CN101429239B - 一种抗动脉粥样硬化的表位组合物、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表位组合物、其制备方法及用途，尤其是一种抗动脉粥样硬化的表位组合物、其制备方法和用途，属于生物药学技术领域。本发明的表位组合物包括牛结核分枝杆菌热休克蛋白65中15个具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位。其有益效果是：通过组合多个mHSP65分子中具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位，使得到的表位组合物能够充分发挥类似全mHSP65分子的免疫功效；同时由于仅选择使用具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位而避免使用全分子，减少了对其他自身免疫疾病的影响，避免了潜在的副作用；避免了由全mHSP65分子自身的蛋白酶活性带来的降解问题，使工艺更加稳定和可行。
Description
技术领域
本发明涉及一种表位组合物、其制备方法及用途，尤其是一种抗动脉粥样硬化的表位组合物、其制备方法和用途，属于生物药学技术领域。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis)是一种严重危害人类健康的常见疾病，近年来在我国的发病率呈现逐年增加的趋势。目前动脉粥样硬化已不再被简单地认定为是大中型动脉壁脂质沉积的结果，而是一种由脂质代谢异常、血液凝固失调以及与遗传、环境、微生物感染等因素有关的血管慢性炎症共同造成的疾病过程。在人类动脉粥样硬化各阶段的病变中都观察到淋巴细胞、炎症因子的参与，随着其相关自身抗原的鉴定，动脉粥样硬化已被归属为自身免疫性疾病范畴。
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)65/60是动脉粥样硬化的主要自身免疫抗原之一，在临床患者和实验模型动物的体内都可以检测到抗HSP65/60的抗体。HSP65/60属于热休克蛋白60家族，是一类高度保守的蛋白分子，微生物源的HSP65和哺乳动物源的HSP60在蛋白序列上的同源性可达50-60％，菌源HSP65分子之间更可高达90％。正是由于这种高度的保守性使得两者之间存在明显的交叉反应，当某些微生物感染机体时，针对微生物HSP65的免疫应答可能因为该交叉反应而错误识别机体血管内皮组织表达的HSP60，对自身组织加以攻击，从而启动或加速了动脉粥样硬化的过程。
黏膜给予自身抗原诱发免疫耐受是预防自身免疫性疾病的有效途径。已有研究证实，黏膜给予牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovine)热休克蛋白65(mHSP65)分子可以减轻低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠的动脉粥样硬化程度，但是应用mHSP65全分子作为预防动脉粥样硬化的疫苗存在一些缺点和顾虑：首先，mHSP65不仅仅是动脉粥样硬化的自身抗原，它同时还是多种其他的自身免疫疾病的自身抗原，例如：I型糖尿病、白塞氏病、实验性脑脊髓炎等等。mHSP65分子中的不同表位可能和不同的自身免疫疾病相关。由于不同自身免疫疾病的发病机理不一，且自身抗原在不同免疫条件下对疾病产生的效果也可能截然不同，因此在利用mHSP65全分子免疫预防动脉粥样硬化的同时有可能对其他自身免疫疾病产生不利影响，需要大量的实验来评估其安全性；其次，mHSP65分子具有蛋白酶的催化活性，在制备过程中很容易被自身蛋白酶活性所分解，其制备条件要求较高，不容易建立稳定简便的生产工艺。
发明内容
本发明的目的是：针对现有技术的缺陷，提出一种抗动脉粥样硬化的表位组合物，替代完整mHSP65分子起到预防动脉粥样硬化的作用。
本发明的另一个目的是提供制备抗动脉粥样硬化的表位组合物的方法。
本发明的再一个目的是提供抗动脉粥样硬化的表位组合物在制备抗动脉粥样硬化的药物中的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种抗动脉粥样硬化的表位组合物，包括牛结核分枝杆菌热休克蛋白65中15个具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位，所述表位的氨基酸序列如下：
(1)Ala-Gly-Val-Ala-Asp-Pro-Val-Lys-Val-Thr-Arg-Ser-Ala-Leu-Gln-Asn-Ala-Ala-Ser-Ile-Ala-Gly-Leu-Phe-Leu；
(2)Leu-Glu-Asp-Pro-Tyr-Glu-Lys-Ile-Gly-Ala-Glu-Leu-Val；
(3)Ala-Thr-Val-Leu-Ala-Gln-Ala-Leu-Val-Arg-Glu-Gly-Leu；
(4)Glu-Ala-Thr-Gly-Ala-Asn-Ile-Val-Lys-Val-Ala-Leu-Glu-Ala-Pro-Leu-Lys-Gln；
(5)Ile-Ala-Glu-Ala-Met-Asp-Lys-Val-Gly-Asn-Glu-Gly-Val-Ile-Thr-Val-Glu-Glu；
(6)Asp-Pro-Tyr-Ile-Leu-Leu-Val-Ser-Ser-Lys-Val-Ser-Thr-Val-Lys-Asp；
(7)Glu-Gly-Glu-Ala-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Val-Asn-Lys-Ile-Arg-Gly-Thr；
(8)Val-Ala-Gly-Gly-Gly-Val-Thr-Leu-Leu-Gln-Ala-Ala-Pro-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Lys-Leu-Glu-Gly-Asp；
(9)Ala-Thr-Val-Leu-Ala-Gln-Ala-Leu-Val-Arg-Glu-Gly-Leu-Arg-Asn；
(10)Val-Ala-Ala-Gly-Ala-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Lys-Arg-Gly-Ile-Glu-Lys-Ala-Val-Glu-Lys；
(11)Leu-Ser-Leu-Leu-Gly-Lys-Ala-Arg-Lys-Val-Val-Val-Thr-Lys-Asp；
(12)Asn-Thr-Phe-Gly-Leu-Gln-Leu-Glu-Leu-Thr-Glu-Gly；
