CN101426534A - 检测和治疗视网膜疾病的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了关于年龄相关的黄斑变性(AMD)和/或眼视网膜色素上皮细胞吞噬作用的多重基因，以及检测和治疗AMD、基于所述吞噬作用－相关和/或AMD－相关基因的其它视网膜变性状态的方法和组合物。还提供了用于测试AMD的治疗化合物和治疗方案的动物模型、包括吞噬作用－相关和/或AMD－相关基因的多态变异体的基因阵列，可用于对来自受试者核苷酸样品的遗传筛选以在与AMD相关的多个基因中获得多态变异体序列分布型。

Description

检测和治疗视网膜疾病的方法和组合物
背景技术
年龄相关黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)为年龄超过60岁的高龄人群中第一致盲原因。该病为破坏性疾病，破坏患病个体的中央视觉(central vision)，剥夺他们完成日常生活所必需的活动例如阅读和驾车的能力(Bressler等人，1988；Evans，2001；Gottlicb，2002)。一项研究中已报道AMD在75岁或75岁以上人群中的患病率为7.8％(Klein等人，1992)。
AMD为慢性进行性疾病，涉及外层视网膜层(包括光感受器和支持该光感受器的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial，RPE))以及已知为脉络膜的眼相邻血管层(adjacent vascular layer)中的细胞。黄斑变性的特征为黄斑(macula)的衰退，所述黄斑为中央视网膜负责高敏度视觉的一小部分(直径约2毫米)。迟发性黄斑变性(即AMD)通常被确定为不是“干”就是“湿”。所述湿的(“渗出性的”)新生血管型(neovascular)AMD影响大约10％患有该疾病的患者，特征为异常血管从脉络膜毛细血管层(choriocapillaris)经过视网膜色素上皮细胞长出，一般引起出血、渗出作用、瘢痕化和/或浆液性视网膜脱离(serous retinal detachment)。大约90％的AMD病人为非新生血管型的干燥类型，特征为视网膜色素上皮细胞萎缩以及丧失黄斑感受器。
AMD的临床标志之一是存在碎屑样(debris-like)物质的沉着物，术语称“脉络膜小疣(drusen)”，积聚在布鲁赫膜(Bruch’s membrane)上，所述布鲁赫膜为将RPE(最外层视网膜)与下面的脉络膜分开的细胞外基质组分的多层复合物。脉络膜小疣能通过眼底镜眼检查观察到。所述沉着物已在患有AMD病人捐献的眼的微观研究中得到广泛表征(Sarks等人，1988)。根据包括沉着物的相对大小、丰度和形状在内的几个标准，在临床检查的活体眼中观察到的沉着物可以分为软脉络膜小疣或硬脉络膜小疣(参考例如Abdelsalam等人，1999)。组织化学和免疫细胞化学研究已表明脉络膜小疣包括多种脂类、多糖、氨基葡聚糖和蛋白质(Abdelsalam等人，1999；Hagerman等人，1999，2001)。
AMD目前还没有治愈方法。几种类型的疗法可用，用激光光凝固湿型AMD异常血管的方法成为标准疗法(Gottlieb，2002；Algvere和Seregard，2002)。这种疗法的局限在于只有描绘清楚的新生血管的损害才能用此法治疗，50％的病人会遭受血管泄漏的复发(Fine等人，2000)。由于所述治疗所需的激光的能量，受治疗区域内的光感受器也将死亡，病人也经常遭受治疗后立刻中枢性失明。新的新生血管损害最终将发展，需要重复治疗。
结合用光敏试剂激活的低能量激光的光动力疗法成为激光治疗方法的有用的补充(Bressler，2001)。在此方法中，使用对异常新生血管具有亲和力的光敏试剂即维替泊芬(verteporfin)。所述血管的选择性靶向作用(selective targeting)可以被非热激光激活产生能破坏异常血管的活性氧。在研究组中，只有33％接受使用维替泊芬的光动力疗法的受试者具有实质性视觉丧失，相比之下61％的受试者没有接受维替泊芬。然而前述疗法只对患有典型脉络膜新生血管膜的病人有益。这种新治疗模式的全部长期的益处仍有待确定。尽管有上述优点，然而所述治疗方法不能避免随后形成新的新生血管损害。
另一种可用的湿型AMD的治疗方法包括黄斑下的外科手术和外线束(external-beam)放射疗法。包括视网膜易位(translocation)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor)的抑制的研究正在进行(Algvere和Seregard，2002)。为阻止进展到晚期AMD，使用包括维生素C和E、β-胡萝卜素和锌在内的抗氧化剂的治疗显示是有用的，预防性激光治疗也正在进行研究(Gottlieb，2002)。
尽管有上述进展，但是应该认识到现有AMD的治疗方法主要治标(Algvere和Seregard，2002)。没有进攻该疾病未知根本原因的可用的治疗方法。因此所述疾病在治疗后仍能继续进展，出现新生血管形成的再发展和黄斑的破坏。因此仍然迫切需要了解所述疾病的分子机制，从而治疗学治疗或治愈方法能针对其根本原因。
已清楚地认识到遗传因素在AMD病因学中起重要作用。例如，已报道有AMD家族史的人和AMD病人的同胞具有较高危险发生AMD(Evans，2001)。单卵双胞胎与异卵双胞胎相比，表现出更高的AMD临床特征同病率(concordance rate)(Klein等人，1994)。另一项研究发现患有AMD的单卵双胞胎AMD全部一致，而只有42％的异卵双胞胎一致(Meyers等人，1995)。因此，一种了解AMD病因学的主要方法为寻找AMD相关基因。例如，诸如大家族中的连锁分析(linkage analysis)、同胞配对(sib pair)中的等位基因共有性分析(allele sharing analysis)以及人群中相关性研究(association study)的方法已经用于尝试鉴定与AMD线关基因(Guymer，2001)。大型AMD家族中报道了连锁染色体区域1q(Klein等人，1988)。等位基因共有性分析结果未产生新的候选基因(Week等人，2000)。在一个大家族中的人染色体1q的家族型年龄相关黄斑变性基因定位中已经报道了海米生丁-1(Hemicentin-1)中的相关突变(Schultz等人，2003)。
用于AMD的另一遗传策略为测试引起其他类型遗传性黄斑变性的基因作为假定AMD的成因基因(“候选基因”)。表型类似AMD的几种具有清楚遗传性模式(hereditary pattern)遗传特性的黄斑疾病(所谓“孟德尔氏黄斑疾病”)已得到描述。所述疾病的实例包括索斯比氏眼底营养不良(Sorsby’sfundus dystrophy)、斯塔加特氏病(Stargardt′s disease)、贝斯特病(Best disease)和多英氏蜂窝状视网膜营养不良(Doyne′s honeycomb retinal dystrophy)(Guymer，2001)。这些疾病的成因基因已经被分析作为AMD的候选基因。然而至今尚未清楚地证明它们中任何一个与AMD有病因关系。例如，发现三磷酸腺苷结合盒转运子基因(ATP-binding cassette transporter gene，ABCR)为退行性斯塔加特氏病的致病基因(Hutchinson等人，1997)。提出ABCR为AMD的候选基因，在一项研究中，16％患有AMD的病人最初显示出具有该基因的突变(Allikmet等人，1997)。然而该结果已出现异议(Stone等人，1998)。
不能通过如染色体基因定位(chromosomal mapping)、遗传连锁分析和候选基因分析的经典遗传方法找到AMD基因的最可能的原因为，AMD为“多基因”或“综合”遗传疾病。综合遗传疾病被认为是那些多重基因变化引起的疾病。所述疾病表现特有的综合遗传模式(Heiba等人，1994；Klein等人，1994)。就老年疾病AMD而言，通常认为疾病的病程不仅受到上述多重遗传因素结合的影响，还受到环境危险因素的一定影响。
针对发现AMD成因基因的第二大途径已经为针对阐明该疾病的机理的基于假设研究，次要目的为鉴定该机制有关基因。关于AMD致病机理的很多假说已经被提出并且经过检验，在此课题上结果出现多篇文献。
氧化损伤作为AMD假定机制已经成为一个主要课题(Winkler等人，1999；Evans，2001；Husain等人，2002)。公知视网膜具有极高的氧消耗量，并且光感受器和视网膜色素上皮细胞存在于非常富氧环境中。RPE位置紧邻脉络膜毛细血管层，富含毛细血管丛具有高氧合血。所述视网膜为光敏感器官，其中在光照射的时间内光敏化信号持续产生，导致尤其是反应性氧种(oxygen species)的产生。氧化损伤假说的主要证明中，已报道抗氧化剂在临床研究测试中具有减缓严重AMD进程的适度有益效果(Hyman和Neborsky，2002)，但是几项研究的结果相反(Flood等人，2002)。吸烟能降低抗氧化剂的血浆水平，已与AMD增加的风险相联系(Mitchell等人，2002)。氧化损伤理论附加的证明为最近脉络膜小疣的蛋白质组分析，表明在所述沉着物中存在几种氧化修饰的产物(Crabb等人，2002)。
已经提出RPE中的功能障碍是AMD的主要发病机理，能够导致脉络膜小疣形成(Hogan，1972)。RPE功能障碍的最早可知症状是脂褐素(lipofuscin)积聚，可能导致在布鲁赫膜特征性增厚、脉络膜小疣形成以及在湿型AMD中观察到的脉络膜新生血管化(Gass等人，1985；Sarks等人，1988；Green，1999)。脂褐素由多数得自光感受器外节(outer segment，OS)的吞噬膜(phagocytosed membrane)的氧化的聚合分子组成(Katz，1989；Kennedy等人，1995)。公知OS膜富含多不饱和脂肪酸，为过氧化作用的极好底物(Katz，1989)。公认所述分子不能被降解，因此开始在RPE细胞中作为脂褐素积聚。至少脂褐素的一种组分即荧光基团A2E(fluorophore A2E)——吡啶二类视黄醛(pyridinium bisretinoid)已被证明有毒，引起膜失去稳定性(De和Sakemar，2002)并且抑制培养的猪及人的RPE细胞中的细胞色素C氧化酶和细胞凋亡(Shaban等人，2002)。因此RPE中的A2E和脂褐素积聚被认为是直接与所述细胞随年龄的功能障碍和死亡有关。
氧化损伤、脂褐素积聚以及脉络膜小疣形成的病变不限于AMD，在所有高龄个体中都有一定程度的发生。因此根本问题仍然没有解决，为什么所述病变在某些人中比在其他人中会更严重地导致AMD。在开发靶向AMD根本原因的新疗法的进程中，将要求更多促进观察病理学的关于光感受器、RPE和脉络膜细胞中主要细胞代谢途径的具体基因靶标的知识。
发明内容
本发明提供了用于筛选和治疗包括年龄相关的黄斑变性(age-relatedmacular degeneration，AMD)在内的视网膜变性状态的方法和组合物，以及用于测试治疗化合物和方法的动物模型。本发明为基因探索策略的成果，最终得到1)患有AMD的眼组织与正常眼组织比较2)在RPE细胞外节(outersegment，OS)吞噬作用过程中表现出差异表达的基因的分离。OS吞噬作用为RPE细胞的重要功能，包括多步复杂过程，其副产品促成反应性氧种的产生以及RPE细胞内脂褐素的积聚。
用一种称为基因表达的比较杂交分析(comparative HybridizationAnalysis of Gene Expression，CHANGE)的表达克隆新策略，分离出了至少200个AMD相关基因和至少60个在RPE细胞中表达的吞噬作用相关基因。五个以前未表征的基因通过所述策略鉴定出来并且证明与AMD和/或RPE吞噬作用相关。编码所述基因产物的cDNA核苷酸序列这里列为SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17。
这里还描述了称为“AMD/吞噬基因”或“AMDP基因”的六个基因的子集，符合AMD和RPE吞噬作用的双重亲缘关系标准。所述基因中的三个基因即前列腺素D2合酶(SEQ ID NO：2)、膜相关基质金属蛋白酶1(matrixmetalloproteinase，membrane-type 1，MT1-MMP)(SEQ ID NO：15)和未知RPE-表达cDNAAMDP-3(SEQ ID NO：17)都证实在AMD中的上游调控。在AMD中受下游调控的AMDP基因包括酪蛋白激酶1ε(casein kinase 1epsilon)(SEQ ID NO：9)、铁蛋白重多肽1(ferritin heavy polypeptidel)(SEQID NO：10)和SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白(SEQ ID NO：16)。
这里公开的其他先前未知与RPE吞噬作用功能相关的基因包括未知PHG-1(SEQ ID NO：1)、髓磷脂碱蛋白(SEQ ID NO：3)、未知PHG-4(SEQID NO：4)、未知PHG-5(SEQ ID NO：5)、花生样2/分隔蛋白(septin)4(SEQ ID NO：6)、毛状蛋白样1(coactosin-like 1)(SEQ ID NO：7)、丛生蛋白(clusterin)(SEQ ID NO：8)、metargidin(SEQ ID NO：11)、未知PHG-13(SEQ ID NO：12)、视黄醛结合蛋白1(SEQ ID NO：13)和肌动蛋白γ1(actin gamma1)(SEQ ID NO：14)。
通过上述策略发现的典型的AMDP基因为膜型基质金属蛋白酶1(membrane-type matrix metalloproteinase 1，MT1-MMP)(SEQ ID NO：15)。MT1-MMP为编码关于细胞外基质再造的蛋白酶的基因，例如通过特异性激活明胶酶原A。明胶酶A为负责特异性断裂基底膜主要结构成分IV型胶原的主要金属蛋白酶。MT1-MMP还表现出抗其他细胞外基质的活性。
基于以下发现，已经证明MT1-MMP为筛选和治疗AMD和其他视网膜病变的非常吸引人的治疗靶标：
1)MT1-MMP在患有AMD的病人的眼中、AMD的猴模型中以及关于OS中RPE吞噬作用缺陷的视网膜变性模型RCS大鼠中的RPE和光感受器内受上游调控；
2)MT1-MMP与RPE细胞吞噬作用机制直接相关；
3)通过用抗MT1-MMP抗体在视网膜下空间中阻断激活MT1-MMP的存在，显著减缓RCS大鼠中视网膜变性的进程；
4)发现能产生mRNA剪接变体得到截短蛋白(truncated protein)的MT1-MMP的同义多态性(synonymous polymorphism)(即P259P)和影响蛋白催化结构域的MT1-MMP的错义多态性(missense polymorphism)(即D273N)，在患有AMD病人(54.8％对31.6％)和家族性黄斑病病人(68.2％对31.6％)的DNA中具有较高发生频率。
基于上述发现，本发明的一个目的是提供一种延迟或逆转受试者的视网膜或脉络膜变性疾病或状态的方法。所述方法包括用调节AMDP相关或吞噬作用相关基因的表达或活性的试剂接触具有或者处在即将发展成视网膜或脉络膜变性疾病或状态危险中的受试者的视网膜或脉络膜细胞。AMDP相关或吞噬作用相关的基因可以是人未知PHG-1、前列腺素D2合酶、髓磷脂碱蛋白、人未知PHG-4、人未知PHG-5、花生样2/分隔蛋白4、毛状蛋白样1、丛生蛋白、酪蛋白激酶1ε、铁蛋白重多肽1、metargidin、人未知PHG-13、视黄醛结合蛋白1、肌动蛋白γ1、膜相关基质金属蛋白酶1(matrixmetalloproteinase，membrane-associated1，MT1-MMP)、SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白和人未知AMDP-3。这里确定的上述AMDP相关或吞噬作用相关的基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQID NO：17。
优选的靶向用于调节表达或活性的基因为前列腺素D2合酶、MT1-MMP和未知基因AMDP-3，鉴于在AMD中表现受上游调控。在特别优选的实施方式中，所述试剂针对MT1-MMP核苷酸或蛋白。所述视网膜或脉络膜变性疾病或状态可以为AMD。所述方法可以为治疗遭受AMD痛苦或者处在发展成AMD的危险中的受试者。
所述方法可以延迟视网膜或脉络膜变性疾病或状态，或者可以逆转所述疾病或状态。
所述方法实施中接触的细胞类型可以是光感受器、RPE细胞或米勒细胞(Muller cell)，或者是包括内皮细胞、平滑肌细胞、白细胞、巨噬细胞、黑素细胞或成纤维细胞在内的脉络膜细胞类型。
在所述方法的优选实施方式中，其中AMDP相关或吞噬作用相关的基因是MT1-MMP，所述MT1-MMP可以位于细胞内或者例如感光器间基质的细胞外基质中。
在所述方法的一些实施方式中，所述试剂下游调控核苷酸的表达或者AMDP相关或吞噬作用相关的基因氨基酸序列。在优选实施方式中，所述靶向基因包括MT1-MMP、前列腺素D2合酶和AMDP-3，这里所述基因在AMD中表现出过度表达。所述试剂可以是寡聚核苷酸，例如核酶、反义RNA、干扰RNA(RNAi)分子或三股螺旋形式分子。
所述试剂还可以为特异性结合MT1-MMP、前列腺素D2合酶或者AMDP-3的蛋白或肽的抗体。优选所述抗体可以中和蛋白质或肽的至少一种生物学活性。例如，抗MT1-MMP的抗体可以中和明胶酶原A的激活作用或细胞外基质组分的降解作用。
在另一实施方式中，所述下游调控MT1-MMP、前列腺素D2合酶或者AMDP-3表达的试剂可以为小分子。
本发明的另一目的是提供一种确定受试者处在发展成视网膜或脉络膜变性疾病或状态的危险中的方法。所述方法包括筛选受试者的核苷酸序列在至少一种吞噬作用相关或AMDP相关基因中存在至少一种多态性，其中所述多态性的存在表明该受试者比没有出现多态性的受试者的发展成视网膜或脉络膜变性疾病或状态的危险性高。
所述吞噬作用相关基因包括但不限于未知PHG-1、前列腺素D2合酶、髓磷脂碱蛋白、未知PHG-4、未知PHG-5、花生样2/分隔蛋白4、毛状蛋白样1、丛生蛋白、酪蛋白激酶1ε、铁蛋白重多肽1、metargidin、未知PHG-13、视黄醛结合蛋白1、肌动蛋白γ1、膜相关基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)、SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白和未知AMDP-3。编码所述吞噬作用相关基因产物的核苷酸包括eDNA序列这里分别列在SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17中。
此方法中筛选的所述AMDP相关基因可以包括但不限于前列腺素D2合酶、酪蛋白激酶1ε、铁蛋白重多肽1、SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白和AMDP-3。编码所述AMDP相关基因产物的核苷酸包括cDNA序列这里分别列在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17中。
此方法中筛选的所述多态性可以出现在感兴趣的基因的内含子、外显子或者启动子区域之内。
在所述筛选方法的优选实施方式中，感兴趣的基因为MT1-MMP。所述多态性可以出现在人MT1-MMP基因区域内，该基因可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用具有选自由SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19、SEQID NO：20和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24和SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57以及SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58所组成的组中的核苷酸序列的扩增引物对。
在所述方法特别优选的实施方式中，多态性在人MT1-MMP基因的外显子5的285碱基对片段内。在此区域内，所述多态性可以包括D273N错义多态性和P259P同义多态性。
本发明的另外一个目的是提供一种治疗受试者的视网膜或脉络膜变性疾病或状态的方法。所述方法包括用包括编码试剂的核苷酸的载体接触受试者的视网膜或脉络膜细胞，所述试剂下游调控或抑制吞噬作用相关或AMDP相关mRNA或蛋白质的表达。所述包括在载体中的试剂可以为反义RNA、核酶或干扰RNA(RNAi)分子。在优选实施方式中，靶向所述吞噬作用相关或AMDP相关基因用于下游调控的是前列腺素D2合酶、MT1-MMP和AMDP-3，各自包括的核苷酸序列这里列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17。
另一方面，本发明提供了一种治疗视网膜或脉络膜变性疾病或状态的方法，该方法将载体递呈需要形式的吞噬作用相关或AMDP相关基因产物给需要治疗的受试者。所述载体可以包括编码吞噬作用相关或AMDP相关基因的野生型或多态变异体的核苷酸序列。
本发明的另一实施方式为用于防止或治疗受试者视网膜或脉络膜变性疾病或状态的组合物，该组合物包括阻断吞噬作用相关或AMDP相关基因的表达或活性的试剂。在一些实施方式中，所述试剂可以为反义RNA、核酶或干扰RNA(RNAi)分子。所述试剂还可以是抗体或者小分子。
包括载体的用于防止或治疗受试者视网膜或脉络膜变性疾病或状态的组合物也在本发明范围内。在多个实施方式中，所述载体可以包括编码下游调控或抑制吞噬作用相关或AMDP相关mRNA或蛋白质的表达的试剂的核苷酸，或者编码吞噬作用相关或AMDP相关蛋白的野生型或多态变异体的核苷酸。在优选实施方式中，所述吞噬作用相关或AMDP相关基因包括MT1-MMP、前列腺素D2合酶和AMDP-3。在特别优选实施方式中，所述基因为MT1-MMP。
本发明还提供了几种有用的非人类转基因动物的实施方式，例如作为AMD和其他视网膜变性状态的模型。优选转基因动物为哺乳动物，更优选啮齿动物，最优选小鼠。在一个实施方式中，转基因动物包括分离的核苷酸构建体，该构建体引起该动物的至少一种细胞类型过度表达吞噬作用相关或AMDP相关基因。所述吞噬作用相关或AMDP相关基因优选为MT1-MMP、前列腺素D2合酶或AMDP-3。优选转基因动物模型设计在特定细胞类型中过度表达吞噬作用相关或AMDP相关基因产物，该细胞类型包括选自光感受器、RPE细胞及米勒细胞的视网膜细胞类型；和包括内皮细胞、平滑肌细胞、白细胞、巨噬细胞、黑素细胞和成纤维细胞的脉络膜细胞类型。在一些实施方式中，所述感兴趣基因条件性过度表达。
另一个优选AMD/视网膜变性动物模型的实施方式为非人类转基因动物，该动物包括分离的核苷酸构建体，该构建体引起该动物的至少一种细胞类型表达吞噬作用相关或AMDP相关基因和/或蛋白质的多态变异体。在优选实施方式中，所述核苷酸和/或蛋白质为MT1-MMP、前列腺素D2合酶或AMDP-3。所述多态变异体与正常对照人群相比，可以为发病率增加的患有AMD的人群。
又一优选实施方式为非人类多转基因动物(polytransgenic animal)，该动物包括至少一个第一分离的核苷酸构建体和至少一个第二分离的核苷酸构建体，所述第一构建体引起该动物的至少一种细胞类型表达与AMD发病率增加相关的第一基因的多态变异体，并且所述第二构建体引起该动物的至少一种细胞类型表达与AMD发病率增加相关或者与RPE吞噬作用相关的第二基因的多态变异体。
在多转基因动物的优选实施方式中，所述第一基因为MT1-MMP，并且所述第二基因选自ABCR、载脂蛋白E(apolipoprotein E)、C-C趋化因子受体-2、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、海米生丁/FIBL-6、锰超氧化歧化酶(manganese superoxide dismutase)、C-C趋化因子配体/单核细胞趋化蛋白1和对氧磷酶(paraoxonase)。
