CN106257288A - 一种血清TPOAb IgG4水平检测方法 - Google Patents

一种血清TPOAb IgG4水平检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、包板：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将TPO稀释成2μg/ml，各孔加50μl包被酶标板；S2、封闭：采用PBS‑T溶解的3％BSA封闭酶标板；S3、血清的稀释与检测：待测血清用PBS‑T以1：50稀释，各孔加入50μl，每份血清复孔检测，每块酶标板均设立空白、阳性和阴性对照；S4、二抗：各孔加入50μl用以PBS‑T稀释的HRP标记的鼠抗人IgG4；S5、反应底物及终止反应：各孔加入50μl辣根酶的底物显色液，静置6～8分钟，显色后各孔加50μl的1mol/L盐酸终止反应，用酶标仪在490nm下测定各孔OD值；S6、数据处理：血清标本的OD值为抗原包被孔与相应的非抗原包被孔OD值的差值，该方法能有效的检测血清TPOAb IgG4的水平，方法实施简单，可靠性强。

Description

一种血清TPOAb IgG4水平检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种血清TPOAb IgG4水平的检测方法。
背景技术
甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)是桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)的标志性抗体，其能够通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)或补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)损伤甲状腺细胞,因此在HT的发病机制中发挥重要作用。TPOAb还能进一步干扰甲状腺过氧化物酶的催化作用，阻碍甲状腺激素的合成，进而导致甲状腺功能减退(简称甲减)。
TPOAb主要为IgG型抗体。人IgG根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键数目、位置的不同又可以分为四种亚型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG4在血清中的含量最低，在IgG总量中所占比例不足5％，平均浓度为0.35-0.51mg/mL。由于IgG4分子存在“半抗体转换”机制导致“双特异性”IgG4抗体形成，其不能与抗原形成免疫复合物，且IgG4与C1q及Fc受体的亲和力较低，不能进一步激活补体及介导免疫效应细胞的功能。基于上述特点，有学者认为IgG4是一种非致病性抗体。
近年有研究报道，HT患者依据免疫组化染色结果可分为IgG4阳性及阴性HT。同IgG4阴性HT相比，IgG4阳性HT患者年龄更小，病情进展更快，更容易出现甲减，组织病理上纤维化程度更重。此外，有报道发现IgG4阳性HT患者中甲状腺乳头状癌(papillarythyroid carcinoma，PTC)的发生率明显升高，且在IgG4阳性HT基础上发生的PTC预后更差。综上所述，将HT患者进一步分为IgG4阳性及阴性两种免疫表型具有重要的临床意义，但目前IgG4阳性HT的诊断仍依靠术后组织病理切片的免疫组化染色结果，而大部分HT患者并不需要手术治疗，因此临床实践中迫切需要寻找并确定能够早期诊断IgG4阳性HT的无创性血清学诊断指标。
在IGg4相关性疾病(IgG4-related diseases，IgG4-RD)的研究中，血清总IgG4浓度大于135mg/dL是其血清学诊断标准。且在部分IgG4-RD患者中，血清IgG4浓度的变化与疾病活动度相关。因此部分学者认为血清总IgG4可能可以作为无创性血清学方法应用于IgG4阳性HT。但本研究组在前期工作中发现，IgG4阳性HT组中血清IgG4水平与IgG4阴性HT组相比，差异无显著性，提示应用血清总IgG4水平并不能区分上述两种免疫表型。而IgG4阳性HT组患者术前血清TPOAb的IgG4水平均明显高于IgG4阴性组。因此检测TPOAb IgG4水平可能有助于鉴别这两种免疫表型，但目前国内外并无TPOAb IgG4的成熟检测方法。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，可以有效解决背景技术中的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，包括如下步骤：
S1、包板：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将TPO稀释成2μg/ml，各孔加50μl包被酶标板；非抗原包被孔加0.05mol/L碳酸盐缓冲液50μl，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次，拍干；