(13)Gly-Pro-Lys-Gly-Arg-Asn-Val-Val-Leu-Glu-Lys-Lys-Trp-Gly-Ala-Pro；
(14)Val-Ala-Gly-Gly-Gly-Val-Thr-Leu-Leu-Gln-Ala-Ala-Pro-Thr；
(15)Ala-Pro-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Lys-Leu-Glu-Gly-Asp；其中，所述表位组合物含有氨基酸序列为(1)～(15)中的至少1个表位。
本发明中抗动脉粥样硬化的表位组合物的制备方法由以下技术方案实现：
(a)提取表位步骤：将mHSP65中具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的1～15个表位分成I～V组，每组中表位的总氨基酸个数≤75个；
(b)构建重组质粒步骤：将霍乱霉素B亚基(CTB)的DNA序列插入pET28a质粒中，得到重组质粒pET28a-CTB，再分别将每组各个表位的DNA序列串联插入重组质粒pET28a-CTB中CTB的DNA序列下游，得到表达各融合蛋白的I～V个重组质粒；
(c)以包涵体形式表达融合蛋白步骤：在37℃下培养含有表达融合蛋白的重组质粒的重组基因工程菌，用终浓度为3～15mmol/L的α-乳糖诱导表达融合蛋白；
(d)分离纯化融合蛋白步骤：将所述重组基因工程菌的菌体裂解后离心收集含有融合蛋白的包涵体沉淀、用包涵体洗涤液和0.5-2mol/L尿素溶液洗去部分杂质、再用6-8mol/L尿素溶液变性溶解包涵体、透析复性后经离子交换柱层析纯化，得到纯化后的I～V种融合蛋白；
(e)制备表位组合物步骤：将纯化后的I～V种融合蛋白按摩尔比1∶1混合后，用6-8mol/L尿素溶液进行变性处理，再经透析复性后冻干，得到抗动脉粥样硬化的表位组合物。
本发明的抗动脉粥样硬化的表位组合物在制备抗动脉粥样硬化的药物中的用途，是采用黏膜方式给药，诱使机体重新建立对这些表位的免疫耐受，从而抑制了可能发生的自身免疫攻击，最终预防动脉粥样硬化或减轻动脉粥样硬化的病变程度。
本发明的有益效果是：通过组合多个mHSP65分子中具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位，使得到的表位组合物能够充分发挥类似全mHSP65分子的免疫功效；同时由于仅选择使用具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位而避免使用全分子，减少了对其他自身免疫疾病的影响，避免了潜在的副作用；避免了由全mHSP65分子自身的蛋白酶活性带来的降解问题，使工艺更加稳定和可行。
附图说明
图1为本发明中表位组合物的设计原理示意图。
图2为质粒pET28a-CTB-123结构图。
图3为质粒pET28a-CTB-456结构图。
图4为SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白CTB-123、CTB-456的表达。图中：1.标准分子量蛋白；2.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；3.载荷pET28a-CTB-123质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；4.载荷pET28a-CTB-456质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)。
图5为SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白CTB-123、CTB-456的分离纯化和混合复性结果。图中：1.载荷pET28a-CTB-123质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；2.载荷pET28a-CTB-456质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；3.纯化后的融合蛋白CTB-123(非变性条件上样)；4.纯化后的融合蛋白CTB-456(非变性条件上样)；5.混合复性后得到的含(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)共6个表位的表位组合物(非变性条件上样)。
图6为表位组合物的抗动脉粥样硬化疗效示意图，图中纵坐标为斑块面积百分比(％)，1.正常对照组；2.PBS对照组；3.卵清蛋白组；4.表位组合物组。
图7为家兔主动脉动脉粥样硬化斑块染色图，图中，条状含阴影部分为血管，血管中阴影部分为动脉粥样硬化斑块，其余为正常血管壁，a.PBS对照组；b.表位组合物组。
图8为SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白CTB-123的表达。图中：1.标准分子量蛋白；2.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；3.载荷pET28a-CTB-123质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)。
图9为SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白CTB-123复性和纯化结果。图中：1.载荷pET28a-CTB-123质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；2.复性纯化后的融合蛋白CTB-123(非变性条件上样)，即含(1)、(2)、(3)共3个表位的表位组合物。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案进一步说明
实施例一
如图1所示，本发明的原理是：根据霍乱毒素B亚基(CTB)通常以五聚体形式存在，在变性条件下解聚成单体，复性时又可重新聚集的特性，将其作为帮助组合多个表位的载体分子使用。将选定的表位分成1-5组，串联融合于CTB的C端，形成新的融合蛋白，分离纯化后利用CTB的自我聚合能力，将融合蛋白混合复性得到表位组合物。此外霍乱毒素B亚基多分子的聚集也可以有效地增强所呈现表位的免疫刺激能力，表位组合物经黏膜给药可以通过CTB定向结合到黏膜表面的神经节苷脂(GM1)受体上，利于表位组合物功能的发挥。用健康人和动脉粥样硬化病人血清进行的表位扫描研究表明，mHSP65分子中至少有15个具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位，利用这些表位设计表位组合物，通过诱导免疫耐受，抑制动脉粥样硬化的发生与发展。
