CN101430332A

CN101430332A - 过氧化物酶抗体板式荧光酶免法及其应用

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Publication number: CN101430332A
Application number: CNA2008101538849A
Authority: CN
Inventors: 方佩华; 张艳丽; 许静; 李宁; 吕枚
Original assignee: Tianjin Medical University General Hospital
Current assignee: Tianjin Medical University General Hospital
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2008-12-09
Publication date: 2009-05-13

Abstract

本发明是一种过氧化物酶抗体板式荧光酶免法及其应用。其特征在于用人甲状腺过氧化物酶(hTPO)蛋白做抗原包被多孔板，用含1－5％BSA的PBST封闭；然后再以多孔板做载体依次加入抗hTPO第一抗体或标准品、酶标第二抗体、荧光底物和终止液，最后在荧光/化学发光分析仪上测定荧光强度。可用于临床鉴别自身免疫性和非自身免疫性甲状腺病，以及诊断慢性淋巴细胞性甲状腺炎。本发明以多孔位塑料板为固相载体的荧光酶免疫分析，板材来源容易、成本低、易推广；所建方法特异、灵敏、稳定，测定数值经国家标准校准，准确度良好，适合临床需要和推广。

Description

过氧化物酶抗体板式荧光酶免法及其应用

【技术领域】

本发明属于医学超微量检测技术领域，是以多孔板做载体制备固相抗原酶标板，用于定量检测人甲状腺过氧化物酶(hTPO)抗体荧光酶免法(FEIA)的建立及临床应用。

【背景技术】

自身免疫性甲状腺病(AITD)是一类多发病，主要包括桥本甲状腺炎(HT)、Graves病(GD)、产后甲状腺炎(PPTD)等。其发病受遗传背景、环境条件和免疫系统等多种因素的影响，表现为甲状腺功能异常，且伴有多种甲状腺自身抗体的生成，如甲状腺过氧化物酶抗体(hTPOAb)、促甲状腺素受体抗体(TRAb)、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)等。

hTPO及hTPOAb在AITD，特别是HT发病过程中起着重要作用。hTPO是一种含有血红素辅基的膜结合糖蛋白，位于甲状腺细胞顶缘的细胞膜上，在甲状腺激素生物合成过程中，催化甲状腺球蛋白中的酪氨酸残基的碘化反应及碘化酪氨酸残基的偶联，最终生成甲状腺激素，是甲状腺激素合成过程中不可缺少的酶。当甲状腺发生病变，滤泡细胞结构受到破坏时，hTPO则由甲状腺细胞顶部向外周血溢漏，导致甲状腺内浸润的B淋巴细胞产生针对甲状腺组织成分的抗体，其中包括hTPOAb，该抗体是一种抑制性自身免疫抗体，产生后可与hTPO结合并抑制hTPO的活性，使甲状腺激素合成受阻，进而激素合成量减少，导致甲状腺功能异常。患者血清中出现高水平的hTPOAb是早期诊断AITD特别是HT的一个特异性指标，也是评估AITD临床诊断、治疗及预后的重要依据。

我国hTPOAb的测定开始于20世纪80年代，但多停留在定性测定的水平，甲状腺微粒体抗体(TMAb)的放射免疫分析仍是目前国内较普遍的检测方法，但由于该法测定的是TMAb，并非是纯的hTPOAb，所以TMAb检测的特异性和敏感度均低于hTPOAb的检测。近十余年开始引进国外定量hTPOAb试剂盒应用于临床，现用的商品试剂盒有以表面多孔的塑料微颗粒为固相载体的荧光酶免疫分析或以聚苯烯塑料珠或固相磁颗粒为载体的化学发光免疫分析。而本发明是以多孔位塑料板为固相载体的荧光酶免疫分析，板材来源容易、成本低、易推广；所建方法特异、灵敏、稳定，测定数值经国家标准校准，准确度良好，适合临床需要和推广。

【发明内容】

本发明的目的在于将hTPO蛋白做抗原包被于酶标板上制备固相酶标板，以此建立板式固相定量检测hTPOAb FEIA的方法。

本发明为实现上述目的所采用的方案是设计一种过氧化物酶抗体板式荧光酶免法并应用于临床。过氧化物酶抗体板式荧光酶免法，其特征在于用人甲状腺过氧化物酶(hTPO)蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％ BSA的PBST封闭；然后再以多孔板做载体依次加入抗hTPO第一抗体或标准品、酶标第二抗体、荧光底物和终止液，最后在荧光/化学发光分析仪上测定荧光强度。

