CN101429231B - 一种抗高血压活性三肽及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗高血压活性三肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗高血压活性三肽及其制备方法。该抗高血压活性三肽的氨基酸序列为：Asn-Pro-Trp。其通过水解酪蛋白获得。本发明活性三肽具有良好的抑制ACE活性及抗高血压的功能，可用于制备抗高血压的饮食品或药品。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性肽领域，特别涉及一种通过水解酪蛋白得到的抗高血压活性三肽及其制备方法和应用。
背景技术
动物乳，常见的如牛乳是一种成分复杂的生物流体，其中蛋白质含量为32g/L，主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，而酪蛋白大约占80％(26g/L)，是含磷的几种蛋白质的复合体，以胶体形式存在于牛乳中。牛乳蛋白质在营养上是优质的全价蛋白质，蕴藏着多种生物活性肽片段，在生理上有许多作用。
目前文献报道的大部分所谓的降血压肽产品为ACE抑制物(ACEI)，但没有经过动物实验的验证环节，很难确定为是真正的抗高血压活性肽产品。例如1982年，Maruyama等(Maruyama S.，Suzuki H.A peptide inhibitorof angiotensin I converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein.Agric.Biol.Chem.1982，46：1393-1399.)采用胰蛋白酶水解酪蛋白，首次从酪蛋白中获得了具有抑制ACE活性的三种肽Pro-Pro、Ala-Pro、Ala-Hyp；而有些具有降血压功能的活性肽是经过酪蛋白发酵产生，而不是通过酶解作用产生，例如用L.helveticus和S.cerevisiae发酵得到的酸奶，以5mL/kg(体重)的剂量饲喂SHR，可在6～8h内明显地降低其心脏收缩压(Maeno M，YamamotoN，Takano T.Identification of an antihypertensive peptide from caseinhydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP 790.JDairy Sci.1996，79：1316-1321.)。
本申请人在专利申请号为200710042207.5的中国专利申请中公开了一种从酪蛋白中生产具有抗高血压功能的活性肽的方法，其选用0.072AU/g酪蛋白的碱性蛋白酶Alcalase，在55℃～60℃，pH在8.4～8.6范围，酶解酪蛋白水溶液5～6小时左右，再采用大孔树脂DA201-C、70％的乙醇为洗脱液对水解物进行脱盐处理得到纯化的酪蛋白水解活性肽，该活性肽为多种肽的混合物，具有良好的抑制ACE功能和降血压功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗高血压活性三肽及其制备方法。该活性三肽从上述酪蛋白的Alcalase酶水解活性肽中进一步分离得到，其具有更佳的抑制ACE功能和降血压功能。
本发明人在上述CN 200710042207.5的技术基础上，进一步研究发现，从通过Alcalase酶水解的酪蛋白活性肽中可以分离出一种活性三肽，在较小剂量下即具有良好的抑制ACE功能和降血压功能，并通过结构检测分析得到活性肽的序列。
本发明的一种抗高血压活性三肽，其氨基酸序列为：Asn-Pro-Trp，用单字母表示为N-P-W，即由天冬氨酸-脯氨酸-色氨酸3个氨基酸残基组成。
