单体单元，优选至少35个单体单元，最优选至少50个单体单元，即，至少50个N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺部分。
多糖A的N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺部分可任选地进行化学修饰。有利的修饰包括甲基羧基化形成N，O-羧甲基脱乙酰壳多糖。还有利的修饰是脱乙酰壳多糖盐酸盐。
结合的多糖X优选被部分取代或完全取代。
在优选方案中，多糖X不是壳多糖和/或脱乙酰壳多糖(X≠A)。更优选地，多糖X选自：淀粉，直链淀粉，支链淀粉，醋孟南(acemannan)，右旋糖酐，阿拉伯半乳聚糖，半乳甘露聚糖，半乳葡甘露聚糖，黄原胶，角叉菜胶，藻酸盐，瓜尔胶，金合欢胶，琼脂糖，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，透明质酸，阿拉伯树胶，及其混合物。更优选地，多糖X选自含有半乳糖、甘露糖和古罗糖醛酸(guluronic acid)的多糖，阿拉伯半乳聚糖，半乳甘露聚糖，半乳葡甘露聚糖，醋孟南和黄原胶。
多糖X优选选自天然存在的复合多糖类，诸如角叉菜胶，藻酸盐，瓜尔胶，金合欢胶，琼脂糖和阿拉伯树胶。
本发明的具体实施方案是内源性的生理活性多糖诸如肝素或硫酸软骨素作为多糖X反应形成本发明的结合产品(I)。
当肝素用作多糖X时，肝素抗凝活性和对巨噬细胞和粒细胞的局部抑制作用与脱乙酰壳多糖的粘附性、表面活性和活化成膜性相结合。引入硫酸软骨素化合物作为多糖能够制造由生物可降解型的低变态组织组成的人造成膜和软骨样覆盖层。另一种修饰是将透明质酸作为多糖X引入到本发明的结合产品中。
根据本发明，多糖X包含至少10个，优选至少20个，更优选至少325个单体单元。优选是葡萄糖单元，其更优选经历化学修饰。多糖X还优选包含半乳糖和/或甘露糖单元。
多糖X的水溶性，以及多糖X与其它胶体形成材料之间的亲合性可以受到半乳糖单元的比例的影响。众所周知，多糖和半乳甘露聚糖(也称作半乳葡甘露聚糖)之间的分子间相互作用，以及蛋白质和半乳甘露聚糖(也称作半乳葡甘露聚糖)之间的分子间相互作用，以及半乳甘露聚糖的水溶性可以实质上受到半乳糖单元与甘露糖单元的比的影响。因此，得自半乳甘露聚糖或半乳葡甘露聚糖的特别有利的多糖X具有的半乳糖对甘露糖的比为1:3到1:5。
糖苷连接的葡萄糖分子可在2、3和6位被取代，优选在C-2和C-6位被取代。优选地，X的取代基与X的摩尔比为最多10,000。
摩尔取代度MS被定义为是取代基总数与单体单元总数的比。优选摩尔取代度为0.3到0.85，或低于0.3。进一步优选摩尔取代度为0.4到0.7，更优选为0.5到0.6。
取代度DS被定义为是被取代单体单元总数与单体单元总数的比。优选取代度为0.3到0.75，或低于0.3。进一步优选取代度为0.4到0.65，更优选0.5到0.55，其中取代度不大于摩尔取代度值。
“部分取代”是指多糖具有至少0.02的取代度DS。如果摩尔取代度MS大于0.97则认为多糖被完全取代。
C2/C6取代比被定义为是结合于葡萄糖单元C2位的取代基总数与结合于葡萄糖单元C6位的取代基总数的比。优选地，C2/C6取代比为3到12，更优选为4到6。
同其它的合成胶体类似，多糖X不是具有恒定分子量的单元物质。而是，其经常是具有不同大小的分子的多分散混合物，其可通过例如其分子量分布进行定义。分子量分布的宽度和最大值位置可受到现有技术中常用的制备方法和纯化方法的影响。
平均分子量Mw被定义为是总分子量与总粒子数的比。分子量分布的数均值或中值Mn可直接通过渗透压测定法测定。Mn是在50％的粒子具有较大分子量且50％的粒子具有较低分子量处的值。
底部部分的Mw，即，10％的最小多糖X分子的Mw，优选超过20,000，更优选超过15,000，还优选超过9,000，更优选超过6,500。
顶部部分的Mw，即，10％的最大多糖X分子的Mw，优选低于2,160,000，更优选低于1,000,000，还优选低于550,000，甚至更优选低于150,000。
优选地，多糖X的平均分子量Mw为10kDa到500kDa。在本发明的一个实施方案中，多糖X的Mw为150kDa到350kDa。在另一个实施方案中，多糖X的Mw为200kDa。
更优选地，作为多糖X的羟乙基淀粉具有低于30,000的分子量和小于或等于0.3的取代度DS，其中m优选为15到50。进一步优选作为多糖X的羟乙基淀粉具有低于4000的分子量，其中m优选为100到200。进一步优选作为多糖X的羟乙基淀粉具有低于1500的分子量，其中m优选为300到750。
在一个实施方案中，表示多糖X的多分散性的商Mw/Mn低于9.5，优选低于5.3，更优选低于2.4。
多糖X的取代基优选选自羟乙基和羧甲基。在一个实施方案中，被羟乙基取代的多糖的羟基可通过连接基交联，例如通过如下所述的Z1和Z2交联，其起始化合物优选携带羧基、异氰酸酯、羧酸卤，羧基亚烷基和/或酯基作为官能团。
在另一个实施方案中，被一羧酸或二羧酸酯化的淀粉(形式上)例如乙酰基淀粉或丙酰基淀粉用作多糖X。根据另一个实施方案，羧酸可通过醚键结合到多糖X中。优选选自羧甲基淀粉、羧乙基淀粉、羧丙基淀粉的羧基淀粉。适当的单羧酸包括例如乙酸，丙酸，苯甲酸，丁酸，丙烯酸，水杨酸，戊酸，异戊酸，精氨酸，赖氨酸和组氨酸，及其它们的C1-C10烷基酯，卤化物和酐。适当的二羧酸包括例如己二酸，庚二酸，壬二酸，癸二酸，山梨酸，邻苯二甲酸，对苯二甲酸，间苯二酸，松蕈酸，柠檬酸，草酸，丁二酸，富马酸，马来酸，戊二酸，丙二酸，酒石酸，苹果酸，谷氨酸，门冬氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及他们的C1-C10烷基酯，卤化物和酐。优选丙二酰氯。
多糖X优选是淀粉、直链淀粉和/或支链淀粉，更优选羟乙基淀粉(HES)。
在本发明的一个实施方案中，多糖X是HES 200/0.5。HES x/y是具有x kDa的平均分子量Mw和y的摩尔取代度MS的羟乙基淀粉，即，HES 200/0.5是具有200kDa的平均分子量Mw和0.5的摩尔取代度MS。
因为壳多糖和脱乙酰壳多糖自身是不溶于水的，因此亲水性多糖X与这种疏水性的聚合物型壳多糖或脱乙酰壳多糖A结合形成本发明的结合产品(I)用于亲水性处理。分子的极性从而显著增加。除了通过引入羟乙基淀粉进行亲水性处理，还可通过脱乙酰化显著改善壳多糖的水溶性，即将壳多糖转化为脱乙酰壳多糖。壳多糖的碱性脱乙酰化得到脱乙酰壳多糖，其在低于6.5的pH下溶于有机溶剂。
众所周知，可通过结合于氨基的乙酰胺基的皂化反应从壳多糖制备脱乙酰壳多糖。反应通过例如谨慎地加热悬浮在0.5N NaOH中的壳多糖进行。这一皂化反应的程度可容易地通过控制反应温度进行控制。例如，将悬浮在2N乙酸中的壳多糖与0.5N的NaOH在惰性气氛中混合，并加热。脱乙酰壳多糖的游离氨基的比可通过Van Slyke反应确认。
壳多糖和脱乙酰壳多糖化合物的优点在于可完全生物降解。该化合物被壳多糖酶、溶菌酶和其它的溶菌酶类所降解。生物相容性和可酶促降解的壳多糖和脱乙酰壳多糖化合物可通过使用本发明的任选被取代的多糖进行修饰而被改善，用作许多适应症用输注物质。就此而论，m，即X与A的摩尔比起到关键作用。
脱乙酰壳多糖已知具有复合性质并与例如过渡金属诸如铜、锌和镉选择性地形成复合物。另外，脱乙酰壳多糖具有吸附内毒素、核酸和纳米粒子的性质。脱乙酰壳多糖吸附粒子和染料的能力已经被广泛用在化妆品工业和废水技术中。在人体中这些性质的使用与脱乙酰壳多糖的溶解度性质有冲突。脱乙酰壳多糖在有机酸的存在下在低于6.5的低pH下可有利地溶解，因为该聚合物化合物在这种条件下作为可溶性多聚阳离子存在。本发明的结合产品(I)可用于附着粒子、毒素、微生物和病毒。在附着之后，结合产品(I)被网状组织细胞系统的细胞所吞噬，从而吸附物质可被从身体清除。
