CN101419223A - 用于三维显微解剖的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种三维显微解剖方法,用于借助冷激光消融或者借助多光子吸收而分离在亚毫米范围内的确定结构,其中,所要分离的结构的释放借助所有空间方向上的方向信息进行。本发明此外涉及一种3D显微解剖系统,用于从试样中分离确定的三维结构,包括:控制单元;消融室连同里面所具有的试样夹持器,试样夹持器上安装所要处理的试样并且试样夹持器可沿轴线V运动并可环绕旋转轴线R转动,其中,试样夹持器具有与控制单元连接的调整装置,控制单元可以安排调整装置使试样夹持器沿轴线H运动并环绕旋转轴线R转动;以及激光装置,其至少部分通过消融室内所具有的激光窗口置入消融室内,激光装置与控制单元连接并具有可调整的镜组,镜组借助控制单元这样调整,使激光射束在试样的区域内聚焦。
Description
技术领域
本发明涉及一种特别是从生物学物体中分离确定三维结构的方法和一种用于实施该方法的装置。
背景技术
显微解剖可以从试样中有针对性地隔离绝大部分生物学材料。现有技术中通常使用机械或者二维激光基础上的显微解剖方法和装置,利用其可以从绝大部分生物学试样中切下和收集确定的结构。
二维激光基础上的显微解剖方法例如在DE 10 2006 000 934 A1中有所介绍。其中将生物学标本,例如组织学的组织切片涂覆在载体上。随后通过激光辐射进行标本的选择,其中,计算机控制电机驱动的显微镜载物台,载体处于该显微镜载物台上面。在切除物体后,该物体通过激光射击加速并由收集装置收集。所要分离的结构的释放在这种情况下借助两个空间方向上的方向信息进行。
用于设置在平面载体上的物体的其他激光显微解剖系统由WO97/29355 A和WO 01/73398 A所公开。
在激光基础上的显微解剖方法中,可切除的最大层厚度通常约为100微米。具有相应更大层厚度的更大体积采用公知的激光显微解剖方法不能分离。传统的激光显微解剖方法均以显微镜结构为基础,其中运动自由度局限在与光轴垂直的轴线上。传统的处理方法此外需要复杂的试样制备,因为所要处理的试样层首先必须事先制造。通常试样制备就已经导致在最后的过程步骤中所要检查的材料变化和变性。此外,试样在整个处理期间的低温冷却以公知的激光基础上的显微解剖方法不能实现。传统设备的显微镜结构迫使共同的光学部件物镜用于激光聚焦以及成像。这种组合迫使在物镜可见光波长度范围内的成像特性以及激光透射与激光聚焦的质量之间的妥协。
利用机械方法也可以使用较厚的试样。然而低温冷却的材料却很难机械切割。此外,利用机械方法很难为显微镜应用取得所要求的精确度。
无论是机械方法还是传统的激光显微解剖,均非常费时并因此可产生的试样量受到极大限制。蛋白质组学以及基因组学的许多分析方法不适用这种小的试样量。
为分析早期生长阶段的种子,需要从籽粒中提取未损伤和未退化的细胞材料,因为只有从未损伤的材料中才能提供可供使用的分析。活检材料分离时也适用用于分析的类似前提条件。因此对显微解剖方法和显微解剖装置存在需求,借助显微解剖方法和显微解剖装置可以隔离或分离试样中未退化结构。
发明内容
本发明的目的因此在于,提供一种用于从试样中分离未退化或者少退化的确定三维结构的方法和一种用于实施该方法的装置。
该目的通过一种按权利要求1所述的方法和一种按权利要求20和25所述的装置得以实现。其他具有优点的实施方式来自从属权利要求。
