CN101426536A - 治疗、预防和诊断骨病变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明通常涉及治疗、预防和诊断领域。更特别地，本发明鉴别与骨形态发生和骨病理学有关的基因和基因产物。更特别地，本发明考虑了在治疗、预防和诊断骨病变中调节这些基因的表达或调节基因产物的活性。以细胞为基础的治疗和在体外培养中细胞的处理也是本发明的组成部分。

Description

治疗、预防和诊断骨病变的方法

技术领域

本发明通常涉及治疗、预防和诊断领域。更特别地，本发明识别骨形态发生和骨病变的基因和基因产物。更特别地，本发明考虑了在治疗、预防和诊断骨病变中调节这些基因的表达或调节基因产物活性。以细胞为基础的治疗和体外培养中细胞的处理也是本发明的组成部分。

背景技术

任何在说明书中参考的现有技术不是，也不应当被认为承认或任何形式地暗示该现有技术在任何国家形成公知知识的部分。

本文引证的参考文献的详细目录集中在本说明书的结尾。

骨病变包括骨癌、骨折、颅缝早闭、骨质疏松症和其他导致受影响的受试者严重损害、丧失生活质量和提早死亡的生化或结构上的缺陷。外科或其他的物理干预曾经是处理许多这些病变的主要方法。具有能通过医药干预治疗或预防或帮助修复骨相关障碍的需求。

出生时，人的头骨由45块骨单元组成，这些骨单元被称为骨缝的纤维连接分离(Wilkie and Morriss-Kay，Nat Rev Genet 2(6)：458-468，2001)。包围大脑的骨骼被称为颅盖，它通过膜内骨化的方式发育。相比之下，组成颅底和面部区域的骨骼是通过更普遍的软骨内骨化的方式形成的。对于正常的头骨发育，颅盖缝需要保持纤维连接(未融合)直到大脑停止生长，和头骨的其他部分，特别是面部区域停止生长以允许与新生长有关的骨头的活动。

颅盖骨首先从外胚层间质(骨化的主要中心)的浓缩(condensation)形成，然后分化为骨母细胞、前造骨细胞和最后地造骨细胞，其分泌胶原一蛋白多糖的细胞外基质(ECM)。ECM的矿化阻止了分化为骨细胞的造骨细胞。起始骨形成的信号还不清楚。一旦主要骨化中心建立，成长骨从骨化主要中心辐射出，形成扁平的骨针。在大概18周的孕育里，正在成长的骨化前沿(growing osteogenicfronts)会合，在这些边缘形成骨缝(Dixon et al，Fundamentals of Craniofacial Growth，New York，CRC Press，1997)。

除了额缝以外，正常的骨缝融合是直到出生后才发生，而额缝要到成人期才会融合(Cohen Am J Med Genet 47(5)：581-616，1993)。然而，颅骨的生长在4—6岁时停止，而在生命的头6个月发生最多的生长(Enlow，Facial Growth，Philadelphia，WB Saunders Co.，1990)。大脑会在颅盖缝停止生长并最终融合前就停止生长，因此似乎大脑的生长并不完全负责颅顶的生长(Cohen 1993同上)。停止生长不总是导致融合(Dixon等，1997同上)。缝融合的原因仍然不清楚，可能涉及许多因素，包括激素、遗传、机械和局部因素(Persson et al，Journal of Anatomy 125：313-321，1978)。

在骨化前沿，融合以前造骨细胞停止增殖和分化为造骨细胞开始。骨缝的边缘逐渐地侵占缝间的空间，从一个平的边缘变为牙间交错。最后的分化导致简单的小梁骨骼多层网状结构所代替(Cohen，1993同上)。细胞凋亡在骨缝的维持中似乎也扮演了角色。如果骨缝在生长过程中靠得太近，随后临近细胞的细胞凋亡就会发生，以保持骨骼的分开。因此细胞凋亡的异常会导致提早融合(Furtwangler et al，Acta Anat 124(1-2)：74-80，1985)。

颅盖缝的过早融合被称为颅缝早闭，西方世界中2500个活产婴儿会发生1例(Wilkie，Am J Med Genet 90(1)：82-84，2000)，而且是第二常见的头盖缺陷。融合可能是由于过早地在相对的骨间形成了骨桥，也可能是由于骨生长增加导致非常重叠的骨。它仅能发生在颅骨缝的一处或多处，它可以发生在出生前或后，它可以是偶发的或综合病症的。颅骨早闭的研究是重要的，因为它提供了研究骨缝融合、骨生长和分化成因的模式，由此得到调节骨缝维持和融合的因素。已知的颅缝早闭的原因各种各样，包括由于基因突变导致的单基因疾病、代谢紊乱、性血液病紊乱和致畸剂。

至少有5个引起综合病症的颅缝早闭基因已被识别，然而偶发形式的还未得到很好的理解。有超过100个综合症显示出了一些颅缝早闭的形式。最普遍占优势的遗传形式是亚伯特氏(Apert)、Beare-Stevenson、波士顿、面骨发育不全(Crouzou)、Jackson-Weiss、法伊弗氏(Pfeiffer)、Saethre-Chotzen和Muenke综合症(由Muenke and Wilkie Craniosynostosis Syndromes 3：6117-6146，2000综述)。即使具有相同突变，这些综合症的表型在病人间也是不一致的。然而，所有的这些表型都与多种面部和肢体异常有关。

修正因颅缝早闭引起的面部异常需要进行侵入性外科手术，通过重新打开组织的已融合的部分。在非综合病症的情况中，通常去掉已融合的组织允许颅骨重新正常生长，骨骼在短时间内被更换。然而，在大多数综合病症的情况，当骨骼重新融合太早时，需要多次的外科手术不断地重新打开组织。特别是当遗传异常的存在被第一次检测到时，确定能够限制骨缝的过早再融合或能够被用于停止骨缝的过早融合的治疗剂就有了高度的价值。

培养骨缝的间叶细胞是研究骨缝间叶细胞体外分化过程的常规方法。因此需要识别帮助确定造骨细胞分化阶段的生物标记。颅盖缝的ECM由90％的1型胶原蛋白(α1(I)胶原蛋白和α2(I)胶原蛋白)、细胞贴附蛋白(骨桥蛋白(OP)，纤维连接蛋白和血小板反应素)、钙结合蛋白(骨连接蛋白(ON)，骨涎蛋白(BSP))，涉及矿化的蛋白(骨钙素(OC))和酶(胶原酶和碱性磷酸酶(ALP))组成(Ducyet al，Cell 89(5)：747-754，1997；Robbins，Robbins Pathologic Basis of Disease，1999]。胶原蛋白是最早在骨原细胞中表达的因子，接下来是ALP、ON、BSP，最后是在后增生的造骨细胞中的OC。OP实际上在所有增生的骨母细胞和前成骨细胞中表达，而胶原蛋白在祖细胞中表达之前低的BSP表达也被识别到了(Liu et al，J CellSci 116(9)：1787-1796，2003)。因此，现行的造骨细胞表型的标记是Coll、ALP、BSP、ON和OC。然而，研究表明，这些标记有大量的表达重叠，不能唯一地识别分化每个阶段的细胞(Liu等，2003同上)。

对未融合缝间叶细胞与已融合颅盖缝骨间的基因表达差异的研究能识别涉及骨生成的基因。这些基因除了促进造骨细胞分化和骨矿化(已融合缝特有)，还能促进细胞增生和早期造骨细胞种群(间叶细胞特有)的维持。

发明内容

在整个说明书和接下来的权利要求书中，除了上下文的需要外，否则，词语“包含”和它的变化如“包含”(comprises)和“包含”(comprising)将被理解为暗示包括了整体或步骤的整体或步骤或组但是并不排除其他任何的整体或步骤或组。

说明书下文所提及的所有科学引文、专利、专利申请和制造商的技术说明书都以其全文引入本文作为参考。

针对本发明，与骨病变有关的差异表达基因已被识别。这些基因的确认使开发治疗、预防、诊断和组织培养的方案成为可能，该方案是用来治疗、预防、和控制一系列骨病变包括骨癌、骨再吸收和修复、骨折、以骨缝为基础的头盖异常包括颅缝早闭、细胞骨架障碍、骨质疏松症、矿化不足和其他生化或结构缺陷。本发明更进一步使促进骨健康包括骨生长成为可能。这些基因也可以被看作是骨病变的生物标记，因此可以被用于诊断一系列的紊乱或相同的或骨健康的状态发展的风险。操控基因的表达或基因产物的活性也被用于体外细胞培养如开发脂肪来源的基质细胞系、骨髓来源的基质细胞系、破骨细胞和造骨细胞。

不希望将本发明限制于任何一个理论或行动方式，建议被识别的基因通常涉及骨细胞增殖(典型的是未融合的骨缝)和骨细胞分化(典型的是正在融合的骨缝)。

相应的，本发明的一方面考虑治疗或预防骨病变包括降低受试者骨病变发展的风险的方法，所述的方法包括给予所述病人有效剂量的试剂，所述试剂调节遗传物质的表达或遗传物质编码产物的活性，其中遗传物质在未融合和融合的骨缝中差异表达。

本发明进一步提供了一套生物标记包括一个或多个在未融合骨缝和融合头盖缝差异表达的基因或基因产物在制造骨病变药物或开发骨病变诊断方案中用途。

优选的受试者是人。“生物标记”的参考包括基因或基因产物。“基因产物”包括蛋白质或RNA。

用于本说明书的缩写词列在表1中。

表1

缩写词表

 

缩写词	描述
		α1(I)coll	α1 I型胶原蛋白
α2(I)coll	α2 I型胶原蛋白
		ALP	碱性磷酸酶
BSP	骨涎蛋白
		ECM	细胞外基质
OC	骨钙蛋白
		ON	骨连接蛋白
OP	骨桥蛋白

附图说明

有些图包含了彩色显示或实体。彩色照片可以请专利权人提供或从适当的专利局获得。如果从专利局获得费用可能是强制的。

图1是前10个目标的差异表达的基因在融合和不融合骨缝间的表达水平的图示。在融合和未融合系列中的每个柱状图分别代表一种骨缝。

图2(a)和(c)和图2(b)分别是图和照片显示，其显示了通过微阵列分析识别的具有差别表达的mRNA和蛋白质的证实。(a)对从矢状缝、冠状缝、人字缝和额缝分离出的未融合、正融合和已融合的骨缝组织进行实时QRT-PCR分析，有6个基因在未融合骨缝中表达增加(C1QTNF3短的异构体(short isoform)、RBP4、GPC3、PTN、PRELP、FMOD)，有3个基因在融合骨缝中表达增加(ANXA3，、WIF1和CYFIP2)。平均表达+SEM显示(b)以(c)中所见的顺序进行单个蛋白质样本的蛋白质印迹分析，对胶原蛋白1型(COL1)、GPC3、C1QTNF3和RBP4。(c)标准化到COL1表达的蛋白质印迹光密度测定分析。在(b)和(c)中的数字是指病人数。

图3(a)到(c)是照片显示，其显示骨缝中两个优选基因的表达方式。(a—b)荧光免疫检测法和H&E染色，其显示在头盖骨外(ectocranial)表面骨(未融合的冠状缝)的骨细胞(OC)的细胞质的RBP4定位(橙色直到黄色)。(c—d)系列荧光免疫检测法(c)和H&E部分(d)，其显示RBP4定位于钙化组织(bn)和间叶细胞(m)之间的区域(未融合的左人字缝)中的细胞中。(e)RBP4在未融合的缝(冠状的)的颅腔表面没有检测到。(f)RBP4定位到正在发育的骨内膜造骨细胞的细胞质，那些正发育的骨陷于骨样质(箭头)，和骨细胞(未融合冠状缝)。(g)对(f)中的中心区域的相应的相差图。(h)RBP4在已融合骨缝没有被检测到。红血球有弱的自发荧光(矢状)。(i-1)在接近中缝区域中的组织面(箭头)的间质细胞中GPC3荧光免疫检测法和H&E检测到的蛋白质(i)。膜染色观察邻近钙化骨骼的间质细胞的细胞质延伸部分(k-1)。(j)深到(k)的H&E部分，其显示钙化骨伸入进间叶细胞和骨内膜的造骨细胞间。比例尺：10μm。

具体实施方式

本发明以生物标记的形式提供差异表达的基因，其确定了用于治疗、预防和诊断受试者骨病变的靶标。生物标记包括一套在未融合骨缝对融合骨缝中差异表达的基因或基因产物。特别地，未融合骨缝与融合骨缝在具有以骨缝为基础的头盖骨畸形例如但不限于颅缝早闭的受试者中。然而，生物标记的鉴定使针对一系列的骨病变包括骨癌、骨再吸收和修复、骨折控制、以骨缝为基础的头盖骨畸形如颅骨早闭、细胞支架障碍、骨质疏松症和矿化缺陷和其他生化或结构缺陷的治疗、预防和诊断方案发展成为可能。生物标记也在促进骨生长或保持骨健康状态中具有用途。生物标记在本文中是指“靶标基因”或“靶标蛋白质”或“靶标基因表达产物”。