材料
(1)宿主菌和质粒：
宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工具菌种，质粒pET28a为基因工程常用克隆载体，在与基因工程研究有关的实验室都有保存。
(2)酶和试剂：
分子克隆工具酶购自MBI公司；PCR纯化试剂盒为Promega公司产品。
(3)培养基：
LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989。该书是基因工程技术领域的经典著作，在高校图书馆均有收藏。
(4)DEAE52纤维素为Whatman公司产品。
方法
基因组DNA提取、质粒提取、聚合酶链反应(PCR)、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌：在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A LaboratoryManual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
(a)提取表位：
选择15个mHSP65中具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位，其氨基酸序列如下：
(1)Ala-Gly-Val-Ala-Asp-Pro-Val-Lys-Val-Thr-Arg-Ser-Ala-Leu-Gln-Asn-Ala-Ala-Ser-Ile-Ala-Gly-Leu-Phe-Leu；
(2)Leu-Glu-Asp-Pro-Tyr-Glu-Lys-Ile-Gly-Ala-Glu-Leu-Val；
(3)Ala-Thr-Val-Leu-Ala-Gln-Ala-Leu-Val-Arg-Glu-Gly-Leu；
(4)Glu-Ala-Thr-Gly-Ala-Asn-Ile-Val-Lys-Val-Ala-Leu-Glu-Ala-Pro-Leu-Lys-Gln；
(5)Ile-Ala-Glu-Ala-Met-Asp-Lys-Val-Gly-Asn-Glu-Gly-Val-Ile-Thr-Val-Glu-Glu；
(6)Asp-Pro-Tyr-Ile-Leu-Leu-Val-Ser-Ser-Lys-Val-Ser-Thr-Val-Lys-Asp；
(7)Glu-Gly-Glu-Ala-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Val-Asn-Lys-Ile-Arg-Gly-Thr；
(8)Val-Ala-Gly-Gly-Gly-Val-Thr-Leu-Leu-Gln-Ala-Ala-Pro-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Lys-Leu-Glu-Gly-Asp；
(9)Ala-Thr-Val-Leu-Ala-Gln-Ala-Leu-Val-Arg-Glu-Gly-Leu-Arg-Asn；
(10)Val-Ala-Ala-Gly-Ala-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Lys-Arg-Gly-Ile-Glu-Lys-Ala-Val-Glu-Lys；
(11)Leu-Ser-Leu-Leu-Gly-Lys-Ala-Arg-Lys-Val-Val-Val-Thr-Lys-Asp；
(12)Asn-Thr-Phe-Gly-Leu-Gln-Leu-Glu-Leu-Thr-Glu-Gly；
(13)Gly-Pro-Lys-Gly-Arg-Asn-Val-Val-Leu-Glu-Lys-Lys-Trp-Gly-Ala-Pro；
(14)Val-Ala-Gly-Gly-Gly-Val-Thr-Leu-Leu-Gln-Ala-Ala-Pro-Thr；
(15)Ala-Pro-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Lys-Leu-Glu-Gly-Asp，
从中选定(1)～(6)共6个表位来进行表位组合物的研究。将以上6个表位按顺序分组，(1)～(3)一组，(4)～(6)一组，每组中表位的总氨基酸个数≤75个。
(b)构建重组质粒：
首先构建pET28a-CTB重组质粒，借助于计算机软件设计两条引物P1和P2，两条引物核苷酸序列如下：
P1：5’GGGTCATGACACCTCAAAATATTACTG 3’
P2：5’AAAGCTAGCATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGC 3’
引物P1中引入NcoI的同尾酶PagI酶切位点，引物P2中引入NheI酶切位点。引物由上海英俊公司合成。
用实验室已有pET28a-CTB-P277质粒为模板，以P1和P2为上下游引物PCR扩增获得CTB基因片段。将扩增纯化后的CTB基因片段用PagI和NheI消化，消化后产物与用NcoI和NheI消化后的pET28a质粒片断连接得到pET28a-CTB质粒。连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，筛选含有pET28a-CTB质粒的基因工程菌，称为pET28a-CTB重组基因工程菌。该工程菌的构建是进一步构建pET28a-CTB-123和pET28a-CTB-456重组基因工程菌的重要中间步骤。
其次构建pET28a-CTB-123重组质粒，根据大肠杆菌的密码子偏爱性，借助于计算机软件设计如下六条引物：
P1-1：5’ATAGCTAGCGCCGGCGTTGCTGACCCGGTCAAGG 3’
P1-2：5’CTGAAGCTTAATCCTCCAGCAGGAACAGCCCCGCGATGGA 3’
P2-1：5’CGCCGATCTTCTCGTACGGATCCTCCAGCAGGAACAGCCC 3’
P2-2：5’GACAAGCTTAGACCAGCTCGGCGCCGATCTTCTCGTACGG 3’
P3-1：5’GAACCAACGCCTGGGCCAGCACGGTGGCGACCAGCTCGGCGCCGATCTTC 3’
P3-2：5’GACAAGCTTACAGGCCCTCGCGAACCAACGCCTGGGCCAG 3’
其中引物P1-1中引入NheI酶切位点，引物P3-2中引入HindIII酶切位点。引物由上海英俊公司合成。
