CN101428148B - 一种rgd多肽放射性药物及其制备方法 - Google Patents
一种rgd多肽放射性药物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101428148B CN101428148B CN200810239036XA CN200810239036A CN101428148B CN 101428148 B CN101428148 B CN 101428148B CN 200810239036X A CN200810239036X A CN 200810239036XA CN 200810239036 A CN200810239036 A CN 200810239036A CN 101428148 B CN101428148 B CN 101428148B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rgdxk
- rgd
- product
- pkm
- hynic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及一种RGD多肽放射性药物及其制备方法。所述RGD多肽放射性药物包括RGD多肽和放射性核素99mTc，所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[L-c(RGDxK)]2，所述放射性核素99mTc通过一个双功能螯合剂HYNIC标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM，所述RGD多肽放射性药物为99mTc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。本发明RGD多肽放射性药物，进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊断效果。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断放射性药物，特别涉及用于integrin αvβ3阳性肿瘤诊断的RGD多肽放射性药物及其制备方法。
背景技术
肿瘤生长过程中关键的一环是肿瘤血管生成。没有新的血管生成肿瘤在长到几个厘米大小之后便不能再继续生长。肿瘤血管生成被各种蛋白分子调控，其中包括integrin αvβ3。integrin αvβ3是一种细胞外基质受体，它是由α和β两个亚基组成的异源二聚体跨膜糖蛋白。integrin αvβ3是整合素家族重要的组成成员，作为与新生血管相关的分子标志物之一，它高表达在新生血管内皮细胞表面和某些肿瘤细胞表面(成神经细胞瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌等)，而在已存在的血管和正常组织中不表达或表达很低。integrin αvβ3在肿瘤生长和转移过程中的高度限制表达，使其成为一个非常有吸引力的靶点，用于肿瘤的诊断和治疗。
研究证实含有RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的配体与integrin αvβ3具有高亲和力和特异性。不同放射性核素标记的RGD序列配体，如RGD环肽二聚体和四聚体等已被用于肿瘤的显像和治疗研究。RGD二聚体或四聚体比其单体具有更高的integrin αvβ3亲和力，主要源于两个因素，一是两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin αvβ3相结合，或者是一个RGD模序与integrin αvβ3结合之后增加了细胞表面结合位点局部RGD浓度。如果两个RGD模序之间的距离足够长，那么它们可以同时与integrin αvβ3结合；如果两个RGD模序之间的距离不是足够长，那么它们只能增加局部RGD浓度。目前报道的RGD环肽二聚体E[c(RGDxK)]2(E代表谷氨酸，c代表环化，R代表精氨酸，G代表甘氨酸，D代表天冬氨酸，x为f或y，分别代表苯丙氨酸或酪氨酸)，其两个RGD模序之间的距离为6个键，由于距离不够长，因此E[c(RGDxK)]2的两个RGD模序很难同时与细胞表面相邻的两个的integrin αvβ3受体结合(如图1所示)。从这个意义上讲，两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrinαvβ3相结合具有更重要的作用。为此，有必要发明新型的RGD多肽二聚体，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以能同时与细胞表面表达的相邻的integrin αvβ3受体相结合，增强RGD多肽与integrin αvβ3的亲和力，提高肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊治效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RGD多肽放射性药物及其制备方法。该药物首先将三个甘氨酸分子(G3，G＝glycine)或四个聚乙二醇分子(PEG4，PEG＝Polyethylene glycol)与RGD单体连接，然后再将此二聚化，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrin αvβ3受体相结合(图2)，即以双价形式与integrin αvβ3结合，这样会进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊断效果。该药物通过双功能螯合剂将放射性核素99mTc标记到新型RGD环肽二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术，对integrin αvβ3阳性肿瘤进行显像诊断。
本发明的目的是通过如下技术方案实现：
一种RGD多肽放射性药物，包括RGD多肽和放射性核素99mTc，所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将G3或PEG4与RGD多肽单体连接，再将两个连接有G3或PEG4的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[L-c(RGDxK)]2(L＝G3或PEG4)，所述放射性核素99mTc通过一个双功能螯合剂HYNIC(hydrazinonicotinamide，联肼尼克酰胺)标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有PKM(药代动力学修饰分子，PKM＝G2、G3、G4或PEG4)(G2代表两个甘氨酸分子，G4为四个甘氨酸分子)，所述RGD多肽放射性药物为99mTc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