本发明过氧化物酶抗体板式荧光酶免法，用于临床鉴别自身免疫性和非自身免疫性甲状腺病，以及诊断慢性淋巴细胞性甲状腺炎。

本发明建立的定量检测抗hTPO FEIA的标准曲线是用本室自制的抗hTPO阳性血清做标准品，经中国药品生物制品检定所提供的国家hTPOAb标准品多次校准后确定的。自制的抗hTPO标准品浓度分别约为200、100、50、25、6、2IU/ml。

本发明的积极效果：

1、将hTPO蛋白做抗原包被在固相载体多孔板上，进而用此成功地建立了定量检测抗hTPO FEIA。

2、建立的板式固相定量检测抗hTPO FEIA是把酶联免疫分析ELISA与荧光检测技术结合起来，具有高度的敏感性和特异性，操作方便，可以同时进行大量标本的检测，并可在荧光分析仪上迅速读出结果。而且多孔位塑料板来源方便，价格低廉，易于临床推广应用。

3、建立的板式固相定量检测抗hTPO FEIA已用于临床检测自身免疫性甲状腺病，特别对慢性淋巴细胞性甲状腺炎具有重要的特异的诊断价值，对鉴别自身免疫性和非自身免疫性甲状腺病也有重要的临床意义。

【附图说明】

图1为抗hTPO标准品建立的标准曲线图；

图2为hTPO与hTPOAb和TGAb结合反应曲线图；

图3为平行实验曲线图；

图4为相关性检测曲线图；

图5为FEIA检测5种甲状腺病患者血清hTPOAb阳性率曲线图。

以下结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。

【具体实施方式】

本发明过氧化物酶抗体板式荧光酶免法用人甲状腺过氧化物酶(hTPO)蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％ BSA的PBST封闭；然后再以多孔板做载体依次加入抗hTPO第一抗体、酶标第二抗体、荧光底物和终止液，最后在荧光/化学发光分析仪上测定荧光强度。

所述多孔板抗原包被是：在多孔板上每孔加100ng-2μg/100μl hTPO，4℃过夜，然后漂洗，再用含1-5％BSA的PBST封闭液封闭，每孔加100μl，25-37℃温育1小时，再漂洗，完成。

所述多孔板是各种不同数量孔位的多孔塑料板。

所述加入抗hTPO第一抗体是：用稀释液1:50-1:200稀释的人血清标本或已知量标准物在多孔板上每孔加100μl，25-37℃温育1小时，漂洗。

所述加入酶标第二抗体是：在多孔板上每孔加1:5000-1:20000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG 100μl，25-37℃温育1小时，漂洗，而后再用蒸馏水漂洗。

所述加入荧光底物是：用0.01-0.05M pH7.8-10.0的Tris-HCL缓冲液1:2-1:15稀释的四甲基磷酸伞形酮(4-MUP)100μl，25-37℃温育1小时；最后，在多孔板上每孔加0.05-0.15M EDTA终止液50-100μl，25-37℃温育1-20分钟。

所述漂洗是用PBST 200-300μl漂洗1-3次。

本发明在具体实施中还可以有以下方式。

一、固相抗原酶标板的制备

1.包被抗原

将hTPO用包被缓冲液(0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH9.6，0.02％ NaN3)稀释至100ng/100μl-2μg/100μl，每孔加100μl，空白孔加包被缓冲液100μl，4℃过夜。

2.固相载体的选择

将HT病人血清进行1：100，1：400及1：800的稀释，每样均做6孔，在NUNC透明板条，Costar透明板条，Thermo黑色板条及国产透明板条中进行测定筛选。

结果见表1。

表1.同一hTPOAb阳性标本在不同固相载体上的测定结果(RFU)

结果表明，各种塑料板的板质在抗原固相化及精密度的基本条件上均可满足本实验的要求即均可使用，但相同稀释度的血清在国产透明酶标板上所达到的荧光强度最大，且变异系数可到2.8％，精密度较好，可以达到理想的测量结果，此外与其他板条比较，国产透明酶标板价格便宜，来源方便，故首选作本技术的固相载体。

二、板式固相定量检测hTPOAb FEIA的建立

(一)板式固相FEIA原理

该技术是将抗原包被在96孔聚苯乙烯板上，通过固相化的抗原吸附待测样品中的TPOAb(第一抗体)，洗去未反应的物质后，加入碱性磷酸酶标记的第二抗体与第一抗体进行结合反应，漂洗后，加入荧光底物4-甲基磷酸伞形酮(4-MUP)，4-MUP被碱性磷酸酶分解产生4-甲基伞形酮(4-MU)和磷酸，4-MU经过355nm激发光的激发后产生460nm的荧光，此荧光强度与标本中抗体的量呈正比，用Fluoroskan Ascent FL仪器测量得到相对荧光单位，根据标准曲线即可以计算出样品中TPOAb的浓度。