在本发明的一个实施方案中，医药物质R3配位结合于(复合于)结合产品(I)。R3优选是金属离子。更优选地，R3是铁，优选是FeII，钾，镁，锌，钙，钆和/或铜。
根据本发明，可以选择复合结合产品(I)，使得复合物可在体内释放R3并且将R3作为微量元素和/或重要矿物质提供。在另一个实施方案中，选择复合结合产品(I)，使得复合物不能在体内释放R3，例如，为了能够将复合物用作造影剂，优选R3＝钆。
不仅是那些含有基于葡萄糖单元及其变体如羟乙基淀粉、羧乙基淀粉和右旋糖酐的多糖X的本发明的结合产品(I)，而且主要是那些含有基于半乳糖和甘露糖及其变体的多糖X的结合产品(I)都适用于引入到人体内和非肠道给药。
可有利地用作多糖X的羟乙基淀粉的Mw<130,000和DS为0.3到0.7。要用作多糖X的羟乙基淀粉的C2/C6比有利地是4到6。如果结合产品(I)被用于吸附抗原和其调理作用，可使用分子量<60,000道尔顿的羟乙基淀粉，更有利地为1500到10,000道尔顿的羟乙基淀粉作为多糖X。另一方面，被引入到多糖A中的多糖单元X的数字m应当足够高以确保化合物的相应亲水化。数字m的大小根据多糖A的大小及其游离氨基数目的不同而实质上不同。在巨噬细胞中的噬菌作用下，多糖X在溶酶体中迅速地水解并被肾排泄，即，不被储存。已知的大红细胞溶酶体的酶清单可以水解A和X之间的胺和/或酰胺键，一方面根据A和X的性质，另一方面根据m的大小的不同而异。释放的羟乙基淀粉显然低于肾的排除阈值(60,000道尔顿)。
根据本发明的结合产品(I)的可计算的和可测量的理化性质，本发明的结合产品(I)可用作各种适应症的不溶性药物，作为病毒抑制药，抗生素特别是抗霉菌剂，作为离子交换剂，带电粒子和分子的吸附介质，和作为胶体血液代用品和抗凝剂。重要的理化性质是溶液的粘度、动态粘度、胶体渗透压、电导率、电阻抗、热稳定性和可高压灭菌能力(autoclavability)，以及光传输，吸附，在电泳期间的行为，吸附性和水结合量。本发明的结合产品(I)的溶液优选是热稳定的和可高压灭菌的。对于吸附，本发明的结合产品(I)优选具有对于待吸附物质的足够的结合量。对于带电粒子的吸附性也可通过电泳进行估算。
根据本发明，结合产品(I)可被与X共价结合的式(II)的残基取代：
-Z1cR1  (II)
和/或被与A共价结合的式(III)的残基取代：
-Z2dR2  (III)，
其中R1是药学活性分子残基，R2是药学活性分子残基，且R1和R2可相同或不同，并且其中Z1是与R1和X二者共价结合的连接基，Z2是与R2和A二者共价结合的连接基，c＝1或0，d＝1或0，并且其中式(II)的残基与X的摩尔比是a，式(III)的残基与A的摩尔比是b，a是0到1000的整数，b是0到1000的整数，并且a和b至少之一不是0。
优选地，a＝1、2、3、4或最多150、350或750的整数。优选地，b＝1、2、3、4或最多150、350或750的整数。
作为R1和/或R2要与结合产品(I)结合的药学活性分子R，可使用所有的那些可共价结合于本发明的结合产品(I)的物质，即，所述物质具有能与X和/或A的互补官能团反应的官能团，例如形成羧酸酯，羧酸酰胺和/或氨基甲酸酯，根据官能团的不同而异。能与结合产品(I)形成羧酸酯的药学活性分子是优选的。更优选地，R1和/或R2选自氨基酸残基、肽残基和蛋白质残基。
更优选地，R选自抗生素，化疗剂，细胞生长抑制剂，抗原，寡核苷酸，递质，伪代谢底物和细胞毒物质。这些医药物质共价结合于结合产品(I)并被巨噬细胞所吞噬。
对于R与X和与A的共价结合，原则上两种结合都是可能的。R可经历与脱乙酰壳多糖的游离氨基的结合。R也可结合于X和/或A的羟基之一上。
从携带氨基(-NH2)的基础多糖X和/或A开始，对于具有选自以下的官能度的药学活性物质R可进行R的结合：
羧基(-COOH)；
羧酸卤化物(-C(O)Cl，-C(O)Br和/或-C(O)I)；
羧基亚烷基(-(CH2)q-COOH，q＝1-10)；或
酯基(-COOAlk，其中Alk是含1-7个碳原子的烷基)。
相反地，具有这些官能度的X和/或A可以经历与携带氨基的(-NH2)的药学活性物质R的结合。
从携带羟基(-OH)的基础多糖X和/或A开始，对于具有选自以下的官能度的药学活性物质R可进行R的结合：
异氰酸酯(-NCO)；
羧基(-COOH)；
羧酸卤化物(-C(O)Cl，-C(O)Br和/或-C(O)I)；
羧基亚烷基(-(CH2)q-COOH，q＝1-10)；或
酯基(-COOAlk其中Alk为含1-7个碳原子的烷基)。
相反地，具有这些官能度的X和/或A可以经历与携带羟基的(-OH)的药学活性物质R的结合。
如果c＝0，则R1优选通过羧酸酯、羧酸酰胺和/氨基甲酸酯键直接与X结合。如果d＝0，则R2优选通过羧酸酯、羧酸酰胺和/氨基甲酯键直接与A结合。
在本发明的另外的实施方案中，可使用另外的二官能、三官能或多官能分子来形成连接基，其在药学活性物质R和X和/或A之间形成连接基。
用于连接基Z1和/或Z2的适合的起始化合物选自直链或支链的、饱和或不饱和的、脂肪族或脂环族的烃基，其具有1-22个、优选2-15个、更优选3-8个碳原子；芳基、芳基-C1-C4-烷基和芳基-C2-C6-烯基，其在芳基残基中具有5到12个、优选6到12个、更优选6个碳原子，其可以任选地被C1-C6-烷基和/或C2-C6-烷氧基取代；或杂芳基、杂芳基-C1-C4-烷基和杂芳基-C2-C6-烯基，其中在杂芳基残基中具有3-8个碳原子和一个或两个选自N、O和S的杂原子，其可以被C1-C6-烷基和/或C2-C6-烷氧基取代；和
其中连接基Z1的起始化合物包含2到20个用于与R1和X形成共价键的官能团，并且其中连接基Z2的起始化合物包含2到20个用于与R2和A形成共价键的官能团，其中所述官能团各自独立地选自：
羟基(-OH)，
氨基(-NH2)，
羧基(-COOH)，
异氰酸酯(-NCO)，
羧酸卤化物(-C(O)Cl，-C(O)Br和/或-C(O)I)，
羧基亚烷基(-(CH2)q-COOH，其中q＝1-10)，或
酯基(-COOAlk，其中Alk是含1-7个碳原子的烷基)。
在优选实施方案中，采用双官能分子形成连接基。还优选用于形成连接基的三官能分子。更优选具有相同官能团的用于形成连接基的双官能和三官能分子。