所述连接剂L为PEG4或G3。
所述PKM为G2或G3或G4或PEG4。
一种RGD多肽放射性药物制备方法，包括以下步骤：
a、L-c(RGDxK)的制备
将Boc(t-Butyl carbamate，叔丁氧羰基)保护的连接剂L溶于1mL DMF(二甲基甲酰胺)中，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，也为HOSu)和DCC(二环己基碳二亚胺)，室温下搅拌反应2小时。将c(RGDxK)加入到上述反应液中，用DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL0.5M NH4OAc缓冲溶液(pH＝7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干。获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-L-c(RGDxK)。将Boc-L-c(RGDxK)加入到3.0mLTFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟。旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5MNH4OAc缓冲溶液(pH＝7.0)，经Zorbax C18半制备柱HPLC方法分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干。获得产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物L-c(RGDxK)。
b、E[L-c(RGDxK)]2的制备
将Boc保护的谷氨酸(E)溶于5mL DMF，加入NHS和DCC，室温搅拌10小时。滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物。用3mL CH2Cl2溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓缩至1mL左右。缓慢逐滴加入到30mL乙醚中，析出白色沉淀，过滤并真空干燥得到产品。获得产物经1H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2。将Boc-E(OSu)2溶于无水1mL DMF中，加入L-c(RGDxK)。使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]2。用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]25分钟，去除Boc-保护基团。粗产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[L-c(RGDxK)]2。
c、PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备
将Boc-PKM-OSu和E[L-c(RGDxK)]2溶于2mL DMF和H2O的混合液(1:1＝v:v)，使用0.1N NaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜。将反应液真空蒸干，得到粗产品并将之溶于2mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟。产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产品PKM-E[L-c(RGDxK)]2。
d、HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备
将HYNIC-NHS(联肼尼克酰胺)和PKM-E[L-c(RGDxK)]2溶于DMF和H2O的混合液(1:1＝v:v)中，使用0.1N NaOH调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干。
e、99mTc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备
配制含TPPTS(三苯基膦三磺酸钠)5.0mg，tricine(三羟甲基甘氨酸)6.5mg，琥珀酸二钠38.5mg，琥珀酸12.7mg和20μg的HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的混合液500μL于10mL西林瓶中，加入1.0-1.5mL的Na99mTcO4溶液(10-50mCi)，100℃水浴加热西林瓶反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制成RGD多肽放射性药物。
所述HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备Zorbax C18半制备柱(9.4mm x250mm，100pore size)，梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25mM NH4OAc，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始时90％A和10％B，5分钟时85％A和15％B，30分钟时65％A和35％B，32-36分钟时50％A和50％B。
所述RGD多肽放射性药物用于integrin αvβ3阳性肿瘤患者的显像诊断，以及对接受靶向integrin αvβ3的抗癌药物治疗患者的选择和疗效评价。
本发明的有益效果：
1、在本发明RGD多肽放射性药物，首先将三个甘氨酸分子(G3)或四个聚乙二醇分子(PEG4)与RGD多肽单体连接，然后再将此二聚化，即合成E[G3-c(RGDxK)]2或E[PEG4-c(RGDxK)]2，这样两个RGD模序之间的距离就从6个键增加到26个键或38个键，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrin αvβ3受体相结合(如图2所示)，即以双价形式与integrin αvβ3结合，这样会进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊断效果。