据此进行用于借助冷激光消融或者借助多光子吸收从试样分离在亚毫米的范围内确定三维结构的三维显微解剖方法,其中,所要分离结构的释放借助所有空间方向上的方向信息进行。亚毫米范围在这种情况下包括直至1毫米的所要分离结构的特征性长度或者直至约1mm3的所要分离的结构体积。冷激光消融是指通过采用短波激光辐射切除材料,从而试样不通过光子吸收加热。激光因此不激励分子的转动带或振动带。作为对冷激光消融的替换,材料处理可以多光子吸收过程为基础。在多光子吸收过程中产生非常高的光子密度。由此可能可以通过材料同时吸收多个光子并将单个光子的能量总和带入材料内。大多数情况下,为产生高的光子密度使用皮秒或者飞秒范围内极短激光脉冲的强聚焦的激光器。试样优选由生物学材料制成。优选激光器发射脉冲时间小于5ns的脉冲。
在本发明中,为构成激光基础上的显微解剖遵循一种全新的方案。通过取消材料层的标本制作和运动自由度的数量的提高,可以对多种材料体积进行解剖。足够数量的运动自由度可以使使用者非常灵活和自由地预先规定所要提取的材料体积的形状。此外,因为利用这种方案可以实现一条从试样标本制作到试样分析封闭的冷却链,所以可以产生具有足够试样体积的几乎未损伤和未退化的试样。产生足够的试样量对处理速度提出很高的要求。激光聚焦镜组与观察镜组的脱离可以使可供使用的激光功率得到最佳利用。
在冷激光消融的基础上所介绍的本发明要求通过具有100μJ范围内的脉冲能量和重复率数百赫兹的新型固体激光器的可支配性实现。
用于为从试样中分离确定的三维结构的三维显微解剖的方法优选包括下列步骤:a)提供至少所要分离的结构的三维体积模型;b)根据三维体积模型借助三维冷激光消融方法至少部分释放所要分离的结构;借助三维冷激光消融的方法开辟了一种用于试样处理的新方法。该方法还可以实现一条封闭的冷却链,从而试样在处理过程期间得到持续冷却或冷冻。依据本发明的方法保证无损伤地提取下面也称为VOI(感兴趣体积)的所要分离的结构。通过该方法可以关于所述VOI连续切除试样薄层。由此通过激光辐射达到减少构架转换的目的。此外,依据本发明的方法保证所提取的体积达到迄今不能达到的精确度。利用该方法可以达到10μm范围内的精确度。
依据步骤a)三维体积模型的提供优选借助一种成像方法进行,该方法至少可以以其三维结构检测所要分离的结构。成像方法为三维结构在最近几年得到了引人瞩目的进一步开发。可供使用的标准化的方法和系统并因此可以有效和成本低廉地与本方法一体化。
成像方法优选包括下列方法之一:核磁共振成像、计算机X线断层成像术、超声波、光学显微镜可视化方法中的3D模拟;上述方法特别传播广泛且完全成熟并因此特别适合在本发明中应用。
成像优选包括10微米范围内的分辨率。现代的成像方法可以达到该范围内的分辨率并因此有助于满足本方法中对特别高的分离精确度的要求。作为选择,体积模型也可以根据参数化直接由使用者制作或描绘。
光学参数优选用于校验和/或者参考,以便可以使三维体积模型的位置和定向与装入3D显微解剖系统内的试样的位置和定向相一致。光学参数可以是试样中现有的结构特征或者可以人工添加或者加入。为可以实施一种全自动的分离方法,有益的是试样与体积模型相关尽可能精确地定向。优选通过光学参数进行定向,因为可以利用至少部分现有的光学元件软件支持实施定向。因此可以达到特别高的定向精确度,其有助于满足本发明中对特别高的分离精确度的要求。
本发明的方法此外优选包括在步骤b)之前实施的步骤a1),即准备试样,以便可以从中提取所要分离的体积,其中,试样的准备包括下列方法之一:试样埋入塑料材料内、试样埋入长链有机物质如蜡或者石蜡内、利用塑化加工的液体浸透试样、低温冷冻试样;这样准备的试样有助于避免三维冷激光消融方法中的构架转换,从而可以分离未退化或者至少很少退化的结构。
试样的准备优选包括将试样冷冻到4℃以下的温度。试样的冷却是一种减少处理过程期间构架转换的特别简单、快速和成本低廉的可能性。
三维冷激光消融方法依据步骤b)优选包括下列其他步骤:
b1)在采样头上固定试样,采样头可沿轴线V运动并环绕旋转轴线R转动,其中,运动可借助与控制单元连接的各自调整装置自动进行;
b2)确定试样夹持器为顺序处理试样的运动顺序,并将该运动顺序储存在控制单元的存储单元内;