特别适合的化合物包括例如二羧酸类，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、壬二酸、癸二酸、马来酸、富马酸、山梨酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二酸、松蕈酸、柠檬酸、和它们的C1-C10烷基酯、卤化物和酸酐；二异氰酸酯类，例如二苯乙烯二异氰酸酯、双(二苯乙烯二异氰酸酯)、二茴香胺二异氰酸酯、四亚甲基二异氰酸酯、六亚甲基二异氰酸酯、间亚苯基二异氰酸酯、亚(间二甲苯基)二异氰酸酯、C1-C6烷基苯二异氰酸酯、1-氯苯-2，4-二异氰酸酯、环己基甲烷二异氰酸酯、3，3’-二甲氧基二苯基甲烷4，4’-二异氰酸酯、1-硝基苯2，4-二异氰酸酯、1-烷氧基苯2，4-二异氰酸酯、亚乙基二异氰酸酯、亚丙基二异氰酸酯、亚环己基1，2-二异氰酸酯、3，3′-二氯-4，4′-亚联苯基二异氰酸酯、二亚苯基二异氰酸酯、2-氯三亚甲基二异氰酸酯、亚丁基1，2-二异氰酸酯、乙叉基二异氰酸酯、二苯基甲烷4，4′-二异氰酸酯、二苯基乙烷二异氰酸酯、1，5-萘二异氰酸酯、环己烷二异氰酸酯和异佛尔酮二异氰酸酯；二醇类，例如乙二醇、丙二醇、丁二醇和新戊二醇、1，5-戊二醇、3-甲基-1，5-戊二醇、双酚A、1，2-或1，4-环己烷二醇、己内酯二醇(己内酯和乙二醇的反应产物)、羟基烷基化的双酚、三羟甲基丙烷、三羟甲基乙烷、季戊四醇、1，6-己二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇、1，4-丁二醇、2-甲基-1，8-辛二醇、1，9-壬二醇、1，10-癸二醇、环己烷二甲醇、二-、三-和四-乙二醇、二-、三-和四-丙二醇、平均分子量为150到15,000的聚乙二醇和聚丙二醇、三羟甲基乙烷、三羟甲基丙烷和季戊四醇；和/或二胺类，例如1，2-二氨基乙烷、1，2-或1，3-二氨基丙烷、1，2-、1，3-或1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、2，2-二甲基-1，3-二氨基丙烷、六亚甲基二胺、1，7-二氨基庚烷、1，8-二氨基辛烷、三甲基-1，6-二氨基己烷、1，9-二氨基壬烷、1，10-二氨基硅烷、1，12-二氨基十二烷、1，2-二氨基环己烷、1，4-二氨基环己烷、1，3-环己烷双(甲基胺)、1，2-亚苯基二胺、1，3-亚苯基二胺、1，4-亚苯基二胺、4，4′-亚乙基二苯胺、4，4′-亚甲基二苯胺、4，4′-二氨基-1，2-二苯乙烯、4，4′-硫代二苯胺、4-氨基二硫二苯、2，6-二氨基吡啶、2，3-二氨基吡啶、3，4-二氨基吡啶、2，4-二氨基嘧啶、4，5-二氨基嘧啶、4，6-二氨基嘧啶。
这种连接基的使用尤其使得在化合物带有与X和/或A相同的官能团例如各自为醇或者由于某些其它原因彼此不能直接反应以形成键的情况下X和/或A与药学活性分子残基R1和/或R2的组合能够用作药学活性分子R。优选适合的连接基与X和/或A二者以及与活性物质R1和/或R2形成羧酸酯、羧酸酰胺和/或氨基甲酸酯。特别优选的是与选自羧酸酯的双官能连接基的结合。
有利地，可以将允许化学结合药学活性物质R1的另外的特异性残基引入到X中，例如生物素、氨基酸或带有硫化物基团的残基例如半胱氨酸。
根据本发明，作为R1和/或R2结合于结合产品(I)的药学活性分子R，可以另外采用选自以下的药物：减食欲剂、抗酸中毒剂、氨基酸(例如组氨酸)或修饰的氨基酸、强壮剂/抗缺氧剂、镇痛药/抗风湿病药、驱虫剂、抗变态反应药、抗贫血药、抗心律失常药、抗生素/抗感染药、抗老年痴呆药(促智药)、抗糖尿病药、解毒剂、止吐药/抗眩晕药、抗癫痫药、止血药(抗纤维蛋白溶解药和其它止血药)、抗高血压药、抗低血糖药、抗低渗药、抗凝剂、抗真菌药、抗寄生虫药(内用)、抗炎剂、镇咳药/祛痰药、动脉硬化药、浴疗剂和热疗用药物、β阻断剂、钙通道阻断剂和肾素-血管紧张素系统抑制剂、毛细支气管扩张药/止喘药、利胆剂、和胆道治疗剂、胆碱能药、皮质激素(内用)、皮肤用药(内用)、食疗药/营养治疗剂、诊断剂和诊断助剂、利尿剂、血流兴奋药、脱瘾药、酶抑制剂、酶制剂和转运蛋白、溶纤药、老年病用药、痛风治疗剂、流感治疗剂、妇科用药、抗痔疮药(直肠病学)、肝用药、安眠药/镇静剂、垂体和下丘脑激素、调节肽及其抑制剂、免疫治疗剂和细胞因子、输注和标准注溶液、器官灌流液、心脏治疗药、龋齿和牙周病治疗剂和其它牙科制剂、冠状动脉用药、通便剂、脂质抑制剂、神经治疗剂、胃肠用药、偏头痛镇痛药、矿物质代谢制剂、肌肉松弛药、麻醉剂、甲状旁腺激素、钙代谢调节剂、骨质疏松症用药、神经病制剂和其它亲神经药物、神经递质(例如，多巴胺)或修饰的神经递质、眼科用药、耳用药、抗帕金森病药和用于锥体外系病症的其它药物、精神治疗药、窦炎用药、强壮剂/补养药、甲状腺治疗剂、血清、免疫球蛋白和疫苗、性激素及其抑制剂、解痉药、血小板聚集抑制剂、抗肺结核药、免疫刺激药、泌尿科用药、血管治疗剂、维生素、伤口治疗剂、细胞生长抑制剂和转移抑制剂。也就是说，R1和/或R2为选自上述组中的药物。
更优选地，R选自肌醇、地高辛和丙泊酚。
在另一个变体中，R选自神经氨酸化合物。
本发明的结合产品(I)可以用作生物相容性物质，即，身体可耐受的物质。优选地，将它们用作植入物、手术助剂或药用装置中的组件。
作为植入物的优选用途是长期的或短期的植入物，例如人造血管、血管植入物、人造心脏瓣膜、心脏二尖瓣、腱和韧带代用品、软骨代用品或用于在手术过程中封闭不希望的开口的贴片和伤口覆盖物。
作为手术助剂的优选用途是手术工具、以短期方式体内使用的一次性制品、导管、导管通道、缝合材料、生物可降解的缝合材料、注射器、体外血液通道、血液袋或用于静脉内使用的溶液的袋、或袋的片材。
作为医疗装置组件的优选用途是作为人工心肺机和透渗析机或过滤器、血液袋、输注通道、蠕动泵或透析膜的部件。
另外优选的是其作为隐形眼镜用物质，作为护发素、保湿霜或指甲油的美容添加剂，用于固定细胞和酶，作为亲和色谱法和蛋白质分离的载体，用于受控的治疗系统(受控的药物递送系统)，用于选择性药物释放的系统或用于体外组织培养的技术(组织工程)。
本发明的结合产品(I)的特别适应症是在免疫学应用范围内提供微球体和在结合于其它医药活性化合物时作为调节药物活性的载体材料。本发明的结合产品(I)使得可以得到以下的组件，所述组件具有广泛用于生物学(用于甲壳类动物、昆虫和真菌)的尺寸上稳定的外壳，作为完全生物可降解的血管支架和植入物，这取决于多糖X的取代程度和壳多糖化合物A的进一步相互交联。壳多糖组分还有可能进行另一种交联，例如通过在引入X之前和之后并入上述二价连接基。对于这种应用，植入物也可以通过对带电体的静电聚集而成形。
原则上，任何带静电的带电体或导体都可以用作在电化学方面不与要聚集的脱乙酰壳多糖薄膜反应的带电体。银、铂和金最适合作为电极材料。在下文中说明适合作为聚集表面的阴极射线管屏和可用作带电体的带电回转支承板。
优选结合产品(I)可通过壳多糖或脱乙酰壳多糖A与多糖X的两步反应得到。
其中：
(a)所述结合是胺键，则该过程包括以下步骤：
- 使多糖A与多糖X反应以形成亚胺；和
- 随后将亚胺还原为相应的胺；或
其中：
(b)所述结合是酰胺键，则该过程包括以下步骤：
- 将多糖X的醛基氧化；和
- 随后使氧化产物与多糖A反应。
在(a)中，在第一步骤中，壳多糖或脱乙酰壳多糖A的氨基与多糖X的末端醛基反应以形成希夫碱。在第二步骤中，用还原剂将希夫碱还原为相应的胺。亚胺还原得到胺是本领域技术人员公知的且在已知条件下进行。适合的还原剂包括例如盐样的氢化物例如LiAlH4、LiBH4、NaBH4、或NaBH3CN。然而，也可以使用本领域技术人员已知的其它还原剂。
为了形成酰胺键(b)，首先将多糖X的醛基氧化，在随后的步骤中，使得到的作为内酯和/或羧酸的氧化产物与多糖A反应，形成羧酸酰胺(得自内酯和/或羧酸与多糖A的氨基的反应)。对于氧化，可使用本领域技术人员已知的任何适合的方法。优选地，使用Hashimoto的方法(描述在Hashimoto等人，Kunststoffe，Kautschuk，Fasern，Vol.9(1992)，第1271-1279中)，其中可以选择性地将糖的还原型醛端基氧化，得到反应性的酯(内酯)。多糖X的末端醛基优选通过在氢氧化钾水溶液的存在下与碘反应而被选择性地氧化。优选地，将0.1N碘溶液和/或0.1N KOH溶液用作试剂。在本发明的优选实施方案中，反应在有机溶剂中进行，例如DMSO或乙基二甲胺基丙基碳二亚胺。
在制备本发明的结合产品(I)形成希夫碱((a)的步骤1)时，认为壳多糖/脱乙酰壳多糖A和多糖X二者都必须在分子中具有还原性端基。因此，在合成本发明的化合物时，必须阻止壳多糖和脱乙酰壳多糖化合物A的还原性端基本身与壳多糖和/或脱乙酰壳多糖A的氮原子反应。优选通过形成脱乙酰壳多糖和/或壳多糖薄膜以高的程度阻碍末端醛基与脱乙酰壳多糖的氨基的这种反应。这将形成与结合产品(I)竞争的偶联产物。