2、本发明不仅在两个RGD模序之间引入G3和PEG4，同时在RGD多肽分子与双功能螯合剂HYNIC之间引入PKM，即HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，以进一步改善药代动力学性质，特别是从非肿瘤组织的清除动力学。
3、本发明中使用HYNIC作为双功能螯合剂，同时使用tricine和TPPTS作为协同配体从而使“99mTc-HYNIC核”具有更加良好的体内外稳定性。
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为结构改造前RGD环肽二聚体与integrin αvβ3受体结合示意图；
图2为结构改造后RGD环肽二聚体与integrin αvβ3受体结合示意图；
图3为RGD环肽二聚体及其99mTc标记物结构示意图；
图4为不同RGD多肽体外受体竞争结合分析；
图5为99mTc标记的不同RGD多肽于注射后不同时间在神经胶质瘤摄取的对比；
图6为99mTc标记的不同RGD多肽于注射后不同时间在乳腺癌摄取的对比；
图7为注射99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2后30min神经胶质瘤动物模型的γ显像图；
图8为注射99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2后30min乳腺癌动物模型的γ显像图。
具体实施方式
本发明实施例中所采用的材料：Dicyclcohexylcarbodiimide(DCC，N，N＇-二环己基碳二亚胺)，N-hydroxysuccinimide(NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)，succinic acid(琥珀酸)，disodium succinate hexahydrate(琥珀酸二钠)，trisodiumtriphenylphosphine-3，3＇，3＂-trisulfonate(TPPTS，三苯基膦三磺酸钠)，N，N-Dimethylform amide(DMF，N，N-二甲基甲酰胺)，tricine(三羟甲基甘氨酸)均购自美国Sigma-Aldrich公司。HYNIC-NHS(联肼尼克酰胺)购自美国Noca-biochem公司。环化RGD多肽单体c(RGDfK)]2购自美国PeptideInternational，Inc.公司。Na99mTcO4洗脱液购自北京原子高科股份有限公司。
实施例：
本实施例以99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2多肽放射性药物及其制备方法为例。
99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2中，RGD环肽二聚体是将连接剂PEG4与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有PEG4的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[PEG4-c(RGDfK)]2，放射性核素99mTc通过一个双功能螯合剂HYNIC标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PEG4，所述RGD多肽放射性药物为99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfk)]2制备方法如下：
预先配备Zorbax C18半制备柱，HPLC方法一：使用LabAlliance HPLC系统，配备Zorbax C18半制备柱(9.4mm x 250mm，100
pore size)，梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25mM NH4OAc(pH5.0)，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始时90％A和10％B，5分钟时85％A和15％B，30分钟时65％A和35％B，32-36分钟时50％A和50％B。
PEG4-c(RGDfK)的制备：将Boc(t-Butyl carbamate，叔丁氧羰基)保护的PEG4-OH溶于1mL DMF(二甲基甲酰胺)中，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，也为HOSu)(3.5mg，0.03mmol)和DCC(二环己基碳二亚胺)(6.2mg，0.03mmol)，室温下搅拌反应2小时。将c(RGDfK)(26.3mg，0.02mmol)加入到以上反应液中，用DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL0.5M NH4OAc缓冲溶液(pH＝7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻干。获得产品Boc-PEG4-c(RGDfK)约7.5mg。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝1665([M+H]+)，[C75H117N20O23]+理论值为1665.85。
将上述所得Boc-PEG4-c(RGDfK)(10mg，6mol)加入到3.0mL TFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟。旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5M NH4OAc缓冲溶液(pH＝7.0)，经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻干。获得产品PEG4-c(RGDfK)约7.0mg。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝1565.2([M+H]+)，[C70H109N20O21]+理论值为1565.80。
E[PEG4-c(RGDfK)]2的制备：将Boc-保护的谷氨酸(E)(0.247g，1.0mmol)溶于5mL DMF，加入NHS(0.253g，2.2mmol)和DCC(0.453g，2.2mmol)，室温搅拌10小时。滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物。用3mL CH2Cl2溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓缩至1mL左右。缓慢逐滴加入到30mL乙醚中，析出白色沉淀，真空干燥得到产品0.27g。获得产物经1H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2。