本发明制备上述抗高血压活性三肽的方法，包括将酪蛋白的Alcalase酶水解活性肽进一步通过体积排阻色谱方法进行分离，其中所述的体积排阻色谱参数如下：色谱柱为Sephadex G-15 1.6×100cm，检测波长为220nm，样品浓度为10mg/ml，进样量为15ml，洗脱液为pH3.6、0.02moL/L的醋酸缓冲液，流速为42ml/h；分离到峰I～VI共6个峰，收集峰V组分。
较佳地，该收集的组分还进一步经HPLC纯化，其中色谱柱：μBondapakC18 19×300mm I.D.，检测波长：220nm或280nm，进样量：2mL，流速：20mL/min，洗脱条件：0min～20min 100％～75％A、0～25％B，20min～50min75％～50％A、25％～50％B，A为0.1％TFA水溶液，B为含0.1％TFA、体积比为1∶1的乙腈和水组成的有机相，所述的百分比均为体积百分比(v/v)。
根据本发明，所说的酪蛋白的Alcalase酶水解活性肽即为参照上述本申请人CN 200710042207.5的专利文献公开的方法制得的多种肽的混合物。
经体外的抑制ACE活性试验显示本发明抗高血压活性三肽具有良好的抑制ACE活性；而进一步的动物体内试验显示本发明的活性三肽具有良好的降血压功效；其可用于制备抗高血压的药品或饮食品。
附图说明
图1为液相色谱与质谱连用测定本发明抗高血压活性三肽结构的图谱，其中，A图为HPLC图谱，B为质谱图。
图2为体积排阻色谱分离获得本发明抗高血压活性肽的图谱。
图3为高效液相色谱分离获得本发明抗高血压活性三肽的图谱(P1峰)。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1 酪蛋白的Alcalase酶水解活性肽的制备
参照CN 200710042207.5，具体步骤为：
1、采用酶反应器进行酶的反应：
(1)酪蛋白溶解
将1000ml水加入反应器中，升温至最佳温度55℃左右，称取150g酪蛋白(上海化学试剂公司)，在磁力搅拌下缓慢、逐渐放入水中，用2mol/LNaOH调节pH至8.5左右，在55℃的条件下使酪蛋白全部溶解，使反应器中酪蛋白的浓度为15％(w/v，g/ml)。
(2)酶解
按照酶活力单位/底物重量为0.072AU/g酪蛋白的比例，加入4.5g食品级蛋白酶Alcalase(诺维信生物技术有限公司，2.4L，酶活力2.4AU/g)，维持反应温度为55℃，并通过ZDJ-4A自动电位滴定仪滴加2mol/L NaOH维持酶解液的pH为8.5左右，酶解时间为5小时。采用甲醛滴定法测定酶解液中的游离氨基氮为5.625g，计算得水解度为25％。
(3)冷却、干燥
以上述水解度时为反应终点，将酶解液快速冷却至室温，用10％(v/v)的盐酸调pH值至4.6，待沉淀析出后，以10000r/min速度离心30min除去未水解的酪蛋白。离心后得到的上清液真空浓缩后，冷冻干燥。
2、大孔树脂脱盐
用水将样品溶解，样品浓度为40mg/ml，采用大孔树脂DA201-C(江阴市有机化工厂)进行脱盐，70％(v/v)的乙醇为洗脱液，比较集中的在大约1小时将大部分吸附的多肽洗脱下来，解吸附率为82％，脱盐率达到98％。
3、干燥样品
收集上述洗脱液，旋转蒸发回收乙醇，得到浓缩液。将浓缩液进一步喷雾干燥后得到酪蛋白的Alcalase酶水解活性肽的淡黄色的粉末样品。
实施例2本发明抗高血压活性三肽的制备
1、体积排阻色谱分离过程
将Sephadex G-15装到1.6×100cm柱子中。取实施例1的酪蛋白的Alcalase酶水解活性肽样品，用pH3.6、0.02moL/L醋酸缓冲液溶解配制成一定浓度10mg/mL的溶液15mL上柱，并以同样缓冲液以42ml/h流速洗脱，同时用紫外检测仪在波长(λ)为220nm进行检测，如图2所示，分离到峰I～VI共6个峰，收集峰V组分，冷冻干燥组分。
2、高效液相色谱纯化过程
HPLC系统：Waters600E(Waters公司)；
分析用参数：
色谱柱：μBondapak C18 3.9*300mm I.D.(Waters公司)；
检测器：Waters2996二级管阵列；
检测波长：220nm，280nm；
进样量：20μL；流速：1mL/min；