b3)通过完成运动顺序实施消融方法,其中,控制单元根据运动顺序控制调整装置。通过该方法可以连续切除试样的薄层,以便释放出VOI。由此达到减少由于激光辐射的构架转换的目的。此外,本发明的方法保证所提取的体积达到迄今不能达到的精确度。特别是全自动的分离方法有助于此,其中,借助计算的运动步骤控制激光器和采样头,从而可以降低特别是通过手动切割VOI不可避免的不精确性。
作为选择,激光焦点与试样之间的相对运动也可以通过一种设备实现,其中激光设备安装在机器人系统上并因此可以以足够的自由度运动和固定安装试样。
作为选择,所需的自由度在激光设备的运动与试样的运动之间分配。
所要分离结构的释放优选借助激光装置进行,该激光装置至少部分装入在其中释放所要分离结构的消融室内。激光器最近作为切割工具具有重要意义,因为它们可以使切片达到特别高的精确度。切片可以按照一种方式精确实施,从而不影响或者仅很少影响周围结构。因此未退化或者至少很少退化的结构可以很高的精确度进行分离。
步骤b)优选在至少部分冷冻的试样上进行。本方法可以在低温冷冻的试样上进行分离,这样明显有助于避免构架转换。
此外,该方法的特征在于,试样的一个空间尺寸比另外两个空间尺寸小至少一个数量级。
依据本发明的方法优选包括在使用摄像机设备的情况下监测消融方法的步骤。为确保所要求的质量标准,建议通过安装简单和成本低廉的摄像机系统进行监测。
摄像机设备优选与控制单元连接,其借助图像处理方法和特征性的光学参数用于试样绝对定位的校验和/或者参考,其中,该方法包括在步骤b1)与b3)之间实施的附加步骤,利用三维体积模型校验试样。摄像机设备可以适当的方式除了监测操作过程外也用于试样的定向。因此由于双重功能而节省成本和空间需求。
作为选择,成像系统可以市场上常见的摄像机可与其连接的显微镜为基础。
本发明的方法优选包括在步骤b)期间和/或者之后实施的步骤c),分开和提取已分离的结构,其中,该步骤包括下列方法至少之一:将落下的已分离结构收集在收集容器内、借助激光射击打掉部分已分离的结构、通过粘附提取、通过抽吸提取、通过冲洗提取、通过超声波提取、通过静电提取;上述方法特别适用于提取VOI和需要时最终分开VOI,因为它们可以简单和成本低廉地实施。
本发明的目的此外利用一种用于从试样中分离确定的三维结构的3D显微解剖系统得以实现,该系统包括:
控制单元;
消融室连同里面所具有的试样夹持器,试样夹持器上安置所要处理的试样和试样夹持器可沿轴线V运动并可环绕旋转轴线R转动,其中,试样夹持器具有与控制单元连接的调整装置,控制单元可以安排调整装置使试样夹持器沿轴线V运动并环绕旋转轴线R转动;以及
激光装置,其至少部分通过消融室内所具有的激光窗口置入消融室内,其与控制单元连接并具有可调整的镜组,镜组可以借助控制单元这样调整,使激光射束聚焦在试样的区域内或者试样可以通过附加的调整件沿光轴移动到激光焦点内。借助这种显微解剖系统可以利用其上述优越性和优点实施上述方法。
试样夹持器此外优选可以借助调整装置沿第三轴线H移动,其中,控制单元与该调整装置连接和调整装置可以安排试样夹持器沿该轴线H移动。激光需要准确聚焦到所要切割的区域上。具有使试样的精确定向变得容易的其他自由度有助于将试样所要切割的区域这样置入聚焦的区域内,即使周围的区域很少受到干扰。因此可以分离未退化或者至少很少退化的结构。
出于同一原因,激光装置优选具有与控制单元连接的激光调整装置,其中,激光射束的偏转角可以通过控制单元进行调整。
试样夹持器优选为机械夹持器或者试样借助埋入凝胶或者这类材料内而固定于其上的夹持器。
消融室优选具有可以对室进行冷却的冷却装置,从而可以冷却(优选低温冷却)试样或者优选在保持在冷却状态下,优选保持低温冷却状态。试样的冷却是一种在处理过程期间减少构架转换的特别简单、快速和成本低廉的可能性。
为此消融室内的温度优选低于4℃,典型地约为-18℃,因为在这种温度下构架转换随着时间明显降低。
激光器的光轴优选垂直处于旋转轴线R上(其中旋转轴线R和V重叠),并垂直处于轴线H上。轴线的垂直或平行设置可以高精确度实施。此外,这种设置简化运动顺序的计算。
消融室内优选在试样下面具有两个收集容器A1和A2。VOI的提取和分开借助收集容器可以简单和成本低廉地实施。
作为选择,本发明的目的利用一种用于从试样中分离确定三维结构的3D显微解剖系统得以实现,该系统包括:
控制单元,
安装在机器人系统上具有足够的运动自由度的激光单元,从而激光焦点可以有针对性地置放在试样上,
激光透射材料制成的微型冷却室,
用于观察试样和过程进展以及试样夹持器或微型冷却室容纳情况的光学显微镜。
附图说明
图1示意示出一种依据本发明的实施方式用于从试样中分离确定三维结构的装置。
具体实施方式
图1示意示出一种依据本发明的实施方式用于从试样中分离确定三维结构的装置。所要剥离的体积下面也称为VOI(感兴趣体积)。
在本实施方式中,处于消融室1内的是具有试样2的采样头。消融室1包括外壳,在外壳内从试样中剥离确定的三维结构。采样头可沿垂直轴线V和水平轴线H移动并可环绕旋转轴线R转动设置。轴线V和R可以如在本实施方式中那样相同。采样头沿轴线V和H以及环绕轴线R的运动借助相应的调整装置电动进行,该装置图1中未示出。采样头和试样依据这种实施方式可以三个自由度运动。试样夹持器例如可以是机械夹持器或者这样构成,即使试样借助埋入凝胶或者这类材料内固定。消融室1包括图中未示出的冷却装置,从而试样可以在室内低温冷却或者可以保持在低温冷却的状态下。冷却装置可以包括传统的冷冻机和传感器,以便可以将消融室1内部的温度调整到所要求的数值上并保持在该数值上。
试样的标本制作借助激光装置6进行,其除了高能量脉冲式UV激光器外还包括具有物镜的可调激光镜组并至少部分通过激光窗口3置入消融室1内。在本实施方式中,激光装置6的物镜处于消融室1的内部。不言而喻,作为对采样头的可沿三个自由度运动的设置的附加或者选择,激光装置6或者激光装置的一部分也可以转动和/或者移动设置。特别是可以具有激光射束相对于激光光轴的偏转功能,以便移动激光器的焦点P。
试样沿可供使用的自由度定向的控制通过控制单元5进行,其在本实施方式中包括PC。该PC与激光装置6和调整装置连接。此外,PC与冷却装置连接,以便监测消融室1内部的温度。
标本制作过程利用同样与PC连接的摄像机装置4监测。虽然摄像机装置4在图中处于消融室1的外面,但其也可以设置在消融室1的内部。摄像机装置4不仅用于监测和质保,而且也用于特征性光学参数的校验和参考,以便使试样如下面进一步介绍的那样与体积模型相一致。
下面介绍上面装置使用的用于确定三维结构分离的方法。
首先制作或者产生试样或者至少所要分离区域的三维体积模型。为此可以使用试样的已经可供使用的模型,例如也可以是理论模型。但在这种情况下,通常使用成像方法,例如像核磁共振成像、计算机X线断层成像术、超声波或者光学显微镜的方法。在拍摄三维图像后,将该图像储存在控制装置中适用于在计算机上处理的计算机模型内。所要剥离的体积通过三维数据段确定,其中,该数据段由使用者通过选出所要选择的体积确定。VOI的确定既可以借助预制完成的体积模型,也可以从所要处理物体的直接3D可视化中完成。作为选择,VOI也可以直接从由使用者输入的参数或者手工描绘中计算和制作。
随后将试样装入优选冷却到-18℃的消融室1内并利用试样夹持器固定。为使可视化体积的位置可与装入3D显微解剖系统内的试样相一致,必须使用如校验点或者通过特征性光学参数参考的参考方法。参考可以或者通过人工标注的参考点,或者也可以通过所要处理物体的特征性结构进行。可以实现光学可视化的是,利用摄像机装置4内所含有的数字摄像机和宏观物镜观察试样。物镜和摄像机可以直接设置在消融室1内。参考和校验可以借助摄像机装置4和公知的图像处理方法进行。试样以体积模型的定向,也就是数据段相对于所夹住的试样的坐标系通过参考法确定。
运动顺序的计算同样可以软件支持进行,控制单元5按照该运动顺序控制调整装置和激光器,以便使该激光器分开所要分离的区域。从VOI中也计算出运动算法,其可以使VOI以其整体或者片段的方式全自动剥离。
下一步激光器通过激光窗口3插入并借助透镜在试样上聚焦。激光器的光轴在此方面与旋转轴线R基本上垂直。激光器参数如激光器功率和焦点位置可以调整并可以适当的方式由控制单元5调整。
消融过程优选在试样的最低点上开始并在试样环绕旋转轴线R转动和试样沿轴线V和H移动期间根据所计算的运动顺序切除材料。所切除的材料落入设置在消融室1内试样下面的收集容器A1内。如果剥离目标体积,那么该目标体积通过激光射束从剩余的试样上切下并落入同样设置在消融室1内试样下面的收集容器A2内。在这种情况下,可以或者交换或者移动收集容器A1和A2,或者采样头可以借助调整装置直接设置在各自的收集容器上面。
借助例如数字摄像机可以记录全部处理过程。附加的图像处理模块可以确定所分离的体积并因此承担自动的质量控制。
Claims (29)
1.三维显微解剖方法,用于借助冷激光消融或者借助多光子吸收而从试样分离在亚毫米范围内的确定结构,其中,所要分离的结构的释放借助所有空间方向上的方向信息进行。
2.按权利要求1所述的方法,其特征在于,所述试样由生物学材料制成。
3.按权利要求1或2所述的方法,其特征在于,激光器发射脉冲时间小于5ns的脉冲。
4.按前述权利要求之一所述的方法,此外包括在所述释放之前实施的步骤:提供至少所述所要分离的结构的三维体积模型。
5.按权利要求4所述的方法,其特征在于,三维体积模型的制作借助成像方法进行,所述成像方法至少能够以所述所要分离的结构的三维结构检测所述所要分离的结构。
6.按权利要求5所述的方法,其特征在于,所述成像方法包括下列方法之一:核磁共振成像、计算机X线断层成像术、超声波、光学显微镜可视化方法中的3D模拟。
7.按权利要求5或6所述的方法,其特征在于,所述成像包括10微米范围内的分辨率。
8.按权利要求4-7所述的方法,其特征在于,三维体积模型的所述制作以通过使用者确定的参数化或者手工描绘为基础。
9.按权利要求4-8之一所述的方法,其特征在于,特征性的光学参数用于校验和/或者参考,以便使所述三维体积模型的位置和定向与装入3D显微解剖系统内的所述试样的位置和定向相一致。
10.按前述权利要求之一所述的方法此外包括在所述释放之前实施的步骤:
准备所述试样,以便能够从中提取所述所要分离的体积,其中,所述试样的所述准备包括下列方法中的至少一个:
所述试样埋入塑料材料内、所述试样埋入长链有机物质如蜡或者石蜡内、利用塑化加工的液体浸透所述试样、冷冻所述试样。
11.按权利要求10所述的方法,其中,所述试样的所述准备包括将所述试样冷冻到4℃以下的温度。
12.按前述权利要求之一所述的方法,其特征在于,所述三维冷激光消融方法包括下列其他步骤:
在采样头上固定所述试样,所述采样头能够沿轴线(V)运动并环绕旋转轴线(R)转动,其中,所述运动能够借助与控制单元(5)连接的各个调整装置自动进行;
确定试样夹持器为顺序处理所述试样的运动顺序,并将该运动顺序储存在所述控制单元(5)的存储单元内,
通过完成所述运动顺序实施所述消融方法,其中,所述控制单元(5)根据所述运动顺序控制所述调整装置。
13.按前述权利要求之一所述的方法,其特征在于,所述所要分离的结构的所述释放借助激光装置(6)进行,所述激光装置至少部分装入消融室(1)内,在所述消融室中进行所述所要分离的结构的释放。
14.按前述权利要求之一所述的方法,其特征在于,所述释放在至少部分冷冻的试样上进行。
15.按前述权利要求之一所述的方法,其特征在于,所述试样的一个空间尺寸比另外两个所述空间尺寸小至少一个数量级。
16.按前述权利要求之一所述的方法,此外包括在使用摄像机装置(4)的情况下监测所述消融方法的步骤。
17.按权利要求16所述的方法,其特征在于,所述摄像机装置(4)与所述控制单元(5)连接,并借助图像处理方法和所述特征性的光学参数而用于所述试样绝对定位的校验和/或者参考,其中,所述方法包括利用所述三维体积模型校验所述试样的附加步骤。
18.按前述权利要求之一所述的方法,其特征在于,所述方法具有分开和提取已分离结构的步骤,其中,所述步骤包括下列方法至少之一:将落下的所述已分离结构收集在收集容器内、借助激光射击打掉部分所述已分离结构、通过粘附进行提取、通过抽吸进行提取、通过冲洗进行提取、通过超声波进行提取、通过静电进行提取。
19.按前述权利要求之一所述的方法,其特征在于,所述激光器为UV激光器。
20.用于从试样中分离确定的三维结构的3D显微解剖系统,包括:
控制单元(5);
消融室(1)连同里面所具有的试样夹持器,在所述试样夹持器上安装所要处理的试样并且所述试样夹持器能够沿轴线(V)运动并能够环绕旋转轴线(R)转动,其中,所述试样夹持器具有与所述控制单元
(5)连接的调整装置,所述控制单元能够安排所述调整装置使所述试样夹持器沿所述轴线(V)运动并环绕所述旋转轴线(R)转动;以及
激光装置(6),所述激光装置至少部分通过在所述消融室(1)内的激光窗口(3)置入所述消融室(1)内,所述激光装置与所述控制单元(5)连接并具有可调整的镜组,所述镜组能够借助所述控制单元(5)这样调整,使激光射束在所述试样的区域内聚焦或者所述试样能够通过附加的调整件而沿光轴移动到激光焦点内。
21.按权利要求20所述的3D显微解剖系统,其特征在于,所述试样夹持器此外借助调整装置能够沿第三轴线(H)移动,其中,所述控制单元(5)与所述调整装置连接,以及所述控制单元(5)能够令所述试样夹持器沿所述第三轴线(H)移动。
22.按权利要求20或21所述的3D显微解剖系统,其特征在于,所述激光装置(6)具有与所述控制单元(5)连接的激光调整装置,其中,所述激光射束的偏转角能够通过所述控制单元(5)进行调整。
23.按权利要求20-22之一所述的3D显微解剖系统,其特征在于,所述激光器的所述光轴垂直于所述旋转轴线(R),所述旋转轴线(R)和(V)重叠,并且所述激光器的所述光轴垂直于所述轴线(H)。
24.按权利要求20-23之一所述的3D显微解剖系统,其特征在于,所述消融室(1)内具有两个收集容器(A1、A2)。
25.用于从试样中分离确定三维结构的3D显微解剖系统,包括:
控制单元,
安装在机器人系统上的激光单元,其具有调焦装置并具有运动自由度,从而激光焦点能够有针对性地置放在所述试样上,
光学显微镜,用于观察所述试样和过程进展以及试样夹持器或微型冷却室的容纳情况。
26.按权利要求20-25之一所述的3D显微解剖系统,其特征在于,所述试样夹持器装入由激光透射材料制成的微型冷却室内。
27.按权利要求20-26之一所述的3D显微解剖系统,其特征在于,所述试样夹持器为机械夹持器,或者所述试样夹持器为所述试样借助埋入凝胶或者这类材料内而固定在其上的夹持器。
28.按权利要求20-27之一所述的3D显微解剖系统,其特征在于,所述消融室(1)或所述微型冷却室具有能够对所述室进行冷却的冷却装置,从而能够冷却所述试样或者将所述试样保持在冷却状态下。
29.按权利要求28所述的3D显微解剖系统,其特征在于,所述消融室(1)或所述微型冷却室内的温度低于4℃,典型地约为-18℃。
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