(二)最佳条件的探索

1.抗原包被量、一抗稀释度及荧光底物稀释度的选择

在酶标板上按交叉连续稀释法排列组合，抗原包被量为100ng/孔-2μg/孔不等分组包被；一抗稀释度为1-200倍稀释不等分组；荧光底物稀释度为1-15倍稀释不等分组。在不同条件下测定同一hTPOAb阳性血清和阴性血清的RFU及其比值。结果多种配比均能使RFU阳性质控血清/RFU阴性质控血清比值大于2.1倍以上。我们首选了抗原包被量为每孔1μg/100μl，一抗稀释度为1：100，荧光底物稀释度为1：10。

2.荧光底物、终止液反应时间的选择

将反应体系在37℃温箱中温育30min-120min不等分组，观察不同时间荧光发光强度的变化，分别测定其RFU值。与此同时，加入终止液0.05M EDTA后5min-60min不等，观察荧光强度的变化。我们首选加入荧光底物后37℃温育60min，再加终止液5min后在荧光/化学发光分析仪上测定结果。

(三)标准品的制备及标准曲线的建立

1.hTPOAb标准品的制备

经过筛选，选取抗hTPO阳性血清，分装、冷干，-30℃避光保存，做为本室制备的标准品备用。

2.标准曲线的建立

用国家hTPOAb标准品对本室制备的标准品进行6次校准后，确定本室自制的抗hTPO标准品浓度分别约为200、100、50、25、6、2IU/ml，以抗hTPO标准品浓度为横坐标，以其对应的荧光强度(RFU)为纵坐标，在半对数坐标纸上做图建立标准曲线。结果见图1所示。

(四)板式固相定量检测hTPOAb FEIA操作步骤

1.包被抗原：将hTPO用包被缓冲液(0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH9.6，0.02％　NaN3)稀释至1ug/100ul，每孔加100μl，空白孔加包被缓冲液100μl，4℃过夜。

2.漂洗：每孔用300μl PBST漂洗3次。

3.封闭：每孔加100μl封闭液(含3％　BSA的PBST)，37℃温育1小时。

4.漂洗：方法同2。

5.结合一抗：每孔加1:100稀释(稀释液为PBS)的待测血清100μl；标准曲线各孔分别加已知不同浓度的标准品100μl，37℃温育1小时。

6.漂洗：方法同2。

7.结合二抗：每孔加1：20000稀释(用含1％　BSA的PBST稀释)的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG 100μl，37℃温育1小时。

8.漂洗：方法同2再用蒸馏水漂洗3次。

9.加入荧光底物：每孔加1：10稀释(用0.1MTris-HCl缓冲液pH10.0稀释)的4-MUP 100μl，37℃温育1小时。

10.终止反应：每孔加0.05M EDTA终止液50μl，37℃温育5min后在荧光/化学发光分析仪上测定RFU值。

(五)方法学鉴定

1.特异性

包被hTPO抗原，分别将含高浓度甲状腺球蛋白抗体(TGAb)和hTPOAb的血清进行一系列稀释后作为一抗进行测定，观察其与抗原的交叉结合反应情况。

结果显示hTPO与hTPOAb特异性结合，hTPO与TGAb无交叉结合反应，结果见图3所示。

2.精密度

(1)批内变异：一次实验中分别测定同一阳性质控血清和阴性质控血清各6样，计算批内变异(CV％)分别为5.14％和19.36％。

(2)批间变异：同一阳性质控血清和阴性质控血清，两个月内连续测定6次，计算批间CV％值分别为6.72％、17.90％。

3.准确度

加入已知浓度的hTPOAb，浓度分别为100IU/ml，25IU/ml及3IU/ml，用本法检测，分别计算高、中、低浓度样品的回收率，平均回收率为98％。结果见表2。

表2 血清hTPOAb回收率的测定结果

4.健全性

将hTPOAb阳性血清分别进行两次对倍稀释，用测得的三个浓度值绘成一条稀释曲线，该曲线与标准曲线呈平行关系。如图3所示。

5.相关性

分别用本法和定量hTPOAb微粒酶联免疫分析商品试剂盒检测61例甲状腺病患者血清，对检测结果进行相关性分析。结果表明两种检测方法呈显著正相关(r＝0.80，P<0.01)。如图4所示(横坐标为本法检测hTPOAb的浓度，纵坐标为商品hTPOAb试剂盒检测hTPOAb的浓度)。

三、板式固相定量检测hTPOAb FEIA的初步临床应用(临床检测796例分析)

(一)人血清hTPOAb阳性切线值的确定

检测262例健康男性(年龄20-30岁)血清hTPOAb浓度，结果显示hTPOAb为正偏态分布(P<0.01)。因此，结果以百分位数表示，正常人群血清hTPOAb浓度中位数为3IU/ml，以浓度高于P95即5IU/ml为阳性切线值。

(二)各种甲状腺病患者血清hTPOAb的测定

1.病例来源

病例均来自天津医科大学总医院门诊患者，全部根据患者临床症状、体征和实验室检查等资料确诊。其中慢性淋巴细胞性甲状腺炎(HT)患者多数有甲减临床表现，甲状腺肿大质韧，血清甲状腺激素显示低功能状态，TMAb和TGAb强阳性，4例有病理证实；Graves’病(GD)初诊患者甲状腺弥漫性肿大，血清FT3、FT4水平高于正常，sTSH低于正常且未经治疗，GD复诊患者为经过治疗，绝大多数血清FT3、FT4已降至正常的GD确诊病人。

HT患者166例，(男22例，女144例，年龄13-71岁，平均43.3岁)；GD初诊68例，(男18例，女50例，年龄11-72岁，平均42.7岁)；GD复诊202例，(男70例，女132例，年龄14-75岁，平均45.6岁)；单纯性甲状腺肿43例，(男3例，女40例，年龄13-65岁，平均36.1岁)；腺瘤17例，(男2例，女15例，年龄27-60岁，平均40.2岁)；亚急性甲状腺炎38例，(男10例，女28例，年龄18-42岁，平均33.9岁)。

2.检测结果以中位数和四分位间距表示，率的比较用χ²检验。结果见表3。

表3 五种甲状腺病患者血清hTPOAb检测结果

注：^*表示HT与其他各组之间分别比较的χ²值，#表示HT与其他各组之间分别比较的P值。

检测结果表明：GD初诊和复诊两组之间的阳性率(32.35％ vs 31.68％)并无统计学差异(P>0.05)，所以将其合并进行分析，其阳性率为31.85％。

应用板式固相定量检测hTPOAb FEIA检测HT、GD、单纯性甲状腺肿、腺瘤和亚急性甲状腺炎5种患者血清，阳性检出率分别为89.76％、31.85％、0、11.76％和26.32％，其中HT的阳性检出率最高，HT与其他各组之间有显著性差异，P均<0.01。如图5所示。

板式固相定量检测hTPOAb FEIA应用于临床甲状腺病患者的血清学检查，结果显示HT患者有很高的阳性检出率，因此，该方法对HT具有重要的特异的诊断价值，对鉴别自身免疫性和非自身免疫性甲状腺病也有重要的临床意义。

Claims

1、一种过氧化物酶抗体板式荧光酶免法，其特征在于用人甲状腺过氧化物酶hTPO蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％ BSA的PBST封闭；然后再以多孔板做载体依次加入抗hTPO第一抗体或标准品、酶标第二抗体、荧光底物和终止液，最后在荧光/化学发光分析仪上测定荧光强度。

2、根据权利要求1所述的过氧化物酶抗体板式荧光酶免法，其特征在于所述多孔板抗原包被是：在多孔板上每孔加100ng-2μg/100μl hTPO，4℃过夜，然后漂洗，再用含1-5％ BSA的PBST封闭液封闭，每孔加100μl，25-37℃温育1小时，再漂洗，完成。

3、根据权利要求1所述的过氧化物酶抗体板式荧光酶免法，其特征在于所述多孔板是多孔塑料板。

4、根据权利要求1所述的过氧化物酶抗体板式荧光酶免法，其特征在于所述加入抗hTPO第一抗体是：用稀释液1:50-1:200稀释的人血清标本或已知量标准物在多孔板上每孔加100μl，25-37℃温育1小时，漂洗。

5、根据权利要求1所述的过氧化物酶抗体板式荧光酶免法，其特征在于所述加入酶标第二抗体是：在多孔板上每孔加1:5000-1:20000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG 100μl，25-37℃温育1小时，漂洗，而后再用蒸馏水漂洗。

6、根据权利要求1所述的过氧化物酶抗体板式荧光酶免法，其特征在于所述加入荧光底物是：用0.01-0.05M pH7.8-10.0的Tris-HCL缓冲液1:2-1:15稀释的四甲基磷酸伞形酮(4-MUP)100μl，25-37℃温育1小时；最后，在多孔板上每孔加0.05-0.15M EDTA终止液50-100μl，25-37℃温育1-20分钟。

7、根据权利要求2或4、5所述的过氧化物酶抗体板式荧光酶免法，其特征在于所述漂洗是用PBST 200-300μl漂洗1-3次。

8、权利要求1所述的过氧化物酶抗体板式荧光酶免法应用，其特征在于用于临床鉴别自身免疫性和非自身免疫性甲状腺病，诊断慢性淋巴细胞性甲状腺炎。