将上述所得Boc-E(OSu)2(4.4mg，0.01mmol)溶于无水1mL DMF中，加入PEG4-c(RGDfK)(5.28mg，0.03mmol)。使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并冻干，得到15mg白色粉末。经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]2。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝1913.13([M+H]+)，[C86H138N21O28]+理论值为1912.99。
用无水TFA浸泡上述产物Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]25分钟，去除Boc-保护基团。粗产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[PEG4-c(RGDfK)]2。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝1813.0([M+H]+)，[C81H130N21O26]+理论值为1812.99。
PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2的制备：将Boc-PEG4-OSu(5.1mg，11μmol)和E[PEG4-c(RGDfK)]2(5mg，2.76μmol)溶于2mL DMF和H2O的混合液(1:1＝v:v)，使用0.1N NaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜。然后反应液真空蒸干，得到粗产品，溶于2mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟。产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间为16.4分钟时的馏分，合并收集液并冻干。获得预期产品PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2约2.4mg，纯度大于95％。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝2061.46([M+H]+)，[C92H151N22O31]+理论值为2061.1。
HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(HYNIC-3PEG4-dimer)的制备：将HYNIC-OSu(2mg，4.8μmol)和PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(2.4mg，1.2μmol)溶于2mL DMF和H2O的混合液(1:1＝v:v)，使用0.1N NaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间为20.6分钟的馏分，合并收集液并冻干，得到产物1mg。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝2364.33([M+H]+)，[C105H160N25O35S]+理论值为2364.1。
99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(99mTc-3PEG4-dimer)的制备：配制含TPPTS 5.0mg，tricine 6.5mg，琥珀酸二钠38.5mg，琥珀酸12.7mg和20μgHYNIC-3PEG3-dimer的混合液500μL于10mL西林瓶中，加入1.0-1.5mL的Na99mTcO4溶液(10-50mCi)，100℃水浴加热西林瓶反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制备出RGD多肽放射性药物99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(99mTc-3PEG4-dimer)。
对依据本发明方法制备的RGD多肽放射性药物99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(99mTc-3PEG4-dimer)取样进行放射性HPLC分析(HPLC方法二：使用LabAlliance HPLC系统，配备放射性在线检测器和Zorbax C18分析柱(4.6mm x 250mm，300
pore size)，梯度淋洗25分钟，流速1.0mL/min，其中流动相A为25mM NH4OAc(pH5.0)，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始至2分钟时90％A和10％B，5分钟时85％A和15％B，20分钟时80％A和20％B，25分钟时90％A和10％B)，99mTc-3PEG4-dimer的标记率>95％，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯度>98％。
HYNIC-3PEG4-dimer与integrin αvβ3结合亲和力测定：高表达integrin αvβ3的U87MG人神经胶质瘤细胞作为实验样本，使用125I-c(RGDyK)作为integrinαvβ3受体特异性结合的放射性配基，采用竞争结合实验测定HYNIC-3PEG4-dimer的IC50值(半抑制浓度)，并设c(RGDyK)、HYNIC-PEG4-c(RGDfK)(HYNIC-PEG4-monomer)、HYNIC-PEG4-E[c(RGDfK)]2(HYNIC-PEG4-dimer)、HYNIC-E[PEG4-c(RGDfK)]2(HYNIC-2PEG4-dimer)、HYNIC-E{E[c(RGDfK)]2}2(HYNIC-tetramer)为对照。实验结果显示，c(RGDyK)，HYNIC-PEG4-monomer，HYNIC-PEG4-dimer，HYNIC-2PEG4-dimer，HYNIC-3PEG4-dimer和HYNIC-tetramer竞争125I-c(RGDyK)与U87MG细胞结合的IC50值分别为37.3±10.1nM，31.7±9.7nM，7.5±2.3nM，2.9±0.7nM，2.4±0.7nM和2.8±0.5nM(如图4所示)，表明HYNIC-2PEG4-dimer、HYNIC-3PEG4-dimer与integrin αvβ3的亲和力明显好于其它现有RGD多肽分子，说明改造后的RGD环肽二聚体E[PEG4-c(RGDfK)]2与integrin αvβ3的亲和力明显好于其单体及改造前的RGD环肽二聚体，改造后的RGD环肽二聚体能以双价形式与integrin αvβ3结合。