尽管可以通过使用没有溶解于有机溶剂的脱乙酰壳多糖而使第一步骤的平衡状态向有利于形成结合产品(I)的方向转化，但是由此形成的化合物保持为更大的集料(aggregates)和集簇(clusters)，从而期望的进一步的反应强烈地受到位阻的影响。例如，形成这种集料或集簇的化合物几乎不可能进行化合物的区域选择性官能化。
可以在酸性介质中避免集料和集簇形成，因为脱乙酰壳多糖易溶于酸例如乙酸中。优选多糖A溶解于选自稀的弱有机和无机酸的溶剂中，所述溶剂具有小于6.5的pH，优选小于5.5，更优选小于5.0。更优选地，pH为2.0-6.0。特别优选的溶剂是在人和/或动物代谢中可降解的溶剂，例如乙酸和乳酸。
将脱乙酰壳多糖溶液施用于支承板，以形成薄膜。因为形成的脱乙酰壳多糖薄膜是要用作进一步反应的固体基质，并且希夫碱的形成受到溶液中残留酸的干扰，所以必须尽可能完全地除去溶液中的残留酸。这是通过用蒸馏水或pH大于7.0的磷酸盐缓冲剂洗涤薄膜进行的。通过本发明支承板上的强的负电荷，阻止了在低pH下仍可溶的聚阳离子脱乙酰壳多糖被从支承板洗掉。相比之下，对于带正电荷的板，可以观察到脱乙酰壳多糖薄膜经常是完全地漂浮远离。对于相应地正电极化的阴极射线管可以观察相同的现象。另外，为了避免脱乙酰壳多糖被洗掉，从外周到中心依次施加洗脱剂。流出的洗脱溶液的pH显示酸性有机溶剂的完全除去。
除去溶剂的另一个可能的方法是将用作溶剂的乙酸和/或另外的溶剂蒸发。
优选地，使用不与起始材料或产物反应的溶剂。特别地，应该使用不干扰希夫碱形成的官能团例如羧基的溶剂。
在本发明的优选实施方案中，将二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇、二甲基亚砜或其混合物用作第一和/或第二反应步骤的溶剂。特别优选二氯甲烷作为亚胺形成的第一步骤的溶剂。对于第二步骤的还原，特别优选甲醇作为溶剂。
对于第一反应步骤并且由此对于本发明化合物的制备，制备的脱乙酰壳多糖薄膜的表面结构是关键性的。在制备薄膜结构时，必须实质上避免集料和集簇的形成。特别优选薄的或单层的脱乙酰壳多糖薄膜。薄的和/或单层的薄膜使得以更高的收率得到结合产品(I)。另外，有可能通过光学装置例如激光和荧光检测器、光学和电子显微镜来进一步评价覆盖密度。
本发明的方法产生具有很少不匀度的脱乙酰壳多糖薄膜。相比之下，通过浸渍或条涂(stripping)制备的脱乙酰壳多糖薄膜的显微镜评价表现出得到的薄膜结构具有强的不匀度。另外，有机溶剂随蒸馏水或磷酸盐缓冲剂的渗漏另外引起制备的薄膜起皱和分离。相比之下，如果只在薄膜已经干燥之后除去溶剂，则促进了裂纹和显微镜可见不匀度的形成。
通过将回转支承板上的成膜结构离心，可以制备具有可选择的层厚度的非常均匀的薄膜。然而，在这种方法中，脱乙酰壳多糖分子A的氨基的位置和取向基本上是随机的。在薄膜形成过程中，氨基可以面对支承板或自由表面。在随后的第一反应步骤中，由于位阻，只有那些面对自由表面的氨基能够与多糖X的醛反应。
根据本发明，通过使支承板表面带静电而控制质子化形式的氨基(铵基团)的位置和取向。在带正电荷的表面上，由于静电排斥，脱乙酰壳多糖分子取向为使得它们的铵基团面向远离支承板表面的方向。
本发明的脱乙酰壳多糖薄膜的最大厚度使得其中阳离子基团的取向刚好由支承板的电荷模式决定。对于更厚的脱乙酰壳多糖薄膜，质子化基团的取向只由脱乙酰壳多糖分子的相互作用决定。因此，可允许的最大层厚度取决于支承板的电极化程度。
由脱乙酰壳多糖分子的铵基团取向所导致的它们的排列在除去酸溶剂过程中脱乙酰壳多糖转变为其不溶性形式时得到保持，其中氨基没有质子化并且因此不带有任何正电荷。
在一个实施方案中，支承板的表面通过阴极射线而静电带电。
在得到的(固体)脱乙酰壳多糖薄膜中，有显著更多的氨基取向为远离支承板表面而不是朝向支承板表面。向薄膜添加其中溶解或悬浮多糖X的液体。所述溶液的pH范围优选为使得脱乙酰壳多糖不溶解并且其中其氨基不处于质子化状态。优选的pH范围是最低为6.5，优选为6.8-10，更优选最低为7.0，更优选为7.5或更高到8.0。优选溶液包括缓冲剂，更优选缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。
通过搅动支承板，优选通过旋转或振动，要彼此反应的多糖A与X之间的接触得到优化。在多糖X与脱乙酰壳多糖A已经反应完全或在已经达到所要达到的平衡状态时，在约30分钟之后，除去过量的多糖X。
另一个实施方案包括使羧甲基-取代的多糖X结合于脱乙酰壳多糖。除了多糖分子的末端醛基之外，羧基之一还可以与脱乙酰壳多糖的氨基反应，形成希夫碱。
为了表征该化合物，除羟乙基或羧甲基之外，还可以将多糖用荧光素或其它指示剂取代。
通过其中在本领域技术人员公知的条件下将形成的希夫碱还原为相应胺的第二步骤，得到结合产品(I)。优选地，将盐样的氢化物用于还原更优选使用氢化铝锂(LiAlH4)、硼氢化锂(LiBH4)、氰基硼氢化钠(NaBH3CN)或硼氢化钠(NaBH4)。
在一个实施方案中，羟基乙基取代的多糖X的羟基可以与二羧酸或二羧酸卤化物反应，从而使结合的多糖残基交联，或者交联的多糖X与脱乙酰壳多糖A反应。对于交联，草酸、丙二酸、琥珀酸、己二酸、和它们的卤化物是尤其适合的。可以根据反应进行酯化，得到结合产品(I)，其中可以将分子间交联用作构成部分。
根据本发明，如果A作为薄膜存在或者作为粒子结合，取决于它们的浓度、A的脱乙酰化的游离氨基数和A的固定结构上的带电模式，多糖分子X可以以任何期望的距离分离，使得可以根据A的氨基的分布自由地选择结合产品(I)中多糖X的单独的结合分子的相互距离。在结合于A的单独的多糖残余物之间的距离充分大时，在加入例如二羧酸卤化物时不能发生交联。反而是药学活性物质可以结合于X以形成连接基而不导致交联，这在这种情况下是不希望的。这个实施方案优选使用具有>800,000的充分大MW的壳多糖和/或脱乙酰壳多糖分子A和<150,000相对低MW的多糖X，其中优选A是过量的。
在一个实施方案中，本发明的方法另外包括以下步骤：
用式(II)的残基取代X
-Z1cR1  (II)
和/或
用式(III)的残基取代A
-Z2dR2  (III)
其中R1是药学活性分子残基，R2是药学活性分子残基，和R1和R2可相同或不同，和
其中Z1是共价结合于R1和X二者的连接基，Z2是共价结合于R2和A二者的连接基，c＝1或0，d＝1或者0，和
其中式(II)的残基与X的摩尔比是a，(III)的残基与A的摩尔比是b，a是0到1000的整数，b是0到1000的整数，并且a和b中至少一个不是零。
用于引入医药物质的合成方法的特例是其中上述式(II)的残基共价结合于X的结合产品(I)的取代，其中在另外的步骤中，通过将胺和/或酰胺键裂解而使A和X分开。换句话说，在将X用式(II)的残基取代之后，在另外的步骤中使X和A彼此分开。本领域技术人员知道可以用于方便地进行选择性裂解A-X键的条件，即，对式(II)的残基与之结合的X的结构没有或有很少的影响。取决于R1和X与A之间的键，适合的方法包括但不限于任选地在金属催化剂的存在下进行的在碱性介质中的水解、酶促水解，优选采用蛋白酶和von Braun胺裂解。
这种裂解反应的产物至少是被式(II)的残基取代的多糖X，相当于在EP-A-1 230 935中被描述为改性胶体的化合物。因此，本发明的方法是EP-A-1 230 935所述方法的改进或生产EP-A-1 230 935所述化合物的中间步骤。根据该方法，通过使脱乙酰壳多糖薄膜上的多糖通过多糖的末端醛基与由于其电荷取向的脱乙酰壳多糖薄膜的游离氨基共价结合以形成希夫碱而进行的分离和取向，使得多糖被医药活性物质或残基区域选择性地取代。该方法可以由装置进行和控制。