洗脱条件：0min～20min 100％A～75％A、0～25％B，20min～40min，75％A～60％A、25％～40％B，40min～60min，60％A～50％A、40％～50％B。
制备用参数：
色谱柱：μBondapak C18 19*300mm I.D.(Waters公司)
检测器：Waters2996二级管阵列；
检测波长：220nm，280nm；
进样量：2mL；
流速：20mL/min；
洗脱条件：0min～20min 100～75％A、0～25％B，20min～50min 75～50％A、25～50％B；
流动相：A为0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液；B为含0.1％TFA、体积比为1∶1的乙腈和水组成的有机相；上述百分比均为体积百分比。
如图3所示中的P1峰，收集P1峰得到样品，冷冻干燥后，样品呈淡黄色粉末。样品又在同样条件下进行纯度鉴定得到单峰，说明样品达到高效液相纯度。
3、结构测定与分析
液相色谱与质谱连用(LC-ESI-MS)
实验条件：HPLC系统：WatersTM 650E Advanced Protein PurificationSystem(美国Waters公司)
该试验用质谱仪配套了高级分析软件Biolynx，可以根据肽的分子离子的质量数，推测出其氨基酸组成和序列，并找出肽在质谱中出现的碎片离子，以及这一序列的匹配度。
色谱柱：μBondaparkTMC18P/N84176
检测器：DualλAbsorbance Detector，210nm和280nm
色谱仪：WATERS 2690
检测器：WATERS 996
分析柱：Waters Sunfire C-18 2.1×150mm
流动相：乙腈-水-1％甲酸(v/v)梯度洗脱
柱温：35℃
流速：0.3ml/min
进样量：5μL
MS系统：WATERS Platform ZMD 4000 美国Waters公司
离子方式： EIS- EIS+
毛细管电压： 3.88 3.87 kVolts
锥孔电压： 30 30 Volts
离子源温度： 120 ℃
脱溶剂气温度： 300 ℃
质量范围： 100-1000 m/z
光电倍增器电压： 700 Volts
Analyser Vacuum： 2.6e-5 mBar
Gas Flow： 4.2 lit/hr
结果如图1所示。实验结果分析：
本发明抗高血压活性三肽的分子质量为415；
三肽的序列为：天冬氨酸-脯氨酸-色氨酸，
符号缩写为：Asn-Pro-Trp(或N-P-W)。
另外，采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间串联质谱方法(MALDI-TOP-TOP-MS)对本发明抗高血压活性三肽进行结构测定和分析，试验条件为：
Autoflex MALDI-TOP-TOP-MS Bruker公司
检测条件 N2激光源波长337nm
离子类型 正离子
检测方式 反式方式
飞行管长2.7M，加速电压20KV，反色电压23KV
基质 CCA
结果同上。
试验实施例1 抗高血压体外试验
在5ml试管中分别加入200μl的5mmol/L HHL(马尿酰组氨酰亮氨酸)溶液和作为ACEI的80μl的30μg/mL本发明的活性三肽(实施例2溶于水制得)，于37℃下保温3min，加入20μl血管紧张素转换酶(ACE 0.1U/ml)混匀后在37℃下保温30min。再加250μl的1.0N盐酸溶液终止反应。在上述溶液中加入1.7ml乙酸乙酯和硼酸钠缓冲液(pH8.3)750ul的混合液中，经15s振荡混匀后，静置5min，用移液管吸取1.0ml的乙酸乙酯层，在228nm处测吸光度OD值。同时设立对照组(B)和空白组(C)，具体操作步骤如下表：
| A(样品) | B(对照) | C(空白) | |