本发明RGD多肽放射性药物中，当连接剂L为G3、药代动力学修饰分子PKM为G3时，本发明药物为99mTc-HYNIC-G3-E[G3-c(RGDfK)]2(99mTc-3G3-dimer)，其制备方法同上。
本发明RGD多肽放射性药物中，药代动力学修饰分子也可以是G2或G4。
图3为RGD环肽二聚体及其99mTc标记物结构示意图。
99mTc-3PEG4-dimer和99mTc-3G3-dimer在荷瘤裸鼠生物分布：将BALB/c荷U87MG人神经胶质瘤裸鼠以及荷MDA-MB-435人乳腺癌裸鼠随机分成若干组，每组4只。各组实验裸鼠分别经尾静脉注射100μL(～74kBq)不同的99mTc标记的RGD多肽，于注射后30分钟、60分钟和120分钟按组分别处死实验裸鼠，取血及主要脏器，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。
在U87MG人神经胶质瘤动物模型中，99mTc-3PEG4-dimer和99mTc-3G3-dimer的肿瘤摄取大约是99mTc-PEG4-monomer(99mTc-HYNIC-PEG4-monomer)和99mTc-G3-monomer(99mTc-HYNIC-G3-monomer)肿瘤摄取的3倍(如图5所示)。在MDA-MB-435人乳腺癌动物模型中，99mTc-3PEG4-dimer和99mTc-3G3-dimer的肿瘤摄取明显好于99mTc-tetramer(99mTc-HYNIC-tetramer)，并且高于99mTc-PEG4-dimer(99mTc-HYNIC-PEG4-dimer)肿瘤摄取的两倍(如图6所示)，这充分说明99mTc-3PEG4-dimer和99mTc-3G3-dimer是以双价形式与integrin αvβ3结合，而99mTc-PEG4-dimer是以单价形式与integrin αvβ3结合。另外，99mTc-3PEG4-dimer和99mTc-3G3-dimer在肝和肾的摄取只为99mTc-tetramer的一半。从肿瘤的摄取以及靶组织与非靶组织的放射性比值来讲，99mTc-3PEG4-dimer和99mTc-3G3-dimer明显优于99mTc-PEG4-dimer和99mTc-tetramer。图7为荷U87MG人神经胶质瘤裸鼠注射99mTc-3PEG4-dimer的γ显像图(箭头代表肿瘤部位)，图8为荷MDA-MB-435人乳腺癌裸鼠注射99mTc-3PEG4-dimer的γ显像图，注射后30min肿瘤即清晰可见(箭头代表肿瘤部位)。
Claims (2)
1.一种RGD多肽放射性药物，包括RGD多肽和放射性核素99mTc，其特征在于：所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[L-c(RGDxK)]2，所述连接剂L为PEG4或G3，所述放射性核素99mTc通过一个双功能螯合剂HYNIC标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM，所述药代动力学修饰分子PKM为G2、G3、G4或PEG4，所述RGD多肽放射性药物为99mTc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
2.一种权利要求1所述的RGD多肽放射性药物的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
a、L-c(RGDxK)的制备
将Boc保护的连接剂L溶于1mL DMF中，加入NHS和DCC，室温下搅拌反应2小时；将c(RGDxK)加入到上述反应液中，用DIEA将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜；向反应液中加入3mL 0.5M NH4OAc缓冲溶液并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱HPLC方法分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-L-c(RGDxK)；将Boc-L-c(RGDxK)加入到3.0mL TFA中，室温反应30分钟；旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL 0.5M NH4OAc缓冲溶液，经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物L-c(RGDxK)；
b、E[L-c(RGDxK)]2的制备
将Boc保护的谷氨酸溶于5mL DMF，加入NHS和DCC，室温搅拌10小时；滤掉副产物DCU，滤液真空蒸干得到粗产物；用3mL CH2Cl2溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓缩至1mL左右；缓慢逐滴加入到30mL乙醚中，析出白色沉淀，过滤并真空干燥得到产品；获得产物经1H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2；将Boc-E(OSu)2溶于无水1mL DMF中，加入L-c(RGDxK)；使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]2；用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]25分钟，去除Boc-保护基团；粗产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[L-c(RGDxK)]2；
c、PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备
将Boc-PKM-OSu和E[L-c(RGDxK)]2溶于2mL DMF和H2O的混合液，使用0.1NNaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜；将反应液真空蒸干，得到粗产品并将之溶于2mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产品PKM-E[L-c(RGDxK)]2；
d、HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxk)]2的制备