在另外的步骤中，有可能将物质R1和/或R2区域选择性地引入到结合产品(I)中，任选地使用连接基进行。对于取代基的区域选择性引入，化合物可以以电荷依赖性的方式聚集到具有非常复杂的带电模式的电极结构上。形成薄膜的脱乙酰壳多糖分子的电荷依赖性取向可以通过聚集到带电的平面纳米结构电极上来实现。可以通过电子显微镜法在高真空下将这种纳米结构印刷电路烧制成电极。
除了选择多糖A的脱乙酰作程度即其反应性氨基数目之外，还可以在多糖A与多糖X反应形成结合产品(I)之前借助大分子的方式影响要结合于多糖A的多糖X的分离，所述大分子通过分子间吸引力与多糖X聚结并且由此起到多糖X的单独分子之间的间隔基的作用。适合的是任何大分子，条件是其可以与多糖X聚结并且形成平行分子的大的聚集物并且同时没有使其在随后工艺步骤中与多糖X和/或多糖A反应以形成共价键的官能团。也就是说，对于不与结合产品(I)共价结合的大分子的聚结，可以使用一方面不能与脱乙酰壳多糖的氨基形成共价键以形成希夫碱并且另一方面具有充分强的对多糖X的分子间吸引力的那些大分子，特别是多糖。
众所周知，在κ-角叉菜胶和醋孟南之间有非常强的分子间吸引力，引起两种多糖聚集在一起。因此，例如κ-角叉菜胶可以与醋孟南形成平行分子的聚结物，如在特别实施方案中那样。根据本发明，在X和A成键的上游步骤中，多糖X与大分子形成平行分子的聚结物，所述大分子优选为κ-角叉菜胶、糖蛋白或得自细胞膜的大分子。这种大分子不应该包含任何使得它们在随后步骤的反应条件下与多糖X和/或多糖A反应以形成共价键的官能团。
根据本发明，可以首先在没有脱乙酰壳多糖分子A的存在下将κ-角叉菜胶的末端醛基还原，例如通过与盐样的氢化物例如硼氢化钠反应进行。不含还原性醛基的κ-角叉菜胶可以随后与醋孟南形成更大的集簇。在醋孟南与多糖A的反应过程中，κ-角叉菜胶起到间隔基的作用而不共价结合于胺基。多糖A的胺基被醋孟南的狭促占据是位阻性的。在并入医药活性物质R1和/或R2之前，必须将这些还原的多糖洗脱。
根据本发明，半乳甘露聚糖和/或半乳葡甘露聚糖也可以用作多糖X，并且其中醛基已经被除去或被保护的κ-角叉菜胶可用作用于分离和/或模式生成的大分子。
如果作为多糖X的κ-角叉菜胶是要结合于多糖A，则这可以通过可用作多糖X的个体多糖的混合比例来实现。然而，也可能目的在于不是将对大分子的聚结并入到本发明分结合产品(I)中，而是在A和X反应以形成结合产品(I)之后洗脱掉。
在特别的实施方案中，在可以与多糖X和/或A的官能团反应的官能团已经被除去和/或用保护基保护起来之后，可以使用通过微生物或细胞合成的大分子作为聚结于多糖X的间隔基，以便空间上影响多糖X并入到本发明的结合产品(I)中。这种大分子包括得自细菌、真菌和酵母菌的细胞膜的多糖和糖蛋白。
在使用具有较大分子间结合力倾向例如范德华力的多糖X时，结合产品(I)可以具有对发挥位阻影响的非还原性生物学结构的高亲合力。
在一个实施方案中，通过与金属复合以及通过电极和其它电化学方式实现X和/或A的进一步取代。
结合产品(I)在分子量和分子的电荷图形方面具有差异，并且另外在分子量和分子的电荷图形方面不同于起始材料。因此，有可能通过凝胶渗透色谱法和/或电泳从反应产物分离起始材料和/或纯化反应产物，其中根据它们的大小(更确切地说是它们的流体力学体积)和/或电泳流动性从起始材料纯化和/或分离反应产物。
在本发明的一个实施方案中，医药物质R3配位结合(复合)于结合产品(I)。R3优选是金属离子。更优选地，R3是铁(优选为FeII)、钾、镁、锌、钙、钆和/或铜。
根据本发明，可以选择复合的结合产品(I)，使得复合物可以在体内释放R3，以便提供示踪元素或重要的矿物质。在另一个实施方案中，选择复合的结合产品(I)使得复合物不能在体内释放R3，例如以便使得复合物用作造影剂，优选其中R3＝钆。
本发明的装置优选用于制备结合产品(I)。本发明的装置包括由绝缘材料例如玻璃、塑料或琥珀制成的可静电带电的支承板1，使得可以通过支承板1的静电电荷形成电场。通过本发明的装置，可以由液相产生纳米结构表面。此外，表面可以选择性地被几何学官能化，以便静电固定特定的分子或微观粒子。通过静电结构，液体中的粒子，例如溶解的脱乙酰壳多糖分子，可以借助电场移动并且选择性地定位。
在本发明方法的特定的实施方案中，所述方法包括以下步骤：对支承板(1)施加脱乙酰壳多糖或壳多糖A的溶液或悬浮液；使支承板(1)静电带电，形成电场；制备脱乙酰壳多糖或壳多糖薄膜；通过使脱乙酰壳多糖或壳多糖薄膜与多糖X的溶液或悬浮液在大于6.8的pH下接触使脱乙酰壳多糖或壳多糖A反应，形成希夫碱；通过加入还原剂还原希夫碱，得到结合产品(I)。在另外的步骤中，结合产品(I)可以与R1和任选地与Z1反应，和/或与R2和任选地与Z2反应，得到被式(II)和/或(III)的残基取代的结合产品(I)。随后，进行以下步骤：使至少被式(II)的残基取代的结合产品(I)反应以裂解A和X之间的胺键和/或酰胺键，以便至少得到被式(II)的残基取代的多糖X。
在一个实施方案中，支承板1可以旋转，其中可借助马达控制性调节和借助转数计确定旋转的每分钟转数。优选支承板1为平面的。在另一个实施方案中，支承板具有凹面设计，并且由此形成容器。
凹面弯曲的支承板使得能够在由弯曲产生的反应容器中进行化学反应。可以通过缓慢旋转容器实现加入的试剂的混合，而不使形成的薄膜结构分离或扰动。通过增加每分钟转数，试剂可以被离心离开边缘，即，除去，而不干扰薄膜结构。
支承板1可以通过本领域中已知的方法静电带电。在一个实施方案中，回转支承板的一个侧面可以接近绝缘加紧的纸表面并且由此静电带负电荷。在支承板的相对侧上形成相反的正电荷。
任选地，支承板1可以以受控的方式静电带电。在另外的实施方案中，将电极布置在支承板中或其表面上。通过使电极带电，可以在支承板1的表面上形成复杂的电荷图形。电极连接于发电机。在优选实施方案中，支承板1通过其轴连接于发电机。在一个实施方案中，可旋转支承板1的连接是通过滑动接触实现的。
任选地，产生电荷的设备还能够测量这种电荷。在本发明的一个实施方案中，本发明的装置包括用于产生和测量支承板表面的静电电荷的至少一个设备2，所述设备能够使可旋转的支承板的顶侧和底侧静电带电有不同的电荷。在本发明的一个实施方案中，本发明的装置包括用于产生和测量支承板表面的不同电荷的至少一个设备3，其中所述设备包括以导电的方式与所述可旋转的支承板的中心连接的阴极，和在支承板表面外周上的环形阳极，其中所述电极连接于发电机。
在一个实施方案中，电极布置在支承板中心的上方。电极可以通过使其接近支承板而以导电的方式连接于脱乙酰壳多糖薄膜或加入的试剂。在优选实施方案中，电极材料是石墨。
在所述方法的另一个实施方案中，支承板没有旋转设计，但是涂有脱乙酰壳多糖薄膜的支承板布置在至少一个阴极射线管的屏上。优选地，支承板设计为在阴极射线管的屏上的反应容器。通过偏转板和/或偏转线圈适当地调节阴极射线，可以在支承板表面上产生特定的电荷图形，其影响脱乙酰壳多糖的带正电荷的氨基的聚集并且影响随后的化学反应，即，电子位移和氧化还原作用。
有利地，可以再现用成象方法例如电子显微技术记录的结构，用于在整合到所述阴极射线管中的支承板上产生特定的电荷图形。在这种方法的特定实施方案中，可以通过偏转线圈使阴极射线偏转到检视窗上，使得可以通过偏转到检视窗上而观察入射在支承板上的电荷图形。阴极和支承板之间的距离可以小于或大于阴极和检视窗之间的距离。通过适当地获得阴极和检视窗之间和阴极和支承板之间的距离，在支承板上产生的电荷图形可以放大在检视窗上(在距离更远的情况下)。通过适当地将成像电子显微镜和使支承板带电的二者连接于计算机并且借助连接的电子显微镜观察在支承板上制备的结构，可以使两个系统彼此配合。优选地，阴极射线和用于对其进行控制和使其偏转的设备连接于计算机，所述计算机从电子显微镜或另一个成像设备获得信息。