| 100mU/ml ACE(ul)1N HCl(ul)5mM HHL(ul)ACEI(ul)硼酸钠缓冲液(ul)100mU/ml ACE(ul)1N HCl(ul)ACEI(ul)硼酸钠缓冲液(ul)乙酸乙酯(ml) | 00200800 | 002000750 | 202502008000007501.7 |
| 37℃水浴3min | |||
| 20 | 20 | ||
| 37℃水浴30-60min | |||
| 25007501.7 | 2508001.7 | ||
| 超纯水(ml) | 15S振荡混匀静置5min取1ml的乙酸乙酯层，采用N2吹干 | 1.5 | |
| 1.5 | 1.5 | ||
| 228nm检测光吸收值 | |||
ACE抑制活性(％)＝[(B-A)/(B-C)]×100％
A：在有ACE及ACE抑制物(ACEI)存在的条件下的OD值(实测值)
B：无ACE抑制物存在的条件下测得的OD值(对照值)
C：无ACE抑制物存在的条件下测得的OD值(空白值)
本发明活性三肽对ACE抑制活性为85.5％。
试验实施例2抗高血压动物体内试验
采用RBP-1B型大鼠血压仪进行尾静脉测定血压的方法，测定大鼠的收缩压(SBP)。
1、在SHR大鼠(自发性高血压大鼠)清醒状态下，首先在40℃的恒温箱内保温20min，采用RBP-1B型大鼠血压仪进行尾静脉测定血压的方法，测定大鼠的收缩压(SBP)。于实验前一周开始隔天测定大鼠的血压，待大鼠稳定适应后开始实验记录。先测定灌胃前的大鼠血压(BP，mmHg)和心率(HR，次/min)，然后5mg/kg剂量(根据大鼠的体重灌胃)样品(实施例2的活性三肽)灌胃，对照组灌胃纯水同样剂量，连续灌胃样品10天，测定灌胃样品后的第1d、3d、5d、7d、9d、10d大鼠血压和心率，而且测定第一天大鼠灌胃样品后2h、4h、6h、10h的血压和心率。每个测试点均测定2次大鼠的血压和心率，2次测定的间隔时间约1min，取2次测定值的平均值作为该测试点大鼠的血压和心率值。
注：将测得的数据用SPSS统计软件进行统计处理，采用t检验方法。
试验结果表明，在产品应用过程中采用本发明活性三肽5mg/kg剂量与对照组相比有明显的降压作用。
2、正常血压的SD大鼠试验
试验方法同抗高血压动物体内试验操作
| SBP(mmHg) | 0d | 1d | 3d | 5d | 7d | 9d |
| SD大鼠 | 112.0 | 113.0 | 112 | 116 | 117 | 114 |
由以上数据得出：本发明抗高血压活性三肽对血压正常大鼠没有影响。
Claims (3)
1.一种抗高血压活性三肽，其氨基酸序列为：Asn-Pro-Trp。
2.一种制备如权利要求1所述的抗高血压活性三肽的方法，其包括将酪蛋白的Alcalase酶水解活性肽进一步通过体积排阻色谱分离，其中，所述的酪蛋白的Alcalase酶水解活性肽是选用0.072AU/g酪蛋白的碱性蛋白酶Alcalase，在55℃～60℃，pH在8.4～8.6范围，酶解酪蛋白水溶液5～6小时左右，再采用大孔树脂DA201-C、70％的乙醇为洗脱液对水解物进行脱盐处理得到酪蛋白水解活性肽；所述的体积排阻色谱参数如下：色谱柱为SephadexG-151.6×100cm，检测波长为220nm，样品浓度为10mg/ml，进样量为15ml，洗脱液为pH3.6、0.02moL/L的醋酸缓冲液，流速为42ml/h；分离到峰I～VI共6个峰，收集峰V组分；该收集的组分还进一步经HPLC纯化，其中色谱柱：μBondapak C1819×300mm I.D.，检测波长：220nm或280nm，进样量：2mL，流速：20mL/min，洗脱条件：0min～20min 100％～75％A、0～25％B，20min～50min 75％-50％A、25～50％B，A为0.1％TFA水溶液，B为含0.1％TFA、体积比为1∶1的乙腈和水组成的有机相，所述百分比均为体积百分比。
3.如权利要求1所述的抗高血压活性三肽在制备抗高血压的药品或饮食品中的应用。
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