以实验室已有的含有mHSP65基因的pET28a-HSP65质粒为模版，用P1-1和P1-2为上下游引物PCR扩增获得表位(1)的基因片段；以纯化后的表位(1)基因为模版，依次以P1-1和P2-1为一对引物，以P1-1和P2-2另为一对引物进行两次加端PCR，得到表位(1)、(2)串联的基因片断；以纯化后的表位(1)、(2)串联基因为模版，依次以P1-1和P3-1为一对引物，以P1-1和P3-2另为一对引物进行两次加端PCR，得到表位(1)、(2)、(3)串联的基因片断。该基因片断用NheI和HindIII消化，消化后产物与用NheI和HindIII消化后的pET28a-CTB质粒片断连接得到pET28a-CTB-123质粒。连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，筛选含有pET28a-CTB-123质粒的基因工程菌，称为pET28a-CTB-123重组基因工程菌，其结构示意图见图2。
CTB-123融合蛋白氨基酸序列为：
Met-Thr-Pro-Gln-Asn-Ile-Thr-Asp-Leu-Cys-Ala-Glu-Tyr-His-Asn-Thr-Gln-Ile-Tyr-Thr-Leu-Asn-Asp-Lys-Ile-Phe-Ser-Tyr-Thr-Glu-Ser-Leu-Ala-Gly-Lys-Arg-Glu-Met-Ala-Ile-Ile-Thr-Phe-Lys-Asn-Gly-Ala-Ile-Phe-Gln-Val-Glu-Val-Pro-Gly-Ser-Gln-His-Ile-Asp-Ser-Gln-Lys-Lys-Ala-Ile-Glu-Arg-Met-Lys-Asp-Thr-Leu-Arg-Ile-Ala-Tyr-Leu-Thr-Glu-Ala-Lys-Val-Glu-Lys-Leu-Cys-Val-Trp-Asn-Asn-Lys-Thr-Pro-His-Ala-Ile-Ala-Ala-Ile-Ser-Met-Ala-Asn-Ala-Ser-Ala-Gly-Val-Ala-Asp-Pro-Val-Lys-Val-Thr-Arg-Ser-Ala-Leu-Gln-Asn-Ala-Ala-Ser-Ile-Ala-Gly-Leu-Phe-Leu-Leu-Glu-Asp-Pro-Tyr-Glu-Lys-Ile-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Ala-Thr-Val-Leu-Ala-Gln-Ala-Leu-Val-Arg-Glu-Gly-Leu。
再构建pET28a-CTB-456重组质粒，根据大肠杆菌的密码子偏爱性，借助于计算机软件设计如下六条引物：
P4-1：5’ATAGCTAGCGAGGCGACCGGC 3’
P4-2：5’TATCCTAGGCTGCTTCAGCGG 3’
P5-1：5’ATAGCTAGCATCGCCGAGGCGATGG 3’
P5-2：5’CGCAAGCTTACTCCTCGACGGTGAT 3’
P6-1：5’GCTGACCAGCAGGATGTAGGGGTCCTCCTCGACGGTGATG 3’
P6-2：5’CGCAAGCTTTAATCCTTGACAGTGGACACCTTGGAGCTGACC 3’
其中，引物P5-1中引入NheI酶切位点，P5-2中引入HindIII酶切位点，P4-1中引入NheI酶切位点，P4-2中引入NheI的同尾酶BlnI酶切位点，引物P6-2中引入HindIII酶切位点。引物由上海英俊公司合成。
以pET28a-HSP65质粒为模版，用P5-1和P5-2为上下游引物PCR扩增获得表位(5)的基因片段，NheI和HindIII消化后插入同样用NheI和HindIII消化后的pET28a-CTB质粒片断连接得到pET28a-CTB-5质粒；再以pET28a-HSP65质粒为模版，用P4-1和P4-2为上下游引物PCR扩增获得表位(4)的基因片段，用NheI和BlnI消化后插入同样用NheI单酶消化后的pET28a-CTB-5质粒片断连接得到pET28a-CTB-45质粒；最后以含有表位(4)、(5)串联基因的pET28a-CTB-45质粒为模版，依次以P4-1和P6-1为一对引物，以P4-1和P6-2另为一对引物进行两次加端PCR，得到表位(4)、(5)、(6)串联的基因片断。该基因片断用NheI和HindIII消化，消化后产物与用NheI和HindIII消化后的pET28a-CTB质粒片断连接得到pET28a-CTB-456质粒。连接产物转化大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)，筛选含有pET28a-CTB-456质粒的基因工程菌，称为pET28a-CTB-456重组基因工程菌，其结构示意图见图3。
CTB-456融合蛋白的氨基酸序列为：
Met-Thr-Pro-Gln-Asn-Ile-Thr-Asp-Leu-Cys-Ala-Glu-Tyr-His-Asn-Thr-Gln-Ile-Tyr-Thr-Leu-Asn-Asp-Lys-Ile-Phe-Ser-Tyr-Thr-Glu-Ser-Leu-Ala-Gly-Lys-Arg-Glu-Met-Ala-Ile-Ile-Thr-Phe-Lys-Asn-Gly-Ala-Ile-Phe-Gln-Val-Glu-Val-Pro-Gly-Ser-Gln-His-Ile-Asp-Ser-Gln-Lys-Lys-Ala-Ile-Glu-Arg-Met-Lys-Asp-Thr-Leu-Arg-Ile-Ala-Tyr-Leu-Thr-Glu-Ala-Lys-Val-Glu-Lys-Leu-Cys-Val-Trp-Asn-Asn-Lys-Thr-Pro-His-Ala-Ile-Ala-Ala-Ile-Ser-Met-Ala-Asn-Ala-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Ala-Asn-Ile-Val-Lys-Val-Ala-Leu-Glu-Ala-Pro-Leu-Lys-Gln-Ile-Ala-Glu-Ala-Met-Asp-Lys-Val-Gly-Asn-Glu-Gly-Val-Ile-Thr-Val-Glu-Glu-Asp-Pro-Tyr-Ile-Leu-Leu-Val-Ser-Ser-Lys-Val-Ser-Thr-Val-Lys-Asp。
(c)以包涵体形式表达融合蛋白CTB-123和CTB-456：