本发明的装置可以另外包括用于透照支承板1的设备6，以及用于测量通过支承板1的光的光探测器。在一个实施方案中，所述装置包括用于照射支承板表面的设备以及用于测量支承板反射的光的光探测器。独立地，所述装置可以包括用于使支承板表面上形成的薄膜磁化和用于测量支承板表面上的磁场的设备。优选所述设备可移动地布置在支承板的上方和/或下方。优选地，其可以在至少一个方向上相对于支承板移动，例如借助于步进马达61和转轴62。
优选地，所述装置包括在支承板1中心上方提供的移液或定量设备4，其与支承板1的距离可以改变。任选地，所述装置包括另外的定量设备，可以选择其与支承板中心的距离，其中还可以控制性地改变它们在支承板上方的高度。
图1表示本发明的装置的说明性实施方案的顶部平面图。图表示相同实施方案的剖视图，其中：
1是支承板，其可以以受控的方式静电带电，并且可以以可调的每分钟转数旋转；
2是用于产生和测量支承板1表面的静电电荷的设备，例如通过使所述可旋转支承板的顶侧和底侧带有不同的静电电荷；
3是用于在支承板1表面上产生和测量不同电荷的设备，例如通过并入以导电方式连接于可旋转支承板中心的阴极和支承板表面的圆周上的环形阳极，其中所述电极连接于发电机；
4是在支承板1的中心上方提供的移液或定量设备，其与支承板的距离可以改变；和
6是透照支承板1的设备以及用于测量通过支承板1的光的光探测器，其中所述设备6包括步进马达61和转轴62；
11是可以驱动所述可旋转支承板的马达；和
12是转数计。
通过随后的实施例进一步说明本发明，然而本发明不受其限制。
实施例
实施例1
将10mg的高度粘性的脱乙酰壳多糖(2-氨基-2-脱氧-(1→4)-β-D-glucopyranan)(Fluka Biochemika)溶解在12ml蒸馏水中。随后，将根据DeBelder和Granath制备的荧光素的DS为0.02的用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的0.5mg HES 200/0.5溶解于1.5ml的0.1N磷酸盐缓冲液pH 7.5中，并且通过在黑暗中摇动混合。在30分钟之后，加入0.025g氰基硼氢化钠NaBH3CN(Acros Organics，New Jersey)并且摇动混合物和使其在黑暗中室温静置2小时。每30分钟手动摇动试剂，直到鼓泡停止。在最迟120分钟之后，再次加入相同量的0.025g氰基硼氢化钠，并对混合物进行同样的处理。使用具有相同组成的对照溶液进行相同的过程，但是不加入氰基硼氢化钠。
在72小时之后，将两种试剂分离并且冷冻干燥。与氰基硼氢化钠反应的混合物表现出脱乙酰壳多糖微粒的透明的黄色，而没有用氰基硼氢化钠处理的微粒没有明显的颜色。在用荧光灯(波长540-590nm)照射时，可以观察到荧光的黄色。随后，将两种冷冻干燥的试剂暴露于负电荷的强电场。未与氰基硼氢化钠混合的干燥物质立即被电场吸引。根据本发明与氰基硼氢化钠混合的物质不是带电形式(聚阳离子)，因此不受电场的影响。
实施例2
将10mg的高度粘性的脱乙酰壳多糖(2-氨基-2-脱氧-(1→4)-β-D-glucopyranan)(Fluka Biochemika)溶解于10ml蒸馏水中。随后，将根据DeBelder和Granath制备的荧光素的DS为0.02的用FITC标记的0.5mg HES 200/0.5溶解于1.5ml的0.1N磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，并且通过在黑暗中摇动混合。在30分钟之和，加入0.025g的氰基硼氢化钠NaBH3CN(Acros Organics，New Jersey)。摇动混合物并且使其在黑暗中室温静置2小时。每30分钟手动摇动试剂，直到鼓泡停止。在最迟120分钟之后，再次加入相同量的0.025g氰基硼氢化钠，并对混合物进行同样的处理。
实施例3
在摇动下将2g的低粘度的脱乙酰壳多糖(2-氨基-2-脱氧-(1→4)-β-D-glucopyrnanan)(Fluka Biochemika)溶解于50ml的2N乙酸中。使混合物静置36小时，直到气泡不再明显。将平面的载玻片夹紧在图1中所示的薄膜离心机中。在薄膜离心机的旋转中心上方提供的移液设备充满有脱乙酰壳多糖溶液。使离心机以200rpm旋转并且用发生器使其带负电荷。使移液设备缓慢接近回转支承板。最初，将200μl的脱乙酰壳多糖溶液施加在支承板的中心并且通过增加转数在支承板上分配形成薄膜。用在薄膜离心机上方提供的灯和测量设备测定圆形薄膜结构的半径。增加离心机的转数，直到形成的薄膜的半径不再增加。将薄膜在300rpm干燥超过12小时。
将薄膜以150rpm的每分钟转数用水洗涤，从薄膜的外部周边开始，直到滴落的洗涤溶液具有中性的pH。向支承板添加3ml的磷酸盐缓冲液。将5g的HES-460完全溶解于7ml水中，并且将其添加到支承板上。在30分钟之和，加入0.025g的氰基硼氢化钠NaBH3CN(AcrosOrganics，New Jersey)。使混合物缓慢旋转30分钟并且使其室温静置2小时。其后，每30分钟旋转试剂10分钟，直到鼓泡停止。在最迟120分钟之后，再次加入相同量的0.025g氰基硼氢化钠，并对混合物进行同样的处理。在72小时之后，使试剂离心从支承板上方离开，将制备物反复地用磷酸盐缓冲液pH 7.5洗涤，干燥并且通过电子显微技术检查。使用具有相同电荷的支承板进行相同的过程，但是不加入氰基硼氢化钠。
在氰基硼氢化钠反应时，观察到几乎仅在样品的边缘区发生气泡形成。图3表示没有加入氰基硼氢化钠形成的实施例3的脱乙酰壳多糖薄膜。图4表示在经过实施例3的本发明的方法之后的脱乙酰壳多糖薄膜。在制备物的边缘区，发现明显的改变和起皱，这在薄膜的中间区没有观察到。对薄膜边缘区这种改变的显著限制只在支承板带负电荷时可以观察到。这些观察结果表明，支承板的电极化引起脱乙酰壳多糖分子的阳离子基团朝向板取向，并且由此只有在边缘区可进行本发明的反应。在支承板带负电荷时，加入氰基硼氢化钠之后的气泡形成也是只在边缘区观察到。
实施例4
在摇动下将5g壳多糖悬浮在2N乙酸中。使混合物静置，直到气泡停止，并且在三口烧瓶中用氮气吹扫。随后，缓慢加入250ml的0.5N NaOH。将混合物在95℃加热20分钟。残余物用过量的水洗涤并且在80℃干燥。
在摇动下使形成的脱乙酰壳多糖溶解于2N乙酸，并且使用实施例3中所述的装置在薄膜离心机的带正电荷板上以300rpm离心。随后以低的每分钟转数从周边开始用水洗涤，直到滴落的洗涤溶液具有中性的pH。将支承板上的薄膜聚集在3ml的磷酸盐缓冲液(pH7.5)中。将1g的HES 130/0.5溶解于5ml的H2O中并且移液到支承板上。
在30分钟之后，加入0,025mg的氰基硼氢化钠。使混合物缓慢旋转30分钟，然后使其静置2小时。其后，使支承板缓慢旋转10分钟，直到鼓泡停止。在120分钟之后，再次加入0.025g氰基硼氢化钠，并对混合物进行同样的处理。在72小时之后，将上清溶液离心掉，并将制备物重复地用磷酸盐缓冲液洗涤并且干燥。
将带有制备物的支承板置于具有滴液漏斗和pH电极的反应容器中，并且小心地用水涂覆。用稀的氢氧化钠水溶液调节pH为8-8.5。小心地加入0.5g吡啶，并且小心地摇动容器。其后，加入30mg的丙二酸二氯化物，然后缓慢旋转反应容器。随后，加入50mg的肌醇。使反应在60℃静置2小时。其后，再次加入30mg丙二酸二氯化物，然后加入50mg肌醇并且再次使混合物在60℃静置2小时。这个过程再重复两次。其后，将支承板小心地用水洗涤并且冷冻干燥。