在其他多转基因动物的优选具体施方式中，所述第一基因为MT1-MMP，并且所述第二基因为吞噬作用相关或AMDP相关基因选自人未知PHG-1、前列腺素D2合酶、髓磷脂碱蛋白、人未知PHG-4、人未知PHG-5、人花生样2/分隔蛋白4、毛状蛋白样1、丛生蛋白、酪蛋白激酶1ε、铁蛋白重多肽1、metargidin、人未知PHG-13、视黄醛结合蛋白1、肌动蛋白γ1、SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白和人未知AMDP-3。
本发明特别优选实施方式中的转基因动物为小鼠，小鼠提供相对较短的寿命的优势，使它们比其他长寿的动物模型如猴更适于用于研究年龄相关疾病。
再一方面，本发明提供了编码先前未表征基因产物的分离的核苷酸，这里表示为吞噬作用相关和/或AMDP相关蛋白。编码所述蛋白的核苷酸包括包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17的核苷酸序列。
本发明还提供了包括大量分离的寡聚核苷酸序列的基因阵列，所述序列位于自然人AMD相关和/或吞噬作用相关基因的内含子序列、外显子序列或者启动子序列中。通过阵列中存在的所述基因通过寡聚核苷酸序列编码cDNA，该cDNA包括这里示于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：62-SEQ ID NO：69的核苷酸序列。
在基因阵列的优选实施方式中，至少一个基因是MT1-MMP，并且所述寡聚核苷酸序列包括P259P或D273N多态变异体的MT1-MMP编码序列。所述MT1-MMP的变异体这里表现出相对于它们在正常对照受试者人群中的发生率而言，在患有AMD以及其他黄斑变性状态的人群中它们的发生率增加。
所述阵列还包括至少一个寡聚核苷酸序列，该序列包括除MT1-MMP外的一个或多个AMD相关基因的至少一个多态变异体。所述多态突变体序列可以包括：ABCR(D217N；G1961E)、锰超氧化歧化酶(V47A)、载脂蛋白E(C130、R176C和C130R、R176)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(A25T)和对氧磷酶(Q192R、L54M)。
本发明所述基因阵列用于例如从受试者中筛选DNA样品，以检测受试者DNA中大量AMDP相关和/或吞噬作用相关基因多态变异体的分布。与AMD多基因(综合疾病)病因学一致，仔细考虑受试者DNA中属于AMDP相关或吞噬作用相关基因特异性多肽变异体的结合分布的信息，能够用于预测受试者处在即将发展成诸如AMD的视网膜紊乱危险中的可能性，大于缺乏所述AMDP相关或吞噬作用相关基因的特异性多肽变异体结合的受试者。
本发明所述特制的AMD和相关疾病的基因阵列，能够提供方便且相对价廉的测试已知与AMD和相关疾病相关的大量多态变异体的方法。
本发明的所述目的和其他目的在下列说明书和实施例里更加详细地提出，意在详细说明本发明但并不用于限制本发明的范围。
附图说明
附图构成本发明说明书的一部分，还包括本发明特定方面的说明。通过参考下列一幅或者多幅附图，结合本发明实施方式的详细描述可以更好地理解本发明。
图1为显示两份CHANGE阵列组(panel)的照片，每一组包括96个基因(点)根据本发明实施方式用“+”和“-”探针(探针1和探针2)杂交；与探针1杂交和与探针2杂交相比，向上和向下的箭头分别表示基因表达的增加或减少；
图2(上面的组)表示培养的RPE细胞杆体外节(rod outer segments，ROS)吞噬作用的活性测定机理示意图；下面的组表示根据本发明实施方式输送ROS后，活BPEI-1RPE细胞进行吞噬作用的黑白照片；当通过荧光显微镜观察时，RPE细胞中的溶酶体因硫酰罗丹明(sulforhodamine，SR)染色呈红色并且异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)染色的ROS呈绿色；连续吞噬作用阶段过程中，ROS结合在细胞表面，然后被RPE细胞摄入，第一吞噬体(phagosome)及然后被溶酶体融合的吞噬溶酶体(phagolysosome)(通过桔黄色荧光区分)；
图3为显示根据本发明实施方式在输送FTIS-ROS后，在指示的时间点观察大规模培养活BPEI-1RPE细胞的ROS吞噬作用不同时期的系列照片；靠上的四组显示了ROS在输送最初的9-10个小时大量结合到细胞表面；输入ROS后开始大约的11个小时，靠下的四组显示了ROS的摄入和吞噬溶酶体的形成同步；
图4为显示根据本发明的一个实施方式通过CHANGE发现的RPE细胞表达的16个吞噬作用相关基因(“吞噬基因(phagogene)”)的mRNA表达概况的曲线图；体外ROS吞噬作用过程中选择时间点上RPE细胞中吞噬基因表达水平的波动；参看下文表1中提供了吞噬基因(PHG-1-16)的鉴定；
图5为显示根据本发明实施方式，用于划分人捐献眼视网膜中AMD相关变化的分级系统的三张照片；等级显示：0-+1，最小限度的布鲁赫膜增厚；+2-+3，多重小到中等大小的脉络膜小疣，伴随布鲁赫膜增厚；+3-+4，大量合生脉络膜小疣；
图6为ROS输送后4小时和13小时，培养的RPE细胞吞噬作用过程中，表示MT1-MMP和肌动蛋白mRNA表达的两个RNA印迹和曲线图；可见在4小时时表达下降，在13小时时表达上升，结果通过CHANGE得到证实；每一泳道RNA的存在量通过肌动蛋白的杂交估计，用于MT1-MMP杂交信号的标准化；
图7为显示根据本发明的实施方式，正常大鼠视网膜MT1-MMP的mRNA表达的波动(昼夜)模式的曲线图；MT1-MMP表达的最高水平出现在上午六点，在体内光感受器(OS)脱落和吞噬作用最大的时间前的约1-2小时；
图8为显示根据本发明的实施方式，用抗MT1-MMP抗体免疫染色的八张在一天不同时间固定的正常大鼠视网膜免疫荧光染色的显微照片(相差和荧光)；在OS和RPE中存在的MT1-MMP蛋白免疫荧光水平可见昼夜差异，上午六点观察到最高的信号水平，上午十点稍低以及晚上十点没有信号，MT1-MMP的mRNA表达水平的连续昼夜模式见图7；
图9为用抗MT1-MMP抗体染色的人视网膜切片的荧光显微照片，根据本发明的实施方式，显示了MT1-MMP蛋白在杆和锥光感受器OS中以及在RPE细胞内吞噬体中的位置；
图10(A-C)为三张荧光显微照片，显示了根据本发明实施方式，抗MT1-MMP抗体在培养的RPE细胞的ROS吞噬作用方面的效果；未与抗体孵育的对照细胞(B)的细胞质中以及与不相关(X-抑制蛋白(X-arrestin))抗体孵育的细胞(C)中明显摄入输送的ROS(荧光)，而ROS结合和吞噬作用没有在输送ROS前与抗MT1-MMP抗体孵育的细胞中发生(A)；
图11(A-D)为四张正常大鼠视网膜的苏木精曙红染色(H&E stained)石蜡切片的显微照片，显示了在外层视网膜结构上视网膜下注射抗MT1-MMP抗体的效果；在抗MT1-MMP抗体注射的左眼OS中观察到明显延长并且OS正常定向、连续抑制OS吞噬作用(A、B)；相反，在同一动物未注射的右眼(O.D.)视网膜结构正常(C)；视网膜下注射不相关(X-抑制蛋白(X-arrestin))抗体没有效果(D)；
图12展示了患有AMD受试者(A)相对于正常对照受试者(N)在RPE/脉络膜以及视网膜中MT1-MMP的mRNA表达水平的RNA印迹分析；A可见患病的视网膜中MT1-MMP的mRNA水平增加5.5倍，该受试者RPE/脉络膜中伴随增加1.2倍；RNA印记杂交信号关于每一泳道RNA的存在量，使用肌动蛋白杂交作为参考标准化；
图13为显示在患有AMD受试者视网膜中，MT1-MMP的mRNA水平与AMD相关病理学严重程度的增加(0-+4级变化)正相关；
图14显示了包括人MT1-MMP外显子5的285碱基对PCR产物的核苷酸序列；密码子259和密码子273的位置加了下划线；显示AMD和黄斑变性病人中发现的多态性P259P和D273N的碱基变化表示为黑体；
图15为显示在出生后7天视网膜下注射抗MT1-MMP抗体、30天龄固定的RCS大鼠中遗传性视网膜变性延迟的两张显微照片；与对比的同一动物的未注射对照眼(B)中的中部中央区域相比，在注射眼(A)的视网膜外核层中保留更大数目的光感受器核(大约2倍)证明视网膜变性延迟。
具体实施方式
基于上述发现，本发明提供了相关AMD和/或RPE细胞吞噬作用的新基因、检测和治疗AMD和其它黄斑变性状态的方法和组合物，以及基于吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的、尤其是用于测试AMD的治疗化合物和治疗方案的有用动物模型。下面结合附图详细描述适合所述组合物和方法优选实施方式。虽然如此，从说明书所述实施方式，基于下面提供的描述可以达到或者实现本发明的其它方面。
生物学方法
这里描述关于常规分子生物学技术的方法。所述技术本领域普遍公知，在方法学论著例如Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，2nd ed.，vol.1-3ed.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；以及Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel等人，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(周期性更新)中的到详细描述。例如在Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，Academic Press：San Diego，1990中描述了使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的各种技术。例如在Beaucage andCarruthers，Tetra.Letts.22：1859-1862，1981，和Matteucci等人，J.Am.Chem._Soc.103：3185，1981中讨论了核苷酸的化学合成方法。核苷酸的化学合成可以在例如商业自动寡聚核苷酸合成器上完成。免疫方法(例如，抗原特异性抗体的制备、免疫沉淀和免疫印迹)在例如Current Protocols inImmunology，ed.Coligan等人，John Wiley & Sons，New York，1991；以及Methods of lmmunological Analysis，ed.Masseyeff等人，John Wiley & Sons，New York，1992中得到描述。本发明还可以选用基因转移和基因治疗的常规方法。参见例如，Gene Therapy：Principles and Applications，ed.T.Blackenstein，Springer Verlag，1999；Gene Therapy Protocols(Methods in MolecularMedicine)，ed.P.D.Robbins，Humana Press，1997；以及Retro-vectors forHuman Gene Therapy，ed.C.P.Hodgson，Springer Verlag，1996。
通过CHANGE分离的吞噬作用相关基因
鉴定有关RPE细胞OS中吞噬作用的基因完成引导本发明的研究，当受到干扰时，可以导致RPE中的应激和机能障碍。所述应激能导致一种或多种不期望出现的与黄斑、视网膜或脉络膜疾病相关的变化，例如脂褐素增加积聚、脉络膜小疣形成或新生血管膜形成。这里描述的所述基因发现基于RPE吞噬作用中的机能障碍是导致诸如AMD相关变化的重要因素的前提。RPE细胞完成维持光感受器内环境稳定的重要功能。所述必需的任务包括尤其是每日吞噬和消化OS膜的过程，OS膜得以更新并每日从光感受器OS末端脱落(Young和Bok，1969)。正如下面进一步所描述，所述吞噬过程包括结合、摄入和消化OS膜的步骤。在正常环境中，RPE细胞为不分裂的细胞。因此贯穿每个个体一生时间，每日OS吞噬作用的过程不仅代表了在这些细胞上的巨大新陈代谢载荷，还代表了促成在这些细胞内未消化物质的积聚，特别是脂褐素、细胞内废物复合汞齐包括有毒光感受器衍生的物质例如A2E。
因此，一方面本发明提供了先前未知与RPE细胞吞噬作用过程功能上相关的核苷酸和蛋白序列。在本发明之前没有系统寻找过RPE细胞OS吞噬作用机理有关基因，这里还命名了“吞噬作用相关基因”或“吞噬基因”缩写为“PHG”。与AMD为多基因疾病的认识一致，并且RPE吞噬作用为多步细胞内关于许多不同基因产物的必需过程，本发明的发明人基于对细微变化的认识，找到确定吞噬作用相关基因，例如一个或多个吞噬作用相关基因的DNA序列中多态性，或者在吞噬作用相关基因中的多态性与其它基因多态性的结合，可能共同作用产生AMD中能观察到的表现型。
为了通过差异表达得到感兴趣基因，如下面实施例进一步描述的，开发常规表达概略策略，称为基因表达的比较杂交分析(comparative HybridizationAnalysis of Gene Expression，CHANGE)。所述CHANGE阵列包括在RPE中表达的大约10000个基因，每组阵列排列包括96个cDNA(见图1)。为了得到吞噬基因，RPE表达基因的CHANGE阵列用成对“+/-OS”杂交探针筛选。所述“+/-OS”杂交探针用体外OS吞噬作用过程中表达在吞噬的RPE细胞系中的总RNA(+OS探针)和没有输送OS的对照细胞中的总RNA制成(-OS探针)。基于OS吞噬作用过程中表现出的表达变化(即增加或减少)，如图1箭头所示，通过与+OS探针比较-OS探针杂交的杂交信号的变化证实，挑选阵列中的基因进行进一步分析。从大约10000个基因中筛选，基于通过CHANGE检测的基因表达变化鉴定约60个假定吞噬作用相关基因。从这60个基因中，随机选出16个表现吞噬刺激(即用+/-OS探针筛选)的杂交密度变化非常明显的基因进一步研究，证实它们与RPE吞噬作用功能相关。表1提供了上述随后证实的与RPE细胞OS吞噬作用相关的吞噬基因的列表。所述基因在下面的表2中进一步描述。还见图4显示了体外RPE细胞OS吞噬作用过程中所述基因的mRNA表达概况。
表1  通过CHANGE分离的人吞噬作用相关基因
 
名称 克隆数 核苷酸SEQID NO       氨基酸SEQID NO(S)    鉴定
PHG-1 6-29 1 71-79 未知
PHG-2 33-25 2 80 前列腺素D2合酶
PHG-3 33-74 3 81 髓磷脂碱蛋白
PHG-4 43-16 4 82-84 未知
PHG-5 45-88 5 85 未知
PHG-6 53-7 6 86 花生样2/分隔蛋白4
PHG-7 55-26 7 87 毛状蛋白样1
PHG-8 55-28 8 88 丛生蛋白
PHG-9 57-29 9 89 酪蛋白激酶1ε
PHG-10 57-29 9 89 酪蛋白激酶1ε(双份(duplicate))
PHG-11 73-51 10 90 铁蛋白重多肽1
PHG-12 74-39 11 91 metargidin
PHG-13 78-70a 12 92-98 未知
PHG-14 78-70c 13 99 视黄醛结合蛋白1
PHG-15 80-31 14 100 肌动蛋白γ1
PHG-16 91-40 15 101 膜相关基质金属蛋白酶1
通过CHANGE分离的AMDP相关基因
另一方面，本发明提供了先前未知与AMD相关基因的核苷酸和蛋白序列。为了获得AMD相关基因，如上所述使用其它的“+/-”探针对反复筛选大约10000个RPE表达基因的CHANGE阵列。所述用于鉴定AMD相关基因的“+/-”探针，用取自患有AMD及未患该病的人捐献的眼RPE/脉络膜以及年龄吻合的AMD猴模型的正常及患病的眼的总RNA制成。基于AMD中相对于高龄正常对照眼中表现出的差异表达(即增加或减少)，选择阵列中的基因做进一步分析。基于通过CHANGE测试的基因表达改变的标准，鉴定出大约200个AMD相关基因。
为了鉴定AMD相关吞噬基因(“AMDP基因”)，对比从上述两次CHANGE筛选的数据，以鉴定在RPE细胞OS吞噬作用和AMD中都差异表达的RPE基因子集。如上所述，吞噬作用CHANGE筛选产生了大约60个吞噬基因，并且推定AMD相关的基因数目达约200个。初步对比两个数据库，得到了6个基因的子集在吞噬作用和AMD中都显示出表达变化(表2)。所述基因这里命名为“AMD相关吞噬基因”或“AMD/吞噬基因”缩写为“AMDP”。
表2
 
名称 克隆数 核苷酸SEQID NO       氨基酸SEQID NO(S)    鉴定
AMDP-1 33-25 2 80 前列腺素D2合酶
AMDP-2 37-14 16 102 SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白
AMDP-3 47-94 17 103-121 未知
AMDP-4 57-29 9 89 酪蛋白激酶1e
AMDP-5 73-51 10 90 铁蛋白重多肽1
AMDP-6 91-40 15 101 膜相关基质金属蛋白酶1
再上述列举的基因中，CHANGE杂交分析显示基因AMDP-1、AMDP-3和AMDP-6在AMD眼中的表达水平高于对照组，然而基因AMDP-2、AMDP-4和AMDP-5在AMD眼中的表达水平低于对照组。AMDP基因在后面实施例3中进一步描述。
编码吞噬作用相关和/或AMDP相关基因产物的核算以及其多态变异体
如上所述，本发明提供了关于通过差异克隆策略(CHANGE)——展示RPE吞噬作用和/或AMD中表达变化所发现的基因的核苷酸和氨基酸序列。一方面本发明提供了通过此策略分离的新纯化的核苷酸(多核苷酸)。本发明先前未知的核苷酸包括这里鉴定为PHG-1(SEQ ID NO：1)、PHG-4(SEQID NO：4)、PHG-5(SEQ ID NO：5)、PHG-13(SEQ ID NO：12)和AMDP-3(SEQ ID NO：17)的核苷酸序列。所述核苷酸序列分别编码具有这里鉴定为SEQ ID NO：71-SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：82-SEQ ID NO：84、SEQID NO：85、SEQ ID NO：92-SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：121的氨基酸序列的多肽。
本发明还包括先前未知的与RPE吞噬作用和/或AMD有关的特征核苷酸和多肽应用。基于RPE吞噬作用过程中和/或AMD病人体内的表达变化，发现所述先前已经表征的基因与吞噬作用和AMD的关系。后者的核苷酸组包括前列腺素D2合酶(SEQ ID NO：2)、髓磷脂碱蛋白(SEQ ID NO：3)、花生样2/分隔蛋白4(SEQ ID NO：6)、毛状蛋白样1(SEQ ID NO：7)、丛生蛋白(SEQ ID NO：8)、酪蛋白激酶1ε(SEQ ID NO：9)、铁蛋白重多肽1(SEQ ID NO：10)、metargidin(SEQ ID NO：11)、视黄醛结合蛋白1(SEQ ID NO：13)、肌动蛋白γ1(SEQ ID NO：14)、膜相关基质金属蛋白酶1(SEQ ID NO：15)、和SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白(SEQ ID NO：16)。
本发明的核苷酸分子可以为RNA形式或DNA形式(例如cDNA、基因组DNA和合成DNA)。本发明优选核苷酸分子为天然多核苷酸，这里所述天然核苷酸包括分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQID NO：17所示的核苷酸序列。
所述编码天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的编码序列可以与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列一致。它们也可以为不同的编码序列，由于遗传密码子的重复性或简并性，它们可以编码与如SEQID NO：1至SEQ ID NO：17所示多核苷酸所编码的同样多肽。本发明范围内的其它核苷酸分子包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17所示序列的变异体，例如它们编码的片段、类似物和这里描述的吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的衍生物。所述衍生物可以是例如，自然发生的天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因等位基因的变异体、拼接变异体或非自然发生的吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的变异体。所述变异体具有的核苷酸序列与对应的天然SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17所示序列存在一个或多个碱基的差异。例如，所述变异体的核苷酸序列可以表征为天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的一个或多个核苷酸的缺失、添加或取代。
在一些应用中，变异体核苷酸分子编码维持吞噬作用相关和/或AMDP相关功能活性的多肽。在另外的应用中，变异体核苷酸分子编码表征为吞噬作用相关和/或AMDP相关基因中的重要功能活性基因缺乏或减少的多肽。需要保留天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的功能活性的，优选变异体核苷酸特征沉默或保守核苷酸变化。
在其它应用中，显示出一个或几个天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因功能活性的实质变化的变异吞噬作用相关和/或AMDP相关多肽，可以通过进行核苷酸取代产生，引起比被编码多肽中小于保守变化的变化。所述核苷酸取代的实例为引起(a)多肽主链的结构；(b)多肽的电荷或疏水性；(c)氨基酸侧链体积的变化的取代。一般预期产生蛋白质性质的最大变化的核苷酸取代为密码子的非保守变化。可能导致蛋白质结构的较大变化的密码子变化的实例包括引起(a)例如丝氨酸、苏氨酸的亲水性残基，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸的疏水性残基；(b)具有其它任意残基的半胱氨酸或脯氨酸；(c)例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸的具有带正电侧链的残基，例如谷氨酸或天冬氨酸的具有带负电侧链的残基；或者(d)例如酪氨酸具有大侧链的残基，例如甘氨酸的美欧侧链的残基的取代。
本发明范围内自然发生天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因等位基因变异体为与天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因至少具有75％(例如76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％)序列同源性的核苷酸，并且其编码的多肽和具有天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因至少一种相同的功能活性。本发明范围内天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因同系物为分离自非人类物种的、与天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因至少具有75％(例如76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％)序列同源性的核苷酸，并且其编码的多肽和具有天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因至少一种相同的功能活性。