接种含pET28a-CTB-123的重组基因工程菌到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养过夜，按2％比例转接入新鲜LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃培养4小时后，加入终浓度为5mmol/L的α-乳糖诱导表达融合蛋白CTB-123。诱导后6小时取少量菌液，离心回收菌体，SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了CTB-123多肽基因的融合表达，融合蛋白占细菌总蛋白的50％以上。
融合蛋白CTB-456的表达条件同上，SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白占细菌总蛋白的50％以上。以上结果见图4。
(d)分离纯化融合蛋白CTB-123和CTB-456：
诱导表达6小时后离心收集pET28a-CTB-123重组基因工程菌菌体，将菌体悬浮在菌体裂解液(0.5％ Triton X-100乳化剂，0.02％溶菌酶，50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.0)中，37℃搅拌过夜。离心收集沉淀，依次用包涵体洗涤液I(0.2％TrionX-100乳化剂，50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.0)、低浓度尿素溶液(2mol/L尿素，0.2％TrionX-100乳化剂，50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.0)多次洗涤沉淀，以除去包涵体中的部分杂蛋白。最后的沉淀用高浓度尿素溶液(8mol/L尿素，50mmmo/L Tris-Cl缓冲液，pH8.0)裂解，离心回收上清，装入透析袋中透析复性。最初透析外液为4mol/L尿素、50mmol/LTris-Cl缓冲液、pH8.0，每隔24小时更换一次外液，并将外液的尿素浓度依次降低为2mol/L、1mol/L、0.5mol/L至0mol/L。复性后的蛋白溶液上Cellulose-DEAE 52离子交换柱纯化。用50mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH8.0)平衡柱子，用0～300mol/L NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白CTB-123的洗脱峰，于非变性条件制样(即不煮沸)，经SDS-PAGE电泳检测已达到电泳纯，与菌体中未复性的CTB-123单体比较条带上移，表明复性成功。
重组蛋白CTB-456的分离纯化同上，此处不再赘述。收集含目的蛋白CTB-456的洗脱峰，于非变性条件制样，经SDS-PAGE电泳检测已达到电泳纯，与菌体中未复性的CTB-456单体比较条带上移，表明复性成功。以上结果见图5。
(e)制备表位组合物：
将融合蛋白CTB-123和CTB-456混合复性制备表位组合物：用考马斯亮蓝法对融合蛋白CTB-123和CTB-456进行蛋白定量，将两种蛋白溶液按蛋白摩尔数1∶1混合，加入尿素至终浓度为8mol/L使其再次变性，装入透析袋中按(d)中所述方法透析复性制备表位组合物。透析后冻干，-20℃保存。取适量复性得到的表位组合物，于非变性条件制样，经SDS-PAGE电泳检测与菌体中未复性的单体比较条带上移，且基本不存在未复性的单体，表明融合蛋白已混合复性成五聚体，即成功形成了表位组合物。结果见图5。
对以上表位组合物进行药效学研究：
选用体重为1.5-2.0kg的雄性新西兰大白兔，随机分成四组，每组八只，分别为：正常对照组；PBS对照组；卵清蛋白对照组和表位组合物组。正常对照组饲喂普通家兔饲料，不进行任何免疫；其余各组饲喂含高胆固醇的饲料，配方为0.5％胆固醇，5％猪油，94.5％基础兔饲料，控制每只兔每天的胆固醇摄入量为0.5g。高脂饲料饲喂两周后开始给药。采用小剂量低浓度多次黏膜给药的免疫方式，每只家兔每隔一天黏膜给药200μL药液(1mg/mL)或等体积磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)，共给药10次。各组药物均以灭菌PBS溶解。实验共进行4个月，于第17周时处死动物，从主动脉出心脏处至髂动脉分岔处剥取主动脉，剔除血管背面的脂肪组织，沿背侧纵向剪开，10％福尔马林固定4天后，以0.2％Sudan III乙醇溶液染色30min，70％乙醇洗脱背景着色后扫描血管内表面，使用南航病理分析系统软件测定动脉粥样硬化斑块占血管内皮总面积的百分比，结果见图6。PBS对照组和表位组合物组动物的主动脉斑块染色情况如图7所示，从主动脉弓起始取主动脉进行染色，PBS对照组动物发生严重的动脉粥样硬化，而表位组合物组动物仅仅在部分动物的主动脉弓处有轻微的斑块生成，表位组合物滴鼻对动脉粥样硬化斑块的抑制率大于70％(p＜0.001)。
实施例二
在材料及条件与实施例一相同的情况下制备3个表位组成的表位组合物
1.制备3个表位组成的表位组合物
(a)提取表位：
与实施例一相同，从mHSP65中具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位中选取(1)～(3)共3个表位来进行表位组合物的研究，该组中表位的总氨基酸个数≤75个。
(b)构建重组质粒：
首先构建pET28a-CTB重组质粒，借助于计算机软件设计两条引物P1和P2，两条引物核苷酸序列如下：
P1：5’GGGTCATGACACCTCAAAATATTACTG 3’
P2：5’AAAGCTAGCATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGC 3’
引物P1中引入NcoI的同尾酶PagI酶切位点，引物P2中引入NheI酶切位点。引物由上海英俊公司合成。
用实验室已有pET28a-CTB-P277质粒为模板，以P1和P2为上下游引物PCR扩增获得CTB基因片段。将扩增纯化后的CTB基因片段用PagI和NheI消化，消化后产物与用NcoI和NheI消化后的pET28a质粒片断连接得到pET28a-CTB质粒。连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，筛选含有pET28a-CTB质粒的基因工程菌，称为pET28a-CTB重组基因工程菌。该工程菌的构建是进一步构建pET28a-CTB-123和pET28a-CTB-456重组基因工程菌的重要中间步骤。
其次构建pET28a-CTB-123重组质粒，根据大肠杆菌的密码子偏爱性，借助于计算机软件设计如下六条引物：
P1-1：5’ATAGCTAGCGCCGGCGTTGCTGACCCGGTCAAGG 3’
P1-2：5’CTGAAGCTTAATCCTCCAGCAGGAACAGCCCCGCGATGGA 3’