Claims (63)

1.结合产品(I)，其包括：
m个多糖X分子与一个多糖A分子，
其中所述多糖A选自壳多糖或脱乙酰壳多糖，
m是1-10,000的整数，和
X和A之间的连接基是胺和/或酰胺键。
2.权利要求1的结合产品，其特征在于所述多糖X选自直链淀粉、支链淀粉、醋孟南、右旋糖酐、阿拉伯半乳聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖、黄原胶、角叉菜胶、藻酸盐、瓜尔胶、金合欢胶、琼脂糖、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸、阿拉伯树胶、淀粉、及其混合物。
3.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是半乳甘露聚糖。
4.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是半乳葡甘露聚糖。
5.权利要求3或4中任一项的结合产品，其特征在于多糖的半乳糖对甘露糖的比为1:3-1:5。
6.权利要求2的结合产品，其特征在于所述多糖X是直链淀粉和/或支链淀粉。
7.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是醋孟南。
8.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是右旋糖酐。
9.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是阿拉伯半乳聚糖。
10.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是黄原胶。
11.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是角叉菜胶。
12.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是藻酸盐。
13.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是瓜尔胶。
14.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是金合欢胶。
15.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是琼脂糖。
16.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是肝素。
17.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是硫酸软骨素。
18.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是透明质酸。
19.权利要求1或2的结合产品，其特征在于所述多糖X是阿拉伯树胶。
20.前述权利要求中一项或多项的结合产品，其特征在于所述多糖X被部分或完全取代。
21.权利要求20的结合产品，其特征在于多糖X的取代基选自羟乙基和羧甲基。
22.权利要求20或21的结合产品，其特征在于所述多糖X是羟乙基淀粉。
23.权利要求22的结合产品，其特征在于所述羟乙基淀粉的分子量低于30,000，其取代度DS小于或等于0.3，并且m优选为15-50。
24.权利要求22的结合产品，其特征在于所述羟乙基淀粉的分子量低于4000，并且m优选为100-200。
25.权利要求22的结合产品，其特征在于所述羟乙基淀粉的分子量低于1500，并且m优选为300-750。
26.权利要求1的结合产品，其特征在于所述多糖X是用单羧酸和/或二羧酸酯化的淀粉。
27.前述权利要求中一项或多项的结合产品，其特征在于所述多糖A是脱乙酰程度为90％-40％、更优选为75％-60％的脱乙酰壳多糖。
28.前述权利要求中一项或多项的结合产品，其特征在于所述结合产品(I)被共价结合于X的式(II)的残基取代，
-Z1cR1   (II)，
和/或被共价结合于A的式(III)的残基取代
-Z2dR2         (III)，
其中
R1是药学活性分子残基，
R2是药学活性分子残基，和
R1和R2可相同或不同，和
其中
Z1是与R1和X二者共价结合的连接基，
Z2是与R2和A二者共价结合的连接基，
c＝1或0，
d＝1或0，和
其中
式(II)的残基与X的摩尔比是a，
式(III)的残基与A的摩尔比是b，
a是0-1000的整数，
b是0-1000的整数，和
a和b的至少一个不是零。
29.权利要求28的结合产品，其特征在于连接基Z1和/或Z2的起始化合物选自具有1-22个、优选2-15个、更优选3-8个碳原子的直链或支链的、饱和或不饱和的、脂肪族或脂环族的烃基残基；芳基部分中具有5-12个、优选6-12个、更优选6个碳原子的芳基、芳基-C1-C4-烷基和芳基-C2-C6-烯基，其可任选地被C1-C6-烷基和/或C2-C6-烷氧基取代；或在杂芳基部分中具有3-8个碳原子和一个或两个选自N、O和S的杂原子的杂芳基、杂芳基-C1-C4-烷基和杂芳基-C2-C6-烯基，其可被C1-C6-烷基和/或C2-C6-烷氧基取代；和
其中连接基Z1的起始化合物包含用于与R1和X形成共价键的2-20个官能团，和
其中连接基Z2的起始化合物包含用于与R2和A形成共价键的2-20个官能团，
其中所述官能团各自独立地选自：
羟基(-OH)，
氨基(-NH2)，
羧基(-COOH)，
异氰酸酯(-NCO)，
羧酸卤化物(-C(O)Cl，-C(O)Br和/或-C(O)I)，
羧基亚烷基(-(CH2)q-COOH，其中q＝1-10)，或
酯基(-COOAlk，其中Alk是含1-7个碳原子的烷基)。
30.权利要求28或29的结合产品，其特征在于c＝0，并且R1通过羧酸酯、羧酸酰胺和/或氨基甲酸酯键直接结合于X。
31.权利要求28或29中任一项的结合产品，其特征在于d＝0，并且R2通过羧酸酯、羧酸酰胺和/或氨基甲酸酯键直接结合于A。
32权利要求28到31中任一项的结合产品，其特征在于R2和/或R1选自氨基酸残基和肽残基。
33.权利要求28到31中任一项的结合产品，其特征在于R2和/或R1选自蛋白质残基。
34.权利要求28到31中任一项的结合产品，其特征在于R2和/或R1基于选自以下的药物：减食欲剂、抗酸中毒剂、氨基酸或修饰的氨基酸、强壮剂/抗缺氧剂、镇痛药/抗风湿病药、驱虫剂、抗变态反应药、抗贫血药、抗心律失常药、抗生素/抗感染药、抗老年痴呆药、抗糖尿病药、解毒剂、止吐药/抗眩晕药、抗癫痫药、止血药、抗高血压药、抗低血糖药、抗低渗药、抗凝剂、抗真菌药、抗寄生虫药、抗炎剂、镇咳药/祛痰药、动脉硬化药、浴疗剂和热疗用药物、β阻断剂、钙通道阻断剂和肾素-血管紧张素系统抑制剂、毛细支气管扩张药/止喘药、利胆剂和胆道治疗剂、胆碱能药、皮质激素、皮肤用药、食疗药/营养治疗剂、诊断剂和诊断助剂、利尿剂、血流兴奋药、脱瘾药、酶抑制剂、酶制剂和转运蛋白、溶纤药、老年病用药、痛风治疗剂、流感治疗剂、妇科用药、抗痔疮药、肝用药、安眠药/镇静剂、垂体和下丘脑激素、调节肽及其抑制剂、免疫治疗剂和细胞因子、输注和标准注溶液、器官灌流液、心脏治疗药、龋齿和牙周病治疗剂和其它牙科制剂、冠状动脉用药、通便剂、脂质抑制剂、神经治疗剂、胃肠用药、偏头痛镇痛药、矿物质代谢制剂、肌肉松弛药、麻醉剂、甲状旁腺激素、钙代谢调节剂、骨质疏松症用药、神经病制剂和其它亲神经药物、神经递质或修饰的神经递质、眼科用药、耳科用药、抗帕金森病药和用于锥体外系病症的其它药物、精神治疗药、窦炎用药、强壮剂/补养药、甲状腺治疗剂、血清、免疫球蛋白和疫苗、性激素及其抑制剂、解痉药、血小板聚集抑制剂、抗肺结核药、免疫刺激药、泌尿科用药、血管治疗剂、维生素、伤口治疗剂、细胞生长抑制剂和转移抑制剂。