将HYNIC-NHS和PKM-E[L-c(RGDxk)]2溶于DMF和H2O的混合液中，使用0.1N NaOH调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；
e、99mTc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxk)]2的制备
配制含TPPTS 5.0mg，tricine 6.5mg，琥珀酸二钠38.5mg，琥珀酸12.7mg和20μg的HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxk)]2的混合液500μL于10mL西林瓶中，加入1.0-1.5mL的Na99mTcO4溶液，100℃水浴加热西林瓶反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制成RGD多肽放射性药物；
所述HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备Zorbax C18半制备柱，梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25mM NH4OAc，B为乙腈；淋洗梯度设定为起始时90％A和10％B，5分钟时85％A和15％B，30分钟时65％A和35％B，32-36分钟时50％A和50％B。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810239036XA CN101428148B (zh) | 2008-12-05 | 2008-12-05 | 一种rgd多肽放射性药物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810239036XA CN101428148B (zh) | 2008-12-05 | 2008-12-05 | 一种rgd多肽放射性药物及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101428148A CN101428148A (zh) | 2009-05-13 |
| CN101428148B true CN101428148B (zh) | 2010-09-01 |
Family
ID=40643916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200810239036XA Active CN101428148B (zh) | 2008-12-05 | 2008-12-05 | 一种rgd多肽放射性药物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101428148B (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102861347B (zh) * | 2012-10-09 | 2014-12-10 | 安徽筑梦生物科技有限公司 | 99mTc标记半乳糖化RGD肿瘤诊断药物及制备方法 |
| CN102911256B (zh) * | 2012-11-02 | 2016-06-01 | 厦门大学 | 一种放射性标记的多肽配合物及其制备方法和应用 |
| CN104667306B (zh) * | 2015-02-09 | 2018-02-02 | 刘丽 | 99mTc标记RGD多肽三聚体肿瘤显像药剂的化学结构及制备方法 |
| TW201524523A (zh) | 2015-02-12 | 2015-07-01 | Bailing Cloud Biomedical Technologies Innovation | ｍＴｃ標記ＲＧＤ環肽三聚體腫瘤顯像藥劑的化學結構及製備方法 |
| CN106474495B (zh) * | 2016-11-21 | 2019-07-09 | 中国医学科学院阜外医院 | 含亚氨基二乙酸的99mTc标记的RGD多肽肿瘤诊断药物及其制备方法 |
| US10494403B2 (en) * | 2018-03-06 | 2019-12-03 | Ciphore Biomed Technology Limited Company | Cyclopeptide, pharmaceutical or cosmetic composition comprising the same and method for preparing the same |
| CN109045313B (zh) * | 2018-09-11 | 2020-02-18 | 北京大学 | 一种靶向her2的d型多肽放射性药物及制备方法 |
| CN110420337A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-11-08 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种靶向整合素α6的二聚体多肽放射性药物及其制备方法 |
| CN110339375B (zh) * | 2019-05-24 | 2024-02-02 | 广东瑞迪奥科技有限公司 | 一种靶向HER2的rk多肽放射性药物及其制备方法 |
| CN110746492B (zh) * | 2019-11-20 | 2020-07-14 | 南京恒远科技开发有限公司 | 一种联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽的制备工艺 |
| CN111228521B (zh) * | 2020-01-17 | 2021-03-19 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种Dar2多肽放射性药物及其制备方法 |
-
2008
- 2008-12-05 CN CN200810239036XA patent/CN101428148B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101428148A (zh) | 2009-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101428148B (zh) | 一种rgd多肽放射性药物及其制备方法 | |
| JP6786731B2 (ja) | 二重標的イメージング用分子プローブ及びその調製方法と応用 | |