S2、封闭：采用PBS-T溶解的3％BSA封闭酶标板，各孔加250μl，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次后，拍干；
S3、血清的稀释与检测：待测血清用PBS-T以1：50稀释，各孔加入50μl，每份血清复孔检测，每块酶标板均设立空白、阳性和阴性对照，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次后，拍干；
S4、二抗：各孔加入50μl用以PBS-T稀释的HRP标记的鼠抗人IgG4为二抗，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次后，拍干；
S5、反应底物及终止反应：各孔加入50μl辣根酶的底物显色液，静置6～8分钟，显色后各孔加50μl的1mol/L盐酸终止反应，用酶标仪在490nm下测定各孔OD值；
S6、数据处理：血清标本的OD值为抗原包被孔与相应的非抗原包被孔OD值的差值。
根据上述技术方案，所述0.05mol/L碳酸盐缓冲液的配制如下：将1.08g的Na2CO3和2.95g的NaHCO3粉碎混合；再加蒸馏水定容至900ml，调pH值至9.6。
根据上述技术方案，所述0.1％PBS-T配制如下：将500ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液和0.5ml的Tween-20混合。
根据上述技术方案，所述0.01mol/L磷酸盐缓冲液的配制如下：将4.25g的NaCl、2.901g的Na2HPO4·12H2O和0.296g的NaH2PO4·2H2O加蒸馏水定容至500ml，调pH值至7.2
根据上述技术方案，所述底物显色液的配制方法为：在使用前5分钟内配制，将4mg的邻苯二胺、10ml的柠檬酸缓冲液和3％过氧化氢溶液混合。
根据上述技术方案，所述柠檬酸缓冲液的配制方法为：将1.05mg的柠檬酸和3.58g的Na2HPO4·12H2O加蒸馏水定容至150ml，调pH值至5.0。
根据上述技术方案，所述3％过氧化氢溶液的配制方法为：将2ml的30％H2O2加蒸馏水定容至20ml。
根据上述技术方案，所述1mol/L盐酸配制方法为：将43.1ml的浓盐酸加蒸馏水定容至500ml。
根据上述技术方案，所述3％BSA封闭液的配制方法为：将0.3g的BSA和10ml的0.01M PBS-T缓冲液混合。
本发明的有益效果：
本发明通过配制0.05mol/L碳酸盐缓冲液、0.1％PBS-T、底物显色液以及3％BSA封闭液等溶液，将血清TPOAb依次经过包板、封闭、血清的稀释与检测、二抗、反应底物及终止反应进行检测，该方法能有效的检测血清TPOAb IgG4的水平，方法实施简单，可靠性强。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例：
一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，包括如下步骤：
S1、包板：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将TPO稀释成2μg/ml，各孔加50μl包被酶标板；非抗原包被孔加0.05mol/L碳酸盐缓冲液50μl，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次，拍干；
S2、封闭：采用PBS-T溶解的3％BSA封闭酶标板，各孔加250μl，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次后，拍干；
S3、血清的稀释与检测：待测血清用PBS-T以1：50稀释，各孔加入50μl，每份血清复孔检测，每块酶标板均设立空白、阳性和阴性对照，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次后，拍干；
S4、二抗：各孔加入50μl用以PBS-T稀释的HRP标记的鼠抗人IgG4为二抗，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次后，拍干；
S5、反应底物及终止反应：各孔加入50μl辣根酶的底物显色液，静置6～8分钟，显色后各孔加50μl的1mol/L盐酸终止反应，用酶标仪在490nm下测定各孔OD值；
S6、数据处理：血清标本的OD值为抗原包被孔与相应的非抗原包被孔OD值的差值。
上述溶液的配制方法如下：
0.05mol/L碳酸盐缓冲液的配制如下：将1.08g的Na2CO3和2.95g的NaHCO3；再加蒸馏水定容至900ml，调pH值至9.6。
0.1％PBS-T配制如下：将500ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液和0.5ml的Tween-20混合。