自然发生的天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因等位基因变异体和天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因同系物可以使用本领域公知的技术，通过筛选天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的天然功能活性(例如，明胶酶原A的激活、MT1-MMP的情况)分离。所述同系物和等位基因变异体的核苷酸序列可以通过常规DNA测序方法测定。可选地，公共或非专属性(non-proprietary)核苷酸数据库可以用于寻找鉴定其它具有与天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因高百分率同源序列非的核苷酸分子。
非自然发生的吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的变异体为自然不发生、与天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因至少具有75％(例如76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％)序列同源性的核苷酸。非天然自然发生的吞噬作用相关和/或AMDP相关的核苷酸的实例为编码吞噬作用相关和/或AMDP相关蛋白片段的核苷酸、与天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因杂交的核苷酸、或者在严格条件下与天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因互补的核苷酸、与天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因共有至少65％序列同源性的核苷酸、或与天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的互补的核苷酸以及编码吞噬作用相关和/或AMDP相关基因融合蛋白的核苷酸序列。
本发明范围内编码吞噬作用相关和/或AMDP相关基因片段的核苷酸为分别编码例如2、5、10、25、50、100、150、200、250、300或者更多吞噬作用相关和/或AMDP相关蛋白的氨基酸残基的核苷酸。较短寡聚核苷酸(例如6、12、20、30、50、100、125、150或200的碱基长度)编码或杂交编码吞噬作用相关和/或AMDP相关基因片段的核苷酸，可以用作探针、启动子或反义分子。较长的多核苷酸(例如300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000或者更多碱基例如4000、5000、6000、7000、8000和9000碱基)编码或杂交编码吞噬作用相关和/或AMDP相关基因片段的核苷酸，当希望调整吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的功能活性时，可以用于代替天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因。编码吞噬作用相关和/或AMDP相关基因片段的核苷酸可以通过酶消化(例如使用限制性酶)、化学降解吞噬作用相关和/或AMDP相关基因及其变异体的全长序列制备。
在严格条件下杂交如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示核苷酸或者与如SEQ ID NO：1、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示核苷酸互补的核苷酸也在本发明范围内。例如，所述核苷酸在低严格条件、中等严格条件或者高等严格条件下与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示核苷酸杂交或者与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示核苷酸互补。优选所述核苷酸具有核苷酸序列与如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示核苷酸全部或者部分互补。其它本发明范围内的如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示核苷酸的变种为与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQID NO：17所示核苷酸共有至少65％(例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％)序列同源性的核苷酸、或与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：12和SEQ ID NO：17所示核苷酸互补的核苷酸。在严格条件下杂交的核苷酸，或者与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示核苷酸共有至少65％序列同源性的核苷酸，或者与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：12和SEQ ID NO：17所示核苷酸互补的核苷酸可以通过本领域公知的技术得到。
编码天然吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的融合蛋白的核苷酸分子，例如编码如这里SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17所示核苷酸的核苷酸分子也在本发明范围内。所述核苷酸可以通过制备当导入合适宿主时表达吞噬作用相关和/或AMDP相关的融合蛋白的构建体(例如表达载体)制备。例如所述构建体可以通过连接编码吞噬作用相关和/或AMDP相关蛋白(例如MT1-MMP)的第一多核苷酸，在阅读框(frame)中融合编码其它蛋白的第二多核苷酸制备，这样构建体在合适表达系统中表达产生融合蛋白。
本发明包括如上所述编码能与吞噬作用相关和/或AMDP相关多肽的核苷酸杂交的标记的核苷酸探针。所述本发明的核苷酸分子允许本领域技术人员构建核苷酸探针用于检测生物材料中的本发明核苷酸序列。所述探针可以用于检测吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的杂交。所述技术一般包括与本发明探针在适合核苷酸中互补序列与探针特定复性条件下，接触和孵育得自病人或其它细胞来源样品的核苷酸(例如mRNA分子)。孵育后，移除未复性的核苷酸，并且如果存在已与探针杂交的核苷酸，进行检测。
所述检测本发明核苷酸分子可以包括使用扩增方法(例如PCR)扩增特异性基因，然后用本领域技术人员公知的技术分析扩增分子。本领域技术人员可以继续设计合适的引物。例如可以用商业提供软件例如OLIGO4.06引物分析软件(National Biosciences，Plymouth Minn)或者其它适合的程序设计引物，引物长度大约为22至30个核苷酸，具有GC含量约50％或以上，并且与模板退火温度约为60℃至72℃。
这里所述的杂交和扩增技术可以用于定量和定性方面检测吞噬作用相关和/或AMDP相关基因表达。例如，可以从一种细胞类型或者组织中分离出已知表达吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的RNA，例如具有SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：17所示核苷酸的基因，以及检测应用杂交(例如标准RNA印迹分析)或PCR技术这里作为参考。可以用到例如，检测可能导致正常或异常选择性剪接的转录子大小差异的技术。所述技术也可以用于定量检测正常个体相对于表现出疾病症状的个体之间的全长和/或选择性剪接的转录子水平差异。所述引物和探针可以使用上述的原位方法，即直接在得自活组织检查的病人组织、切除术或者眼库的组织切片上(固定和/或冷冻)。本发明特别应用的探针和引物在下面的实实例中进一步描述。
吞噬作用相关和/或AMDP相关核苷酸的遗传筛选
另一方面本发明提供了检测处在即将发展成视网膜或脉络膜疾病或变性状态危险中的受试者的方法。这里所用的“视网膜或脉络膜疾病或变性状态”包括但不限于下列任何眼视网膜或脉络膜的状态：导致光感受器、RPE细胞或视网膜其他细胞类型损伤或死亡、或者包括但不限于内皮细胞、黑素细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、单核细胞和肥大细胞的脉络膜细胞类型损伤、死亡或异常增生。
影响视网膜和/或脉络膜的变性的条件包括年龄相关和其他黄斑病变，包括但不限于年龄相关黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、遗传性和早期发病性黄斑变性(“家族性AMD”)例如斯塔加特氏病/眼底营养不良、贝斯特病/卵黄状变性、先天性弥漫性脉络膜小疣/多英氏蜂窝状视网膜营养不良、范型营养不良(pattern dystrophies)、索斯比氏黄斑营养不良、近中心凹毛细血管扩张(juxtafoveal telangiectasia)、脉络膜萎缩、显性脉络膜小疣(dominant drusen)、晶体蛋白小疣(crystallin drusen)、环状黄斑营养不良(annular macular dystrophy)、隐性脉络膜新生血管膜(occult chorodialneovascular membrane)、无脉络膜(choroideremia)、特发性牛眼样黄斑病变(idiopathic bull′s-eye maculopathies)、回旋形萎缩(gyrate atrophy)以及各种类型的遗传性视网膜色素变性情况。其他疾病或视网膜和脉络膜变性情况包括中毒性视网膜病(toxic maculopathies)，例如，如硫酸羟氯喹制剂中毒(Plaquenil toxicity)的药物引起的黄斑变性，包括视网膜剥离(retinaldetachment)、光视网膜病变(photic retinaopathies)的视网膜紊乱，由外科手术引起的视网膜病，中毒性视网膜病，妊娠性视网膜病(retinopathy ofpregnancy)，诸如巨细胞病毒(CMV)或艾滋病相关的人类免疫缺陷病毒(HIV)视网膜病的严重视网膜病，色素层炎，由于静脉或者动脉闭塞或者其他血管紊乱导致的局部缺血视网膜病，由于眼外伤或穿透性损伤引起的视网膜病，外周玻璃体视网膜病以及诸如视网膜母细胞瘤、脉络膜黑素瘤(choriodal melanoma)影响眼的癌症。
所述检测危险性的方法包括筛选受试者的核苷酸吞噬作用相关和/或AMDP相关基因多态的存在，其中，所述存在多态表明与没有多态性的对照受试者相比，具有多态的受试者处在即将发展成视网膜或脉络膜疾病或变性紊乱的较大危险中。这里用的“正常”或“野生型”核苷酸是指受试者的DNA中特定位置的碱基位于已知普通人群中该主要碱基的特定位置。“多态”、“多态变异体”或“多态碱基或核苷酸”为天然产生的与普通人群中“野生型”代表的碱基相比以较低频率发生的碱基变化。这里所用“多态”可以包括称为“变异”的碱基变化。
本发明吞噬作用相关和/或AMDP相关核苷酸，其本身或者与其他一个或多个核苷酸结合可以用于杂交、扩增和筛选分析生物样品以检测包括点突变、插入、缺失和染色体重排的异常。遗传筛选方法在分子药物领域中公知。可以使用例如，用基因组DNA、直接测序法、单链构象多态分析、异源双链分析(heteroduplex、analysis)、变性梯度凝胶电泳法、化学错配裂解法和寡聚核苷酸杂交(包括在基因阵列中与寡聚核苷酸杂交)。一般而言，基因组DNA样品得自受试者，例如得自受试者的外周血、或得自从捐献的组织例如眼库中制备的生物样品。所述用于扩增特异性基因序列的DNA、例如感兴趣的特定外显子、内含子或启动子序列。为了检测受试者DNA中多态的存在，可以应用单链构象多态分析(single strand conformationpolymorphism，SSCP)、异源双链体分子以及它们的自动模式(automatedversion)，然后DNA序列分析检测特定碱基变化。所述方法还可以用于证实报道的多态，例如人类基因组单链核苷酸多态数据库(Single NucleotidePolymorphism)中可用的多态。
本发明提供了筛选受试者RPE吞噬作用相关和/或AMD相关多态突变体基因的方法。在一个优选的方法中，基于感兴趣基因核苷酸序列和该基因中用于扩增的一个或多个外显子、内含子或启动子序列，设计了正义和反义的引物(扩增引物)对。一个优选的用于筛选患有AMD和其他黄斑疾病的病人的变异体和多态基因的组，包括先前未知这里表现与吞噬作用相关和/或AMD相关的基因、这里鉴定为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所示的cDNA序列。这里还公开了与吞噬作用相关和/或AMD相关的其他优选的基因，具有这里如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的核苷酸(cDNA)序列(见上文表1和表2)。正如这里所示的，典型的与AMD和吞噬作用有关的基因为MT1-MMP(SEQ ID NO：15)。这里公开的任何适合于扩增吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的外显子、内含子或启动子序列的扩增引物可以由分子生物学领域技术人员设计，用于筛选变异和/或多态DNA样品。作为例子，适于扩增人MT1-MMP基因的外显子1-10、内含子1-9和启动子区域的特异扩增引物对在后面表3中公开。
本发明所述核苷酸还可以用于阵列中多重基因的筛选。任何得自本发明核苷酸分子的寡聚核苷酸或者较长片段可以用作基因阵列比如微点阵(microarray)的靶标。所述阵列中的基因靶标可以包括例如得自任何这里公开的吞噬作用相关和/或AMDP相关基因(即SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17)的组合核苷酸，以及任何先前描述的核苷酸，例如先前与RPE吞噬作用和/或AMD相关的核苷酸，包括但不限于得自序列这里鉴定为SEQ IDNO：62至SEQ ID NO：69的核苷酸。在所述阵列中包括的寡聚核苷酸序列可以得自位于感兴趣自然人类基因的内含子、外显子或启动子序列之内的序列。优选所述阵列包括含有感兴趣基因的所有已知多态变异体的寡聚核苷酸序列。更优选适合于例如筛选患有诸如AMD的眼病病人的DNA的常规阵列，包括所有已知的、相对于正常受试者对照人群，在患有AMD以及其他相关紊乱的病人人群中呈示特异性多态变异体表现发生率增加的多态变异体。参见下文表5列举了先前报道的与AMD有关的多态或变异的基因。因此本发明用作AMD筛选适合于包括在常规阵列中的基因以及在AMD中(表示在括号中)显示发生率上升的相关多态变异体，可以包括但不限于：MT1-MMP(P259P；D273N)、ABCR(D217N；G1961E)、锰超氧化歧化酶(V47A)、载脂蛋白E(C130、R176C和C130R、R176)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(A25T)和对氧磷酶(Q192R、L54M)。
本发明所述基因阵列可以用于例如同时监测大量基因的表达水平，以及鉴定大量基因中的遗传变异体、突变和多态。所述得自病人DNA样品与阵列的杂交分析信息可以被用于例如检测基因功能、理解紊乱的遗传基础、诊断或预测疾病发展的可能性，或者开发和检测治疗试剂的活性。所述基因阵列包括微点阵的制备、使用以及分析为本领域技术人员公知。参见例如Brennan，T.M.等人(1995)US5474796；Schena，等人(1996)Proc.Nail.Aca.Sci.93：10614-10619；Baldeschweiler等人(1995)PCT申请WO95/251116；Shalon，D.等人(1995)PCT申请WO95/35505；Heller，R._A.等人(1997)Proc.Nail.Acad.Sci.94：2150-2155；以及Hetler，M.J.等人(1997)US 5605662和Cronin，M.等人(2003)US 6632605。
调整吞噬作用相关和/或AMDP相关基因产物的表达或活性的试剂
另一方面，本发明提供了调整吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的mRNA或蛋白表达水平的试剂。优选的作为下游调控靶标的基因/蛋白质为在AMD和相关紊乱中出现表达增加的基因/蛋白质如这里所证明包括前列腺素D2合酶(prostaglandin D2 synthase，PD2S)(对应的核苷酸和氨基酸序列：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：80)、MT1-MMP(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：101)以及AMDP-3(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：103-SEQID NO：121)。优选的作为上游调控靶标的基因/蛋白质为在AMD和相关紊乱中出现表达增加的基因/蛋白质如这里所证明包括SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：102)、酪蛋白激酶1ε(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：89)以及铁蛋白重多肽1(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：101)。
所述AMDP相关和/或吞噬作用相关mRNA或蛋白质可以为天然物即“野生型”例如，天然MT1-MMP。在另一实施方式中，靶向AMD相关和/或吞噬作用相关基因多态变异体，例如导致表达的mRNA或蛋白功能变化的变异体。当野生型完整mRNA或蛋白允许表达时，所述变化的mRNA或蛋白受抑制。
所述用于下游调控表达的抑制剂可以包括例如反义RNA分子、核酶、小干扰RNA(RNAi)分子和三股螺旋结构。所示试剂的优选实施方式是直接对抗PD2S(SEQ ID NO：2)、MT1-MMP(SEQ ID NO：15)和AMDP-3(SEQ ID NO：17)或者它们的变异体。所述抑制剂还可以包括选择性结合如PD2S、MT1-MMP和AMDP-3的过度表达的吞噬作用相关和/或AMDP相关的蛋白抗体分子。
本发明中的反义核苷酸分子在细胞环境中与细胞内编码吞噬作用相关和/或AMDP相关蛋白的mRNA和/或基因组DNA特异性杂交(例如结合)，所述杂交某种程度上抑制吞噬作用相关和/或AMDP相关蛋白的表达，例如，抑制转录和/或翻译。所述结合可以是常规的碱基对互补，或者例如通过在双螺旋大沟中的特异性相互作用结合DNA双链体的情况。设计反义分子的方法为本领域技术人员公知。构建低聚体用于反义治疗的一般方法参考例如Van der Krol等人(1988)Bioteclmlques 6：958-976；Stein等人(1988)CancerRes 48：2659-2668以及Naraymaan，R.和AKtar，S.(1996)：Antisensetherapy.Curt.Opin.Oncol.8(6)：509-15。作为非限制性实施例，反义寡聚核苷酸可以靶向杂交下列区域：mRNA帽子区域；翻译起始位点、翻译终止位点、转录起始位点、转录终止位点、多腺苷酸化信号、3’非翻译区、5’非翻译区、5’编码区、中间编码区和3’编码区。
反义构建体例如可以被表达质粒输送，在细胞内被转录产生RNA，该RNA互补于细胞内编码吞噬作用相关和/或AMDP相关基因产物的mRNA的至少一个单一部分。可选地，所述反义构建体可以以寡聚核苷酸探针的形式离体产生，当被导入到吞噬作用相关和/或AMDP相关基因表达的细胞中时，通过与编码吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的mRNA和/或基因组序列杂交，引起对应基因的选择性表达抑制。所述寡聚核苷酸探针优选修饰的寡聚核苷酸，可以抵御内源核酸酶例如外切核酸酶和/或内切核酸酶，因此在体内更稳定。用作反义寡聚核苷酸的典型的核苷酸分子为氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫基磷酸酯(phosphothioate)甲基膦酸酯DNA类似物(见例如US 5176996、US 5264564和US 5256775)。优选关于反义DNA，得自翻译起始位点的寡聚脱氧核苷酸，例如在吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的-10到+10区域编码核苷酸序列。
反义方法包括设计与吞噬作用相关和/或AMDP相关mRNA互补的寡聚核苷酸(DNA或者RNA)。所述寡聚核苷酸将结合吞噬作用相关或AMDP相关基因的mRNA转录子并阻止翻译。绝对的互补虽然最优选但是不必要。所述杂交的能力将取决于互补的程度和反义核苷酸的长度。通常杂交的核苷酸越长，与mRNA错配的碱基越多，可能包括并仍然形成稳定的双链(或者三链，视情况而定)。本领域技术人员可以通过使用标准方法测定杂交复合物的解链温度(melting point)，确定错配的容忍程度。与5’末端信息互补的寡聚核苷酸，例如上至5’非翻译序列以及包括AUG起始密码子，一般起作用最有效抑制翻译。然而，与mRNA3’非翻译序列互补的序列也已表现出有效抑制mRNA翻译。(参见例如Wagner，R.(1994)Nature 372：333)因此，寡聚核苷酸无论与吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的5’还是3’非翻译非编码区域互补都能用于反义方法阻止吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的内生mRNA翻译。与mRNA的5’非翻译区互补的寡聚核苷酸应当包括与AUG起始密码子互补。与编码区域的mRNA互补的反义寡聚核苷酸为较低效的抑制翻译的抑制子，但是也可以依照本发明应用。不管设计与吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的mRNA的5’、3’或者编码区域杂交，反义核苷酸都应当至少为六个核苷酸长度，并且优选短于100个核苷酸，更优选低于约50个、25个、17个或10个核苷酸长度。
不考虑靶序列的选择，体外研究优选首先达到反义寡聚核苷酸定量抑制基因表达的能力。所述研究更优选使用对照区分反义基因抑制和寡聚核苷酸的非特异性生物效应。优选所述对照寡聚核苷酸为与待测寡聚核苷酸长度大致相同，并且所述对照寡聚核苷酸的核苷酸序列至少与反义序列的序列不同，并且必须避免与靶序列特异性杂交。所述研究还优选比较靶RNA或蛋白和内标对照RNA或蛋白的水平。