为了描述和主张本发明，下面的术语依照下列的定义使用。

除了另有说明外，可以被理解为本发明不限于特定的基因、化验分析技术、生理状况等等，因为其可以变化。本文所用的术语目的仅仅在于描述特定的实施方案但并不意味着限制也是可以理解的。

除非上下文清楚地规定，否则单数形式“a”，“an”和“the”包括复数的情况。于是，例如“一个基因”的参考包括单个基因，也包括两个或更多基因；“一种试剂”的参考包括关于单种试剂或两种或更多试剂；“骨病变”的参考包括一种骨病变或多种骨病变；等等。

术语“骨病变”包括任何骨障碍或缺陷包括但不限于骨癌、骨矿化缺陷或由于如骨折、“青枝状”骨折或骨头碎板后需要进行的骨修复、以骨缝为基础的头盖障碍如颅缝早闭、细胞骨架障碍、骨质疏松症或其他生化或结构缺陷。术语“骨病变”不认为被限制于任何一种状况、疾病或缺陷。然而一种特别的状况，是颅缝早闭。术语“骨病变”也指骨健康的水平。因此，某种靶标基因或靶标产物可以用于维持或促进骨健康。

本发明也考虑了例如导致骨矿物质含量损失的多种状况。具有这样的症状的病人可以利用熟知的技术通过临床诊断来确定。这些可以被治疗的疾病的典型实例包括发育异常，其中有骨的异常生长和发育如软骨发育不全、颅骨锁骨发育不良、内生软骨瘤病、纤维发育异常、戈谢病(Gaucher′s disease)、低磷酸盐血症性佝偻病、马方综合症、遗传性多发性外生性骨疣、神经纤维瘤病、成骨不全、骨骼石化症(oesteopetrosis)、脆弱性骨硬化、巩膜损伤、骨折、牙周病、假关节和脓性骨髓炎。

本文考虑的另一状况包括骨癌，其中具有骨骼或骨细胞转移到其中的其他组织中的骨细胞的异常生长。

本文考虑的其他状况包括各种各样骨质减少的原因(即引起大于骨矿物质含量或密度低于年轻人骨矿物质含量的峰值的标准偏差的状况)。这样的状况的典型实例包括由贫血、类固醇、肝磷脂、坏血症、营养不良、钙缺乏、先天性骨质疏松症、先天性骨质减少或骨质疏松症、短暂的区域性骨质疏松症和骨软化引起的状况。

术语“颅缝早闭”指颅盖缝过早融合。这种状况源于任何数量的状况包括亚伯特氏、Beare-Stevenson、波士顿、面骨发育不全、Jackson-Weiss、法伊弗氏、Saethre-Chotzen和Muenke综合症。超过100种综合症会引起颅缝早闭(见Muenke和Wilkie，2000同上)。

正如上面所指出的，可能出现帮助骨生长或促进骨健康的维护是非常重要的情况。因此，术语“病变”并不意味着必须是治疗疾病状况。其中受试者生物标记可用于非疾病状况的情况是老年人、年幼的婴儿、运动员和非人类动物如马。此外，在受试者中不是最适宜的骨生长可被促进；具有过度骨生长的受试者中的骨生长需要被抑制；并且骨癌生长也能被抑制。

术语“化合物”、“试剂”、“化学试剂”、“药理活性剂”、“药物”、“活性物”、“药剂”在本文交替使用，指化学的化合物，其能诱导期望的药理和/或生理效应。这个术语也包括了本文特别提到的药学上可接受和药理上有活性的成分，包括但不限于盐、酯、氨基化合物、前体药物、活性代谢物、类似物等等。当术语“化合物”、“试剂”、“化学试剂”、“药理活性剂”、“药物”、“活性物”、“药剂”被使用时，可以被理解为包括了活性剂本身以及药学上可接受的、药理上有活性的盐、酯、氨基化合物、前体药物、活性代谢物、类似物等等。前述的化合物可以特定的调节一个或更多差异表达基因的表达(即根据情况上调或下调表达)或它们可以调节基因产物的活性(即增加或减少基因产物的活性)或它们可以取代无效或低水平的基因产物。因此，本文考虑的化合物可以用于遗传治疗或蛋白质替代或蛋白质抑制治疗。就化合物是遗传分子来说，它可以是DNA、RNA、反义分子、正义分子、双链或单链RNA或DNA、短干扰RNA(siRNA)、RNA干扰(RNAi)或核酸和核糖核酸酶复合体。

“化合物”、“试剂”、“化学试剂”、“药理活性剂”、“药物”、“活性物”、“药剂”的参考包括两种或更多种活性剂的组合。“组合”也包括多部分如两部分组合，其中试剂分开提供和分开给予或分发或在分发前混合在一起。例如，一个多部分药物包可以有两种或更多种分别维持的试剂。

本文使用的术语试剂的“有效量”和“治疗有效量”指提供期望的治疗或生理作用或结果所需的足够量的试剂。这样的效应或结果包括调节靶标基因或基因产物的表达或活性或干扰的生理结果(如症状的改善)。不期望的作用，例如，副作用有时候会随着期望的治疗作用出现；因此，开业医生在决定适当的“有效量”是什么时要平衡潜在的利益及相对应潜在的风险。需要的确切量会因受试者不同而变化，这依赖于种群、年龄和受试者大体情况、给药的方式等等。因此，不可能确定确切的“有效量”。然而，本领域普通技术人员仅仅使用常规实验就可以决定任何单个例子的适当的“有效量”。

“有效量”也包括促进骨生长或全面健康的量。

“药学上可接受”的载体、赋形剂或稀释剂指制药的载体由物质组成，该物质不是生物学上或其他让人不期望的物质，即该物质可同所选的活性剂共同给予受试者而不会引起任何或实质性的副反应。载体可以包括赋形剂和其它添加剂如稀释剂、去污剂去污剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂、防腐剂等等。

相似地，本文提供的化合物的“药学上可接收的”盐、酯、酰胺、前体药物或化合物的衍生物是非生物学上或其他让人不期望的盐、酯、氨基化合物、前体药物或衍生物。

“处理”受试者可以包括在易受影响的个体上防止状况或其它不利的生理事件，以及通过改善状况的症状治疗有临床症状的个体。在促进全面骨健康或预防骨损害时，“预防”这个术语也可以使用。

本文使用的“受试者”是指动物，优选哺乳动物，更优选人类，其能够从本发明的制药配方和方法中获益。能从现在正描述的制药配方和方法中获益的动物类型没有限制。无论是否是人或非人类的动物的受试者都可以被称为个体、患者、动物、宿主或接受者。本发明的化合物和方法可应用在人用药、兽用药，以及通常地，可以用于驯养或野生动物饲养管理。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”本文可交替使用，指氨基酸残基聚合物。该术语应用于氨基酸聚合物，在此聚合物中一个或更多氨基酸残基是相应于天然产生氨基酸、天然产生氨基酸聚合物或重组聚合物的人工化学类似物。

术语“靶标基因”或“靶标基因产物”或“靶标蛋白质”包括基因或它的表达产物，其在未融合缝对已融合缝中上调或下调。表2、3和4提供了这些基因的表，其被术语“靶标基因”所包含。这些基因的表达产物例如是“靶标基因产物”。

本文使用的术语“抗体”包括各种经修饰和改变的抗体的形式，如完整的免疫球蛋白、仅包含轻链和重链可变区的Fv片段、通过二硫键连接的Fv片段(Brinkmann et al，Proc.Natl，Acad.Sci USA，90：547-551，1993)、包括可变区和部分恒定区的Fab或(Fab)’2片段、单链抗体等等(Bird et al，Science 242：424-426，1988；Huston et al，Proc.Nat.Acad.Sci USA，85：5879-5883，1988)。抗体可以是动物(特别是小鼠、大鼠、绵羊或山羊)源或人源或可以是重组的((Morrison et al，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，1984)或人源化的(Jones et al，Nature 321：522-525，1986)。

本文使用的术语“核酸”或“寡核苷酸”或语法同等词是指以共价键结合在一起的至少两个核苷酸。本发明的核酸优选单链的或双链的，通常含有磷酸二酯键，尽管在下面概述的一些例子中，核酸类似物也包括在内，其可以有可替换的骨架，包括例如磷酸胺(Beaucage et al，Tetrahedron 49(10)：1925，1993)和其中提及的参考；Letsinger，J.Org.Chem.35：3800，1970；Sprinzl et al，Eur.J.Biochem.81：579，1977；Letsinger et al，Nucl.Acids Res.14：3487，1986；Sawai et al，Chem.Lett.805：1984；Letsinger et al，J.Am.Chem.Soc.110：4470，1988和Pauwels et al，Chemica Scripta 26：1419，1986)、硫代磷酸(Mag et al，Nucleic Acids Res.19：1437，1991)；美国专利No.5,644,048和二硫代磷酸酯(Briu et al，J.Am.Chem.Soc.111：2321，1989)、O—methylphophoroamidite键(见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：APractical Approach，Oxford University Press)

其它核酸类似物包括那些具有正链骨架(positive backbones)(Denpcy et al，Proc.Natl.Acad.ScI USA，92：6097，1995)；非离子骨架(美国专利No.5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141和4,469,863；Angew，Chem.Intl.Ed English 30：423，1991；Letsinger等，1988上述；Letsinger et al，Nucleoside & Nucleotide 13：1597，1994；Chapters 2 and 3，ASC Symposium Series 580，Carbohydrate Modifications inAntisense Research，Ed.YS Sanghui and P Dan Cook；Mesmaeker et al，Bioorganic &Medicinal Chem.Lett.4：395，1994；Jeffs et al，J.Biomolecular NMR 34：17，1994；Tetrahedron，Lett 37：743，1996)和包括那些在以下文献中描述的非核糖骨架，如美国专利No.5,235,033和5,034,506，和Chapter 6 and 7，ASC Symposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research，Ed.YS Sanghui and P Dan Cook。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸定义中(Jenkins et al，Chem.Soc.Rev.：169-176，1995)。几个核酸类似物在Rawls，C & ENews：35，1997中公开。可以对磷酸核糖骨架进行这样的修饰以促进增加额外的部分如标记，或增加这样的分子在生理环境中的稳定性和半衰期。

术语“测试剂”指能在一个或多个本文所描述的分析实验中被筛选的试剂。该试剂事实上可以是任何化学物质。它可以作为单独被分离的化合物存在或是化学(如组合的)库中的一员。在特别优选的实施方案中，测试剂是小的有机分子。

又，术语“试剂”可以用“化合物”、“分子”、“药剂”和其它上述列举的类似词替代。

“基因”包括基因组基因或cDNA分子。术语“基因”、“cDNA”、“核酸分子”和“核苷酸序列”可以交替使用。“核酸分子”可以是RNA或DNA。

“生物标记”可以是基因或基因产物。“基因产物”可以是蛋白质或RNA。

因此，本发明的一个方面考虑了用于治疗或预防受试者骨病变，减少骨病变发展的危险的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的试剂，该试剂调节遗传物质的表达或遗传物质编码的产物的活性，其中遗传物质在未融合相较于已融合的颅盖缝差异表达。

本发明更进一步提供用于促进受试者的骨生长或健康的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的试剂，该试剂调节遗传物质的表达或遗传物质编码的产物的活性，其中遗传物质在未融合相较于已融合的颅盖缝差异表达。

上面给出了骨病变的例子。

相应地，本发明的特定的例子提供了用于治疗或预防选自一种或多种骨癌、骨矿化缺陷、骨折、以骨缝为基础的头盖障碍、细胞骨架障碍、骨质疏松症或其它生化或结构异常或疾病的状况的方法，所述方法包括给予所述受试者调节基因表达水平或基因产物的试剂，这种调节在未融合缝相较于融合缝是上调或下调的。