0.01mol/L磷酸盐缓冲液的配制如下：将4.25g的NaCl、2.901g的Na2HPO4·12H2O和0.296g的NaH2PO4·2H2O加蒸馏水定容至500ml，调pH值至7.2
底物显色液的配制方法为：在使用前5分钟内配制，将4mg的邻苯二胺、10ml的柠檬酸缓冲液和3％过氧化氢溶液混合。
柠檬酸缓冲液的配制方法为：将1.05mg的柠檬酸和3.58g的Na2HPO4·12H2O加蒸馏水定容至150ml，调pH值至5.0。
3％过氧化氢溶液的配制方法为：将2ml的30％H2O2加蒸馏水定容至20ml。
1mol/L盐酸配制方法为：将43.1ml的浓盐酸加蒸馏水定容至500ml。
3％BSA封闭液的配制方法为：将0.3g的BSA和10ml的0.01M PBS-T缓冲液混合。
基于上述，本发明的优点在于，本发明通过配制0.05mol/L碳酸盐缓冲液、0.1％PBS-T、底物显色液以及3％BSA封闭液等溶液，将血清TPOAb依次经过包板、封闭、血清的稀释与检测、二抗、反应底物及终止反应进行检测，该方法能有效的检测血清TPOAb IgG4的水平，方法实施简单，可靠性强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、包板：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将TPO稀释成2μg/ml，各孔加50μl包被酶标板；非抗原包被孔加0.05mol/L碳酸盐缓冲液50μl，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次，拍干；
S2、封闭：采用PBS-T溶解的3％BSA封闭酶标板，各孔加250μl，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次后，拍干；
S3、血清的稀释与检测：待测血清用PBS-T以1：50稀释，各孔加入50μl，每份血清复孔检测，每块酶标板均设立空白、阳性和阴性对照，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次后，拍干；
S4、二抗：各孔加入50μl用以PBS-T稀释的HRP标记的鼠抗人IgG4为二抗，37℃孵育1小时，用PBS-T冲洗3次后，拍干；
S5、反应底物及终止反应：各孔加入50μl辣根酶的底物显色液，静置6～8分钟，显色后各孔加50μl的1mol/L盐酸终止反应，用酶标仪在490nm下测定各孔OD值；
S6、数据处理：血清标本的OD值为抗原包被孔与相应的非抗原包被孔OD值的差值。
2.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，所述0.05mol/L碳酸盐缓冲液的配制如下：将1.08g的Na2CO3和2.95g的NaHCO3粉碎混合；再加蒸馏水定容至900ml，调pH值至9.6。
3.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，所述0.1％PBS-T配制如下：将500ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液和0.5ml的Tween-20混合。
4.根据权利要求3所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，所述0.01mol/L磷酸盐缓冲液的配制如下：将4.25g的NaCl、2.901g的Na2HPO4·12H2O和0.296g的NaH2PO4·2H2O加蒸馏水定容至500ml，调pH值至7.2。
5.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，所述底物显色液的配制方法为：在使用前5分钟内配制，将4mg的邻苯二胺、10ml的柠檬酸缓冲液和3％过氧化氢溶液混合。
6.根据权利要求5所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，所述柠檬酸缓冲液的配制方法为：将1.05mg的柠檬酸和3.58g的Na2HPO4·12H2O加蒸馏水定容至150ml，调pH值至5.0。
7.根据权利要求5所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，所述3％过氧化氢溶液的配制方法为：将2ml的30％H2O2加蒸馏水定容至20ml。
8.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，所述1mol/L盐酸配制方法为：将43.1ml的浓盐酸加蒸馏水定容至500ml。
9.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法，其特征在于，所述3％BSA封闭液的配制方法为：将0.3g的BSA和10ml的0.01MPBS-T缓冲液混合。
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