本发明的反义寡聚核苷酸可以包括至少一个修饰碱基部分，该部分选自包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟乙基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶、二羟尿苷(dihydrouricil)、β-D-半乳糖基核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-甲基鸟嘌呤(2，2-idimethylguanine)、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胸腺嘧啶、N6-氨基嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-甘露糖基核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基脲嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、3-(3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷((acp3)w)和2，6-二氨基嘌呤的组。本发明的反义寡聚核苷酸还可以包括至少一个修饰的糖基部分选自包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖；还可以另外包括至少一个修饰的磷酸主链选自由磷硫酰、二硫代磷酸酯、氨基硫基磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯以及formacetal或它们的类似物所组成的组中。
本发明的寡聚核苷酸可以通过本领域公知的标准方法合成，例如，通过使用DNA自动合成仪。作为实例，硫基磷酸酯寡聚核苷酸可以通过Stein等人(1998)Nucl.Acids Res.16：3209的方法合成，并且甲基膦酸酯可以通过例如使用受控孔玻璃聚合物支持物(controlled pore glass polymer supports)(Sarin等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451)制备。
反义分子能被输送到表达吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的活体细胞内。已经开发出一些用于向细胞内输送反义DNA或RNA的方法，所述方法为本领域公知。因为细胞内要达到的足以抑制内生mRNA翻译的反义核苷酸浓度经常不同，因此优选方法使用重组DNA构建体，其中所述反义寡聚核苷酸位于强启动子控制下。优选应用所述构建体转染受试者内的靶细胞，结果其转录的足够阻止相应mRNA翻译的量的单链RNA将与编码感兴趣基因产物的内生转录本杂交。例如，载体可以被导入体内，这样可以被细胞吸收并直接转录出反义RNA。所述载体可以保留游离或者可以进行染色体整合，只要该载体可以转录产生出需要的反义RNA。所述载体可以通过本领域标准的重组DNA技术方法构建，在后面进一步描述。载体可以为质粒、病毒或者其他本领域公知的用在哺乳动物细胞中复制和表达的载体。
编码反义RNA序列可以通过任何本领域公知的在哺乳动物细胞，优选人类细胞中起作用的启动子进行表达。所述启动子可以为诱导型的或者组成型的。所述启动子可以包括但不限于：SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、含有劳氏肉瘤病毒3’长末端重复序列的启动子(Yamanoto等人，1980，Cell 22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)以及金属硫蛋白基因调控序列(Brinster等人，1982，Nature 296：39-42)。启动子用作组织或者细胞特异性表达，例如在光感受器、RPE细胞或诸如内皮细胞或黑素细胞的脉络膜类型，也为本领域公知，在后面实施例7中进行进一步描述。
核酶为又一种能下游调控吞噬作用相关和/或AMDP相关基因产物表达的试剂的优选实施方式。核酶分子设计以催化感兴趣基因转录本的断裂，阻止其反义成多肽。(参见例如，Sarver等人.(1990)Science 247：1222-1225以及US 5093246)。一般而言，核酶催化位点特异性断裂或RNA中磷酸二酯键的连接。然而能在特异位点识别序列断裂mRNA各种类型的核酶，可以用于破坏吞噬作用相关和/或AMDP相关mRNA，优选应用锤头状核酶。锤头状和发夹结构的核酶为RNA分子通过碱基与互补RNA靶序列配对起作用，并且完成在特定位点断裂反应。在锤头状核酶的情况下，所述核酶在UX二核苷酸后断裂，其中X可以为除了鸟嘌呤之外的任意核糖核苷酸，虽然如果X为胞嘧啶断裂率最高。所述催化效率还受核苷酸在前的尿嘧啶影响。实际上，靶mRNA中需要有NUX(代表GUC、CUC或UUC)。所述靶用于设计环绕该位点的大约12或13个核苷酸的反义RNA，但是跳过C，C不能与所述核酶形成常规碱基碱基对。
设计合成锤头状核酶可以通过选择性结合和断裂互补的mRNA分子，然后释放片段、用高效蛋白酶重复此过程。这样表现出明显的益处例如，不具催化活性的反义寡聚核苷酸，也是可化学计量的，与靶序列形成1：1的复合物。本发明所述锤头状核酶可以命名为6-4-5茎-环-茎构型，或者其它任意的适合目的构型。一般而言，因为化学断裂步骤很快并且释放步骤为限速步骤，如果所述杂交的核酶的“臂”(单环I和III)相对较短，例如短大约5或6个核苷酸，速度和特异性都能得到提高。特异性构型设计的适合度可以用各种本领域技术人员公知的检测方法实验检测。
锤头状核酶的构建和制备为本领域公知得到详细全面的描述，比如在Haseloff和Gerlach(1988)Nature 334：585-591中。天然吞噬作用相关或AMDP相关基因的核苷酸序列中存在大量潜在的锤头状核酶断裂位点，例如，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17的编码。优选设计所述核酶使所述断裂识别位点位于接近吞噬作用相关或AMDP相关mRNA的5’末端，以提高效率并且减少细胞内无功能mRNA转录本的积聚。本发明中的核酶可以通过下述的载体输送到细胞。
本发明所述核酶还包括RNA核糖核酸内切酶(下文“Cech-型核酶”)例如天然发生于嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)的核酶(称为IVS或L-19IVS RNA)以及已经被Thomas Cech及其合作者广泛描述的核酶(参见例如Zaug等人，(1984)，Science，224：574-578；Been和Cech，(1986)，Cell，47：207-216)。所述Cech-型核酶具有八个碱基对活性位点，该位点与靶RNA序列杂交，然后发生靶RNA断裂。本发明包括靶向八个碱基对活性位点序列的所述Cech-型核酶，所述活性位点序列出现在mRNA，中并对本发明感兴趣的蛋白和多肽具特异性。
本发明另一优选的试剂为RNA介导的干扰(RNA-mediated interference，RNAi)分子，下游调控吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的表达。所述RNAi机制包括用双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)触发序列中与dsRNA高度同源的基因沉默。RNAi为一种进化保守现象，不同种的生物体比如植物、线虫(秀丽隐杆线虫(Caenorhabiditis elegans))、果蝇(果蝇属(Drosophila))、两栖动物及哺乳动物中普遍存在。认为进化保护基因组对抗可动的遗传因子例如转座子和病毒的入侵。在多步过程中，通过核酸内切酶核糖核酸酶III的作用，活性小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)分子在体内产生，称为Dicer。结果21到23个核苷酸的siRNA分子介导降解互补的同源RNA(Zamore等人，2000；Grishok等人，2000)。
非天然产生的RNAi分子可以通过本领域公知的方法合成，有利于用于感兴趣基因的表达沉默。在哺乳动物细胞中，dsRNA长于30个核苷酸已知激活抗病毒应答，导致非特异性RNA转录本降解及宿主细胞内蛋白质翻译普遍迅速停止。然而哺乳动物细胞中基因特异性抑制可以通过体外合成大约21个核苷酸长度的siRNA完成。所述分子足够长可以诱导基因特异性抑制，但又足够短避免宿主的干扰素应答(Elbashir，S.M.等人，2001)。本领域技术人员公认可用电脑程序设计出直接针对特异性mRNA靶序列的RNAi分子。
抑制性RNA小分子通过结合细胞内的蛋白复合物起作用，被称为RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex)，具有解螺旋酶和内切核酸酶活性。所述内切核酸酶活性解开双链RNA分子的螺旋，允许siRNA反义链结合到靶RNA分子上(Zamore等人，2002；Vicker等人，2003)。所述内切核酸酶活性水解靶RNA结合反义链的位点。
RNAi策略可以与基于载体的方法成功结合，达到在例如RNA聚合酶III(Pol III)启动子控制下，于转染细胞中从DNA模板合成小RNA。使用Pol III有利直接合成小非编码转录本，该转录本3’末端通过在4-5个胸腺嘧啶(Ts)范围内终止延伸而确定。所述特性使用DNA模板体内合成与所发现的需要体外合成的活性siRNA结构特征近似的小RNA成为可能。应用所述模板，靶向选择的感兴趣mRNA的小RNA已经在转染细胞中得到表达，并且表现出能够高效特异性抑制相应蛋白的合成(Sui等人，2002)。
为了抑制显性取得功能突变(gain-of-mutation)，或者不需要与野生型序列只存在一个碱基变化的吞噬作用相关或AMDP相关基因的mRNA多态变异体(例如这里所述的一个MT1-MMP的AMD相关变异体)，需要选择性沉默异常mRNA的表达允许正常的等位基因表达。RNAi技术的一个高度有益的特点在于具有单核苷酸特异性能够选择性沉默突变。这种方法的克星性已经得到证实，用RNAi抑制Cu、Zn超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD1)基因的引起肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateralizingsclerosis，ALS)的变异等位基因的表达，可以使正常完整等位基因表达(Ding等人，2003)。
RNAi体内给药的有效率最近已经在几个自身免疫性肝炎的小鼠模型体内得到证实。Fas介导的细胞凋亡(Fas-mediated apoptosis)揭示了肝脏疾病的更广范围。靶向编码Fas受体的Fas基因的siRNA双链体体内剪接的效果显示为在所述模型中保护小鼠不发生肝衰竭和纤维化。静脉注射Fas的siRNA特异性减少Fas的mRNA水平和Fas蛋白在小鼠肝细胞中的表达，并且所述效果没有降低维持了10天。通过注射Fas-特异性抗体诱导的暴发型肝炎中，用siRNA治疗的小鼠82％有效沉默了Fas观察存活了10天，而所有对照组的小鼠在3天内死亡(Song等人，2003)。相似的基于RNAi策略拟定用于靶向或下游调控AMD病人异常或过度表达的基因。
可选地，吞噬作用相关或AMDP相关基因的表达可以通过靶向与吞噬作用相关或AMDP相关基因调控区域(即吞噬作用相关或AMDP相关基因启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列，以形成三股螺旋结构，阻止靶细胞中吞噬作用相关或AMDP相关基因的转录而减少。(一般参见Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，C.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；以及Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)：807-15)。用于形成三股螺旋抑制转录本形成的核苷酸分子优选单链并由脱氧核糖核苷酸组成。所述寡聚核苷酸的碱基组成应当通过Hoogsteen碱基配对原则，启动三股螺旋形成，其中一般要求延伸的嘌呤或者嘧啶的大小以形成单链双链体。核苷酸序列可以为嘧啶基的，会导致TAT和CGC三联体交叉三个相关的链形成三股螺旋。所述富含嘧啶的分子提供了与双螺旋中的一条链在该链平行方向上富含嘌呤的区域的碱基互补性。此外，核苷酸分子可以选择富含嘌呤的，例如，包括G残基延伸。所述分子将与富含GC对的DNA形成三股螺旋，其中大多数嘌呤残基位于靶向双链的一条单链上，结果在CGC三联体中交叉三链中的三条链。所述能靶向形成三股螺旋的可选潜在序列可以通过创造所谓“回转(switchback)”核苷酸分子而增加。回转分子合成可以选择3’-5’、5’-3’方式，这样它们双链体的第一链碱基配对，然后其它链，减少了双链体中一条链上存在相当大嘌呤或嘧啶的延伸必要。
本发明的反义RNA、核酶、RNAi和三股螺旋分子可以通过本领域公知的合成所述分子的任何方法制备。包括本领域公知的化学合成寡聚脱氧核糖核苷酸、寡聚核糖核苷酸技术，例如固相氨基磷酸酯化学合成。可选地，RNA分子可以通过体外和体内转录编码反义RNA分子的DNA产生。所述DNA序列可以为掺入多种普遍的载体，所述载体掺入了合适的RNA聚合酶启动子。可选地，可使用反义cDNA构建体合成反以RNA，其组成型或诱导型取决于使用的启动子。
此外多种公知的核苷酸分子修饰可以作为增加细胞内稳定性和半衰期的方法引入。可能的修饰包括但不限于核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸分子5’和/或3’末端空白序列的加入，或者如上所述在寡聚脱氧核糖核苷酸中应用硫基磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯键连接。
可以下游调控表达或中和本发明吞噬作用相关或AMDP相关基因生物活性的其它实施方式的试剂基于蛋白。能调控表达和/或中和吞噬作用相关或AMDP相关基因产物生物功能的蛋白的实例为特异性结合吞噬作用相关或AMDP相关多肽或肽的抗体。优选多肽，因为这里所示的AMD中检测到的mRNA水平，包括由具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列编码的核苷酸，即这里分别鉴定具有SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：103至SEQ ID NO：121所示氨基酸序列的多肽。本发明所述抗体可以用于干扰吞噬作用相关或AMDP相关蛋白与一个或多个结合或者相互作用于吞噬作用相关或AMDP相关蛋白分子的相互作用。例如，直接抗MT1-MMP蛋白的抗体被认为中和所述蛋白激活明胶酶原A的能力。这里描述的研究结果用直接抗MT1-MMP的抗体，显示出延迟基于以MT1-MMP过度表达为特征的RPE疾病的大鼠模型中视网膜的变性。因此，用抗MT1-MMP抗体，抑制MT1-MMP在光感受器间基质中的过度产生，可能用在患有AMD病人眼中减少基质破坏和改善吞噬作用。
由本发明核苷酸编码的蛋白质(例如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17、或者它们的免疫源片段或类似物以及最优选发现在AMD中上游调控的核苷酸序列编码(即SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17))可以用于提高本发明抗体作用。所述蛋白质可以通过本领域技术人员公知的从细胞/组织中纯化、重组技术或化学合成制备。用于本发明的抗体可以包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段和用Fab表达库制备的分子。参见Kohler等人，Nature 256：495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，”Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，”Elsevier，N.Y.，1981；Ausubel等人，supra；US 4376110、US 4704692和US 4946778；Kosbor等人，Immunology Today 4：72，1983；Cole等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026，1983；Cole等人，“Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，”Alan R Liss，Inc，PP.77-96，1983；以及Huse等人，Science 246：1275，1989。
能调整吞噬作用相关或AMDP相关蛋白的表达或活性的其它基于蛋白质的试剂包括吞噬作用相关或AMDP相关蛋白变异体能与相应的天然蛋白竞争结合配体，例如天然产生的结合前列腺素D2合酶(SEQ ID NO：2)、MT1-MMP(SEQ ID NO：15)和未知基因AMDP-3(SEQ ID NO：17)的配体。所述蛋白变异体可以通过多种本领域公知的各种技术产生。例如吞噬作用相关或AMDP相关蛋白变异体可以通过诱变制得、例如个别的点突变诱导或者平截(truncation)。所述突变可以使吞噬作用相关或AMDP相关蛋白产生实质性变异体，或者只是天然吞噬作用相关或AMDP相关蛋白的功能活性亚类。可选地，蛋白的拮抗形式可以产生并能够抑制所述蛋白自然发生形式的功能，例如竞争性结合另一与吞噬作用相关或AMDP相关蛋白相互作用的分子。此外，对抗(超级对抗)形式的蛋白可以产生组成型表达一个或多个吞噬作用相关或AMDP相关蛋白的功能活性。其它吞噬作用相关或AMDP相关蛋白变异体可以产生包括抵抗蛋白水解断裂的变异体，例如，由于变异变化蛋白酶的靶序列。不管肽的氨基酸序列变化，导致吞噬作用相关或AMDP相关蛋白变异体具有一种或多种吞噬作用相关或AMDP相关蛋白功能活性，能很容易通过测试吞噬作用相关或AMDP相关蛋白变异体的功能活性检测(例如，结合受体或其它配体、或诱导诸如吞噬作用的细胞内应答)。
另一种能调整吞噬作用相关或AMDP相关基因产物的表达或活性的试剂为吞噬作用相关或AMDP相关基因产物的非肽模拟物或化学修饰形式，瓦解吞噬作用相关或AMDP相关蛋白与其它蛋白或与天然吞噬作用相关或AMDP相关基因产物相互作用的分子的结合。参见例如Freidinger等人，inPeptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands.1988。所述分子的实例包括氮杂卓(azepine)(例如参见Huffiman等人，in Peptides：Chemistry and Biology，G.R Marshall ed，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands.1988)，γ取代的内酰胺环(Garvey等人，in Peptides：Chemistry and Biology，G.R Marshall ed，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands.1988)1988)，南五味子酮假肽(Ewenson等人，(1986)J.Med.Chem.29：295；和Eweson等人，in Peptides：Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce ChemicalCo.Reckland III 1985)，β-回转二肽核心(beta-turn dipeptide core)(Nagai(1985)Tetrahedron Lett 26：647；和Sato等人(1986)J.Chem.Soc.Perkin.Trans.1：1231)以及β-氨基醇(Gordon等人.(1985)Biochem.Biophys.Recs.Commun.126：419；以及BiochemBiophys.Res.Commun 134：71)。
吞噬作用相关和/或AMDP相关蛋白还可以进行化学修饰创造与诸如糖基基团、脂类、磷酸酯、乙酰基等的化学部分共价或聚合结合的衍生蛋白。共价衍生吞噬作用相关和/或AMDP相关蛋白可以通过连接将化学部分与蛋白的氨基酸侧链上功能基团或者多肽的N-末端和C-末端连接制备。
其他能调整吞噬作用相关或AMDP相关基因产物的表达或活性的试剂的实施方式为小分子。来自大范围化学分类的小分子能干扰吞噬作用相关或AMDP相关蛋白的活性，例如通过结合蛋白质并钝化其活性，或者选择性地结合到吞噬作用相关或AMDP相关蛋白的靶标上，因此干扰蛋白与其靶标的相互作用。根据感兴趣基因/蛋白质的性质，抑制性小分子可以设计达到各种目的，例如1)占据底物或者靶相互作用蛋白的结合位点，2)结合到吞噬作用相关或AMDP相关蛋白上从而改变其三位构象，因此抑制其活性，3)结合到吞噬/AMDP蛋白的靶分子上，因此阻止该蛋白与正常靶的相互作用。例如，已知MT1-MMP蛋白(SEQ ID NO：100)的小分子抑制剂，诸如可以从绿茶中提取出的多酚类(即表没食子儿茶精3-O-没食子酸酯(Epigallocatechin 3-O-gallate，EGCG)、(-)-表没食子儿茶精3，5-二-O-没食子酸酯以及epitheaflagallin 3-O-没食子酸酯)具有有力明显的对所述蛋白的抑制活性(Oku N.等人，Biol Pharm Bull.(2003)Sep；26(9)：1235-8)。其他金属蛋白酶经典抑制剂大体上也得到描述，比如in Beckett，R等人(2001)US6310084。
基于吞噬作用相关和AMD相关基因的AMD和其他视网膜变性状态的基因疗法
另一方面，本发明提供了天然或者合成的编码吞噬作用相关或AMDP相关基因、或者调整改基因表达或活性试剂输送方法。“基因疗法”定义为通过在细胞内导入和表达遗传信息治疗遗传或者获得性疾病。这里描述了有关基因疗法载体的方法和组合物。所述技术为本领域公知，在方法学参考书中描述，例如，Viral Vectors，eds.Yakov Gluzman和Stephen H.Hughes，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988；Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY，2000；Gene TherapyProtocols(Methods in Molecular Medicine)，ed.Jeffrey R.Morgan，HumanaPress，Totawa，NJ，2001。
在多个实施方式中，根据本发明所述核苷酸掺入重组核苷酸构建体，典型的DNA构建体能够导入宿主细胞并复制。所述构建体优选载体包括复制系统和能够在给定的宿主细胞中转录和翻译编码多肽的序列的序列。用于本发明制备和使用可用载体和宿主细胞的常规组合物和方法，正如在Sambrook等人，supra或Ausubel等人，supra.所述。
根据基因治疗方法的目的用于本发明实践中有用的载体包括各种野生型。一些实施方式为包括编码试剂调整(例如下游调控)AMDP相关或吞噬作用相关mRNA或蛋白表达的载体。其他实施例的载体包括本发明野生型或需要的吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的多态变异体。在前者类型的各种模式的载体中，表达可以受下游调控例如通过表达反义RNA、核酶、RNAi分子或三股螺旋分子直接对抗过表达的mRNA，例如PD2S(SEQ IDNO：2)、MT1-MMP(SEQ ID NO：15)或AMDP-3(SEQ ID NO：17)过表达的mRNA。
其他实施方式的载体直接表达需要的AMDP相关或吞噬作用相关基因的多态变异体，无论为野生型还是变异体类型。例如在一个实施方式中，核苷酸编码正常类型(野生型)的MT1-MMP(例如SEQ ID NO：15)。野生型类型的输送用于例如，受试者不表达正常变异体，但是纯合体表达需要的多态类型(例如这里所需要的MT1-MMP错义多态D273N)，或者杂合体表达两种不同的非所需要的等位基因类型(例如错义多态D273N和同义/剪接变异体多态P259P)。
根据本发明天然或者合成的核苷酸，包括cDNA、反义核苷酸、核酶和RNAi分子，可以掺入重组核苷酸构建体、典型的DNA构建体能够导入宿主细胞并复制。用于本发明制备和使用可用载体和宿主细胞的常规组合物和方法，正如在Sambrook等人，supra或Ausubel等人，supra.所述。这里所用“表达载体”为能够表达DNA分子(编码cDNA、反义核苷酸、核酶或RNAi分子)载体(由于存在合适的转录和/或翻译控制序列)能够克隆到该载体中并因此产生RNA或多肽/蛋白质。当所述表达载体导入合适的宿主细胞内，克隆序列产生表达。
基因表达所需的调控区域的精确性可能在有机体之间大不相同，加上根据克隆序列的性质和在细胞中表达该序列目的，但是一般来说所述元件包括启动子直接起始RNA的转录。所述区域可以包括与转录起始有关的5’非编码序列，例如TATA盒。所述启动子可以为组成型的或者可调节型的。组成型启动子本质上一直引起可操作连接的基因表达。可调节型的启动子可以被激活或钝化。所述可调节型的启动子包括通常“关”但是可以诱导打“开”的诱导型启动子，以及通常“开”但是可以“关”的“可抑制”启动子。公知许多不同的调控子，包括温度、激素、重金属和调控蛋白。所述划分并非绝对；组成型启动子某种程度上可以调节。
所述启动子可以为“遍在”启动子在宿主有机体的所有细胞都有实质活性，例如β-肌动蛋白或optomegalovirus启动子，或者可以为其表达或多或少对靶细胞或组织特异性的启动子。如下面的实施例所述，适用细胞特异性的启动子(例如光感受器特异性、RPE特异性和黑素细胞特异性)在眼中表达，并且诱导型启动子用于在转基因动物特定年龄起始转基因表达。
公知一些适于动物细胞稳定转化的载体或转基因动物的建立。参见例如Pouwels等人，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，Supp.1987。通常动物表达载体包括(1)一个或多个在5’和3’调控序列转录控制下的克隆动物基因和(2)显性选择标记。所述动物表达载体如果需要可以包括启动子调控区域(例如控制诱导型或组成型的、环境调控或者发育调控的，或者细胞或组织特异性表达的调控区域)、转录起始位点、核酶结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。本发明中动物表达载体优选包括用于鉴定细胞已经转化的选择性标记基因。适合动物系统的选择性标记基因包括编码产生抗生物素抗性酶的基因(例如抗性参照均霉素、卡那霉素、争光霉素、G418或链霉素)。
根据本发明能用于表达基因的有用启动子的实例为细胞巨化病毒(cytomegalovirus，CMV)立即早期启动子(CMV IE)(Xu等人，Gene 272：149-156，2001)。所述启动子在大多数动物组织中表现高水平表达，并且通常不依赖带表达的特定编码蛋白。作为实例，在大多数转基因动物组织中，所述CMV IE启动子为强启动子。用于本发明的其他启动子的实例包括SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、腺病毒主要晚期启动子(major latepromoter，MLP)、单纯性疱疹病毒启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、人类免疫缺陷病毒长末端重复(long terminal repeat，LTR)启动子、β肌动蛋白启动子(Genbank#K00790)或者鼠金属硫蛋白启动子(Stratagene SanDiego CA)。合成启动子、杂交启动子等都可以用于本发明且为本领域公知。
动物表达载体还可以包括RNA加工信号例如内含子已经表现增加基因表达(Yu等人，(2002)81：155-163以及Gough等人(2001)Immunology 103：351-361)。RNA剪接序列的定位可以影响动物转基因的表达水平。由此来看，内含子可以在转基因中吞噬作用相关和/或AMDP相关多肽编码基因的定位上游或下游调整基因表达水平。本发明中表达载体还可以包括调控对照区域通常存在于动物基因的5’区域。此外，表达载体中可以包括3’末端区域增强mRNA的稳定性。参见例如Jacobson等人，(1996)Annu.Rev.Biochem.65：693-739以及Rajagopalan等人，(1997)Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.56：257-286。
腺病毒载体已经表现出能够在靶细胞中高效基因表达，并且允许用于大编码容量的异源DNA。“异源DNA”在上下文中可以定义为任何非腺病毒天然的核苷酸序类或基因。应用重组腺病毒作为基因治疗载体的方法已有讨论，例如W.C.Russell，Journal of General Virology 81：2573-2604，2000以及Bramson等人，Curr.Opin.Biotechnol.6：590-595，1995。
重组腺病毒的优选类型为“无胆量(gutless)”、“高容量”或“辅助依赖”腺病毒，这几种类型都已删除病毒编码的序列，并包括病毒反向末端重复(inverted terminal repeats，ITRs)、治疗基因(包括编码吞噬作用相关或AMDP相关基因、或者调控吞噬作用相关或AMDP相关基因表达的试剂的天然或合成的核苷酸，可达28-32千碱基对)以及病毒DNA包装序列。所述重组腺病毒的变异体例如包括组织特异性增强子及启动子可行连接于编码吞噬作用相关或AMDP相关基因、或者调控吞噬作用相关或AMDP相关基因表达的试剂的天然或合成的核苷酸也在本发明范围内。一个在体中可以存在多于一个的启动子。因此多于一个的外源基因可以通过一个载体表达。
本发明的病毒表达载体还包括腺伴随病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)载体。AAV表现出靶细胞高转导效率，并能以位点专一方式整合到宿主基因组中。使用重组AAV载体的方法已有讨论，例如Tal，J.，J.Biomed.Sci.7：279-291，2000以及Monahan and Samulski，Gene Therapy 7：24-30，2000。细胞特异性靶向优选含有一对反向末端重复AAV载体，其侧翼至少一个盒(cassette)包括直接细胞特异性(例如光感受器、RPE或黑素细胞)表达的启动子可行连接于感兴趣基因。使用该载体，所述AAV载体的DNA序列包括ITRs，所述启动子和编码吞噬作用相关或AMDP相关基因、或者调控吞噬作用相关或AMDP相关基因表达的试剂的天然或合成核苷酸可以整合到宿主基因组中。
另一种用于本发明的优选的载体为单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)载体。使用重组HSV载体的方法已有讨论，例如Cotter和Robertson，Curr.Opin.Mol.Ther.1：633-644，1999。HSV载体删除了一个或多个立即早期基因(immediate early gene，IE)，方便无毒，在宿主细胞中以类似潜伏的状态存留并且提供高效细胞转导。重组HSV载体允许大约30千碱基的编码容量。优选的HSV载体由I型HSV设计得到，删除了IE基因。根据本发明还可以使用HSV扩增子载体。通常HSV扩增子载体长度大约15千碱基，具有一个病毒复制起始区和包装序列。该载体中可以存在多于一个的启动子。因此可以通过该载体表达多于一个的异源基因。此外，该载体可以包括序列编码信号肽或其他部分利于从宿主细胞中分泌基因产物。
本发明的病毒载体还可以包括复制缺陷慢病毒载体，包括人类免疫缺陷病毒。使用慢病毒载体的方法已有讨论，例如Vigna和Naldini，J.Gene Med.5：308-316，2000以及Miyoshi等人，J.Virol.72：8150-8157，1998。慢病毒载体能感染分裂和不分裂的细胞并在人上皮组织中高效转导。根据本发明慢病毒载体可以得自人类或非人类(包括猴免疫缺陷病毒(SimianImmunodeficiency Viruses，SIV))的慢病毒。所述载体可以包括病毒的LTRs、引物结合位点、聚嘌呤区、att位点和壳体化位点。所述慢病毒载体可以包装在任何合适的慢病毒衣壳中。所述被来自不同病毒粒蛋白取代粒蛋白称为“假型化”。所述载体衣壳可以包括来自其他病毒的病毒包膜蛋白，包括鼠白血病病毒(Murine Leukemia Virus，MLV)或水泡性口膜炎病毒(VesicularStomatitis Virus，VSV)。使用VSV G-蛋白产生高载体滴度和得到高稳定性载体病毒粒子。所述慢病毒载体中可以存在多于一个的启动子。因此可以通过该载体表达多于一个的异源基因。
本发明还提供了逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒的用法。使用逆转录病毒载体的方法已有讨论，例如Hu和Pathak，Pharmacol.Rev.52：493-511，2000以及Fong等人，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17：1-60，2000。根据本发明，逆转录病毒载体可以包括高达8千碱基对的异源(治疗)基因，取代病毒基因。异源在上下文中定义为不是逆转录病毒天然的任何核苷酸或基因。所述异源DNA可以包括如上所述的组织或细胞特异性启动子，以及吞噬作用相关和/或AMDP相关基因。所述逆转录病毒粒子可以为假模标本(pseudotype)，并且含有得自其他病毒的病毒包装糖蛋白，代替天然逆转录病毒糖蛋白。本发明所述逆转录载体可以整合到宿主细胞基因组中。所述逆转录病毒载体中可以存在多于一个的启动子。因此可以通过该载体表达多于一个的异源基因。
结合两种病毒载体系统优势特征，杂交病毒载体可以用于向靶组织中输送吞噬作用相关或AMDP相关基因，或者调控所述基因表达的试剂。构建杂交载体的标准技术为本领域技术人员公知。所述技术已被发现例如Sambrook等人，In Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor，NY；或者任何数量讨论重组DNA技术的实验室手册。在腺病毒衣壳内的双链AAV基因组包括AAV和腺病毒ITRs的结合可以用于转导细胞。在其他变异体中AAV载体可以被“无胆量”、“高容量”或“辅助依赖”的腺病毒载体代替。腺病毒/AAV杂交载体的方法已有讨论，例如Lieber等人，J.Virol.73：9314，1999。逆转录病毒/腺病毒杂交载体的方法已有讨论，例如Zheng等人，Nature Biotechnol.18：176-186，2000。其中含有腺病毒的逆转录病毒基因组可以整合到宿主细胞的基因组中，并且有效稳定转基因表达。所述杂交病毒载体中可以存在多于一个的启动子。因此可以通过该载体表达多于一个的异源基因。
与本发明一致，可以进一步考虑利于吞噬作用相关或AMDP相关基因表达、或者调控所述基因表达和活性的试剂、以及所述载体的克隆的其他核苷酸序列元件。例如启动子上游的增强子、或编码区域下游的终止子的存在有利于表达。
公知一些非病毒方法，用于导入吞噬作用相关和/或AMDP相关核苷酸、或调整细胞内所述核苷酸的表达或活性的试剂。考察非病毒方法参见例如Nishikawa和Huang，Human Gene Ther.12：861-870，2001。根据本发明可以提供各种应用质粒DNA技术，将吞噬作用相关和/或AMDP相关核苷酸，或者在细胞内被表达的调控吞噬作用相关或AMDP相关核苷酸表达的试剂导入细胞。所述技术为本领域普遍公知，在参考文献中得到描述例如Ilan，Y.，Curr.Opin.Mol.Ther.1：116-120(1999)以及Wolff，J.A.，NeuromuscularDisord.7：314-318(1997)。
将吞噬作用相关和/或AMDP相关核苷酸、或者在细胞内调整所述核苷酸表达的试剂导入宿主细胞的有关物理技术导入的方法可以选择用在本发明中。可以应用细胞电通透作用(也称细胞电穿孔术)输送选择的核苷酸进入细胞。所述技术在Preat，V.，Ann.Pharm.Fr.59：239-244(2001)中得到讨论，并且涉及对细胞施用脉冲电场提高细胞渗透性，致使外源多核苷酸运输通过细胞膜。可选地基因转移的粒子轰击方法涉及Accell装置(基因枪)加速DNA包被的微观金颗粒进入靶组织。该方法学在例如Yang等人，Mol.Med.Today 2：476-481(1996)以及Davidson等人，Rev.Wound Repair Regen.6：452-459(2000)中得到描述。
为了构建本发明实施方式的转基因动物，公知的几种标准方法用于导入重组遗传物质卵母细胞以繁殖转基因动物。所述方法的实例包括：1)粒子输送系统(参见例如Novakovic S等人(1999)J Exp Clin Cancer Res 18：531-6、Tanigawa等人.(2000)Cancer Immunol Immunother 48：635-43)；2)显微注射方法(参见例如Krisher等人，(1994)Transgenic Res.3：226-231、Robinett CC和Dunaway M(1999)，Modeling transcriptional regulation using microinjectioninto Xenopus oocytes.In：Methods：A Companion to Methods in Enzymology 17：151-160或者Pinkert CA和Trounce IA(2002)，Methods 26：348-57)；3)聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)方法(参见例如Meyer O等人，(1998)J.Biol.Chem.273：15621-7或者Park等人(2002)Bioconj Chem，13：232-239)；4)脂质体介导的脱氧核糖核酸摄取(参见例如Hofland HEJ和Sullivan SM(1997)J.Liposome Res.7：187-205或者Hui SW等人(1996)Biophys.J.71：590-599)；以及5)如上所述的电穿孔法。
根据本发明合成基因转移分子可以设计形成具有质粒DNA(包括编码吞噬作用相关和/或AMDP相关核苷酸、或者调整细胞内所述核苷酸表达或活性的试剂、可行连接启动子)的多分子聚合物，并将所得粒子结合到靶细胞表面，通过这种方式激发内吞作用以及胞内膜瓦解。聚合体的DNA-结合阳离子(Polymeric DNA-binding cation)(包括多聚赖氨酸、鱼精蛋白以及阳离子化的白蛋白)能够连接到细胞靶向配体激发受体介导的内吞作用。关于聚合体的DNA-结合阳离子的方法参见例如Guy等人，Mol.Biotechnol.3：237-248(1995)和Garnett，M.C.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.16：147-207(1999)。
阳离子的两亲化合物(Cationic amphiphile)包括脂聚胺(lipopolyamine)和阳离子类脂可以提供受体-非依赖基因转移吞噬作用相关和/或AMDP相关核苷酸、或者编码调控吞噬作用相关和/或AMDP相关基因表达或活性的试剂的核苷酸到靶细胞。形成的阳离子脂质体或阳离子类脂可以与质粒DNA混合产生细胞转染复合物。关于阳离子类脂形成的方法可以参见例如Felgner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.772：126-139(1995)和Lasic and Templeton，Adv.Drug Delivery Rev.20：221-266(1996)。合适的方法还可以包括使用阳离子脂质体作为介导DNA或蛋白质进入细胞的试剂。为了输送治疗基因，DNA也可以与两亲阳离子肽结合(Fominaya等人，J.Gene Med.2：455-464，2000)。
根据本发明，关于基于病毒和非病毒组分的方法都可以应用。基于质粒用于治疗基因输送的EB病毒(Epstein Barr Virus，EBV)在Cui等人，GeneTherapy 8：1508-1513，2001.中得到描述。在Curiel，D.T.，Nat.Immun.13：141-164(1994)中描述了关于DNA/配体/聚阳离子辅助偶联腺病毒。
蛋白转导用于输送治疗蛋白到靶细胞中为基因治疗提供了另一选择，并且蛋白转导的方法在本发明范围内。蛋白转导为蛋白从外界环境到宿主细胞内化作用。内化进程取决于蛋白或肽能穿透细胞膜。所述蛋白或肽的转导特性可以通过作为融合蛋白表达的蛋白(例如吞噬作用相关和/或AMDP相关蛋白)赋予。通常使用蛋白转导载体包括控制触角的基因的肽(antennapediapeptide)、HIV的TAT蛋白转导结构域和单纯疱疹病毒V22蛋白。所述载体参见例如Ford等人，Gene Ther.8：1-4(2001)。
本发明的核苷酸可以在宿主细胞内以任意适合长度的时间表达，包括瞬时表达和稳定长期表达。在优选实施方式中，吞噬作用相关和/或AMDP相关核苷酸、或者调剂所述核苷酸在细胞内的表达和活性的试剂将在适合的并且确定的长度的时间表达治疗量。这里描述了输送完成瞬时或者长期表达转基因的方法。游离的复制型载体通常在细胞中维持居间到高拷贝数，促进高水平表达插入的DNA。一些载体作为游离基因存留，并且所述载体表现为自主单位在宿主细胞中的复制不依赖宿主的染色体。DNA输送通过质粒或者基于病毒的载体，例如包括腺病毒在宿主细胞内以游离状态存在，并且以瞬时方式表达。
根据本发明载体可以包括有利于将DNA整合到宿主染色体中的核苷酸序列元件。大多数转导细胞整合耐受性好，而且是优选保证新转导入细胞内的遗传信息的稳定性。整合包括吞噬作用相关和/或AMDP相关核苷酸、或者调整细胞内吞噬作用相关和/或AMDP相关基因产物表达或活性的试剂的载体，可以通过随机或者位点特异性的方式发生。允许整合到宿主细胞基因组的基于病毒的载体包括那些得自AAV、逆转录病毒和某些AAV/腺病毒杂合体。
本发明所述包括核苷酸分子(包括基因治疗载体)的组合物可以以任何合适的技术给予哺乳动物受试者。例如各种公知技术用病毒载体导入编码吞噬作用相关或AMDP相关基因的天然或合成的核苷酸、或者另一方面，导入调控天然或合成的编码吞噬作用相关或AMDP相关基因的核苷酸的表达或活性的试剂。病毒是天然进化的载体高效输送它们的基因到宿主细胞中，因此成为想要的治疗基因的载体系统。优选病毒载体表现出对宿主细胞低毒性并且产生治疗量的编码吞噬作用相关或AMDP相关基因的天然或合成的核苷酸，或者调控所述基因的表达或活性的试剂，例如以组织特异性的方式。本领域技术人员公知各种方法，包括眼内注射可以用于输送本发明的载体入眼。
MT1-MMP与AMD以及其他视网膜变性的联系
本发明一些实施方式为筛选方法、视网膜变性动物模型及治疗方法基于膜相关基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)(SEQ ID NO：15)。上面所列的AMDP基因中一个基因即MT1-MMP(这里也命名为PHG-16和AMDP-6)，为最初选择的作为AMD治疗的候补靶进一步评价。正如下面实施例所示，结果各种确定的分析清楚证实MT1-MMP为吞噬基因，由1)昼夜模式表达，峰值在早晨，该时间体内OS脱落及吞噬作用最大(图7)；2)人和大鼠眼中OS顶端局部化(图8、图9)；以及3)由抗MT1-MMP抗体抑制的OS吞噬作用体外(图10)和体内，然后在大鼠眼中视网膜下注射(图11)的证明。
MT1-MMP和AMD的关系通过1)在人捐献眼中mRNA表达增加程度和AMD相关变化的严重程度的相互关系(图12和图13)；2)AMD猴模型中光感受器间基质中MT1-MMP抗体免疫定位增强；以及3)在MT1-MMP催化结构域中错义变异体(即D273N)人黄斑变性疾病包括AMD发病率增加，并且MT1-MMP中同义突变体(即P259P)黄斑变性AMD病人中发病率增加证明(参见后文实施例5中表4)。
另一项MT1-MMP研究提供了证据，该基因的过度表达为除AMD外至少一种类型遗传的视网膜变性的普遍特征，在RPE中的原发病因即皇家外科医师学会(Royal College of Surgeons，RCS)大鼠的原发病因。所述RCS大鼠为本领域公知的遗传性视网膜变性疾病的动物模型，其中光感受器变性是由于RPE细胞的吞噬缺陷造成(Bok和Hall，1971)。此模型的病因基因为变异的MERTK(D′Cruz等人，2000)。这里所述的研究中MT1-MMP表现出在RCS大鼠突变体的视网膜和RPE中过度表达。重要地，然后注射抗MTI-MMP抗体(2微升体积)到7天龄RCS大鼠视网膜下的空间。相对于对照，光感受器的变性率在注射抗MTI-MMP抗体动物在30天龄和60天观察龄显著减慢，但是对照抗体和假注射的没有作用(图14)。所述结果提供了证据，直接针对存在于视网膜外部的MTI-MMP蛋白的试剂，例如在视网膜下间隙光感受器间基质里，可以提供有益效果，例如减慢或逆转视网膜变性状态。
先前公认MT1-MMP的功能是在入侵瘤细胞表达，包括激活明胶酶原A，并消化多种细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分(Sato等人，1994；Cao等人，1995；Pei and Weiss，1996)。基于这里所述的发现，现在很明显所述基因提供了一种吸引人的新候补基因靶向治疗AMD和其他视网膜和脉络膜变性疾病。
基于吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的AMD动物模型
在另一方面，本发明包括非人类转基因动物(例如小鼠)适于用作AMD以及其他视网膜和脉络膜变性状态动物模型。迄今为止，缺少合适的短寿命AMD动物模型，该模型随年龄变化能可行追踪，阻碍测试AMD治疗化合物和治疗方法。基于在AMD眼中至少三个AMD/吞噬基因即PD2S(SEQ IDNO：2)、MT1-MMP(SEQ ID NO：15)和AMDP-3(SEQ ID NO：17)过度表达的发现，证明了患有AMD人类、患有AMD的猴以及患有遗传性视网膜变性的RCS大鼠在视网膜中过度表达MT1-MMP mRNA和蛋白。本发明作为优选实施方式的转基因动物过度表达PD2S、MT1-MMP和AMDP-3。
一些转基因模型设计为条件过度表达转基因，只在条件外源刺激附加时，例如强力霉素。因此在所述动物中可以通过给予强力霉素控制转基因表达的起始。作为例子，转基因表达可以在一生的特定时间被激发，例如视网膜在完成产后发育激发(在小鼠大约30天龄发生)。诱导性表达的特征是特别有益于基因例如MT1-MMP，当在胚胎期或者出生后早期过度表达可以预测导致动物中的发育异常。其他转基因实施方式选择性在特定细胞类型如光感受器、RPE细胞或者脉络膜细胞类型中过度表达诸如MT1-MMP、PD2S或AMDP-3的转基因。
然而其他AMD/视网膜和/或脉络膜变性动物模型的优选实施方式结合AMDP相关或吞噬作用相关多态变异体，包括这里发现和描述的。所述模型反映了AMD的复杂基因遗传模式。单一遗传缺陷，例如MTI-MMP存在多态，也许不能引起单独的疾病。然而几个基因多态变异体的特定组合、合适的环境因素以及时间的消耗都可能促成并发机能障碍足以达到一定规模，最终导致AMD或者其他类型视网膜、黄斑或脉络膜变性。例如，其他AMDP基因可能与MT1-MMP多态变异体共同作用产生全光谱AMD。
因此一些AMD和其他视网膜及脉络膜变性的转基因动物模型的实施方式表达一个或几个与AMD和/或RPE细胞吞噬作用有关的基因多态变异体。不同的优选实施方式为多转基因模型表达MT1-MMP变异体，例如组合一个或几个其他AMD相关基因的多态变异体，包括这里公开的AMDP基因(例如具有野生型cDNA序列的基因这里展示为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)，并且AMD相关基因具有先前描述于AMD有关的多态变异体(例如SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69)。在其他多转基因模型优选实施方式中，MT1-MMP多态变异体与其他吞噬作用相关基因的多态变异体结合得到表达(例如，这里具有野生型cDNA序列的基因为SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)。
实施例
本发明还通过下列特殊实施例进一步详细说明，无论如何不应解释为对本发明范围和内容的限制。
实施例1——分离吞噬作用相关和/或AMDP相关基因的研究工具
下面描述了在本发明过程中开发的研究工具包括：1)通过杂交同时计量大量基因表达的简单并支付得起的方法；以及2)基于吞噬性RPE细胞系和吞噬作用活力检测，鉴定吞噬作用相关基因的工具。
CHANE阵列系统
参见图1，开发了一种称为基因表达的比较杂交分析(comparativeHybridization Analysis of Gene Expression，CHANGE)的微点阵技术。用分子生物学领域技术人员公知的技术从大鼠RPE/脉络膜RNA以及人视网膜RNA构建λ gtll cDNA文库。用于文库的大鼠RNA得自大约2-3月龄动物的RPE/脉络膜，周期光(12小时明亮；12小时黑暗)饲养，并且在整个昼夜周期的不同时间处死。自该文库逐个挑选大约一万个克隆，在板上扩增并转移点作为阵列。
从大鼠和人来源的总RNA用作球形表达杂交探针，随后反转录为cDNA，通过PCR扩增，并测试其对检测点阵中特异性基因的表达有用。初步比较一些基因的表达通过CHANGE和RNA印迹分析证实准确性并证明mRNA表达差异很小为大约15-20％可以用CHANGE方法检测。很明显结合生物学相关探针内能够容易地完成反复分析(例如相关探针基于功能、现象或病理)，为此策略最有力的方面。
吞噬作用基因发现工具
鉴定与体内RPE吞噬作用相关的基因的优选方法为在体外系统分析RPE基因表达，以同步方式完成外节(outer segment，OS)吞噬作用功能，正如其在体内发生的一样。啮齿类和其他哺乳动物中外节的脱落和吞噬伴随昼夜节律。光感受器脱落峰值和RPE细胞摄入的最大规模已知就在光起始前开始发生几小时的一个周期(LaVail，1976)。为了在OS吞噬作用过程中连续鉴定基于培养的RPE细胞中不同表达的吞噬基因，优选与培养一致的吞噬过程动力学，尤其是最小化来自细胞周围的不同步吞噬作用的“噪音”。初级RPE培养为普通不合此目的的培养，由于RPE细胞在初级培养中显著的表现型遗传，不同表现型细胞显示相应吞噬作用动力学异质性(McLaren，1996)。
所述异质性的问题可以通过应用RPE细胞永生系防止发生，体内相似的RPE，培养时呈现鹅卵石形态，能够吞噬输送的OS同步结合并摄入。从啮齿类和人类来源制备RPE细胞永生系的方法为本领域公知。表现出想要的吞噬特征典型的细胞系为BPEI-1RPE细胞系(McLaren等人，1993b)。BPEI-1培养物显示出与后面“1型”初级RPE细胞同样的OS吞噬作用动力学，最接近类似体内的RPE(McLaren等人，1993a；McLaren，1996)。优选使用所述细胞系分离吞噬作用相关基因完成大规模吞噬作用分析具有足够的细胞以产生满足两种探针制备和RNA印迹所需的RNA量(大约10-30微克)。
因此合适RPE细胞系的细胞例如BPEI-1高浓度(例如6孔多孔板每孔大约106个细胞)存放，并培养1-2天，例如在先前描述的培养基中(McLaren等人，1993c；McLaren，1996)
为了制备代表不同特定吞噬作用分期的用于CHANGE分析的探针(“分期特异性”探针)，能有利在或RPE细胞培养物中跟随OS吞噬作用，允许分离在吞噬过程中不同的有记载的特异性分期的RNA。为了与此方便，可以使用任何合适的病毒检测OS吞噬作用，例如McLaren等人，(1993c)先前描述的双荧光检测。参考图2，在此检测中RPE细胞溶酶体用活体染料硫酰罗丹明(红色荧光)染色，而输送到细胞的OS事先用荧光素(异硫氰酸荧光素(FITC))(绿色荧光)标记。所述检测可以用在所有吞噬作用分期(即OS结合、摄入和消化)然后用荧光显微镜活体培养。图3显示了在输送用FITC染色的OS给细胞后，OS在活体BPEI-1细胞培养物中通常观察到的不同时期同步结合、摄入和细胞内加工处理过程。
用CHANE分离吞噬基因
为了分离在不同吞噬作用分期表达的吞噬基因，用从在输送OS后不同时期(例如0、1、6、12、18和30小时)提取自RPE细胞培养物中的总RNA制备分期特异性探针，并且同时指出未输送OS的对照培养物。然后通过逆转录总RNA制备“+/-OS”吞噬作用探针，例如正如这里公开的大约1000个RPE表达基因阵列，鉴定那些在OS被RPE细胞吞噬作用过程中差异表达的基因。在OS吞噬作用过程中表现出表达变化的基因，随后被DNA序列分析用标准的技术鉴定，并与GenBank数据库中的序列比较。
实施例2—RPE细胞中吞噬作用相关基因的分离和确定
本实施例描述了用上述方法，对在RPE吞噬过程中表现表达变化的基因的分离。
从CHANGE分析中用“+/-OS”探针筛选的含有大约1000个RPE衍生cDNA的阵列，初步得到大约60个推定为差异表达基因。进一步仔细分析，包括用RNA印迹分析确定差异表达，提供16个确定的吞噬作用相关的起始子集选择进行进一步研究。前文表1提供了如这里所述通过CHANGE技术确定分离的吞噬基因的鉴定列表和序列表编号(即核苷酸：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：15以及氨基酸SEQ ID NO：71-SEQ ID NO：101)。
这些基因在体外吞噬作用过程中表达模式的详细分析，给细胞输送OS后的不同时期从BPEI培养物提取总RNA，通过RNA印迹检查。在活细胞中观察到的所述吞噬作用的特定分期，在提取RNA之前立即用照像摄影记载。如图4所示，16个吞噬基因的表达模式为根据在吞噬过程中不同时期表达的峰值分组丛生，即早期、早中期、中期和晚期。
实施例3—RPE表达基因在AMD中表现表达差异的分离和确定
这里描述通过CHANGE用于推定AMD基因的分离的方法，以及确定它们与AMD关系的方法。
与实施例2中所述的方法类似，应用CHANGE技术鉴定与AMD相关基因，基于假设在AMD病理中起重要作用的基因在疾病过程中表现表达变化。人捐献眼得自当地眼库。通常，接受的眼是在死亡3小时内剜出的并且在12小时内加工处理可用。加工处理前不管死亡时间和处理前逝去的时间，组织真实的质量通过一些标准评价，包括大体的外观检查、组织切片的显微镜评价以及所得RNA的量和质通过RNA印迹分析和反转录PCR评价。
如图5所示，每个眼的AMD相关变化用显微镜分级，与AMD增加的严重程度成比例在0到+5间变化，视网膜/脉络膜带大约3-4毫米宽，沿一侧边缘到另一侧边缘经过视神经乳头和黄斑。考虑在形态学上若干标准指定每个眼的级别，所述标准包括：1)布鲁赫氏膜增厚的程度；2)脉络膜小疣的数量、大小和位置；3)是否存在新生血管化或者脉络膜上新生血管(choridalneovascular，CNV)膜；4)RPE/光感受器是否有萎缩。从每只眼的视网膜以及RPE/脉络膜分离RNA、DNA和蛋白质。
为制备“+AMD”探针，从人捐献眼的RPE/脉络膜提取总RNA，然后混合多个AMD变化+3到+5(中等到严重)的眼。混合得自RPE/脉络膜RNA年龄相近、未患病眼用于制备“-AMD”探针。若上文所述，所得+/-探针用于通过CHANGE鉴定差异表达基因。最初鉴定出患有AMD的受试者与未患个体相比表现差异表达的大约200个RPE表达基因。
然后为了获得吞噬作用相关的基因在AMD中差异表达的基因(即“AMDP基因”)，所述结果用CHANGE筛选吞噬作用相关基因(上述实施例2)并用CHANGE筛选AMD相关基因(此实施例)相比较，鉴定出在CHANGE板(panel)上证实的在吞噬作用和AMD都差异表达RPE基因。所述分析结果产生了6个基因的子集符合双重标准，即前列腺素D2合酶(SEQ ID NO：2)、酪蛋白激酶1ε(SEQ ID NO：9)、铁蛋白重多肽1(SEQID NO：10)、膜相关基质金属蛋白酶1(SEQ ID NO：15)、SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白(SEQ ID NO：16)和人类未知cDNAAMDP-3(SEQ ID NO：17)(见上文表2)。
实施例4—MT1-MMP作为AMD相关和吞噬作用相关(AMDP)基因的分离和表征
本实施例描述MT1-MMP(SEQ ID NO：15)的鉴定，该典型基因是通过CHANGE发现的在吞噬作用和AMD中都表达差异的基因(即“AMD差异吞噬基因”或“AMDP基因”)。
为了鉴定相关AMD和OS吞噬作用都相关的基因，结果如上所述对比两次CHANGE的分析。在两次筛选都差异表达的候选基因中，克隆90-40突出，作为相对新的金属蛋白酶即MT1-MMP(Sato等人，1994)具有合理满足基因疑似有关AMD要求的功能。所述功能包括在OS吞噬作用中起作用(如这里所述)及激活明胶酶原A和对细胞外基质多种成分的降解活性(Sato等人，1994；Cao等人，1995；Pei和Weiss，1996)。
RNA印迹分析各种组织中MT1-MMP的表达证明在RPE、脉络膜和视网膜中表达水平最高，其次是肺和肾上腺。基于其在体外OS吞噬作用过程中通过CHANGE检测的差异表达，假定指定MT1-MMP作为吞噬基因。为了证实功能，该基因的表达模式通过RNA印迹分析OS吞噬作用非依赖检测。参考图6，结果证实MT1-MMP在初始吞噬作用后13个小时表达增加，通过CHANGE在同时检测到增加。进一步发现MT1-MMP的mRNA表达在RPE和视网膜中都随昼夜模式在早晨六点达到峰值，比最大脱落值和体内OS吞噬作用最大值早大约1-2小时(图7)，强有力支持了关于MT1-MMP在白天限制体内OS吞噬作用。
现在参考图8免疫荧光定位MT1-MMP大鼠视网膜在整个昼夜循环中的几个时间点，证实光感受器中OS和视网膜中RPE最强信号固定在上午6点。人类视网膜MT1-MMP蛋白的免疫定位证实信号在杆的顶端、特别是锥、外节，与光感受器OS膜和RPE顶突接触面的活性一致，也许在制备脱落的OS顶端和RPE吞噬作用中起重要作用。
为了得到关于MT1-MMP在OS吞噬作用中功能的证实，抗MT1-MMP的抗体(Chemicon International，Temecula，CA)用于测试其体外抑制BPEI-1细胞的OS吞噬作用的能力。如图10所示，所得结果清楚证实OS吞噬作用被此抗体抑制，但是不相关抗体(X-arrestin)不抑制OS吞噬作用，证实MT1-MMP用于OS吞噬作用过程的功能要求。此外，在体内功能测试中，视网膜下注射抗MT1-MMP的抗体，但是不注射X-arrestin抗体到正常大鼠眼中，倒是显著结构破坏和OS长达4天延迟，符合干扰每日吞噬过程(图11A、B)。因此丰度证据指出关于MT1-MMP在RPE细胞的OS吞噬作用中的关系。
基于AMD的差异表达(即增加)，MT1-MMP通过CHANGE也被鉴定为AMD基因。所述基因表达通过RNA印迹分析检查独立得自患有AMD的病人和正常人捐献眼的RPE/脉络膜以及视网膜的RNA。结果证实增加，并且表现出在视网膜中的增加比在RPE中的增加更显著(图12)。如图13所示，测试取自各种严重程度不同的AMD相关变化的眼的一系列RNA样品，观察到视网膜中MT1-MMP表达增加与眼中病理增加正相关(图13)。此外，当测试猴AMD模型时也表现出了通过RNA印迹分析的MT1-MMP表达增加，MT1-MMP被发现定位于在高度分裂的OS中光感受器间基质(interphotoreceptor matrix，IPM)内。
由于已经发现MT1-MMP在昼夜调节OS吞噬作用中起重要作用，本发明的发明人接着测试了在最大脱离和吞噬作用时间点AMD中是否发生表达增加。在AMD变化的人眼中观察到MT1-MMP表达增加，不支持上述可能，死亡后一天不同的许多次得到的眼中都存在增加。此结果比较合理的解释是MT1-MMP表达失调，正常峰值只出现在大约早晨六点，但是在AMD中也许活性在其他时间也高。所述MT1-MMP表达失调的功能后果是紧密控制昼夜过程的OS脱离和吞噬作用深深有害超时。
实施例5—在患有AMD和黄斑变性状态的受试者中遗传筛选MT1-MMP
本实施例描述在患有AMD和黄斑变性的病人以及正常对照人群中遗传分析MT1-MMP的方法，显示结果发现MT1-MMP的多态与黄斑变性包括AMD相关。
收集患有AMD以及其他黄斑疾病的老年病人以及正常老年受试者的外周血。从白细胞中提取DNA。DNA也可以从当地眼库捐献的眼视网膜和RPE/脉络膜中。在所述捐献眼中拍摄眼底照片记录病理程度，并用实施例3种所述的标准显微镜下分级。为能筛选MT1-MMP的多态，从公开的小鼠基因结构(Apte等人1997)测得的人MT1-MMP中的所有10个外显子，并用人的外显子特异性扩增引物(即SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：37)PCR扩增，结果见下表3。
表3 扩增人MT1-MMP外显子、内含子和启动子序列的DNA引物(扩增引物)
外显子1：
SEQ ID NO：18      9140ex1s   5’-GCCTACCGAAGACAAAGGCG-3′
SEQ ID NO：19      9140ex1a   5′-TAGAGGCTGTCCCCTAGGAG-3′
外显子2：
SEQ ID NO：20      9140ex2s   5′-AGAGGCACCCTATGGGCCAG-3’
SEQ ID NO：21      9140ex2a   5’-CATCTCTGGCGCTGGCATTG-3′
外显子3：
SEQ ID NO：22      9140ex3s   5′-GCACTGATCCCAATCCTCGC-3′
SEQ ID NO：23      9140ex3a   5’-CCCTGCATAAGCACAATGGG-3’
外显子4
SEQ ID NO：24      9140ex4s   5’-GGGAAGGAGAATGTTGCCCC-3′
SEQ ID NO：25      9140ex4a   5’-GAGGAGGGAACCACCCCTAC-3′
外显子5
SEQ ID NO：26：    9140ex5s   5’-GGGAGGCTGAGGGAAGGGAC-3’
SEQ ID NO：27      9140ex5a   5’-GGGGAAATGCGTAGACCAGG-3’
外显子6：
SEQ ID NO：28      9140ex6s   5’-CCCGCCTCCTCCTAAGTCTG-3′
SEQ ID NO：29      9140ex6a   5′-CAGCATGAGCCACCATGCCC-3”
外显子7：
SEQ ID NO：30      9140ex7s   5′-GAACCAGAGACCTAGGCCGC-3′
SEQ ID NO：31      9140ex7a   5′-CAGCTCCTCTAGGGAGACCC-3’
外显子8：
SEQ ID NO：32      9140ex8s   5′-CTAGAGCCTAAGTTGAACCC-3′
SEQ ID NO：33      9140ex8a   5’-GTGGTGGTGGTTTATGAGGC-3′
外显子9：
SEQ ID NO：34      9140ex9s   5′-TAGGACATGCCCATGTCCGC-3′
SEQ ID NO：35      9140ex9a   5’-TCCGCTCTTCCTCAACTCCC-3’
外显子10：
SEQ ID NO：36      9140ex10s  5′-CTCTTTGGGTCTTCCCTTCC-3′
SEQ ID NO：37      9140ex10s  5′-CTCTTTGGGTCTTCCCTTC-′
内含子1：
SEQ ID NO：38      9140int1s  5′CTCGGCTCGGCCCAAAGCAG3′
SEQ ID NO：39      9140int1a  5′GTAGGTCCCCGGGAGGCAGG3′
内含子2：
SEQ ID NO：40      9140int2s  5′GTTTTACGGCTTGCAAGTAAC3′
SEQ ID NO：41      9140int2a  5′CCAAACTTGTCTGGAACACC3’
内含子3：
SEQ ID NO：42      9140int3s  5′CCAGGGTCTCAAATGGCAAC3′
SEQ ID NO：43      9140int3a  5’ATGTGGCATACTCGCCCACC3′
内含子4：
SEQ ID NO：44      9140int4s  5′CTCTGCCGAGCCTTGGACTG3′
SEQ ID NO：45      9140int4a  5’GCATGGCCCAGCTCGTGCAC3’
内含子5：
SEQ ID NO：46      9140int5s  5′TGCCCGATGATGACCGCCGG3’
SEQ ID NO：47      9140int5a  5′GGGTTGAGGGGGCATCTTGG3’
内含子6：
SEQ ID NO：48      9140int6s   5′CACCGTGGCCATGCTCCGAG3’
SEQ ID NO：49      9140int6a   5′CCATCACTTGGTTATTCCTC3′
内含子7：
SEQ ID NO：50      9140int7s   5’CCTACGAGAGGAAGGATGGC3’
SEQ ID NO：51      9140int7a   5′GGTTCCAGGGACGCCTCATC3′
内含子8：
SEQ ID NO：52      9140int85   5′GGATGCCCAATGGAAAGACC3′
SEQ ID NO：53      9140intga   5′CGCTATCCACTGCCCTGAGC3′
内含子9：
SEQ ID NO：54      9140int9s   5′GGGATCCCTGAGTCTCCCAG3′
SEQ ID NO：55      9140int9a   5′TGTTGAATTTCCAGTATTTG3’
启动子1(-1至-480)：
SEQ ID NO：56      9140pro5s-1 5’-TATTAGTAAACTGGCCCTTC-3’
SEQ ID NO：57      9140pro3a   5’-ATCTTTCTTCTGCTTAGTCG-3’
启动子2(-1至-790)
SEQ ID NO：58      9140pro5s-2 5’-TAGAGGTGGAACTAAACCCC-3’
SEQ ID NO：57      9140pro3a   5’-ATCTTTCTTCTGCTTAGTCG-3’
作为实例，人MT1-MMP基因外显子5用具有这里SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列的扩增引物通过PCR扩增，得到285碱基的野生型PCR产物具有图15所示的DNA序列(SEQ ID NO：59)。得到上述产物合适的PCR扩增方案如下：95℃ 3分钟，然后在95℃ 1分钟、62℃ 30秒、72℃ 30秒重复30个循环，最后72℃ 5分钟。所述258碱基的PCR产物用凝胶电泳纯化提取，然后进行DNA测序。
用表3所述的扩增引物，筛选得自患有AMD和家族性黄斑疾病的病人以及未患病正常受试者的DNA突变体或多态MT1-MMP基因。筛选通过使用得自三组黄斑变性受试者的DNA完成：1)56名临床记载的AMD患者见于局部临床诊断；2)22名弥散性及家族性黄斑变性病人见于眼遗传的临床诊断；3)得自六个眼库捐献者的眼，所述眼AMD相关变化范围+2-+5。临床疾病诊断家族性黄斑疾病的包括家族性黄斑营养不良、卵黄形变性黄斑营养不良、近中心凹毛细血管扩张、显性脉络膜小疣、晶体蛋白小疣、环状黄斑营养不良和脉络膜萎缩。
得自正常和患有黄斑变性病人的DNA中筛选的结果揭示了一个“热点”几种多态变异体在MT1-MMP外显子5种。鉴定的第一个变异体即同义变异体这里命名为P259P，在MT1-MMP的cDNA序列中密码子259的C和G核苷酸不同(即CCC脯氨酸对CCG脯氨酸)。如图14所示，所述P259P变异体变异碱基在外显子5的285碱基片段中的第143碱基位置上。参考图14，密码子259位置上用下划线标出，并且在该位置P259P多态变异体碱基用黑体标出。通过PCR用上述列于SEQ ID NO：59的引物对得到人MT1-MMP外显子5的野生型DNA序列产物，含有P259P变异体的外显子5序列列于SEQ ID NO：60。
分析人MT1-MMP基因序列潜在剪接供体(GT)和剪接受体(AG)位点揭示P259P多态可以引起MT1-MMP的剪接变体mRNA。正常剪接从野生型基因序列中移除内含子得到582氨基酸全长MT1-MMP蛋白产物(SEQID NO：100)包括外显子5编码的53个氨基酸(这里示于SEQ ID NO：121)。通过比较，P259P变异体可以在密码子259处创出新的剪接受体位点，跳过可选的受体位点。
再参考图14，鉴定的第二变异体这里命名为D273N，为MT1-MMP中密码子273的错义多态，G和A核苷酸不同(GAT天冬氨酸对AAT天冬酰胺)。该多态位于第183碱基位置在285碱基的外显子5内(图14密码子273下划线，变异体碱基黑体)。所述D273N错义变异体改变野生型带电荷氨基酸(即天冬氨酸)为不带电荷(即天冬酰胺)。通过PCR受试者D273N变态得到人MT1-MMP外显子5核苷酸序列产物这里列于SEQ ID NO：61，并且相应的外显子5预测变异体蛋白的产物列于SEQ ID NO：123。
现在参考4，MT1-MMP筛选分析的结果为突变体P259P同义多态在所有患有黄斑疾病的病人中的发生频率为27.4％，与此相反正常人群的发生频率为10.5％。
表4 黄斑疾病中MT1-MMP多态变异体的频率
 
多态变异体 P259P同义 D273N错义 P259P或D273N15          
正常受试者 10.5％ 21.1％ 31.6％
所有黄斑疾病受试者 27.4％ 31％ 58.3％
AMD 25.8％ 29％ 54.8％
家族性黄斑病 31.8％ 36.4％ 68.2％
20
黄斑疾病受试者同义变异体 0％ 4.8％
D273N错义多态在所有黄斑病人中发现的发生频率更高(即31％)，对比未患病个体(21.1％)。具有两种MT1-MMP多态变异体的一个的受试者总数，相对于在各自位置的野生型碱基，黄斑疾病受试者(58.3％)比正常人群高(31％；p＝0.043)
一些AMD相对于家族性黄斑疾病分析，揭示了在AMD和家族类型黄斑病变中MT1-MMP多态变异种发生频率都增加(表4)。在AMD受试者中，发现两种MT1-MMP多态变异种中的一种的发生频率为54.8％，而在一般人群中所述发生率为31.6％。含有家族性黄斑病的受试者该百分率甚至更高(68.2％；p＝0.029)。所述结果强有力地揭示了MT1-MMP多态变异种的存在与处在即将发展成包括AMD的黄斑病的危险相互关联。需要注意的4.8％黄斑疾病的受试者为纯合子D273N错义多态，但是没有对照(表4)。
实施例6—通过结合MT1-MMP多肽的试剂延迟视网膜变性
本实施例描述研究证明，使用中和MT1-MMP蛋白的试剂，动物(大鼠)模型中遗传性视网膜变性速度减缓。
上述实施例4所述，发现患有AMD的人眼中、AMD猴模型中、以及RCS大鼠中，基于RPE的遗传性视网膜变性的动物模型中MT1-MMP过度表达。RCS大鼠突变表型中，由于MERTK基因突变，其特征为RPE细胞吞噬作用摄入相缺陷。在一些研究中，MT1-MMP在CHANGE分析中再次分离出来，其中从视网膜RNA突变体和年龄相一致的对照RCS大鼠的制备+/-探针。RNA印迹分析在RCS大鼠视网膜中MT1-MMP表达揭示在该模型中MT1-MMP mRNA随视网膜变性进展而增加。该结果表明MT1-MMP坑仔多型视网膜变性发病机理中起普遍作用，特别是那些基于认为缺陷影响基本RPE细胞。
为了测试MT1-MMP在RCS大鼠中视网膜变性发病机理中功能相关，2微升体积(供应商提供)抗MT1-MMP抗体(Chemicon，Temecula，CA)视网膜下注射到未成熟RCS大鼠(7天)眼中。然后随后两个月为视网膜变性过程。参考图15，结果显示显著延迟高达50％视网膜变性，通过观察注射后一个月，测量外核层厚度。假注射或不相关注射(即X-arrestin)没有产生效果。
所述结果进一步补充了MT1-MMP在视网膜变性发病机理中的相关性，使之成为引人注意的治疗关于MT1-MMP过度表达的视网膜变性状态的靶点。
实施例7—AMD中过度表达上游调控基因的AMD动物模型
AMD发病机理的研究由于缺乏合适的、实用的动物模型例如测试候选化合物和方案而受阻。本实施例描述在小鼠中构建动物模型，过度表达这里已经证实在AMD中上游调控的基因。在优选实施例中，所述过度表达的基因是前列腺素D2合酶(prostaglandin D2 synthase，PD2S)、MT1-MMP和AMDP-3，包括各自的cDNA序列这里鉴定为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17。在一些实施方式中，所述基因为条件过度表达型，在一些模式中只在动物光感受器、RPE细胞和/或脉络膜细胞。
如上实施例所述，在患有AMD的人眼中、患有AMD的猴眼中以及基于RPE遗传视网膜变性的RCS大鼠中观察到MT1-MMP的过度表达或者过度活性。为建立在实验室小型啮齿类例如小鼠中制造过度表达表型，转基因小鼠过度表达例如组成结构的MT1-MMP。特别优选实施方式为转基因小鼠模型，特点为条件过表达MT1-MMP、完全发育(fully-developed)并且所述动物的视网膜老化，可以有利避免在发育期的胚胎期或者出生早期就产生MT1-MMP过度表达的有害作用。
为了构建一种过度条件表达MT1-MMP的动物模型，可以使用条件表达系统，例如Tet基因表达系统(BD Biosciences，Palo Alto，CA)。已报道该系统在用强力霉素激活的几个小时内，可以过度表达1000倍或者更多(Gossen等人，1995)。条件表达系统有利于时序控制基因表达，例如过度表达MT1-MMP，引起表达的MT1-MMP转基因开始选择动物生命的时间点，例如成年视网膜完全发育。
用本领域技术人员公知的技术转基因小鼠构建，过度表达例如人或小鼠的MT1-MMP。可以使用任何合适的过度表达。使用Tet系统的实施例中，转基因小鼠构建表达嵌合四环素调控的反式作用子rtTA(Tet-On)从适合的启动子，以及第二转基因包括例如人或小鼠的MT1-MMP cDNA连接到Tet响应元件沉默启动子，该元件响应所述反式作用子。对双转基因的小鼠给予强力霉素，因此构建导致所述基因的过度表达，例如MT1-MMP，通过用强力霉素激活反式作用子，并且随后结合激活沉默启动子。
在一些实施方式中，转基因小鼠过度表达的感兴趣基因例如PD2S，MT1-MMP和AMDP-3，转基因的表达限于表达的细胞或组织类型。正如分子生物学领域公知的，转基因表达的细胞位点可以通过选择组织或细胞特异性的启动子控制。因此一个优选实施方式，转基因模型以光感受器特异性的方式过度表达MT1-MMP转基因。为达到此目的启动子的例子为牛视紫红质启动子(Zack等人，1991)，例如展示在转基因小鼠模型中适合光感受器特异性表达的HRG4(UNC119)(Kobayashi等人，2000)。其它转基因小鼠选择过表达基因的实施方式，例如，RPE细胞中的MT1-MMP、PD2S或AMDP-3。RPE细胞特异性表达是直接的，例如，通过RPE细胞特异性启动子例如得自编码RPE65基因的启动子区域的启动子(Boulanger等人，2000)，或者细胞视黄醛结合蛋白(Kennedy等人，1998)。然而其它实施方式设计转基因选择表达脉络膜细胞类型，例如在内皮细胞内用内皮细胞特异性启动子(Cho等人，2003)，或者在黑素细胞和RPE细胞中用启动子驱动在色素细胞类型中的酪氨酸酶表达(Giraldo等人，2003)。
可以用分子生物学领域技术人员公知的技术，通过卵母细胞注射含有转基因的载体构建的转基因小鼠(参见例如，Kobayashi等人，2000)。所述选择的转基因的过度表达应确定在转基因动物的适合的组织或细胞内(例如在视网膜、或尤其在光感受器或RPE细胞中，或者在一种或几种脉络膜细胞类型中)。使用本领域公知的技术如上面的实例证实，例如使用对转基因特异性的合适探针或引物RNA印迹分析、反转录PCR、用合适的抗体通过蛋白质印迹分析蛋白质，以及用多种免疫定位技术。
在转基因动物中发展的病理学，例如在所述动物的视网膜和/或RPE/脉络膜中，使用很多已知技术评价包括例如通过眼底镜检查检测视网膜、视网膜电描记法(electroretinographic，ERG)测试以及光学和电子显微镜检查贯穿挑选的所述动物个体一生、通过给予强力霉素激活转基因之前和之后，例如在5、10、15、20、25和30日龄(用强力霉素在30日龄给药)以及在用强力霉素激活后的第1、2、5、10、20、30、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680和700天。AMD相关病理，例如脉络膜小疣形成、新生血管化、CNW膜形成、光感受器/RPE萎缩或脉络膜萎缩可以同过本领域公知的标准技术检测。
实施例8—表达吞噬作用相关和/或AMD相关基因多态变异体的AMD动物模型
本实施例描述小鼠AMD和其它表达一个或多个吞噬作用相关或AMD相关基因的多态变异体视网膜变性模型的构建。
如上面所示，在患有AMD病人的DNA发现特定基因包括MT1-MMP的多态变异体具有更高的发生率。为了模拟人类状态，表达人多态和野生型基因例如MT1-MMP的转基因模型小鼠按照如下方法构建。第一，优选测定小鼠体内MT1-MMP基因的基本状态。例如已经测定位于人D273N多态MT1-MMP DNA序列中的野生型氨基酸残基在人和小鼠中都保守。在所述残基上的多态还没有在鼠上得到证实(鼠基因组计划)。野生型残基在用于转基因构建的鼠中的存在可以使用尾生物组织活检、DNA分离和基因分型证实。
为了构建多态和对照(野生型)转基因小鼠模型，分别表达人感兴趣基因的多态和野生型，例如MT1-MMP、包括人多态变异体和野生型MT1-MMP残基的cDNA连接到适合驱动转基因在期望组织活细胞中表达的启动子序列。为从头到尾表达转基因，启动子序列实例为，例如，385碱基人MT1-MMP启动子序列，通过PCR从人基因组DNA中扩增制备，并事先确定驱动基因有力的表达(Lohi等人，2000)。为了辅助识别转基因，在一些实施方式中，MT1-MMP基因和绿色荧光蛋白作为融合蛋白表达，用合适的载体构建，例如BioSignal载体(InVitrogen，Carlsbad，CA)。其它具体实施方式选择在特定组织或细胞中表达的转基因，由组织或者细胞特异性启动子按照上述描述驱动。
使用公知技术，转基因小鼠通过向卵母细胞注射载体构建。在转基因中确定人多态和野生型变异体(例如MT1-MMP)的表达，诸如通过具有等位基因特异性的反转录PCR、以及表达绿色荧光蛋白融合蛋白的模式，通过检测绿色荧光蛋白的表达，例如通过荧光显微镜、蛋白印迹分析、或者免疫检测。所述转基因分析AMD相关药理学存在如实施例7所述。
其它AMD和其它视网膜变性的实施方式为多转基因小鼠表达至少两个已知与AMD有关的基因的多态变异体。在优选实施例中，所述动物表达MT1-MMP多态变异体结合至少一个其它显示与吞噬作用和/或AMD相关的多态基因变异体。
所述动物模型的多转基因模式为基于复合体、AMD多基因理论、假设一定数目的基因微突变、通常称“多态”联合作用引起或创造对疾病的易感性。因此，完整表现型AMD可能要求至少两个联合作用，也许更多，病源基因学用合适的多态的结合。成因基因也许对于AMD发展有附加规模作用，通过促成“共同的”(例如，如果功能相同相关，例如关于OS吞噬作用途径)，或者“累积的”例如，如果功能不相关，但是各自关于独立方面致病途径导致AMD。
优选的多转基因AMD模型实施方式为多转基因动物，共表达第一MT1-MMP多态变异体和至少一个第二多态变异体，给多态变异体为至少一个其它吞噬作用相关和/或AMD相关基因。任何其他第二或更多表现与AMD多态变异体相关的基因可以结合任意一个MT1-MMP的多态变异体。目前已报道与AMD相互关联的基因列于表5中。
表5 报道的与AMD多态性或变异有相互关系的基因
 
基因 核苷酸SEQID NO       氨基酸SEQ IDNO(S)        参考文献
ABCR 62 124 Allikmets等人，1997
载脂蛋白E 63 125 Klaver等人，1998；Simonellli等人，2001
C-C趋化因子受体-2 64 126 Ambati等人，2003
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 65 127 Zurder等人，2002
海米生丁/FIBL-6 66 128 Schultz等人，2003
锰超氧化歧化酶 67 129 Kimura等人，2000
C-C趋化因子配体/单核细胞趋化蛋白1                68 130 Ambati等人，2003
对氧磷酶 69 131 Ikeda等人，2001
因此，在一种形式的优选实施例中，多态形式的MT1-MMP结合多态形式的至少一种其它基因，包括ABCR、载脂蛋白E(apolipoprotein E)、C-C趋化因子受体-2、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、海米生丁/FIBL-6、锰超氧化歧化酶(manganese superoxide dismutase)、C-C趋化因子配体/单核细胞趋化蛋白1和对氧磷酶(paraoxonase)。
类似地，AMD的多转基因模型反映“集合的”病因学理论，多态变异体基因与已知的重要功能相关机制(例如OS吞噬作用)结合，以及MT1-MMP多态变异体(证明这里公开的吞噬作用相关的基因；野生型cDNA序列SEQ ID NO：15；野生型氨基酸序列SEQ ID NO：100)。所述基因包括例如这里公开的吞噬作用相关基因的多态变异体PHG-1至PHG-15(SEQ IDNO：1-14)和AMDP-2至AMDP-3(SEQ ID NOS：16和SEQ ID NOS：17)(参见上文表1和表2)。
为了构建所述模型，首先分离包括报道的选择的基因的多态变异体的DNA，采用合适的扩增引物从患有AMD的病人和未患病的年龄已知的个体的DNA中分离(例如，上述实施例5中MT1-MMP)，用报道证实存在的多态例如ABCR(D217N；G1961E)、锰超氧化歧化酶(V47A)、载脂蛋白E(C130、R176C和C130R、R176)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(A25T)和对氧磷酶(Q192R、L54M)。基因分型和突变分析使用已建立的方法完成(参见例如Mashima等人，1994)。证实多态与AMD的结合并且检测AMD与之任何检测相关性的统计学显著性，例如卡方测验。对于那些与AMD显示结合的多态基因，证实与它们同时出现的具多态MT1-MMP。
首先如上所述常规构建表达例如AMDP-3选择基因的多态变异体的转基因小鼠。为了构建多转基因小鼠，表达第一感兴趣基因多态变异体的转基因小鼠(例如MT1-MMP)与表达第二吞噬作用相关/AMD相关感兴趣基因(例如AMDP-3)的多态变异体的转基因小鼠交叉配对。通过本领域公知的方法如RNA的等位基因特异性RT-PCR和/或感兴趣的多态转基因蛋白免疫检测，例如，通过使用多态形式蛋白的特异性抗体，在感兴趣的组织中如视网膜、RPE或脉络膜中确认了多种转基因的表达。可换地，在其中特异性标记蛋白序列连接到转基因蛋白的实施方式中，使用标记蛋白的鉴定以助于鉴定转基因多态变异体蛋白并将其与野生型区分开。分析多基因小鼠作为如上所述AMD相关变化的证据。
引用的文献
为了方便起见，如下列出了所引用的文献，因此这些文献以其全部内容并入作为参考。
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<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>26
Figure A200580012240D01162
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>27
Figure A200580012240D01163
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>28
Figure A200580012240D01164
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>29
Figure A200580012240D01165
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>30
Figure A200580012240D01166
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>31
Figure A200580012240D01167
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>32
Figure A200580012240D01171
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>33
Figure A200580012240D01172
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>34
Figure A200580012240D01173
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>35
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>36
Figure A200580012240D01175
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>37
Figure A200580012240D01176
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>38
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>39
Figure A200580012240D01181
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>40
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>41
Figure A200580012240D01183
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>42
Figure A200580012240D01184
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>43
Figure A200580012240D01185
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>44
Figure A200580012240D01186
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>45
Figure A200580012240D01187
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>46
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>47
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>48
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>49
Figure A200580012240D01194
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>50
Figure A200580012240D01195
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>51
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>52
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>53
Figure A200580012240D01202
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>54
Figure A200580012240D01203
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>55
Figure A200580012240D01204
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>56
Figure A200580012240D01205
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>57
Figure A200580012240D01206
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>58
Figure A200580012240D01207
<210>59
<211>286
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>59
Figure A200580012240D01211
<210>60
<211>286
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>60
Figure A200580012240D01212
<210>61
<211>286
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>61
Figure A200580012240D01213
<210>62
<211>7318
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>62
Figure A200580012240D01214
Figure A200580012240D01221
Figure A200580012240D01241
Figure A200580012240D01251
<210>63
<211>1156
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>63
Figure A200580012240D01252
Figure A200580012240D01261
<210>64
<211>2273
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>64
Figure A200580012240D01262
Figure A200580012240D01271
<210>65
<211>818
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>65
Figure A200580012240D01272
Figure A200580012240D01281
<210>66
<211>18209
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>66
Figure A200580012240D01282
Figure A200580012240D01291
Figure A200580012240D01301
Figure A200580012240D01311
Figure A200580012240D01321
Figure A200580012240D01331
Figure A200580012240D01341
Figure A200580012240D01351
Figure A200580012240D01361
Figure A200580012240D01371
Figure A200580012240D01381
<210>67
<211>1026
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>67
Figure A200580012240D01382
<210>68
<211>757
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>68
Figure A200580012240D01383
Figure A200580012240D01391
<210>69
<211>2395
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>69
Figure A200580012240D01392
Figure A200580012240D01401
<210>70
<211>74
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>70
Figure A200580012240D01402
Figure A200580012240D01411
<210>71
<211>55
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>71
<210>72
<211>52
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>72
Figure A200580012240D01413
<210>73
<211>45
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>73
Figure A200580012240D01414
Figure A200580012240D01421
<210>74
<211>43
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>74
Figure A200580012240D01422
<210>75
<211>37
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>75
Figure A200580012240D01423
<210>76
<211>35
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>76
Figure A200580012240D01424
<210>77
<211>34
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>77
Figure A200580012240D01431
<210>78
<211>34
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>78
Figure A200580012240D01432
<210>79
<211>190
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>79
Figure A200580012240D01433
Figure A200580012240D01441
<210>80
<211>170
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>80
Figure A200580012240D01442
<210>81
<211>38
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>81
Figure A200580012240D01452
<210>82
<211>38
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>82
Figure A200580012240D01453
<210>83
<211>37
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>83
Figure A200580012240D01461
<210>84
<211>335
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>84
Figure A200580012240D01462
Figure A200580012240D01471
<210>85
<211>459
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>85
Figure A200580012240D01472
Figure A200580012240D01481
Figure A200580012240D01491
<210>86
<211>142
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>86
Figure A200580012240D01492
Figure A200580012240D01501
<210>87
<211>449
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>87
Figure A200580012240D01502
Figure A200580012240D01511
Figure A200580012240D01521
<210>88
<211>416
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>88
Figure A200580012240D01522
Figure A200580012240D01531
<210>89
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>89
Figure A200580012240D01532
Figure A200580012240D01541
<210>90
<211>814
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>90
Figure A200580012240D01551
Figure A200580012240D01571
<210>91
<211>55
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>91
Figure A200580012240D01572
Figure A200580012240D01581
<210>92
<211>54
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>92
Figure A200580012240D01582
<210>93
<211>51
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>93
<210>94
<211>43
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>94
Figure A200580012240D01584
Figure A200580012240D01591
<210>95
<211>39
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>95
<210>96
<211>36
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>96
Figure A200580012240D01593
<210>97
<211>33
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>97
Figure A200580012240D01594
<210>98
<211>317
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>98
Figure A200580012240D01601
Figure A200580012240D01611
<210>99
<211>375
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>99
Figure A200580012240D01612
Figure A200580012240D01621
<210>100
<211>582
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>100
Figure A200580012240D01641
Figure A200580012240D01651
<210>101
<211>2285
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>101
Figure A200580012240D01652
Figure A200580012240D01661
Figure A200580012240D01681
Figure A200580012240D01691
Figure A200580012240D01701
Figure A200580012240D01711
Figure A200580012240D01721
Figure A200580012240D01731
Figure A200580012240D01741
<210>102
<211>88
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>102
Figure A200580012240D01751
<210>103
<211>69
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>103
Figure A200580012240D01752
<210>104
<211>65
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>104
Figure A200580012240D01761
<210>105
<211>61
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>105
<210>106
<211>58
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>106
Figure A200580012240D01763
Figure A200580012240D01771
<210>107
<211>55
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>107
Figure A200580012240D01772
<210>108
<211>50
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>108
Figure A200580012240D01773
<210>109
<211>49
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>109
Figure A200580012240D01774
<210>110
<211>48
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>110
Figure A200580012240D01782
<210>111
<211>48
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>111
Figure A200580012240D01783
<210>112
<211>45
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>112
Figure A200580012240D01784
<210>113
<211>45
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>113
Figure A200580012240D01791
<210>114
<211>44
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>114
Figure A200580012240D01792
<210>115
<211>41
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>115
Figure A200580012240D01793
<210>116
<211>39
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>116
<210>117
<211>39
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>117
Figure A200580012240D01802
<210>118
<211>39
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>118
Figure A200580012240D01803
<210>119
<211>34
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>119
Figure A200580012240D01804
<210>120
<211>33
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>120
<210>121
<211>53
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>121
Figure A200580012240D01812
<210>122
<211>260
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>122
Figure A200580012240D01821
<210>123
<211>53
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>123
Figure A200580012240D01831
<210>124
<211>2273
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>124
Figure A200580012240D01851
Figure A200580012240D01861
Figure A200580012240D01871
Figure A200580012240D01881
Figure A200580012240D01891
Figure A200580012240D01901
Figure A200580012240D01911
<210>125
<211>317
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>125
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Claims (52)

1、一种延迟或逆转受试者视网膜或脉络膜变性疾病或状态的方法，该方法包括将具有视网膜或脉络膜变性疾病或状态或者处在发展成视网膜或脉络膜变性疾病或状态的危险中的受试者的视网膜或脉络膜细胞与调节年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因的表达或活性的试剂相接触。
2、根据权利要求1所述的方法，其中，所述年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因选自由人未知吞噬基因-1、前列腺素D2合酶、髓磷脂碱蛋白、人未知吞噬基因-4、人未知吞噬基因-5、人花生样2/分隔蛋白4、毛状蛋白样1、丛生蛋白、酪蛋白激酶1 ε、铁蛋白重多肽1、metargidin、人未知吞噬基因-13、视黄醛结合蛋白1、肌动蛋白γ 1、膜相关基质金属蛋白酶1、SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白和人未知年龄相关黄斑变性吞噬-3蛋白所组成的组中；所述年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因包括分别鉴定为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的核苷酸序列。
3、根据权利要求2所述的方法，其中，所述年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因为膜相关基质金属蛋白酶1；所述基因包括SEQ IDNO：15的核苷酸序列。
4、根据权利要求1所述的方法，其中，所述视网膜或脉络膜变性疾病或状态为年龄相关黄斑变性。
5、根据权利要求4所述的方法，其中，所述受试者患有年龄相关黄斑变性。
6、根据权利要求4所述的方法，其中，所述受试者处在发展成年龄相关黄斑变性的危险中。
7、根据权利要求1所述的方法，其中，该方法延迟视网膜或脉络膜变性疾病或状态。
8、根据权利要求1所述的方法，其中，该方法逆转视网膜或脉络膜变性疾病或状态。
9、根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞为光感受器、视网膜色素上皮细胞或米勒细胞，或者为选自由内皮细胞、平滑肌细胞、白细胞、巨噬细胞、黑素细胞或成纤维细胞所组成的组中的脉络膜细胞类型。
10、根据权利要求9所述的方法，其中，所述年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因为膜相关基质金属蛋白酶1，所述膜相关基质金属蛋白酶1位于所述细胞内。
11、根据权利要求9所述的方法，其中，所述年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因为膜相关基质金属蛋白酶1，所述膜相关基质金属蛋白酶1位于细胞外基质中。
12、根据权利要求11所述的方法，其中，所述细胞外基质为光感受器间基质。
13、根据权利要求1所述的方法，其中，所述试剂下游调控年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因的表达，所述试剂选自由膜相关基质金属蛋白酶1、前列腺素D2合酶和年龄相关黄斑变性吞噬-3蛋白所组成的组中。
14、根据权利要求13所述的方法，其中，所述试剂为选自由核酶、反义RNA、干扰RNA分子和三螺旋形成分子所组成的组中的寡聚核苷酸。
15、根据权利要求13所述的方法，其中，所述试剂为特异性结合膜相关基质金属蛋白酶1、前列腺素D2合酶和年龄相关黄斑变性吞噬-3蛋白的蛋白或肽的抗体。
16、根据权利要求15所述的方法，其中，所述抗体中和膜相关基质金属蛋白酶1、前列腺素D2合酶或年龄相关黄斑变性吞噬-3蛋白的至少一种生物学活性。
17、根据权利要求16所述的方法，其中，所述年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因为膜相关基质金属蛋白酶1，所述生物学活性为激活明胶酶A或降解细胞外基质。
18、根据权利要求13所述的方法，其中，所述试剂为小分子。
19、一种确定受试者处在发展成视网膜或脉络膜变性疾病或状态的危险中的方法，该方法包括筛选受试者的核苷酸序列在至少一种吞噬作用相关或年龄相关黄斑变性吞噬相关基因中存在至少一种多态性，其中，所述多态性的存在表明该受试者比没有出现多态性的受试者的发展成视网膜或脉络膜变性疾病或状态的危险性高。
20、根据权利要求19所述的方法，其中，所述吞噬作用相关基因包括选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17所组成的组中的核苷酸序列。
21、根据权利要求19所述的方法，其中，所述年龄相关黄斑变性吞噬相关基因包括选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：16和SEQ ID NO：17所组成的组中的核苷酸序列。
22、根据权利要求19所述的方法，其中，所述多态性在吞噬作用相关或年龄相关黄斑变性吞噬相关基因的内含子序列、外显子序列或启动子序列内。
23、根据权利要求19所述的方法，其中，所述多态性在人MT1-MMP基因区域内，该基因使用扩增引物通过聚合酶链式反应扩增，该扩增引物具有选自由SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57以及SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58所组成的组中的核苷酸序列。
24、根据权利要求19所述的方法，其中，所述多态在人膜相关基质金属蛋白酶1基因的外显子5的285碱基对片段内。
25、根据权利要求24所述的方法，其中，所述多态为D273N错义多态。
26、根据权利要求24所述的方法，其中，所述多态为P259P同义多态。
27、一种治疗受试者的视网膜或脉络膜变性疾病或状态的方法，该方法包括将包括编码试剂的核苷酸的载体与受试者的视网膜或脉络膜细胞接触，所述试剂下游调控或抑制年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因的mRNA或蛋白质的表达。
28、根据权利要求27所述的方法，其中，所述年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关基因选自由前列腺素D2合酶、膜相关基质金属蛋白酶1和年龄相关黄斑变性吞噬-3蛋白所组成的组中；所述基因各自包括SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17的核苷酸序列。
29、根据权利要求27所述的方法，其中，所述试剂选自由核酶、反义RNA或干扰RNA(RNAi)分子所组成的组中。
30、一种治疗受试者的视网膜或脉络膜变性疾病或状态的方法，该方法包括将包括编码野生型或多态变异体年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关蛋白的核苷酸的载体与受试者的视网膜或脉络膜细胞接触。
31、一种用于避免或治疗受试者视网膜或脉络膜变性疾病或状态的组合物，该组合物含有阻断年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关蛋白的表达或活性的试剂。
32、根据权利要求31所述的组合物，其中，所述蛋白为膜相关基质金属蛋白酶1、前列腺素D2合酶或年龄相关黄斑变性吞噬-3蛋白。
33、一种用于防止或治疗受试者视网膜或脉络膜变性疾病或状态的组合物，该组合物含有包括编码野生型或多态型年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关蛋白的核苷酸的载体。
34、根据权利要求33所述的组合物，其中，所述年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关蛋白为膜相关基质金属蛋白酶1。
35、一种非人类转基因动物，该动物包括分离的核苷酸构建体，所述构建体引起该动物的至少一种细胞类型过度表达膜相关基质金属蛋白酶1、前列腺素D2合酶或年龄相关黄斑变性吞噬-3蛋白。
36、根据权利要求35所述的转基因动物，其中，所述过度表达受条件控制。
37、根据权利要求36所述的转基因动物，其中，所述细胞类型为选自由光感受器、视网膜色素上皮细胞和米勒细胞所组成的组中的视网膜细胞类型；或者为选自由内皮细胞、平滑肌细胞、白细胞、巨噬细胞、黑素细胞和成纤维细胞所组成的组中的脉络膜细胞类型。
38、一种非人类转基因动物，该动物包括分离的核苷酸构建体，所述构建体引起该动物的至少一种细胞类型表达年龄相关黄斑变性吞噬相关或吞噬作用相关核苷酸和/或蛋白质的多态变异体。
39、根据权利要求38所述的转基因动物，其中，所述多态变异体与患有年龄相关黄斑变性的人群相对于正常对照人群的发病率增加相关。
40、一种非人类多转基因动物，该动物包括至少一个第一分离的核苷酸构建体和至少一个第二分离的核苷酸构建体，所述第一构建体引起该动物的至少一种细胞类型表达与患有年龄相关黄斑变性的人群相对于正常对照人群的发病率增加相关的第一基因的第一多态变异体，所述第二构建体引起该动物的至少一种细胞类型表达与患有年龄相关黄斑变性的人群相对于正常对照人群的发病率增加相关或者与视网膜色素上皮细胞吞噬作用相关的第二基因的第二多态变异体。
41、根据权利要求40所述的转基因动物，其中，所述第一基因为膜相关基质金属蛋白酶1基因。
42、根据权利要求41所述的转基因动物，其中，所述第二基因选自由三磷酸腺苷结合盒转运子基因、载脂蛋白E、C-C趋化因子受体-2、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、海米生丁/FIBL-6、锰超氧化歧化酶、C-C趋化因子配体/单核细胞趋化蛋白1和对氧磷酶所组成的组中。
43、根据权利要求41所述的转基因动物，其中，所述第二基因与所述视网膜色素上皮细胞吞噬作用相关，选自由人未知吞噬基因-1、前列腺素D2合酶、髓磷脂碱蛋白、人未知吞噬基因-4、人未知吞噬基因-5、人花生样2/分隔蛋白4、毛状蛋白样1、丛生蛋白、酪蛋白激酶1 ε、铁蛋白重多肽1、metargidin、人未知知吞噬基因-13、视黄醛结合蛋白1、肌动蛋白γ 1、膜相关基质金属蛋白酶1、SWI/SNF相关/OSA-1核蛋白和人未知年龄相关黄斑变性吞噬-3蛋白所组成的组中。
44、根据权利要求35、38或40所述的转基因动物，其中，所述动物为小鼠。
45、一种编码吞噬作用相关蛋白的分离的核苷酸，所述核苷酸包括SEQID NO：1。
46、一种编码吞噬作用相关蛋白的分离的核苷酸，所述核苷酸包括SEQID NO：4。
47、一种编码吞噬作用相关蛋白的分离的核苷酸，所述核苷酸包括SEQID NO：5。
48、一种编码吞噬作用相关蛋白的分离的核苷酸，所述核苷酸包括SEQID NO：12。
49、一种编码吞噬作用相关蛋白的分离的核苷酸，所述核苷酸包括SEQID NO：17。
50、一种包括大量分离的寡聚核苷酸序列的基因阵列，所述序列位于自然人年龄相关黄斑变性相关和/或吞噬作用相关基因的内含子序列、外显子序列或者启动子序列中，其中，所述阵列中由所述寡聚核苷酸序列所表示的基因编码cDNA，该cDNA包括SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：62-SEQ ID NO：69的核苷酸序列。
51、根据权利要求50所述的基因阵列，其中，至少一个基因为膜相关基质金属蛋白酶1，所述寡聚核苷酸序列包括膜相关基质金属蛋白酶1的基因序列多态变异体P259P或D273N。
52、根据权利要求51所述的基因阵列，其中，所述阵列还包括至少一个寡聚核苷酸序列，该序列包括年龄相关黄斑变性相关基因的至少一个多态变异体；所述多态突变体基因选自由三磷酸腺苷结合盒转运子(D217N；G1961E)、锰超氧化歧化酶(V47A)、载脂蛋白E(C130、R176C和C130R、R176)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(A25T)和对氧磷酶(Q192R、L54M)所组成的组中。
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