35.权利要求1到34中任一项的结合产品，其特征在于医药物质R3配位结合于结合产品(I)，其中R3优选为金属离子，更优选为铁、钾、镁、锌、钙、钆和/或铜。
36.用于制备前述权利要求中任一项的结合产品(I)的装置(10)，其包括由绝缘材料制成的可静电带电的支承板(1)。
37.权利要求36的装置(10)，其另外包括在支承板(1)的上方提供的移液和/或定量设备(4)，其与支承板(1)的距离可以任选地可变调节，并且其在支承板上方的位置可以任选地改变。
38.权利要求36和37中任一项的装置(10)，其特征在于所述支承板(1)是可旋转的。
39.权利要求36到38中任一项的装置(10)，其另外包括用于产生和测量支承板(1)的表面上的静电电荷的设备(2)，所述设备能够使可旋转的支承板(1)的顶侧和底侧静电带有不同的电荷。
40.权利要求38到39中任一项的装置(10)，其另外包括用于在支承板(1)的表面上产生和测量不同电荷的设备(3)，其中所述设备(3)包括以导电方式连接于所述可旋转支承板(1)的中心的阴极，和支承板(1)的表面圆周上的环形阳极，其中所述电极连接于发电机。
41.权利要求36到40中任一项的装置(10)，其另外包括至少一个用于透照支承板(1)的设备(6)以及用于测量通过支承板(1)的光的光探测器，和用于照射支承板(1)的表面的设备以及用于测量被支承板(1)反射的光的光探测器，和/或用于使支承板(1)的表面上形成的薄膜磁化和用于测量支承板(1)的表面上的磁场的设备。
42.权利要求36到41中任一项的装置(10)，其特征在于电极布置在支承板(1)内或其表面上，其适合于以可选择的极性和电荷图形使支承板(1)静电带电。
43.权利要求36到42中任一项的装置(10)，其特征在于电极(9)以可选择的距离布置在支承板(1)的中心的上方。
44.权利要求36或37的装置(10)，其特征在于借助阴极射线管使所述支承板(1)静电带电。
45.制备权利要求1到35中任一项的结合产品的方法，其特征在于：
其中：
(a)当所述结合是胺键时，该过程包括以下步骤：
-使多糖A与多糖X反应形成亚胺；和
-随后将亚胺还原为相应的胺；或
其中：
(b)当所述结合是酰胺键时，该过程包括以下步骤：
-将多糖X的醛基氧化；和
-随后使氧化产物与多糖A反应。
46.权利要求45的方法，其特征在于在上游步骤中，多糖X与大分子形成平行分子的聚结物，所述大分子优选为κ-角叉菜胶、糖蛋白或得自细胞膜的大分子，所述大分子不含使它们能够在随后工艺步骤的反应条件下与多糖X和/或多糖A反应形成共价键的官能团。
47.权利要求45到46中任一项的方法，其特征在于将多糖A溶解于选自稀的有机酸和无机酸的溶剂中，所述溶剂具有小于6.5、优选小于6.0、更优选小于5.5的pH。
48.权利要求45到47中任一项的方法，其特征在于所述多糖X溶解于pH大于6.5、更优选大于7.0、更优选大于7.5的含水溶液。
49.权利要求45到48中任一项的方法，其特征在于将选自盐样氢化物，优选LiAlH4、LiBH4、NaBH4和NaBH3CN的适合的还原剂用于还原。
50.权利要求45到49中任一项的方法，另外包括以下步骤：
用式(II)的残基取代X，
-Z1cR1   (II)，
和/或
用式(III)的残基取代A，
-Z2dR2  (III)，
其中
R1是药学活性分子残基，
R2是药学活性分子残基，和
R1和R2可相同或不同，和
其中
Z1是与R1和X二者共价结合的连接基，
Z2是与R2和A二者共价结合的连接基，
c＝1或0，
d＝1或0，和
其中
式(II)的残基与X的摩尔比是a，
式(III)的残基与A的摩尔比是b，
a是0-1000的整数，
b是0-1000的整数，和
a和b的至少一个不是零。
51.权利要求45到50中任一项的方法，其特征在于反应产物、起始材料、和中间物通过电泳和/或凝胶渗透色谱法彼此分离并且根据它们的电泳流动性和/或它们的流体力学体积进行纯化。
52.权利要求50到51中任一项的方法，其特征在于在用式(II)的残基取代X之后，在另外的步骤中将X和A彼此分离。
53.权利要求45到51中任一项的方法，其特征在于医药物质R3配位结合于结合产品(I)，其中R3优选为金属离子，更优选为铁、钾、镁、锌、钙、钆和/或铜。
54.权利要求45到53中任一项的方法，其使用权利要求36到44中任一项的装置，所述方法包括以下步骤：
- 向支承板(1)施加脱乙酰壳多糖或壳多糖A的溶液或悬浮液；
- 使支承板(1)静电带电以形成电场；
- 制备脱乙酰壳多糖或壳多糖薄膜；
- 通过使脱乙酰壳多糖或壳多糖薄膜与多糖X的溶液或悬浮液在大于6.8的pH条件下接触而使脱乙酰壳多糖或壳多糖A反应，形成希夫碱；
- 通过加入还原剂将希夫碱还原，得到结合产品(I)。
55.权利要求54的方法，其另外包括：
- 使结合产品(I)与R1反应并且任选地与Z1反应，和/或与R2反应并且任选地与Z2反应，以便得到被式(II)和/或(III)的残基取代的结合产品(I)；
- 任选地使至少被式(II)的残基取代的结合产品(I)反应以裂解A和X之间的胺键和/或酰胺键，以便至少得到被式(II)的残基取代的多糖X。
56.权利要求54或55的方法，其特征在于布置在可旋转支承板内或其上的电极以导电方式与存在于支承板(1)上的薄膜和/或试剂连接。
57.权利要求54或55的用于制备结合产品(I)的方法，其特征在于将涂有脱乙酰壳多糖薄膜的支承板(1)布置在至少一个阴极射线管的屏上，其中通过偏转板和/或偏转线圈适当调节阴极射线而在支承板(1)的表面上产生特定的图形。
58.权利要求57的方法，其特征在于所述支承板(1)被设计作为在阴极射线管的屏上的反应容器。
59.权利要求57和58的方法，其特征在于，通过偏转线圈使入射到支承板上的阴极射线选择性地偏转到检视窗上，其中阴极和支承板之间的距离可以小于或大于阴极和检视窗之间的距离。
60.权利要求57到59的方法，其特征在于阴极射线和用于控制和使其偏转的设备连接于计算机，所述计算机从电子显微镜或其它的成像设备获得信息。
61.药物组合物，包括权利要求1到35中任一项的结合产品。
62.权利要求1到35中任一项的结合产品用于制备疾病治疗用不溶性药物的用途。
63.权利要求1到35中任一项的结合产品作为生物相容性物质的用途，优选用于或用作植入物例如人造血管、血管植入物、人造心脏瓣膜、心脏二尖瓣、腱和韧带代用品、软骨代用品、用于在手术过程中封闭不希望的开口的贴片和伤口覆盖物；用于或用作手术助剂，例如手术工具、以短期方式体内使用的一次性制品、导管、导管通道、缝合材料、生物可降解的缝合材料、注射器、体外血液通道、血液袋或用于静脉内使用的溶液的袋、和袋的片材；或用于或用作医疗装置的组件，例如心肺机和透渗析机或过滤器、输注通道、蠕动泵和透析膜的部件。
64.权利要求1到35中任一项的结合产品的用途，用作隐形眼镜的材料；用作护发素、保湿霜或指甲油的美容添加剂；用于固定细胞和酶；用作亲和色谱法和蛋白分离的载体；用于受控治疗系统；用于选择性药物释放的系统；或用于体外组织培养技术。
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