骨癌的生物标记例子包括但不仅限于GPC3、RBP4、C1QTNF3、FMOD、WIF1、PRELP、PTN和CYFIP2，它们的表达谱显示在表5中。

因此，本发明提供了一系列生物标记，包括在受试者的未融合缝相较于已融合缝差异表达的一个或多个基因或基因产物。

在未融合骨缝上调节基因的例子包括但不限于MFAP4、RBP4、IL1 1RA、AMPH、INHBA、C1QTNF3、PRELP、FBLN1、ANGPTL2、AGC1、FMOD、OLFM1、Clorf24、AGC1、SSPN、PTN、MN1、TNN、EGFR、ADCY2、PDZRN3、SPON1、GPC3、HAPLN1、BCL11B、FLRT3、STXBP6、THBS2、KIAA0992、COL3A1、PAM、LSS、COL11A1、TOX、TRIM2、COL8A2、CRISPLD2、BHLHB3、EPHB2、DUSP10、OLFM1、TUBB2、SETBP1、ROR1、TGFB2、ISLR、PRSS11、COL16A1、S100A10、COL8A2、LOXL1、TRIM2、POSTN、LOXL2、CCND2、SSPN、ZCWCC2、ITGBL1、FLJ20701、PAM、ITGB5、MFAP2、CALD1、PTGER4、DIRAS3、THBS3、SIX2、COL6A1、ODZ3、AEBP1、EFEMP1、CAP2、DCAMKL1、ITGB5、CaMKIINalpha、JUN、SPON2、GAP43、EYA2、SNCAIP、EDG2、DNM1、PDZRN4、OGN、ASPN、MID1、ITGB5、EPHA4、RYR3、ATBF1、MEG3、HLF、OSBPL3、PDGFRL、DCHS1、GPC1、CDC42BPA、PTPRF、FGFR2、TLE2、COL6A3、FAT4、MMP14、MID1、LAMA2、LAMC1、EMX2、TMEFF1、PPP2R3A、ITM2A、MEG3、HS3ST3A1、RUNX1T1、PLAGL1、EPLIN、PLEKHA1、EGFL6、ARG2、MATN2、EDIL3、PCSK5、TGFB2、GULP1、MMP2、NELL2、PITX2、DACT1、DUSP10、NEDD4L、TMEM30B、TACC2、EWSR1、ITM2A、FGFR2、ANTXR1、PLCB1、MCC、HLF、TYRO3、FZD1、MT1X、NA、GULP1、OLFML1、ZFHX4、C3orf14、TAGLN、WASL、OSBPL3、SAMD4、CAPN6、FLJ12442、TGFB2、SEMA3C、SPOCK、KCNK1、COL2A1、LAMA2、LMNA、GOLPH4、C14orf78、ARL7、ELOVL4、DPYSL3、TGFB3、COL10A1、PLOD3、GPNMB、COL14A1、TCF8、THY1、EHD2、PNMA2、MEIS2、DNCI1、FKBP14、RUNX1T1、COL6A2、RBM9、CCND1、NAP1L3、LRRN3、TIMP3、LOC133619、IGF1、GOLPH2、MAB21L2、PCLO、PRRX2、COL2A1、GDF10、PPP2R3A、PRSS23、SYNC1、IL6ST、LRRN3、PCSK5、NAV3、MAB21L2、GRP、FAP、GEM、EPHA3、MMP23B、TCEAL2、CREB5、KAL1、HSPA1B、FLJ10970、TPSAB1、SCRG1、TBC1D19、TPSB2、HCFC1R1、TPSAB1、SC65、ATF3、CART1、WIF1和HLA-DRB1。

在已融合骨缝上调的基因的例子包括但不限于CYFIP2、ABCG1、ANXA3、FABP4、DPYD、SHOX2、RNASE6、CHD7、HIST1H1E、CASP1、FLI1、ATF7IP2、ST6GAL1、MMD、LOC54103、PTPRE、PTPN22、TNFSF10、RAB11FIP1、MYCBP、RASSF2、SCAP2、HHEX、CD163、C18orf1、RAB27A、LOC54103、IL7R、GPR126、P2RY14、ARHGAP15、FCER1G、RGS2、HLA-DMB、PLSCR1、TRIM22、FAM60A、CD300A、BLM、PARP8、LAPTM5、CG018、LIG4、RAC2、RAB20、LOC93349、GENX-3414、E2F5、DKFZP586A0522、ACSL1、OAS2、IQGAP2、CLEC2D、HLA-DMA、ZNF588、CD53、SLC4A4、TACSTD1、CXCR4、MFAP3L、TLR2、LCP2、LRMP、IL8RB、ARHGAP19、CXCR4、C1orf38、FLJ11127、LY75、HLA-DRA、MAPK14、PTPRC、SLA、ENPP4、PLCG2、PLEKHF2、STX3A、CENTD1、RIF1、PTPRC、VWF、TTF2、CAPN3、TARP、PRKAR2B、EVI2B、GPLD1、HLA-DQB1、OLR1、NCB5OR、NPL、SLC15A2、TPD52、LCP1、HEM1、PSMB8、RHOH、FCGR3B、KIAA0125、SOCS2、CDC7、QRSL1、SCAP2、BIN2、GMFG、WBSCR5、PYGL、RRAGD、CXCR4、BCL2A1、GZMB、PSMB9、SMC2L1、LY64、ME2、MCM10、AMPD3、IL18RAP、P2RY13、IGHG1、HMOX1、TKT、SLCO4C1、IGLC2、PSCDBP、PRKCB1、LRMP、GAS7、ORM1、CCR2、CRISP2、HERC5、OIP5、SCAP2、GNG4、POLQ、HLA-DPA1、MS4A4A、DC12、FLJ22662、ITK、GIT2、TPD52、SYK、GCH1、ORM1、IMP-3、CD69、MME、ZNFN1A1、MCTP2、MS4A1、RAC2、CEACAM1、ATP8B4、ISG20、TAL1、CD38、RAG2、CUGBP2、BLNK、IMPA2、CRHBP、PLK4、ME2、ARHGDIB、TNFRSF17、BRRN11、CD74、AIF1、MONDOA、CCNA2、CLC、S100A12、CEACAM8、PLAC8、SORL1、LTF、POU2AF1、LCN2、OLFM4、CRISP3、MPO、TCL1A、MPO、DNTT、PRTN3、S100A9、MS4A3、RNASE3、MMP8、MNDA、SELL、ALOX5、HP、SNCA、CAMP、FCN1、ARG1、CEACAM6、GCA、MYB、RNASE2、IGHM、IRF4、RAG1、FCGR3B、TCN1、TCL1A、CORO1A、SPTA1、CEACAM6、PADI4、CSTA、PF4、GYPA、CD37、S100P、NCF2、PRG1、ALAS2、HLA-DQB1、CYP4F3、ALOX5AP、MGAM、IGLL1、IGHM、C13orf18、VPREB1、HBG2和CHI3L1。

特别有用的生物标记包括但不限于PRELP、RBP4、C1QTNF3、GPC3、CYFIP2、MFAP4、IL11RA、INHBA、WIF1、ANXA3、CASP1、SHOX2、FMOD、FBLN1、OGN和PTN。

更加特别有用的基因包括但不限于GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1和SHOX2。GPC3、RBP4和C1QTNF3在未融合骨缝中高表达，而WIF1、ANXA3和SHOX2在已融合和正融合骨缝中高表达。

上面基因的参考包括多态突变体和其衍生物以及其同源物。

相应地，本发明的另一方面考虑了治疗或减少受试者骨病变发展的风险的方法，所述方法包括给予所述受试者能下调基因或基因产物的试剂，该基因或基因产物选自MFAP4、RBP4、IL11RA、AMPH、INHBA、C1QTNF3、PRELP、FBLN1、ANGPTL2、AGC1、FMOD、OLFM1、C1orf24、AGC1、SSPN、PTN、MN1、TNN、EGFR、ADCY2、PDZRN3、SPON1、GPC3、HAPLN1、BCL11B、FLRT3、STXBP6、THBS2、KIAA0992、COL3A1、PAM、LSS、COL11A1、TOX、TRIM2、COL8A2、CRISPLD2、BHLHB3、EPHB2、DUSP10、OLFM1、TUBB2、SETBP1、ROR1、TGFB2、ISLR、PRSS11、COL16A1、S100A10、COL8A2、LOXL1、TRIM2、POSTN、LOXL2、CCND2、SSPN、ZCWCC2、ITGBL1、FLJ20701、PAM、ITGB5、MFAP2、CALD1、PTGER4、DIRAS3、THBS3、SIX2、COL6A1、ODZ3、AEBP1、EFEMP1、CAP2、DCAMKL1、ITGB5、CaMKIINalpha、JUN、SPON2、GAP43、EYA2、SNCAIP、EDG2、DNM1、PDZRN4、OGN、ASPN、MID1、ITGB5、EPHA4、RYR3、ATBF1、MEG3、HLF、OSBPL3、PDGFRL、DCHS1、GPC1、CDC42BPA、PTPRF、FGFR2、TLE2、COL6A3、FAT4、MMP14、MID1、LAMA2、LAMC1、EMX2、TMEFF1、PPP2R3A、ITM2A、MEG3、HS3ST3A1、RUNX1T1、PLAGL1、EPLIN、PLEKHA1、EGFL6、ARG2、MATN2、EDIL3、PCSK5、TGFB2、GULP1、MMP2、NELL2、PITX2、DACT1、DUSP10、NEDD4L、TMEM30B、TACC2、EWSR1、ITM2A、FGFR2、ANTXR1、PLCB1、MCC、HLF、TYRO3、FZD1、MT1X、NA、GULP1、OLFML1、ZFHX4、C3orf14、TAGLN、WASL、OSBPL3、SAMD4、CAPN6、FLJ12442、TGFB2、SEMA3C、SPOCK、KCNK1、COL2A1、LAMA2、LMNA、GOLPH4、C14orf78、ARL7、ELOVL4、DPYSL3、TGFB3、COL10A1、PLOD3、GPNMB、COL14A1、TCF8、THY1、EHD2、PNMA2、MEIS2、DNCI1、FKBP14、RUNX1T1、COL6A2、RBM9、CCND1、NAP1L3、LRRN3、TIMP3、LOC133619、IGF1、GOLPH2、MAB21L2、PCLO、PRRX2、COL2A1、GDF10、PPP2R3A、PRSS23、SYNC1、IL6ST、LRRN3、PCSK5、NAV3、MAB21L2、GRP、FAP、GEM、EPHA3、MMP23B、TCEAL2、CREB5、KAL1、HSPA1B、FLJ10970、TPSAB1、SCRG1、TBC1D19、TPSB2、HCFC1R1、TPSAB1、SC65、ATF3、CART1、WIF1或HLA-DRB1或上调基因或基因产物的表达，该基因或基因产物选自CYFIP2、ABCG1、FABP4、ANXA3、DPYD、SHOX2、RNASE6、CHD7、HIST1H1E、CASP1、FLI1、ATF7IP2、ST6GAL1、MMD、LOC54103、PTPRE、PTPN22、TNFSF10、RAB11FIP1、MYCBP、RASSF2、SCAP2、HHEX、CD163、C18orf1、RAB27A、LOC54103、IL7R、GPR126、P2RY14、ARHGAP15、CASP1、FCER1G、RGS2、HLA-DMB、PLSCR1、TRIM22、FAM60A、CD300A、BLM、PARP8、LAPTM5、CG018、LIG4、RAC2、RAB20、LOC93349、GENX-3414、E2F5、DKFZP586A0522、ACSL1、OAS2、IQGAP2、CLEC2D、HLA-DMA、ZNF588、CD53、SLC4A4、TACSTD1、CXCR4、MFAP3L、TLR2、LCP2、LRMP、IL8RB、ARHGAP19、CXCR4、C1orf38、FLJ11127、LY75、HLA-DRA、MAPK14、PTPRC、SLA、ENPP4、PLCG2、PLEKHF2、STX3A、CENTD1、RIF1、PTPRC、VWF、TTF2、CAPN3、TARP、PRKAR2B、EVI2B、GPLD1、HLA-DQB1、OLR1、NCB5OR、NPL、SLC15A2、TPD52、LCP1、HEM1、PSMB8、RHOH、FCGR3B、KIAA0125、SOCS2、CDC7、QRSL1、SCAP2、BIN2、GMFG、WBSCR5、PYGL、RRAGD、CXCR4、BCL2A1、GZMB、PSMB9、SMC2L1、LY64、ME2、MCM10、AMPD3、IL18RAP、P2RY13、IGHG1、HMOX1、TKT、SLCO4C1、IGLC2、PSCDBP、PRKCB1、LRMP、GAS7、ORM1、CCR2、CRISP2、HERC5、OIP5、SCAP2、GNG4、POLQ、HLA-DPA1、MS4A4A、DC12、FLJ22662、ITK、GIT2、TPD52、SYK、GCH1、ORM1、IMP-3、CD69、MME、ZNFN1A1、MCTP2、MS4A1、RAC2、CEACAM1、ATP8B4、ISG20、TAL1、CD38、RAG2、CUGBP2、BLNK、IMPA2、CRHBP、PLK4、ME2、ARHGDIB、TNFRSF17、BRRN1、CD74、AIF1、MONDOA、CCNA2、CLC、S100A12、CEACAM8、PLAC8、SORL1、LTF、POU2AF1、LCN2、OLFM4、CRISP3、MPO、TCL1A、MPO、DNTT、PRTN3、S100A9、MS4A3、RNASE3、MMP8、MNDA、SELL、ALOX5、HP、SNCA、CAMP、FCN1、ARG1、CEACAM6、GCA、MYB、RNASE2、IGHM、IRF4、RAG1、FCGR3B、TCN1、TCL1A、CORO1A、SPTA1、CEACAM6、PADI4、CSTA、PF4、GYPA、CD37、S100P、NCF2、PRG1、ALAS2、HLA-DQB1、CYP4F3、ALOX5AP、MGAM、IGLL1、IGHM、C13orf18、VPREB1、HBG2和CHI3L1的列表。

上述基因的上调至少比对照组高至少2倍到至少高达100倍，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100倍的上调。

从至少大致2倍到至少大致40倍的上调值是优选的，而从至少大致10倍到至少大致40倍的值是特别优选的。

本发明也提供遗传构建物，其包括编码核酸分子或其反义形式或其以选自在未融合缝相较于融合缝中的表达上调或下调的核酸分子为靶标，如基因选自MFAP4、RBP4、IL11RA、AMPH、INHBA、C1QTNF3、PRELP、FBLN1、ANGPTL2、AGC1、FMOD、OLFM1、C1orf24、AGC1、SSPN、PTN、MN1、TNN、EGFR、ADCY2、PDZRN3、SPON1、GPC3、HAPLN1、BCL11B、FLRT3、STXBP6、THBS2、KIAA0992、COL3A1、PAM、LSS、COL11A1、TOX、TRIM2、COL8A2、CRISPLD2、BHLHB3、EPHB2、DUSP10、OLFM1、TUBB2、SETBP1、ROR1、TGFB2、ISLR、PRSS11、COL16A1、S100A10、COL8A2、LOXL1、TRIM2、POSTN、LOXL2、CCND2、SSPN、ZCWCC2、ITGBL1、FLJ20701、PAM、ITGB5、MFAP2、CALD1、PTGER4、DIRAS3、THBS3、SIX2、COL6A1、ODZ3、AEBP1、EFEMP1、CAP2、DCAMKL1、ITGB5、CaMKIINalpha、JUN、SPON2、GAP43、EYA2、SNCAIP、EDG2、DNM1、PDZRN4、OGN、ASPN、MID1、ITGB5、EPHA4、RYR3、ATBF1、MEG3、HLF、OSBPL3、PDGFRL、DCHS1、GPC1、CDC42BPA、PTPRF、FGFR2、TLE2、COL6A3、FAT4、MMP14、MID1、LAMA2、LAMC1、EMX2、TMEFF1、PPP2R3A、ITM2A、MEG3、HS3ST3A1、RUNX1T1、PLAGL1、EPLIN、PLEKHA1、EGFL6、ARG2、MATN2、EDIL3、PCSK5、TGFB2、GULP1、MMP2、NELL2、PITX2、DACT1、DUSP10、NEDD4L、TMEM30B、TACC2、EWSR1、ITM2A、FGFR2、ANTXR1、PLCB1、MCC、HLF、TYRO3、FZD1、MT1X、NA、GULP1、OLFML1、ZFHX4、C3orf14、TAGLN、WASL、OSBPL3、SAMD4、CAPN6、FLJ12442、TGFB2、SEMA3C、SPOCK、KCNK1、COL2A1、LAMA2、LMNA、GOLPH4、C14orf78、ARL7、ELOVL4、DPYSL3、TGFB3、COL10A1、PLOD3、GPNMB、COL14A1、TCF8、THY1、EHD2、PNMA2、MEIS2、DNCI1、FKBP14、RUNX1T1、COL6A2、RBM9、CCND1、NAP1L3、LRRN3、TIMP3、LOC133619、IGF1、GOLPH2、MAB21L2、PCLO、PRRX2、COL2A1、GDF10、PPP2R3A、PRSS23、SYNC1、IL6ST、LRRN3、PCSK5、NAV3、MAB21L2、GRP、FAP、GEM、EPHA3、MMP23B、TCEAL2、CREB5、KAL1、HSPA1B、FLJ10970、TPSAB1、SCRG1、TBC1D19、TPSB2、HCFC1R1、TPSAB1、SC65、ATF3、CART1、WIF1、HLA-DRB1、CYFIP2、ABCG1、FABP4、DPYD、SHOX2、ANXA3、RNASE6、CHD7、HIST1H1E、CASP1、FLI1、ATF7IP2、ST6GAL1、MMD、LOC54103、PTPRE、PTPN22、TNFSF10、RAB11FIP1、MYCBP、RASSF2、SCAP2、HHEX、CD163、C18orf1、RAB27A、LOC54103、IL7R、GPR126、P2RY14、ARHGAP15、CASP1、FCER1G、RGS2、HLA-DMB、PLSCR1、TRIM22、FAM60A、CD300A、BLM、PARP8、LAPTM5、CG018、LIG4、RAC2、RAB20、LOC93349、GENX-3414、E2F5、DKFZP586A0522、ACSL1、OAS2、IQGAP2、CLEC2D、HLA-DMA、ZNF588、CD53、SLC4A4、TACSTD1、CXCR4、MFAP3L、TLR2、LCP2、LRMP、IL8RB、ARHGAP19、CXCR4、C1orf38、FLJ11127、LY75、HLA-DRA、MAPK14、PTPRC、SLA、ENPP4、PLCG2、PLEKHF2、STX3A、CENTD1、RIF1、PTPRC、VWF、TTF2、CAPN3、TARP、PRKAR2B、EVI2B、GPLD1、HLA-DQB1、OLR1、NCB5OR、NPL、SLC15A2、TPD52、LCP1、HEM1、PSMB8、RHOH、FCGR3B、KIAA0125、SOCS2、CDC7、QRSL1、SCAP2、BIN2、GMFG、WBSCR5、PYGL、RRAGD、CXCR4、BCL2A1、GZMB、PSMB9、SMC2L1、LY64、ME2、MCM10、AMPD3、IL18RAP、P2RY13、IGHG1、HMOX1、TKT、SLCO4C1、IGLC2、PSCDBP、PRKCB1、LRMP、GAS7、ORM1、CCR2、CRISP2、HERC5、OIP5、SCAP2、GNG4、POLQ、HLA-DPA1、MS4A4A、DC12、FLJ22662、ITK、GIT2、TPD52、SYK、GCH1、ORM1、IMP-3、CD69、MME、ZNFN1A1、MCTP2、MS4A1、RAC2、CEACAM1、ATP8B4、ISG20、TAL1、CD38、RAG2、CUGBP2、BLNK、IMPA2、CRHBP、PLK4、ME2、ARHGDIB、TNFRSF17、BRRN1、CD74、AIF1、MONDOA、CCNA2、CLC、S100A12、CEACAM8、PLAC8、SORL1、LTF、POU2AF1、LCN2、OLFM4、CRISP3、MPO、TCL1A、MPO、DNTT、PRTN3、S100A9、MS4A3、RNASE3、MMP8、MNDA、SELL、ALOX5、HP、SNCA、CAMP、FCN1、ARG1、CEACAM6、GCA、MYB、RNASE2、IGHM、IRF4、RAG1、FCGR3B、TCN1、TCL1A、CORO1A、SPTA1、CEACAM6、PADI4、CSTA、PF4、GYPA、CD37、S100P、NCF2、PRG1、ALAS2、HLA-DQB1、CYP4F3、ALOX5AP、MGAM、IGLL1、IGHM、C13orf18、VPREB1、HBG2和CHI3L1。

特别有用的靶标基因是PRELP、RBP4、C1QTNF3、GPC3、CYFIP2、MFAP4、IL11RA、INHBA、WIF1、ANXA3、CASP1、SHOX2、FMOD、FBLN1、OGN和PTN。

更加特别有用的靶标基因是GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1和SHOX2。

与骨形态相关的差别表达基因的鉴定使待发展的治疗和诊断方案成为可能。治疗方案包括调节基因表达、基因替代和蛋白质活性调节或蛋白质替代治疗。诊断方案包括以遗传和蛋白质为基础的分析化验，目的在于确定基因表达或基因产物的水平和/或在基因或基因产物中的任何突变的存在。

本发明因此更进一步提供一种或多种在受试者未融合缝相较于融合缝差别表达的基因或基因产物在制造治疗骨病变的药物中的用途。

差别表达在颅缝早闭患者中很容易确定。因此，本发明考虑了一些靶标基因，其异常表达导致缝过早融合，但其也可以与其他上面列举的骨病变相关。

因此，在本发明的另一个实施方案中提供了筛选可以调节与骨病变相关的靶标基因或靶标基因产物的活性水平的试剂的方法。该方法包括用测试剂接触含有靶标基因的测试细胞并检测与对照细胞中的靶标基因的表达或靶标基因产物的活性相比较的测试细胞中靶标基因表达水平或靶标基因产物的活性的变化，其中测试细胞中靶标基因的表达水平或靶标基因产物的活性与对照细胞中的表达差别表明所述的试剂可以调节骨病变的症状。在特定实施方案中，对照是负对照细胞，该负对照细胞接触的测试剂的浓度低于受试细胞。在不同实施方案中，靶标基因的表达水平可通过测量所述细胞中靶标基因mRNA的水平来检测和/或通过确定生物细胞中蛋白质的水平来测定靶标基因产物的水平。

因此本发明提供治疗剂，其与靶标基因、靶标基因的转录产物或其他基因产物(如一个蛋白质)相互作用。在这样的治疗剂的设计中通常要采取几个步骤。首先，确定靶标对表达或活性起关键作用的特定部分。就蛋白质来说，例如，能通过系统性改变多肽中的氨基酸残基完成该步骤，例如，通过依次取代每一个残基。例如，蛋白质的丙氨酸扫描(Alanine scans)被普遍用于确定如此的蛋白质基序。构成化合物的活性区域的这些部分或残基称为它的“药效团”。正如上面所指出的，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可以交替使用。

一旦找到药效团，根据它的物理特性，如立体化学、键、大小和/或电荷，并使用从一系列来源如分光镜技术、X-衍射数据和核磁共振得来的数据，可模拟出它的结构。计算分析、相似性映射(能模拟药效团的电荷和/或容积，而不是原子间的结合)和其它技术能被用于这个模拟过程。

在这种方法的一个变化中，模拟了靶标的三维结构。模拟能被用来产生试剂，该试剂和线性序列或三维构象发生相互作用。

然后选择模板分子，其中模拟药效团的化学基团能结合在上面。模板分子和结合到其上面的化学基团能被方便地选择以使治疗剂易于合成，可能是药学上可接受的，而且在体内不会降解，同时保持先导化合物的生物活性。作为选择的，其中该试剂是基于肽的，通过将肽环化和增加它的刚性能获得更进一步的稳定性。然后对通过这个途径找到的试剂进行筛选看是否有靶标性质，或它们能调节靶蛋白活性或调节靶标基因表达到什么程度。随后可进行更进一步的优化或修饰以获得一个或多个用于体内或临床测试的最终试剂。

合理的药物设计的目标是生成目标生物活性多肽或它们与其相互作用的小分子(如激动剂、拮抗剂、抑制剂或增强剂)的结构类似物或拮抗剂，以形成药物，该药物是，例如多肽的具有更多活性或更稳定形式，或该药物，例如增强或阻碍多肽在体内的功能(参见例如，Hodgson，BioTechnology 9：19-21，1991)。

本发明考虑了调节靶标基因表达的试剂。这尤其包括对细胞提供基因功能如在基因治疗中，或它也包括使用基因沉默构建物包括反义寡聚核苷酸或表达构建物抑制基因功能。

靶标核酸序列或核酸序列的部分，如能调节核酸表达的核酸序列可以被用载体引入细胞以便使核酸序列保持在染色体外。在这样的状况下，核酸序列将在细胞染色体外的地方被表达。用于引入用于重组和染色体外维持的核酸序列的载体在本领域公知，因此可以使用任何适合的载体。引导核酸进入细胞的方法如电穿孔、磷酸钙共沉淀反应和病毒转导在本领域是已知的。

特别地，许多病毒已经被用作核酸转移载体或作为制备核酸转移载体的基础，包括乳头多瘤空泡病毒(例如SV40，Madzak et al，J Gen Virol 73：1533-1536，1992)、腺病毒(Berkner，Curr Top Microbiol Immunol 158：39-66，1992；Berkner et al，BioTechniques 6：616-629，1988；Gorziglia and Kapikian，J Virol 66：4407-4412，1992；Quantin et al，Proc Natl Acad Sci USA 89：2581-2584，1992；Rosenfeld et al，Cell68：143-155，1992；Wilkinson et al，Nucleic Acids Res 20：233-2239，1992；Stratford-Perricaudet et al，Hum Gene Ther 1：241-256，1990；Schneider et al，NatGenetics 18：180-183，1998)、牛痘病毒(Moss，Curr Top Microbiol Immunol 158：5-38，1992；Moss，Proc Natl Acad Sci USA 93：11341-11348，1996)、腺病毒相关病毒(Muzyczka，Curr Top Microbiol Immunol 158：97-129，1992；Ohi et al，Gene89：279-282，1990；Russell and Hirata，Nat Genetics 18：323-328，1998)、疱疹病毒包括HSV和EBV(Margolskee，Curr Top Microbiol Immunol 158：67-95，1992；Johnson etal，J Virol 66：2952-2965，1992；Fink et al，Hum Gene Ther 3：1-19，1992；Breakefieldand Geller，Mol Neurobiol 1：339-371，1987；Freese et al，Biochem Pharmaco.40：2189-2199，1990；Fink et al，Ann Rev Neurosci 19：265-287，1996)、慢病毒(Naldiniet al，Science 272：263-267，1996)、辛德比斯和Semliki森林病毒(Berglund et al，Biotechnology 11：916-920，1993)和鸟源反转录病毒(Bandyopadhyay and Temin，MolCell Biol 4：749-754，1984；Petropoulos et al，J Virol 66：3391-3397，1992)、鼠源反转录病毒(Miller，Curr Top Microbiol Immunol 158：1-24，1992；Miller et al，Mol CellBiol 5：431-437，1985；Sorge et al，Mol Cell Biol 4：1730-1737，1984；Mann andBaltimore，J Virol 54：401-407，1985；Miller et al，J Virol 62：4337-4345，1988)和人源反转录病毒(Shimada et al，J Clin Invest 88：1043-1047，1991；Helseth et al，J Virol64：2416-2420，1990；Page et al，J Virol 64：5270-5276，1990；Buchschacher andPanganiban，J Virol 66：2731-2739，1982)。

本领域公知非病毒核酸转移方法，如化学技术包括磷酸钙共沉淀反应、机械技术如显微注射、经由脂质体的膜融合介导转移和直接DNA摄入和受体介导DNA转移。病毒介导的核酸转移能同使用脂质体输送的直接的体内核酸转移结合，允许将病毒载体定向到特定的细胞。作为选择的，逆转录酶病毒载体生产者细胞系可以被注入特定的组织。注入的生产者细胞随后能提供持续的载体粒子源。

本发明更进一步考虑反义和正义分子如多聚核苷酸序列的引入，其可用于靶标基因的转录沉默。核酶、微RNAs、合成RNAi、DNA来源的RNAi以及双链RNA也可以被引入。包括反义沉默的转录前和转录后的基因沉默都被考虑。此外，包括所有或部分编码靶标基因的表达产物的基因座位的多核苷酸载体可以在启动子的控制下放在一个反义或正义的位置并引入进细胞。这样的在细胞内的正义或反义构建物的表达干扰靶标转录和/或翻译。

在一个实施方案中，基因工程化的遗传分子编码用来调节靶标基因的表达的寡核苷酸和类似物，即寡核苷酸诱导转录前或转录后基因沉默。通过提供寡核苷酸，其特定地杂交至或靶向一个或多个编码靶标基因产物的靶标核酸分子，完成基因沉默。因此，构建物尤其可以编码微RNA、dsRNA、发夹RNAs、RNAi、siRNA或DNA。如本文所用，术语“靶标基因”方便的用来包括编码靶标基因产物的DNA、从这样的DNA转录的RNA(包括前体mRNA和mRNA或其部分)和来源于这样的RNA的cDNA。

在另一个实施方案中，本发明提供包括给予受试者能调节在未融合缝相较于已融合缝中差别表达的基因的表达的试剂治疗或预防疾病或状况，其特征是骨病变或引起骨病变。该方法包括促进骨生长或骨全面健康。正如以上指出的，可以给予非遗传治疗剂。本发明的试剂能结合一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂以形成药物组合物。药学上可接受的载体包括生理学上可接受的化合物，其作用为例如稳定或增加或减少本发明的药物组合物的吸收或清除率。生理上可接受的化合物包括如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷，抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质，减少肽或多肽的清除或水解的组合物，或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。去污剂也可以用于稳定或增加或减少药物组合物的吸收，包括脂质体载体。关于肽和多肽的药学上可接受的载体和配方对本领域技术人员是熟知的，并在科学和专利文献中有详细的描述，参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18^th Edition，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990(＂Remington′s＂)。

其他生理上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或特别用于阻止微生物生长或活动的防腐剂。各种防腐剂是众所周知的，包括如苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员会意识到，选择药学上可接受的载体包括生理上可以接受的化合物依赖于，例如，本发明的调节剂的给药途径和其特定的理化特性。

以药物组合物的形式给予试剂可以通过本领域技术人员公知的任何合适的方式进行实施。给药的途径包括但不限于呼吸、气管内、鼻咽、静脉内、腹腔内、皮下、颅内、皮内、肌内、眼内、鞘内、脑内、鼻内、经口、经直肠、贴剂和植入。

对于口服给药，化合物可以配方为固体或液体制备物如胶囊、丸剂、片剂、锭剂、粉剂、悬浮剂或乳剂。在制备口服形式的组合物时，可以使用任何通常的药物介质，如水、乙二醇、油乙醇、乙醇、调味剂、防腐剂、染色剂、悬浮剂和口服液体制备物的情况等等(像，例如悬浮剂，酏剂和溶液)；或载体如淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等(像，例如粉剂、胶囊和片剂)。由于很容易给药，片剂和胶囊剂代表了最有利的口服剂量单位形式，在这样的情况下，很明显使用的是固体制药载体。如果需要，可使用标准技术将片剂包糖衣或肠溶衣。活性剂可以装入胶囊使之能稳定地通过胃肠道同时也允许穿过血脑屏障，参见例如国际专利公开号WO 96/11698。

当口服给药时，本发明的试剂可以进行保护免于被消化。完成这个保护可以通过将试剂与组合物复合以使它能抵抗酸和酶的水解，也可以通过将试剂包装到适当的有抵抗力的载体如脂质体中。保护化合物免于被消化的方法在本领域是众所周知的，参见例如Fix，Pharm Res 13：1760-1764，1996；Samanen et al，J PharmPharmacol 48：119-135，1996；美国专利No.5,391,377，其描述了用于口服传递治疗剂的脂质组合物。

适用于注射使用的药物形式包括用于制备无菌可注射的溶液或分散剂的无菌水溶液(其中，水溶性的)或分散剂和无菌粉末或可以是乳剂形式或其他适合于局部应用的形式。这个药物形式必须在制造和储藏条件下是稳定的，必须是防腐的，以防止如细菌和真菌等微生物的污染。载体可以是包含例如如水、乙醇、多羟基化合物(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等等)、其适当的混合物和植物油的溶剂或分散介质。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣剂如卵磷脂，在分散的状况下通过维持所需的粒子大小，和通过使用表面活性剂。可以通过各种抗菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、水杨乙汞等等，阻止微生物的活动。在许多情况中，优选包括等渗剂如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用推迟吸收的试剂如硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。

通过将所需量的试剂并入适当的溶液中，该溶液具有各种上面所列举的其他成分，假如需要的话，随后过滤灭菌后可制备无菌可注射溶液。通常，分散剂的制备是将各种灭菌的活性成分并入灭菌的载体中，该载体包括基本的分散介质和所需的来自上述列举的其他成分。在无菌粉末制备无菌可注射溶液的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其提供了来源于其前述无菌—过滤溶液的活性成分和任何额外所需的成分的粉末。

对于肠胃外给药，试剂可以溶解在药物载体中并可以以溶液形式或悬浮剂形式给予。适当载体的例子是水、生理盐溶水、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇或动物油、植物油或合成油。载体也可以包括其他成分，如防腐剂、悬浮剂、促溶剂、缓冲剂等等。当试剂是通过鞘内给予时，它们也可以被溶解在脑脊髓液中。

对于经粘膜或经皮给药的，可以使用适用于待渗透的障碍的渗透剂来传输试剂。这样的渗透剂在本领域普遍已知，比如，对于经粘膜给药的，可以用胆汁盐和梭链孢酸衍生物。另外，可使用去污剂促进渗透。经粘膜给药可以通过鼻喷剂或用如Sayani and Chien，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 13：85-184，1996中所述的栓剂进行。对于局部的经皮给药，试剂可以配方成软膏、乳膏、药膏、粉剂和凝胶剂。透皮给药系统也包括药物贴剂。

对于吸入给药，本发明的试剂可以用本领域已知的任何系统传递，包括干粉喷雾剂、液体给药系统、空气喷射喷雾器、推进系统等等，参见例如Patton，NatBiotech 16：141-143，1998；用于多肽大分子的产品和吸入给药系统，例如DuraPharmaceuticals(San Diego，CA)、Aradigm(Hayward，CA)、Aerogen(Santa Clara，CA)、Inhale Therapeutic Systems(San Carlos，CA)等等。例如，药物成份可以以喷雾剂或雾的形式给予。对于喷雾剂给药，成份需要以精细分离的形式和表面活性剂以及推进物给予。在另一方面，将成份传递到呼吸组织的装置是吸入器，在吸入器中成份被汽化。其他的液体给药系统包括如空气喷射剂。

本发明的试剂也可以持续给药或持续释放机理给予，其能在体内输送试剂。例如，能持续不断地释放试剂的生物可分解的微球体或胶囊或其它生物可分解聚合物结构可包括在本发明的成份中(例如Putney and Burke，Nat Biotech 16：153-157，1998)。

在制备本发明的药品中，可以使用和操作多种成份修正以改变药物的药代动力学和生物分布。许多改变药代动力学和生物分布的方法是本领域普通技术人员已知的。这样的方法的例子包括将本发明的组合物保护在由物质如蛋白质、脂质(例如，脂质体)、碳水化合物或合成聚合物组成的小泡里。对药代动力学大体的讨论参见例如Remington′s。

在一个方面，将包括本发明的试剂的药物配方并入单层或双层脂质如脂质体，参见例如美国专利No.6,110,490；6,096,716；5,283,185和5,279,833。本发明也提供配方，其中本发明的水溶性调节剂附在单层或双层脂质体的表面。例如，肽可以附在包含酰肼-PEG-(distearoylphosphatidyl)乙醇胺的脂质体上(例如Zalipsky et al，Bioconjug Chem 6：705-708，1995)。脂质体或任何形式的脂质膜，如平面脂质膜或完整细胞如红血球的细胞膜都可以使用。脂质体配方可以以任何方式包括经静脉、经皮(Vutla et al，J Pharm Sci 85：5-8，1996)、经粘膜或经口给药。本发明也提供药物制备物，其中本发明的试剂被并入微囊和/或脂质体中(Suntres and Shek，J PharmPharmacol 46：23-28，1994；Woodle et al，Pharm Res 9：260-265，1992)。脂质体和脂质体配方可以根据标准方法制备，并且其在本领域众所周知，参见例如Remington′s；Akimaru et al，Cytokines Mol Ther 1：197-210，1995；Alving et al，Immunol Rev145：5-31，1995；Szoka and Papahadjopoulos，Ann Rev Biophys Bioeng 9：467-508，1980，美国专利No.4,235,871，4,501,728和4,837,028。

本发明的药物组合物能依据给药方式以多种单位剂量形式进行给予。典型的药物组合物的剂量是本领域的技术人员已知的。这样的剂量实际上是典型地指导性的，可以根据特定的治疗背景、病人的耐受力等进行调整。足以完成这个的试剂的量被定义为“有效量”。用于这个用途的剂量表和有效量，即“用药方案”依赖于许多因素，包括疾病或状况的阶段、疾病或状况的严重程度、病人健康的大致状况、病人的身体状况、年龄、药物配方和活性剂浓度等等。在为病人计划用药方案时，给药方式也应考虑到。用药方案也必需考虑药代动力学，即药物组合物的吸收率、生物利用度、新陈代谢、清除率等等。参见例如Remington′s；Egletonand Davis，Peptides 18：1431-1439，1997；Langer，Science 249：1527-1533，1990。

依照这些方法，根据本发明定义的试剂和/或药物组合物可以和一种或多种其它试剂共同给药。本文对“共同给药”的参考是指用相同的配方或以两种不同的配方经由相同或不同途径同时给予或通过相同或不同途径相继给予。本文对“相继”给予的参考指给予两种类型的试剂和/或药物组合物的时间间隔的不同从秒、分钟、小时或天。试剂和/或药物组合物的共同给药可以按任何次序进行。

本发明也有利于诊断和/或预测分析和试剂的开发，其用于识别疾病或状况的存在，或疾病或状况发展的倾向，或疾病或状况的严重程度，其中疾病或状况的特征是骨病变如与已融合骨缝相关的头盖骨异常。

因此，本发明考虑诊断或预测受试者骨病变的发展的方法，所述方法包括从受试者潜在受影响的骨或骨组织上分离样本，所述的样本包括遗传物质或蛋白质或被遗传物质编码的RNA，然后确定遗传物质的表达模式，其中特定遗传物质的表达相对于对照的上调或下调指示了骨病变或骨病变发展的风险。

因此，分析可以是基于遗传或蛋白质。特别有用的诊断靶标是上面所列举的。单个靶标可以被识别为上调或下调，或两个或多个的一列提供了轮廓，该轮廓本身指示了骨病变的存在或发展为骨病变的风险。

特别优选的诊断分析基于核酸，例如但不限于检测DNA的突变和mRNA的突变和水平。本文对DNA和mRNA的参考指与生物标记有关的核酸分子。在一个实施方案中，生物标记或一套生物标记中的突变预测骨病变例如但不限于颅缝早闭发展的可能性。本文对样本的参考，在其上进行基于核酸或蛋白质的分析，包括生物样本如血清、全血、血浆、粘液、组织液、组织提取物、骨组织活组织检查或其它来源的与骨病变相关的基因或蛋白质。

通过基因产物的转录(即mRNA的转录)的改变和/或基因产物翻译(即蛋白质的翻译)的改变和/或通过翻译后的修饰(即蛋白质折叠、糖基化等)来改变基因的表达水平。表达水平也可以被基因的突变水平所影响。因此本发明优选的分析包括分析转录的mRNA的水平、翻译的蛋白质的水平、活性或翻译的蛋白质或/和突变包括DNA或mRNA中的多态性。

例如，表达水平的改变可以通过检测mRNA和/或mRNA来源的核酸的改变(如反转录的cDNA等。)进行。为了检测靶标基因的表达水平，提供核酸样本进行这样的分析是渴望的。在优选的实施方案中，核酸在生物样本中发现或来源于生物样本。如本文所用，术语“生物样本”指从有机体或有机体的组分(如细胞)获得的样本。样本可以具有任何生物组织或液体。生物样本也可以包括器官或部分组织，如用于组织学目的冷冻组织切片。然而，通常，可以取骨样本，或在颅缝早闭的情况中，样本来源于颅缝。

“对照”通常是未融合缝对融合缝的基因表达模式。

在特定优选的实施方案中，核酸(如来源于mRNA的mRNA核酸)是根据本领域技术人员众所周知的许多方法中的任何方法从样本中分离出来的。分离mRNA的方法是本领域技术人员已知的。例如，分离和纯化核酸的方法在Tijssen，Ed，Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Theory and Nucleic Acid PreparationElsevier，NY and Tijssen，Ed中有详细的描述。

在优选的实施方案中，“总”核酸从给定样本中通过使用，例如，酸性胍盐—苯酚—氯仿提取方法和利用寡聚脱氧胸苷柱层析或通过使用多聚脱氧胸苷磁珠将聚腺苷酸+mRNA分离出来(参见Sambrook et al，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2^nd ed.)1-3：1989或Ausubel et al，Current Protocols in Molecular Biology，F，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1987)。

经常地，在分析表达水平前对核酸样本进行扩增是值得的。扩增核酸的方法对于本领域技术人员是众所周知，包括但不限于聚合酶链反应(PCR，如Innis et al，PCR Protocols，A Guide to Methods and Application.Academic Press，Inc.San Diego，1990)、连接酶链反应(LCR)(参见Wu and Wallace，Genomics 4：560，1989；Landegrenet al，Science 241：1077，1988和Barringer et al，Gene 89：117，1990)、转录扩增(Kwohet al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173，1989)、自主序列复制(Guatelli et al，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87：1874，1990)、点PCR(dot PCR)和连接子接头PCR(linkeradapter PCR)。

可以通过使用核酸杂交技术常规完成使用靶标基因的已知序列、靶标基因转录产物的检测和/或定量。(参见，Sambrook等，1989同上)。例如，一种评估靶标基因反转录cDNA的存在、缺乏或数量的方法是“Southern印迹”(“SouthernBlot”)。在Southern印迹中，典型地片段化并在电泳凝胶上分离的DNA(如反转录的靶标mRNA)，与特异于靶标基因的探针杂交。比较靶标基因探针与“对照”基因探针(如用于“管家基因”的探针)杂交信号的强烈程度就能提供靶标核酸相对表达水平的评估。

作为选择的，靶标基因mRNA能直接在Northern印迹(Northern blot)上定量。简单来说，从给定细胞样本使用，例如酸性胍盐—苯酚—氯仿提取方法分离mRNA。然后，将mRNA进行电泳以将不同种的RNA分离，并将mRNA从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。当使用Southern印迹时，标记的探针被用于识别和/或定量测定靶标基因mRNA。适当的对照(如针对管家基因的探针)提供评估相对表达水平的参考。

确定靶标基因表达水平的替代方法是原位杂交。原位杂交分析众所周知(如Angerer，Meth.Enzymol 152：649，1987)。大体上，原位杂交包括下列主要步骤：(1)固定要分析的组织或生物结构；(2)对生物结构进行预杂交处理以增加靶标DNA或RNA的可获得性，和减少非特异性的结合；(3)将核酸混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后清洗以去除没有结合在杂交体上的核酸片段；和(5)检测杂交的核酸片段。用于这些步骤中的每一个步骤的试剂和使用条件的变化依赖于特定的应用。

在另一个实施方案中，基于扩增的分析能被用于检测靶标基因表达(转录)水平。在这样的基于扩增的分析中，靶标核酸序列在扩增反应中作为模板(如聚合酶链反应(PCR)或反转录PCR(RT-PCR))。在数量扩增中，扩增产物的数量以原始样本中模板数量的指数增长。相较于适当(如没有暴露在测试剂中的健康组织或细胞)的对照的比较提供了靶标基因转录水平的测量。

本发明扩展到基于阵列的杂交形式。阵列是粘附到一种或多种表面(如固体，膜或凝胶)的多种不同的“探针”或“靶标”核酸(或其它化合物)。在优选的实施方案中，多种核酸(或其它部分)粘附到了单独的连续表面或互相并列的多种表面。

在阵列形式中，允许大量不同的杂交反应基本“平行”地进行。这就在单独的“实验”中提供了迅速基本同时的大量杂交的评价。在基于阵列的形式中实施杂交反应的方法是本领域技术人员已知的(参见Pastinen，Genome Res.7：606-6145，1997；Jackson，Nature Biotechnology 14：1685，1996；Chee，Science 274：610，1995；WO96/17958；Pinkel et al，Nature Genetics 20：207-211，1998)。

阵列，特别是核酸阵列能根据大量本领域技术人员已知的方法生产。例如，在简单的实施方案，“低密度”阵列能通过点样(例如用手使用移液管)不同的核酸在载体(例如玻璃表面、膜等等)的不同位置很简单地生产出来。

这种简单的点样方法已经被自动化以生产高密度点样的阵列(见美国专利No.5,807,522)。该专利公开了将微细管轻敲在表面上点上很少量的生物样本的自动化系统的用途。重复这个过程就产生了高密度阵列。

阵列也能用寡核苷酸合成技术来生产。因此，例如美国专利No.5,143,854和PCT专利公开号WO 90/15070和92./10092教授了高密度寡核苷酸阵列的光定向组合合成(light-directed combinatorial synthesis)的用途。高密度阵列的合成也在美国专利No.5,744,305；5,800,992和5,445,934中被公开。

除此之外，或可选择的，靶标基因核酸表达水平的检测、靶标基因的表达的改变能通过检测和/或定量被翻译的靶标基因编码的多肽的数量和/或活性被检测和/或定量。

通过本领域技术人员熟知的大量方法中的任何方法，靶标基因编码的多肽能被检测到和定量。这些可以包括分析生化方法如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、高分散色谱法(hyperdiffusion chromatography)等等，或各种免疫方法如液体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、荧光免疫检验法、Western印迹等等

在一个实施方案中，靶标基因表达产物(如蛋白质)在电泳蛋白质分离法(如1维或2维电泳)中被检测到或定量。使用电泳技术检测蛋白质的方法对本领域技术人员是熟知(见Scope，Protein Purification，Springer-Verlag，NY，1982；Duetscher，Methods in Enzymology Vol.182：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.NY，1990)。

在另一个实施方案中，Western印迹(免疫印迹)分析用于检测和定量本发明多肽在样本中的存在。这种技术通常包括通过基于分子量的凝胶电泳分离样本蛋白质、转移分离的蛋白质到适合载体(如硝酸纤维素滤纸、尼龙滤纸、或衍生的尼龙滤纸)，并将样品和特异性结合靶标多肽的抗体一起孵育。

因此，本发明延伸到靶标多肽的抗体。然而，可以很方便地使用多克隆抗体，单克隆抗体在免疫测定或捕获上的使用是特别优选的，因为它们能大量生产且产物具有均一性。为单克隆抗体生产制备杂种细胞系是通过融合无限增殖细胞系和对免疫原制备物致敏的淋巴细胞进行的(即包括35-LM多肽)或通过本领域技术人员所熟知的方法进行的(见，例如Douillard and Hoffman，Basic Facts aboutHybridomas，in Compendium of Immunology Vol.II，ed.by Schwartz，1981；Kohler andMilstein，Nature 256：495-499，1975；Kohler and Milstein，European Journal ofImmunology 6：511-519，1976)。可以使用单链抗体或转基因鼠表达人源化的抗体或其它识别蛋白。在这点上有用的蛋白质包括双特异抗体、肽模拟物和如scFv片段和Fab片段的抗体片段。

因此，本发明更进一步提供生物化学技术的应用以提供来源于一种动物或鸟类生物且基本上在相同或不同种的另一动物或鸟类生物中不具有免疫原性的抗体。本文中，该生物化学过程被称为“去免疫化(de-immunization)”。本文对＂去免疫化＂的参考包括过程，如移植互补决定区(CDR)、关于免疫—相互作用(immuno-interactive)分子的框架区和可变(v)区突变的“改形(reshaping)”，所有的目的均在于减少特定宿主(如人类受试者)的“免疫—相互作用”分子的免疫原性。在该例子中，优选的抗体是单克隆抗体，其来源于一个动物或鸟类生物并显示了在另一个同种或不同种的动物或鸟类生物，例如但不限于，如果用于人形式的治疗或成像目的，人中减少的免疫原性。

本发明延伸到抗体或它们的抗原结合片段。抗体可以是多克隆的或单克隆的。

靶标多肽的多克隆抗体能用本领域技术人员熟知的方法制备(见，例如，Greenet al，Immunochemical Protocols(Manson ed)：1-5，1992；Williams et al，DNACloning 2：Expression Systems，2^nd Ed，Oxford University Press 1995)。尽管多克隆抗体典型地来源于动物如大鼠、小鼠、兔子、山羊或绵羊，本发明的靶标多肽抗体也可以来源于类人灵长目动物的抗体。可以找到在狒狒上产生诊断和治疗用抗体的普通技术，例如，在Goldenberg等，国际专利公布号WO 91/11465，1991和Losmanet al，Int.J.Cancer 46：310，1990中可找到。

抗体应当包括至少一个可变区域。该可变区域可以是任何大小或具有任何的氨基酸组成成分，通常包括至少一个嵌入骨架序列中的负责抗原结合的高变异氨基酸序列。笼统地说，可变(V)区域可以是任何免疫球蛋白重(V_H)和/或轻(V_L)链可变区域适当的排列。因此，例如，V区域可以是单体的，并且是V_H或V_L区域，其中，这些能以具有可接受的亲和力独立地结合抗原。作为选择的，V区域可以是双聚体并包括V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L双聚体，其中V_H和V_L链是非共价结合(下文缩写为Fv)。然而，当期望时，链可以是直接共价结合的，例如通过两个可变区域间的二硫键结合，或者通过连接子如肽连接子，以形成单链区域(下文缩写为scFv)。

可变区域可以是任何自然发生的可变区域或其工程化版本。工程化版本指使用重组DNA工程技术制造的可变区域。这样的工程化版本包括那些例如通过插入、删除或在天然抗体氨基酸序列上或对它进行改变从天然抗体可变区创造出的。该类型的特定例子包括那些工程化的包括至少一个CDR和任选的一个或多个来自抗体的框架氨基酸和来自第二个抗体的可变区域的残余部分的可变区域。

可变区域可以共价附在至少一个其它抗体区域或其片段的氨基酸的C末端。因此，例如其中V_H区存在于可变区域，这可以被连接到免疫球蛋白的C_H1区域或其片段。类似的，V_L区域可以连接到C_K区域或其片段上。以该方式，例如，抗体是Fab片段，其中抗原结合区包括结合的分别在它们的C末端共价结合到C_H1和C_K区域的V_H和V_L区域。C_H1区域可以用更多的氨基酸进行延伸，例如提供如在Fab片段上发现的铰链区，或提供更多的区域，如抗体CH2和CH3区。

另外一种抗体片段的形式是编码单独的互补决定区(CDR)的肽。通过构建编码目标抗体CDR的基因能获得CDR肽(“最小识别单元”)。制备这样的基因，例如，通过使用聚合酶链反应从RNA或抗体生产细胞合成可变区(参见例如Larricket al，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106，1991；Courtneay-Luck，Monoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application，Ritter et al(eds)，Cambridge University Press：166，1995和Ward et al，Monoclonal Antibodies：Principles and Applications Birch et al，Wiley-Liss，Inc.：137，1995。

用在本发明的抗体优选单克隆抗体(通过常规的免疫和细胞融合程序制备)或来源于自其的片段，通过使用任何适合的标准化学方法如还原或酶切和/或消化技术，如用胃蛋白酶处理。更特别的，利用多种技术能产生单克隆抗—转化生长因子β(anti-TGF-beta)结合蛋白抗体。通过本领域技术人员已知的方法可以获得特异抗原的啮齿类动物单克隆抗体(参见例如Kohler等，1975同上和Coligan et al，Current Protocols in Immunology 1，John Wiley & Sons 1991；Picksley et al，DNACloning 2：Expression Systems，2^nd Edition，Glover et al(eds)，page 93 OxfordUniversity Press，1995)。

简而言之，单克隆抗体可通过将包括靶标基因产物的组合物注入小鼠、通过排除血清样本确定抗体生产的存在、排除脾细胞获得B-淋巴细胞、融合B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞产生杂交瘤细胞、克隆杂交瘤细胞、选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆、培养产生针对抗原的抗体的克隆、从杂交瘤培养物分离抗体获得。

另外，本发明的抗—靶标多肽抗体来源于人单克隆抗体。人单克隆抗体从转基因小鼠获得，该转基因小鼠被工程化以产生针对抗原挑战的特异人抗体。在这种技术中，人重链和轻链基因座的元件被导入小鼠系来源的胚胎干细胞系，其包含了内生重链和轻链基因座的定向敲除。转基因小鼠能合成人特异性抗原的人抗体，并且小鼠能被用于产生人抗体分泌杂交瘤细胞。从转基因小鼠获得人抗体的方法在例如Green et al，Nature Genet 7：1994，Lonbergetal，Nature 368：856，1994和Taylor et al，Int.Immun.6：579，1994中被描述。

通过许多成熟的技术可以将单克隆抗体从杂交瘤细胞培养中分离和纯化。这样的分离技术包括具有蛋白质-A琼脂糖的亲和层析、大小排除层析和离子交换层析法(参见例如Baines et al，Methodsin Molecular Biology 10：79-104，1992)。

为了特别的应用，制备抗-靶标多肽抗体片段是值得的。这样的抗体片段能通过常规的方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体获得。作为例证，通过用胃蛋白酶酶切抗体可产生抗体片段以提供称为F(ab’)₂的5S片段。这个片段还能用硫醇还原剂更进一步地切割以产生3.5S Fab′单价片段。随意地，切割反应实施时使用保护基来保护二硫键分裂产生的巯基。作为替换的，用胃蛋白酶酶切直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法都被描述在如Goldenberg美国专利No.4,331,647；Nisonoff et al，Arch Biochem.Biophys.89：230，1960，Porter，BiochemJ.73：119，1959，Edelman et al，Enzymology 1：422，1967中。

其它分裂抗体的方法，如形成单价轻—重链片段的重链的分离，更进一步片段裂解，或其它酶的、化学的或遗传的技术可以被使用，只要片段结合到能被完整抗体所识别的抗原上。

作为选择的，抗体可以是重组或工程化的抗体，通过使用包括操纵和重新表达编码抗体可变和/或恒定区的DNA的重组DNA技术可以获得这样的抗体。这样的DNA是已知的和/或容易从DNA文库包括如噬菌体抗体文库获得(见Chiswelland McCafferty，J Tibtech 10：80-84，1992)或当需要时能被合成。标准的分子生物和/或化学程序可以被用于测序和操纵DNA，例如如所需要地引入密码子以产生半胱氨酸残基，以修饰、加入或删除其它氨基酸或区域。

制备一种或多种包括编码可变和/或恒定区的DNA的复制表达载体并用于转化适当的细胞系，例如非生产的骨髓瘤细胞系，如生产抗体的细菌(如E.coli)。为了获得有效的转录和翻译，在每个载体中的DNA序列应当包括适当的调节序列，特别是可操作地连接到可变区序列的启动子和引导序列。以这种方式生产抗体的特定方法通常是已知和常规使用的。例如，在Maniatis et al，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989中描述了基本分子生物学程序，可如在Sanger et al，Proc Natl.Acad.Sci USA 74：5463，1977和the Amersham Internationalplc sequencing handbook中描述的实施DNA测序；根据Kramer et al，NucleicAcidsRes.12：9441，1984；the Anglian Biotechnology Ltd Handbook，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci USA 82：488-492，1985；Kunkel et al，Methodsin Enzymol.154：367-382，1987中的方法执行定向诱变。此外，还有许多公开出版物详细地描述了通过操纵DNA、产生表达载体、转化适当的细胞适合于制备抗体的技术，例如Mountain A和Adair JR在Biotechnology and Genetic Engineering Reviews(ed.Tombs，M.10，Chapter 1)Intercept，多佛，英国，1992和国际专利公布号WO 91/09967说明书中所评论的那样。

在特定实施方案中，根据本发明的抗体可以有一个或更多附在它上面效应器或报道分子，并且本发明延伸到这样的修饰蛋白。报道分子是可被检测的部分或标记如酶，或其它报道分子，包括染料、放射性核素、发光基团、荧光基团或生物素等等。靶标多肽特异性免疫球蛋白或其片段可以用放射性标记以用于诊断或治疗应用。抗体的放射性标记技术在本领域是已知的，见Adams，In Vivo 12：11-21，1998，Hiltunen，Acta Oncol，32：931-939，1993。效应器或受体分子可以通过任何可以获得的氨基酸侧链、末端酸或其中存在位于抗体上的碳水化合物官能团附加在抗体上，只要附加物或者附加程序没有反向影响结合性质和分子的有用性。特定的官能团包括例如任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基、羧基或醛基。抗体的附加物和效应器和/或报道分子可以通过效应器或报道分子中的这样的基团和适当的官能团获得。可以通过空间基团或桥接基团直接或间接连接。

本发明的抗体可治疗性地用于抑制或靶向蛋白质或可以诊断性地用于筛选靶标蛋白质的水平。

就上述的诊断分析而言，上面描述的基因产物或抗体或核酸分子可以用多种化合物标记，该化合物包括如荧光分子、毒素和放射性核素。荧光分子的典型实例包括氢化荧光素、藻胆蛋白如藻红蛋白、若丹明、德州红(Texas red)和荧光素酶。毒素的典型实例包括蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、麦芽凝集素、志贺氏杆菌毒素、假单胞菌外毒素A。放射性核素的典型实例包括铜-64、镓-67、镓-68、锆-89、钌-97、锝-99m、铑-105、钯-109、铟-111、碘-123、碘-125、碘-131、铼-186、铼-188、金-198、金-199、铅-203、砹-211、铅-212和铋-212。另外，上面描述的抗体也可以标记或结合到配体结合对的一个配偶体。典型例子包括抗生物素蛋白—生物素、抗生物素蛋白链菌素—生物素和核黄素—核黄素结合蛋白。

本文所描述的用上面详细说明的典型标记结合或标记分子的方法能够被本领域普通技术人员容易地完成。(见单端孢霉烯抗体共轭物，美国专利4,744,981；抗体共轭物，美国专利5,106,951；荧光物质和标记技术，美国专利No.4,018,884；用于诊断和治疗的金属放射性核素标记蛋白，美国专利4,897,255；用于改善螯合动力学的金属放射性核素螯合化合物，美国专利4,988,496；也见Inman，MethodsIn Enzymology 34：30，1974；Wilchek and Bayer，Anal.Biochem.171：1-32，1988)。

诊断和治疗试剂盒和组合物也是本发明的组成部分。这样的试剂盒包括诊断或治疗剂，单独或与其它试剂结合。

因此，本发明的另一方面定向到上调或下调表2或表3或表4列举的基因的试剂在制造用于骨病变受试者的药物或诊断剂中的用途。

本发明被下列非限制实施例更进一步地描述。

实施例1

鉴定与骨病理有关的生物标记

从5个颅缝早闭的病患(雄性，3—7月龄)的颅盖缝提取RNA。缝组织从病患未融合缝和已融合缝中获取。每个组织的基因表达用Affymetrix U133A2.0基因芯片来分析。将所有未融合缝和所有已融合缝的表达谱进行对比。应用生物信息学分析微阵列数据以识别具有显著差别表达的基因。将所有缝结合起来确保被识别的基因在每个冠状缝、矢状缝和人字缝表达，因此没有缝特异性的影响。

用原始样本和增加的4个病患的RNA，对11个基因进行实时定量RT-PCR分析，以证实微阵列的数据。获得89％的相关性，指示微阵列数据是可靠的。

分析培养的传过几次代的原代细胞的生物标记表达。在未修改的培养条件的情况下，被组织显示的生物标记的表达在细胞中没有相关性。这指示培养条件需要修改以重新获得生物标记的正确表达。因此这些标记在确保细胞保持体内表达中是有用的工具。图2提供了通过微阵列分析识别的差别表达的mRNA和蛋白质确认。图3显示了RBP4和GPC3的表达模式。

下面是被识别的关键基因功能的概括：

在未融合缝上调的：下面的基因预计是维持缝开放或控制早期造骨细胞分化的关键。

RBP4是视黄醇(维生素A)的结合剂和载体。所有的反式维甲酸(RA)是视黄醇的代谢物，而且已知它是导致颅缝早闭的致畸剂(Gardner et al，Int.J.Epidemiol 27(1)：64-67，1998；Yip et al，Teratology 21(1)：29-38，1980)。研究表明RA增加了造骨细胞的分化，减少增殖和诱导体外骨结节形成(Song et al，J.Cell Physiol.202(1)：255-262，2005；Cowan et al，Tissue Eng.11(3-4)：645-658，2005)。骨缝间叶细胞的RBP4的一个潜在功能是阻隔视黄醇并调节RA的生物利用度。一旦其表达被下调(在融合阶段)视黄醇被释放并转化为RA，RA刺激造骨细胞分化，过度骨形成。因此，RBP4的抑制剂可以促进骨生成，分泌蛋白质的传递将维持早期造骨细胞的增殖和限制晚期的分化。

C1QTNF3最先是从用TGF-β1处理后在软骨细胞系中鉴定到的。小鼠中胚胎表达分析表明该蛋白在前软骨性的间叶细胞中具有高水平的表达量，但是在成熟的软骨细胞中其表达不能被检测到(Maeda et al，J.Biol.Chem.276(5)：3628-3634，2001)。最近显示，该蛋白能够促进软骨前体和软骨细胞的增殖(Maeda et al，J CellPhysiol.206：537-544，2006)。我们的工作首次在颅顶缝中前体性成骨细胞的间叶细胞中鉴定到C1QTNF3，并且，该蛋白在未融合缝合中高表达表明这个生长因子在调节骨生成方面具有新的作用，一个可能的功能是它可能在骨骼发育过程中调节间叶细胞的凝聚。

GPC3是细胞表面类肝素硫化蛋白多糖。丢失GPC3会导致Simpson-GolabiBehmel综合症，表现为产前和产后过度生长、腭裂、短宽鼻、凸腭、宽鼻梁和不均衡的大头症。BMP4和GPC3的双突变体小鼠具有增加的表型，表明GPC3可能与BMP信号转导有关。GPC3异位表达降低BMP4的表达和阻塞BMP7的活性(Midorikawa et al，Int.J.Cancer 103(4)：455-465，2003；Paine-Saunders et al，Dev.Biol.225(1)：179-187，2000)，表明GPC3可能在限制BMP诱导的造骨细胞方面发挥作用。GPC3缺陷型小鼠还表现出颅缝早闭患者中常见的多指畸形。也显示GPC3能够结合FGF2，过量表达GPC3抑制肝细胞中由FGF2介导的细胞增殖(Midorikawa等，2003同上)。由于FGFR突变是导致多种颅缝早闭综合症的常见原因，以上数据表明GPC3也有可能与骨骼发育中的FGF信号转导过程相互作用。此外，也显示GPC3能够抑制非规范的Wnt信号，激活规范的Wnn/β-连环蛋白信号，从而调节细胞增殖(Song et al，J.Biol.Chem 280(3)：2116-2125，2005；De Cat et al，J.Cell Biol.163(3)：625-635，2003)。在骨原性的间叶细胞中GPC3可能通过多种途径调节细胞生长，但抑制导致增加的生长，而诱导GPC3抑制涉及FGFs、BMPs和非规范性Wnts的信号转导途径。因此，在未融合缝中表达GPC3能够平衡各种信号转导途径，从而保证最佳的骨骼生长。

MFAP4是推测的ECM蛋白，其参与细胞粘附或细胞-细胞相互作用。MFAP4的缺失会导致Smith-Magenis综合症，临床症状为短头畸型、中脸发育不全、凸腭和生长阻滞(Zhao et al，Hum.Mol.Genet 4(4)：589-597，1995)。颅骨发育畸形表明MFAP4可能在间叶细胞缝中具有关键性的地位。牛Mfap4已被鉴定为胶原蛋白结合剂，也有可能在ECM组织中发挥作用(Lausen et al，Biol.Chem.274(45)：32234-32240，1999)。

FMOD是一个小的富含亮氨酸的蛋白多糖(SLRP)，参与ECM组装。它竞争性地结合TGFβ1、2和3，使它们阻隔在ECM中(Hildebrand et al，Biochem J.302(Pt2)：527-34.1994)。它是胶原蛋白原纤维形成的调节蛋白，其RNA的表达在矿化开始前被上调。它结合胶原蛋白，阻碍纤维的形成速率，导致更细小的纤维。它被识别为能被依赖于BMP2的C2C12成肌细胞分化为骨原细胞系上调。该蛋白可能调节细胞生长或迁移。

OGN是富含亮氨酸的角质素硫化蛋白糖，其能够与转化生长因子β协同，诱导异位骨形成。由于生长因子和肿瘤抑制蛋白p53能上调其转录，人们认为骨甘氨酸(osteoglycin)可能调节细胞生长。而且，据显示，该蛋白抑制多核细胞形成，从而限制破骨细胞形成和活性。OGN缺陷型小鼠具有增加的胶原蛋白纤维直径，表明OGN可能在胶原蛋白成纤维化过程中具有功能。

PRELP是存在于结缔组织胞外基质中的结合肝磷脂的小的富含亮氨酸的蛋白多糖(SLRP)。PRELP与基膜中的类肝素硫化蛋白多糖结合。PRELP与胶原蛋白类型I和类型II结合。据认为，PRELP的功能为将基膜锚定到下面的结缔组织。

INHBA，即抑制素βA，也被称为活化素A，是分泌蛋白且是TGF-β超家族的一员。活化素A通过相似的途径将信号传递到TGF-β和BMP(Lagna et al，Nature.383：832-836，1996)。活化素A能够刺激骨发生和骨骼形成(Sakai et al，Bone.25：191-196，1999)。在未融合缝中较高的INHBA表达与其促进骨骼生长的角色一致。

PTN编码多效生长因子，也称为肝磷脂结合生长因子8或造骨细胞刺激因子1，是一个分泌蛋白，其在骨生长中依据浓度和暂时表达具有多种功能(Tare et al，JBone Miner Res.17：2009-2020，2002)。PTN能刺激骨生长(Li et al，Calcif Tissue Int.76：299-306，2005)。PTN在未融合缝中的更高表达与促进骨生长的角色是一致的。

FBLN1，腓骨蛋白1(fibulin 1)是分泌的细胞外基质蛋白。它在骨髓间质中表达(Gu et al，Eur J Haematol.67：176-184，2001)，其中它能结合聚集蛋白聚糖，另一个细胞外基质蛋白，其基因在未融合缝也有更高的表达(表2)。FBLN1在未融合缝有更高的表达暗示它可以促进有利于细胞迁移和骨形成的细胞外环境。

IL11RA也称为ETL2，编码白介素11的受体。通过IL11受体发出信号需要骨骼再造(Sims et al，JBone Miner Res.20：1093-1102，2005)。IL11RA发信号也可以涉及skeletogenic祖先或其它间质细胞(Neuhaus et al，Dev Biol.166：531-542，1994)。IL11RA在未融合缝有更高的表达与促进骨生长的预期角色是一致的。

在已融合缝中上调的：下列的基因预期在缝融合中起到作用。

WIF1是Wnt信号的拮抗剂，最近显示其在C2C12和MC3T3E-1前成骨细胞系的后期分化阶段有强烈的表达。持续不断的Wnt信号激活减少了造骨细胞的分化，因此可能需要WIF1控制造骨细胞的成熟(Vaes et al，Bone 36(5)：803-811，2005)。

ANXA3是钙依赖磷脂结合蛋白家族中的一员。然而，关于ANXA3只知道有限的信息，总的AnxA表达在骨关节炎的进展过程中能被识别到有显著的增加。S100A蛋白质被显示与AnxA5和AnxA6相互作用，因为许多S100A蛋白质也用ANXA3上调，它们也能与ANXA3相互作用。视黄醇能结合AnxA6，并且AnxAs离子通道活性的抑制显示有逆转RA细胞凋亡的作用(Balcerzak et al，FEBS Lett.580：3065-3069，2006)。RA也显示出能刺激鸟生长扁平软骨细胞中的细胞分化和AnxAs表达，这暗示了ANXA3与视黄酸诱导骨生成间的联系。

CASP1显示它诱导细胞凋亡，可以在各个发育阶段起作用。这个基因通过其蛋白水解裂解和激活无活性白细胞介素1前体的能力而被识别，白细胞介素1参与如发炎、感染性休克和伤口愈合等过程的细胞因子。

SHOX2是同源异形框家族中的一员，并具有颅面表达的同源结构域蛋白特有的C末端14个氨基酸残基的基序。有限的胚胎表达分析识别出了在鼻子和鄂中正凝结的软骨间叶细胞中的SHOX2。在前肢芽中，转录被限制在正发育骨周围的未分化的间叶细胞中(Rudiger et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA 95(5)：2406-2411，1998)。SHOX2最近被识别为Runx2的调节子，而Runx2本身是软骨形成和骨生成的重要调节子(Cobb et al，Proc Natl Acad Sci USA.103：4511-4515，2006)。SHOX2在正融合缝和已融合缝的表达降低与我们预计的SHOX2在调节骨生长中有重要的作用是一致的。

CYFIP2，细胞质FMR1(脆性X智力低下1)相互作用蛋白，是肌动蛋白调节蛋白和p53依赖的细胞凋亡的介质。它增加在Jurkat和CD4(+)细胞中纤维连接蛋白介导的结合(Mayne et al，Eur J Immunol.34：1217-27，2004)。这些研究暗示过多的CYFIP2蛋白有利于增加多发性硬化症病人(MS patients)T细胞的黏附属性。因此CYFIP2可能参与缝融合过程中的免疫样反应。

在未融合缝和已融合缝中显示至少有2倍表达增加的基因分别表示在表2和3中。

实施例2

生物标记的鉴定

使用实施例1的方法，优选的生物标记表被确定了。生物标记显示在表4中。

图1显示了10个在实施例1中描述的生物标记在已融合缝和未融合缝中的表达水平。

表5显示了几个优选的生物标记在人骨癌细胞系中的表达。

表4

优选的被识别的生物标记

 

基因       缝       融合阶段      定位表达     表达
	GPC3       L＝C>S   U>Fg＝F      膜
RBP4       L＝C>S   U>Fg>F       细胞质
	C1QTNF3    L＝C>S   U>Fg＝F      细胞质
ANXA3      L＝C＝S  F>Fg>U       细胞质
	WIF1       C＝L<S   F>Fg>U       EC
SHOX2      L＝C<S   F＝Fg>U      细胞核

C＝冠状缝L，人字缝；S，矢状缝；F，已融合；Fg，正融合；U，未融合。

一套优选的生物标记GPC3、RBP4和C1QTNF3在未融合缝中有更高的表达，但是另一套优选生物标记ANXA3、WIF1和SHOX2在已融合和正融合缝中有更高的表达。

表5

几个优选的生物标记在人骨癌细胞系中的简要

通过实时RT-PCR，将几个优选的生物标记基因(突出的)GPC3、RBP4、C1QTNF3和WIF1(见表4)和四个其它生物标记FMOD、PRELP、PTN和CYFIP2(见表2和3)在人骨癌细胞系的相应表达与亲环蛋白A比较。“是”表示表达，“不/非常低”表示表达未检测到。人骨肉瘤细胞系有SaOS(美国模式菌种收集中心[ATCC]HTB-85)、SJSA-1(ATCC CRL-2098)、U-2 OS(ATCC HTB-96)、MG-63(ATCC CR1-1427)、HOS(ATCC CRL-1543)和G-292(ATCC CRL-1423)。

除了这些特定的描述，本领域技术人员将体会到本文描述的本发明很容易变化和修改。因此，本发明包括所有这些变化和修改能被理解。本发明也包括所有这些在本说明书中参考和指出的步骤、特征、组合物和化合物，个别的或全体的，和任何的和所有的任何两个或更多所述步骤或特征的结合。

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Claims (57)

1、治疗或预防受试者骨病变或减少受试者骨病变发展风险的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的试剂，该试剂调节基因的表达或调节基因编码产物的活性，所述基因选自GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2或其哺乳动物同系物，其中所述基因在未融合对已融合颅盖缝中差别表达。

2、根据权利要求1所述的方法，其中GPC3、RBP4和C1QTNF3在未融合缝中相较于已融合缝更高地表达。

3、根据权利要求1所述的方法，其中ANXA3、WIF1和SHOX2在已融合缝或正融合缝中相较于未融合缝更高地表达。

4、根据权利要求1所述的方法，其中受试者是人。

5、根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其中骨病变选自骨癌、骨矿化缺陷疾病、骨损伤、以骨缝为基础的头盖障碍、细胞骨架障碍或骨质疏松症。

6、根据权利要求5所述的方法，其中骨损伤选自骨折、青枝骨折或骨头碎板。

7、根据权利要求5所述的方法，其中以骨缝为基础的头盖障碍是颅缝早闭。

8、根据权利要求5所述的方法，其中骨矿化缺陷疾病是发育异常。

9、根据权利要求1所述的方法，其中基因是GPC3。

10、根据权利要求1所述的方法，其中基因是RBP4。

11、根据权利要求1所述的方法，其中基因是C1QTNF3。

12、根据权利要求1所述的方法，其中基因是ANXA3。

13、根据权利要求1所述的方法，其中基因是WIF1。

14、根据权利要求1所述的方法，其中基因是SHOX2。

15、根据权利要求1所述的方法，其中试剂是核酸分子。

16、根据权利要求1所述的方法，其中试剂是小化学分子。

17、根据权利要求1所述的方法，其中试剂是肽、多肽或蛋白质。

18、治疗受试者的方法，所述方法包括给予所述的受试者有效量的试剂，该试剂调节基因表达或调节基因编码产物的活性，所述基因选自GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2，或其哺乳动物同系物，其中所述基因在未融合对已融合颅盖缝中差别表达，其中选择所述的对表达或活性的调节以在所述受试者中改善骨生长、抑制骨生长和/或抑制骨癌生长。

19、根据权利要求18所述的方法，其中GPC3、RBP4和C1QTNF3在未融合缝中相较于已融合缝更高地表达。

20、根据权利要求18所述的方法，其中ANXA3、WIF1和SHOX2在已融合缝或正融合缝中相较于未融合缝更高地表达。

21、根据权利要求18或19或20所述的方法，其中受试者是人。

22、根据权利要求18所述的方法，其中基因是GPC3。

23、根据权利要求18所述的方法，其中基因是RBP4。

24、根据权利要求18所述的方法，其中基因是C1QTNF3。

25、根据权利要求18所述的方法，其中基因是ANXA3。

26、根据权利要求18所述的方法，其中基因是WIF1。

27、根据权利要求18所述的方法，其中基因是SHOX2。

28、根据权利要求18所述的方法，其中试剂是核酸分子。

29、根据权利要求18所述的方法，其中试剂是小化学分子。

30、根据权利要求18所述的方法，其中试剂是肽、多肽或蛋白质。

31、选自GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2的基因在制备用于治疗受试者骨病变的药物中的用途。

32、选自GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2的基因的表达产物在制备用于治疗受试者骨病变的药物中的用途。

33、根据权利要求31或32所述的用途，其中受试者是人。

34、根据权利要求31或32或33所述的用途，其中骨病变选自骨癌、骨矿化缺陷疾病、骨损伤、以骨缝为基础的头盖障碍、细胞骨架障碍或骨质疏松症。

35、根据权利要求34所述的用途，其中骨损伤选自骨折、青枝骨折或骨头碎板。

36、根据权利要求34所述的用途，其中以骨缝为基础的头盖障碍是颅缝早闭。

37、根据权利要求34所述的用途，其中骨矿化缺陷疾病是发育异常。

38、根据权利要求31或32所述的用途，其中基因是GPC3。

39、根据权利要求31或32所述的用途，其中基因是RBP4。

40、根据权利要求31或32所述的用途，其中基因是C1QTNF3。

41、根据权利要求31或32所述的用途，其中基因是ANXA3。

42、根据权利要求31或32所述的用途，其中基因是WIF1。

43、根据权利要求31或32所述的用途，其中基因是SHOX2。

44、诊断或预测受试者骨病变的方法，所述方法包括确定一个或多个基因的表达模式，所述基因选自GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2，其中GPC3、RBP4和C1QTNF3在未融合组织中表达的提高和ANXA3、WIF1和SHOX2在已融合或正融合缝中表达的提高指示了骨病变或发展为骨病变的倾向的存在。

45、根据权利要求44所述的方法，其中受试者是人。

46、根据权利要求44或45所述的方法，其中骨病变选自骨癌、骨矿化缺陷疾病、骨损伤、以骨缝为基础的头盖障碍、细胞骨架障碍或骨质疏松症。

47、根据权利要求46所述的方法，其中骨损伤选自骨折、青枝骨折或骨头碎板。

48、根据权利要求46所述的方法，其中以骨缝为基础的头盖障碍是颅缝早闭。

49、根据权利要求46所述的方法，其中骨矿化缺陷疾病是发育异常。

50、选自GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2的基因在产生骨病变受试者诊断方案中的用途。

51、选自GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2的基因的表达产物在产生骨病变受试者诊断方案中的用途。

52、根据权利要求50或51所述的用途，其中受试者是人。

53、根据权利要求50或51或52所述的用途，其中骨病变选自骨癌、骨矿化缺陷疾病、骨损伤、以骨缝为基础的头盖障碍、细胞骨架障碍或骨质疏松症。

54、根据权利要求53所述的用途，其中以骨缝为基础的头盖障碍是颅缝早闭。

55、根据权利要求53所述的用途，其中骨矿化缺陷疾病是发育异常。

56、药物组合物，其包括试剂和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂，所述试剂调节基因的表达或调节基因的表达产物，所述基因选自GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2。

57、分离的试剂，所述试剂调节基因表达或调节基因表达产物的活性，所述基因选自GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2，所述表达产物来自基因GPC3、RBP4、C1QTNF3、ANXA3、WIF1或SHOX2。

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