P2-1：5’CGCCGATCTTCTCGTACGGATCCTCCAGCAGGAACAGCCC 3’
P2-2：5’GACAAGCTTAGACCAGCTCGGCGCCGATCTTCTCGTACGG 3’
P3-1：5’GAACCAACGCCTGGGCCAGCACGGTGGCGACCAGCTCGGCGCCGATCTTC3’
P3-2：5’GACAAGCTTACAGGCCCTCGCGAACCAACGCCTGGGCCAG 3’
其中引物P1-1中引入NheI酶切位点，引物P3-2中引入HindIII酶切位点。引物由上海英俊公司合成。
以实验室已有的含有mHSP65基因的pET28a-HSP65质粒为模版，用P1-1和P1-2为上下游引物PCR扩增获得表位(1)的基因片段；以纯化后的表位(1)基因为模版，依次以P1-1和P2-1为一对引物，以P1-1和P2-2另为一对引物进行两次加端PCR，得到表位(1)、(2)串联的基因片断；以纯化后的表位(1)、(2)串联基因为模版，依次以P1-1和P3-1为一对引物，以P1-1和P3-2另为一对引物进行两次加端PCR，得到表位(1)、(2)、(3)串联的基因片断。该基因片断用NheI和HindIII消化，消化后产物与用NheI和HindIII消化后的pET28a-CTB质粒片断连接得到pET28a-CTB-123质粒。连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，筛选含有pET28a-CTB-123质粒的基因工程菌，称为pET28a-CTB-123重组基因工程菌，其结构示意图见图2。
CTB-123融合蛋白氨基酸序列为：
Met-Thr-Pro-Gln-Asn-Ile-Thr-Asp-Leu-Cys-Ala-Glu-Tyr-His-Asn-Thr-Gln-Ile-Tyr-Thr-Leu-Asn-Asp-Lys-Ile-Phe-Ser-Tyr-Thr-Glu-Ser-Leu-Ala-Gly-Lys-Arg-Glu-Met-Ala-Ile-Ile-Thr-Phe-Lys-Asn-Gly-Ala-Ile-Phe-Gln-Val-Glu-Val-Pro-Gly-Ser-Gln-His-Ile-Asp-Ser-Gln-Lys-Lys-Ala-Ile-Glu-Arg-Met-Lys-Asp-Thr-Leu-Arg-Ile-Ala-Tyr-Leu-Thr-Glu-Ala-Lys-Val-Glu-Lys-Leu-Cys-Val-Trp-Asn-Asn-Lys-Thr-Pro-His-Ala-Ile-Ala-Ala-Ile-Ser-Met-Ala-Asn-Ala-Ser-Ala-Gly-Val-Ala-Asp-Pro-Val-Lys-Val-Thr-Arg-Ser-Ala-Leu-Gln-Asn-Ala-Ala-Ser-Ile-Ala-Gly-Leu-Phe-Leu-Leu-Glu-Asp-Pro-Tyr-Glu-Lys-Ile-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Ala-Thr-Val-Leu-Ala-Gln-Ala-Leu-Val-Arg-Glu-Gly-Leu。
(c)以包涵体形式表达融合蛋白CTB-123：
接种含pET28a-CTB-123的重组基因工程菌到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养过夜，按2％比例转接入新鲜LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃培养4小时后，加入终浓度为5mmol/L的α-乳糖诱导表达融合蛋白CTB-123。诱导后6小时取少量菌液，离心回收菌体，SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了CTB-123多肽基因的融合表达，融合蛋白占细菌总蛋白的50％以上。以上结果见图8。
(d)复性及分离纯化融合蛋白CTB-123：
诱导表达6小时后离心收集pET28a-CTB-123重组基因工程菌菌体，将菌体悬浮在菌体裂解液(0.5％ Triton X-100乳化剂，0.02％溶菌酶，50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.0)中，37℃搅拌过夜。离心收集沉淀，依次用包涵体洗涤液I(0.2％TrionX-100乳化剂，50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.0)、低浓度尿素溶液(2mol/L尿素，0.2％ TrionX-100乳化剂，50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.0)多次洗涤沉淀，以除去包涵体中的部分杂蛋白。最后的沉淀用高浓度尿素溶液(8mol/L尿素，50mmmo/L Tris-Cl缓冲液，pH8.0)裂解，离心回收上清，装入透析袋中透析复性。最初透析外液为4mol/L尿素、50mmol/LTris-Cl缓冲液、pH8.0，每隔24小时更换一次外液，并将外液的尿素浓度依次降低为2mol/L、1mol/L、0.5mol/L至0mol/L。复性后的蛋白溶液上Cellulose-DEAE 52离子交换柱纯化。用50mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH8.0)平衡柱子，用0～300mol/L NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白CTB-123的洗脱峰，于非变性条件制样(即不煮沸)，经SDS-PAGE电泳检测已达到电泳纯，与菌体中未复性的CTB-123单体比较条带上移，表明复性成功。透析除盐后冻干，即得到含3个表位的表位组合物，-20℃保存。以上结果见图9。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>中国药科大学
<120>抗动脉粥样硬化的表位组合物抗动脉粥样硬化的表位组合物
<130>表位组合物
<160>31
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>25
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Epitope peptide 1
<400>1
Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn
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Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu
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<223>Epitope peptide 4
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Lys Gln
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Glu Glu
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Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp
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Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr
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Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn
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Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp
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Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro
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Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr
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<212>PRT
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<400>15
Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp
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<213>Artificial Sequence
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gggtcatgac acctcaaaat attactg 27
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aaagctagca tttgccatac taattgcggc aatcgc 36
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atagctagcg ccggcgttgc tgacccggtc aagg 34
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<220>
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ctgaagctta atcctccagc aggaacagcc ccgcgatgga 40
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cgccgatctt ctcgtacgga tcctccagca ggaacagccc 40
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<211>40
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>P2-2
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gacaagctta gaccagctcg gcgccgatct tctcgtacgg 40
<210>22
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>P3-1
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gaaccaacgc ctgggccagc acggtggcga ccagctcggc gccgatcttc 50
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>P3-2
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gacaagctta caggccctcg cgaaccaacg cctgggccag 40
<213>Artificial Sequence
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atagctagcg aggcgaccgg c 21
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tatcctaggc tgcttcagcg g 21
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
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<223>P5-1
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atagctagca tcgccgaggc gatgg 25
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<211>25
<212>DNA
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<220>
<223>P5-2
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cgcaagctta ctcctcgacg gtgat 25
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<212>DNA
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<220>
<223>P6-1
<400>28
gctgaccagc aggatgtagg ggtcctcctc gacggtgatg 40
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<400>29
cgcaagcttt aatccttgac agtggacacc ttggagctga cc 42
<210>30
<211>157
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>CTB-123
<400>30
Met Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr
1 5 10 15
Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu
20 25 30
Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile
35 40 45
Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys
50 55 60
Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu
65 70 75 80
Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala
85 90 95
Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Ala Ser Ala Gly Val Ala Asp Pro
100 105 110
Val Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly
115 120 125
Leu Phe Leu Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val
130 135 140
Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu
145 150 155
<210>31
<211>158
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>CTB-456
<400>31
Met Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr
1 5 10 15
Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu
20 25 30
Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile
35 40 45
Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys
50 55 60
Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu
65 70 75 80
Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala
85 90 95
Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Ala Ser Glu Ala Thr Gly Ala Asn
100 105 110
Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Glu Ala
115 120 125
Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu Asp Pro
130 135 140
Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp
145 150 155
Claims (3)
1.一种抗动脉粥样硬化的表位组合物，包括牛结核分枝杆菌热休克蛋白65中6个具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位与霍乱霉素B亚基的融合蛋白CTB-123和CTB-456，其中CTB-123的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示，CTB-456的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示。
2.根据权利要求1中所述抗动脉粥样硬化的表位组合物的制备方法，具体步骤包括：
(a)提取表位步骤：将氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1-6的表位(1)-(6)分为2组，表位(1)-(3)一组，表位(4)-(6)一组，每组中表位的总氨基酸个数≤75个；
(b)构建重组质粒步骤：先将霍乱霉素B亚基的DNA序列插入pET28a质粒中，得到重组质粒pET28a-CTB，再分别将每组各表位的DNA序列串联插入重组质粒pET28a-CTB中霍乱霉素B亚基的DNA序列下游，得到表达融合蛋白CTB-123的重组质粒pET28a-CTB-123与表达融合蛋白CTB-456的重组质粒pET28a-CTB-456；
(c)以包涵体形式表达融合蛋白步骤：在37℃下培养含有表达融合蛋白的重组质粒的重组基因工程菌，用终浓度为3～15mmol/L的α-乳糖诱导表达融合蛋白；
(d)分离纯化融合蛋白步骤：将所述重组基因工程菌的菌体裂解后离心收集含有融合蛋白的包涵体沉淀、用包涵体洗涤液和0.5～2mol/L尿素溶液洗去部分杂质、再用6～8mol/L尿素溶液变性溶解包涵体、透析复性后经离子交换柱层析纯化，得到纯化后的2种融合蛋白CTB-123和CTB-456；
(e)制备表位组合物步骤：将纯化后的2种融合蛋白按摩尔比1∶1混合后，用6～8mol/L尿素溶液进行变性处理，再经透析复性后冻干，得到抗动脉粥样硬化的表位组合物。
3.根据权利要求1所述抗动脉粥样硬化的表位组合物在制备抗动脉粥样硬化的药物中的用途。
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