| Su et al. | In vitro and in vivo evaluation of a technetium-99m-labeled cyclic RGD peptide as a specific marker of αvβ3 integrin for tumor imaging | |
| AU2005283904B2 (en) | Diagnostic compounds | |
| Bullok et al. | Characterization of novel histidine-tagged Tat-peptide complexes dual-labeled with 99mTc-tricarbonyl and fluorescein for scintigraphy and fluorescence microscopy | |
| CN101485891A (zh) | 放射性核素标记的rgd多肽药物及其制备方法 | |
| Wei et al. | 64Cu-labeled CB-TE2A and diamsar-conjugated RGD peptide analogs for targeting angiogenesis: comparison of their biological activity | |
| Liu et al. | Dual integrin and gastrin-releasing peptide receptor targeted tumor imaging using 18F-labeled PEGylated RGD-bombesin heterodimer 18F-FB-PEG3-Glu-RGD-BBN | |
| AU2001292456B2 (en) | Peptide-based compounds | |
| CN101474415B (zh) | 用于integrinαvβ3阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物及其制备方法 | |
| Mizuno et al. | Purification-free method for preparing technetium-99m-labeled multivalent probes for enhanced in vivo imaging of saturable systems | |
| CN109091683B (zh) | 一种用于整合素αvβ6靶向的环状多肽放射性药物及其制备方法 | |
| NO331741B1 (no) | Peptidbaserte forbindelser som har affinitet for integrinreseptorer, farmasoytiske sammensetninger omfattende slike og bruk av disse for fremstilling av et kontrastmiddel og et medikament. | |
| Fournier et al. | Comparative study of 64 Cu/NOTA-[D-Tyr 6, βAla 11, Thi 13, Nle 14] BBN (6-14) monomer and dimers for prostate cancer PET imaging | |
| Lucente et al. | Novel 64Cu labeled RGD2-BBN heterotrimers for PET imaging of prostate cancer | |
| CN102600489A (zh) | 含iRGD序列的多肽放射性药物 | |
| Satpati et al. | 68 Ga-Chelation and comparative evaluation of N, N′-bis-[2-hydroxy-5-(carboxyethyl) benzyl] ethylenediamine-N, N′-diacetic acid (HBED-CC) conjugated NGR and RGD peptides as tumor targeted molecular imaging probes | |
| CN111675750B (zh) | 针对癌胚抗原相关黏附分子ceacam的肿瘤靶向肽及其应用 | |
| CN104780944B (zh) | 用于癌症和其它疾病的医学成像的靶向缓激肽受体b1的组合物 | |
| Zhang et al. | Preparation and characterization of 99mTc (CO) 3–BPy–RGD complex as αvβ3 integrin receptor-targeted imaging agent | |
| CN110420337A (zh) | 一种靶向整合素α6的二聚体多肽放射性药物及其制备方法 | |
| CN103800923B (zh) | 一种肿瘤双靶点放射性分子探针及其制备方法 | |
| Liu et al. | Integrin alphavbeta3 directed radiopharmaceuticals for tumor imaging | |
| Baishya et al. | Synthesis and Evaluation of Technetium‐99m‐Labeled Bioreductive Pharmacophores Conjugated with Amino Acids and Peptides for Tumor Imaging | |
| CN116023438A (zh) | 一种cxcr4靶向多肽及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220729 Address after: 528000 room 1, unit 102, 1st floor, building 3, Tianfu science and technology center, No. 12, Xianan Road, Guicheng Street, Nanhai District, Foshan City, Guangdong Province Patentee after: Guangdong ruidio Technology Co.,Ltd. Address before: 100191 No. 38, Haidian District, Beijing, Xueyuan Road Patentee before: Peking University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |