CN101410134A - 展示蛋白质a作为向脑部递送的抗体和免疫复合物的结合剂的丝状噬菌体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及噬菌体展示载体，其由下列各项组成：丝状噬菌体和通过其Fc部分与蛋白质A或其片段或变体结合的抗体或抗原－抗体免疫复合物，其中在所述丝状噬菌体表面上展示了作为非－丝状噬菌体分子的蛋白质A或其能够结合抗体Fc部分的片段或变体。将所述噬菌体展示载体配制到药物组合物中，且能够用于治疗/抑制或诊断脑疾病、病症或疾病状况。

Description

展示蛋白质A作为向脑部递送的抗体和免疫复合物的结合剂的丝状噬菌体

发明背景

发明领域

本发明涉及用于向脑部递送抗体和免疫复合物的丝状噬菌体展示载体及其在诊断和治疗中的用途。

相关技术描述

噬菌体展示：

组合噬菌体展示肽文库提供了研究蛋白质：蛋白质相互作用的有效方法。该技术依赖于非常大的随机肽样本的产生，所述随机肽与它们相应的遗传蓝图相关(Scott等，1990；Dower，1992；Lane等，1993；Cortese等，1994；Cortese等，1995；Cortese等，1996)。通常通过构建在丝状噬菌体，诸如M13，fd和f1的外表面上表达的嵌合蛋白实现随机肽的呈递现。该呈递使所有组成部分可以经受结合测定和专门的筛选方案(称为淘选(biopanning)(Parmley等，1988))，从而导致对具有所需结合特性的肽的亲和分离和鉴定。以这种方式，已经对与受体(Koivunen等，1995；Wrighton等，1996；Sparks等，1994；Rasqualini等，1996)、酶(Matthews等，1993；Schmitz等，1996)或抗体(Scott等，1990；Cwirla等，1990；Felici等，1991；Luzzago等，1993；Hoess等，1993；Bonnycastle等，1996)相结合的肽进行了有效的选择。

丝状噬菌体是非裂解、雄性特异性噬菌体，其感染携带F-附加体的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞(综述参见Model等，1988)。丝状噬菌体颗粒以900nm长和10nm厚的细管状结构存在，其含有环形单链DNA基因组(+链)。噬菌体的生命周期需要所述噬菌体与细菌F-菌毛的结合，以及随后所述单链DNA基因组进入宿主。由宿主复制系统识别所述环形单链DNA，并且在噬菌体的复制起始点(-)结构处开始合成互补的第二条DNA链。该双链DNA复制形式是合成单链DNA环形噬菌体基因组的模板，其起始于复制起始点(+)结构处。最终将这些包装到病毒体中，并且在不引起对宿主的裂解或明显损害的条件下，将噬菌体颗粒从细菌中挤压出来。

肽展示系统已经开发了两种噬菌体的结构蛋白：pIII(P3)蛋白和pVIII蛋白。pIII蛋白以5个拷贝/噬菌体而存在，并且专门存在于病毒体的一个尖端(Goldsmith等，1977)。pIII蛋白的N-末端结构域形成结状结构，该结构对感染过程是必需的(Gray等，1981)。这使得噬菌体能够吸附到F-菌毛尖端以及随后所述单链噬菌体DNA渗透和易位到细菌宿主细胞内(Holliger等，1997)。pIII蛋白可以耐受大范围的修饰，且因此被用于在其N-末端表达肽。在不显著影响pIII蛋白功能的条件下，外源肽长达65个氨基酸残基(Bluthner等，1996；Kay等，1993)，并且在有些情况中，甚至与全长蛋白质一样大(McCafferty等，1990；McCafferty等，1992)。

围绕着单链噬菌体DNA的圆柱状蛋白包膜由2700个拷贝的主外壳蛋白、pVIII、α-螺旋状亚基组成，其中所述α-螺旋状亚基由50个氨基酸残基组成。PVIII蛋白自身以螺旋状模式排列，其蛋白的α-螺旋以锐角朝向病毒体的长轴(Marvin等，1994)。该蛋白的一级结构包含3个分离的结构域：(1)N-末端部分，富含酸性氨基酸并暴露于外界环境；(2)中央疏水结构域，其负责：(i)噬菌体颗粒中的亚基：亚基相互作用和(ii)宿主细胞中的跨膜功能；和(3)含有碱性氨基酸并聚集在C-末端的第三结构域，其包埋在噬菌体的内部并与噬菌体-DNA相缔合。pVIII合成为含有23个氨基酸的前导肽的前外壳蛋白，其在跨越细菌内膜易位时分裂，从而产生成熟的50个-残基的跨膜蛋白(Sugimoto等，1977)。pVIII作为展示支架的用途受到这样的事实的阻碍，所述事实是pVIII可以耐受在其N-末端添加不长于6个残基的肽(Greenwood等，1991；Iannolo等，1995)。更大的插入物干扰噬菌体的装配。然而，在这样的系统中引入更大的肽是可能的，所述系统中通过将含有肽、pVIII蛋白的重组体与野生型pVIII在体内混合而产生嵌合噬菌体(Felici等，1991；Greenwood等，1991；Willis等，1993)。这允许在噬菌体颗粒装配的过程中将嵌合pVIII蛋白以低密度(数十到数百个拷贝/颗粒)结合到由野生型外壳蛋白所点缀的噬菌体表面上。使用了两种能够生成嵌合噬菌体的系统：由Smith命名的“8+8型”和“88型”系统(Smith，1993)。

“8+8型”系统基于使得两个pVIII基因分别位于两个不同遗传单位中(Felici等，1991；Greenwood等，1991；Willis等，1993)。重组pVIII基因位于噬菌粒上，所述噬菌粒是除其自身的复制起点外，还含有复制的噬菌体起点和包装信号的质粒。通过用辅助噬菌体超感染携带噬菌粒的细菌而提供野生型pVIII蛋白。另外，辅助噬菌体提供将噬菌粒和辅助基因组包装到病毒体中的噬菌体复制和装配系统。因此，所述细菌分泌两种类型的颗粒：辅助噬菌体和噬菌粒，这两者均与重组体和野生型pVIII蛋白的混合物相结合。

“88型”受益于在一个且相同的感染性噬菌体基因组中含有两个pVIII基因。因此，这避免了对辅助噬菌体和超感染的需要。此外，仅产生一种类型的嵌合噬菌体。

噬菌体基因组编码10种蛋白质(pI-pX)，所有这些蛋白质对于产生感染性后代是必要的(Felici等，1991)。这些蛋白质的基因被安排在由两个非编码区域分隔开的两个紧密包装的转录单位中(Van Wezenbeek等，1980)。一个非编码区域，称为“基因间区域”(定义为位于pIV和pII基因之间)，含有DNA复制的(+)和(-)起点和噬菌体的包装信号，从而能够起始壳体形成。该基因间区域的一些部分是不必要的(Kim等，1981；Dotto等，1984)。而且，发现该区域能够耐受在一些位点插入外源DNA(Messing，1983；Moses等，1980；Zacher等，1980)。噬菌体的第二个非编码区域位于pVIII和pIII基因之间，并且如Pluckthun所举例说明，也被用于结合外源重组基因(Krebber等，1995)。

用噬菌体展示进行免疫：

由表位组成的小合成肽通常是需要肽的化学合成的较差的抗原，且需要与大载体偶联，但是即使那样它们可以诱导低亲和性免疫反应。在本发明人的实验室中，利用仅展示EFRH肽的丝状噬菌体作为抗原，开发了用于产生抗-AβP抗体的免疫程序(Frenkel等，2000和2001)。近年来，丝状噬菌体已经广泛应用于在它们的表面上“展示”所有大组成成分，所述肽是通过在编码噬菌体外壳蛋白的基因5’末端克隆随机寡核苷酸产生的(Scott和Smith，1990；Scott，1992)。如近期报告地，丝状噬菌体是用于多种生物制剂中外源肽的表达和呈递的优秀载体(Greenwood等，1993；Medynski，1994)。丝状噬菌体的施用诱导针对噬菌体作用系统的强免疫反应(Willis等，1993；Meola等，1995)。以上讨论的噬菌体外壳蛋白pIII和pVIII是经常用于噬菌体展示的蛋白质。

由于其线性结构，丝状噬菌体对不同类型的膜具有高度渗透性(Scott等.，1990)，并且跟随嗅束，通过边缘系统到达海马区域，从而靶向受影响的位点。用氯仿处理丝状噬菌体将线性结构改变为环形结构，其阻止噬菌体向脑部的递送。

抗体工程：

应用抗体工程方法，从而在维持其生物活性的同时，最小化mAb的大小(135-900kDa)(Winter等，1994)。这些技术和将PCR技术应用于创建大抗体基因全部组成成分使得抗体噬菌体展示成为用于分离和表征单链Fv(scFv)抗体的多功能工具(Hoogenboom等，1998)。scFV能够展示在噬菌体表面上，从而进行进一步的处理，或者可以作为可溶性scFV(～25kd)片段释放。本发明人的实验室加工了scFV，其表现出与亲本IgM分子相似的抗聚集特性(Frenkel等，2000a)。为了scFV的构建，克隆了来自抗-AβPIgM 508杂交瘤的抗体基因(Frenkel等，2000a)。分泌的抗体在阻止其对培养的PC12细胞的毒性作用中显示出针对AβP分子的特异性活性。位点定向的单链Fv抗体是通过细胞内或细胞外方法将治疗性抗体靶向到脑中的第一步。

蛋白质A：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A是细胞壁成分，其特征在于其与免疫球蛋白，特别是IgG种类的Fc部分的亲和性(Goding，1978)。它与人、小鼠、猪、豚鼠和兔的IgG抗体结合。在小鼠中，蛋白质A以高亲和性与IgG2a和IgG2b抗体结合，但是较差地结合于IgG1和IgG3抗体(Goudswaard等1978)。蛋白质A是42kDa的蛋白质，其具有四个富含天冬氨酸和谷氨酸但缺乏半胱氨酸的重复结构域。IgG结合结构域(结构域B)由3个反平行α-螺旋组成，当该蛋白质与Fc复合时，其中第三个α-螺旋破裂(Graille等，2000)。

斑形成疾病：

斑形成疾病的特征在于脑中淀粉状蛋白斑沉积物的存在以及神经元的变性。淀粉状蛋白沉积物通过聚集为不溶性团块的肽形成。所述肽的性质在不同疾病中不同，但是在大部分情形中，该聚集物具有β折叠结构并被刚果红染料染色。除阿尔茨海默病(AD)外，其他以淀粉状蛋白沉积物为特征的疾病是例如SAA淀粉样变性病、遗传性冰岛综合症、多骨髓瘤和朊病毒疾病，所述阿尔茨海默病包括早发性阿尔茨海默病，迟发性阿尔茨海默病和症状发生前的阿尔茨海默病。动物中最常见的朊病毒疾病是绵羊和山羊的痒病和牛的牛海绵状脑病(BSE)(Wilesmith和Wells，1991)。在人类中鉴定了4种朊病毒疾病：(i)库鲁病，(ii)克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)，(iii)格-施-沙病(GSS)，和(iv)致死性家族失眠症(FFI)(Gajdusek，1977；和Tritschler等，1992)。

朊病毒疾病包括正常细胞朊病毒蛋白(PrPC)向相应的痒病同种型(PrPSc)的转化。分光镜测量证明了PrPC向痒病同种型(PrPSc)的转化包括主要的构象转换，这暗示朊病毒疾病，像其他产生淀粉样蛋白的疾病一样，是蛋白质构象的病症。从PrPC向PrPSc的转换伴随着α-螺旋二级结构的减少(从42％到30％)和β折叠含量的显著增多(从3％到43％)(Caughey等，1991；和Pan等，1993)。该重排作用与异常的生理化学特性相关，所述生理化学特性包括在非变性去污剂中的不溶性和对蛋白质水解的部分抗性。早先的研究显示了与人PrP的残基106-126(PrP106-126)同源的合成肽表现出一些PrPSc的病原和生理化学特性(Selvaggini等，1993；Tagliavini等，1993；和Forloni等，1993)。该肽显示出显著的构象多态性，从而在多种环境中获得不同的二级结构(De Gioia等，1994)。它倾向于在缓冲溶液中采用β折叠构象，并聚集为淀粉状蛋白原纤维，所述淀粉状蛋白原纤维部分抵抗用蛋白酶的消化。抗体3F4和其肽表位(PrP 104-113)的复合物的X射线晶体学研究提供了该可变区域的结构图像，该区域被认为是发展朊病毒疾病所必需的构象重排成分(Kanyo等，1999)。

阿尔茨海默病(AD)是导致老年性痴呆的进行性疾病。广泛地说，该疾病分成两类：发生在晚年(典型的65岁以上)的迟发性和在高龄期前，例如在35-60岁之间充分发展的早发性。在这两种疾病类型中，病理学相似，但是在更早年龄开始的情形中的异常性倾向于更严重和广泛。该疾病特征在于脑中的两种类型的损伤，即老年斑和神经原纤维缠结。通过脑组织剖面的显微镜分析可见，老年斑是与位于中心的细胞外淀粉状蛋白沉积物交叉的达到150mm的混乱嗜中性粒细胞的区域。神经原纤维缠结是tau蛋白的细胞内沉积物，所述tau蛋白由成对彼此扭转的两条细丝组成。

老年斑的主要要素是称为淀粉状蛋白β(Aβ)或β-淀粉状肽(βAP或βA)的肽。淀粉状蛋白β肽是称为淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的前体蛋白的39-43氨基酸的内部片段。已经把若干APP中的突变与阿尔茨海默病的存在联系起来了(Goate等，(1991)，缬氨酸到异亮氨酸；Chartier Harlan等，(1991)，缬氨酸717到甘氨酸；Murrell等，(1991)，缬氨酸717到苯丙氨酸；Mullan等，(1992)，双突变，即将赖氨酸595-甲硫氨酸596改变为天冬酰胺595-亮氨酸596)。

认为所述突变通过增多或改变的从APP向β-淀粉状蛋白的加工，具体地从APP向增加量的长形β-淀粉状蛋白(即，Aβ1-42和Aβ1-43)的加工，而引起阿尔茨海默病。认为其他基因，诸如早老蛋白基因，PS1和PS2中的突变间接影响APP的加工，以产生增加量的长形β-淀粉状蛋白(见Hardy，TINS 20，154，1997)。这些观察说明β-淀粉状蛋白，且特别是其长形，是阿尔茨海默病中的成因性元素。

关于淀粉状蛋白纤维的公开文献说明了圆柱形β折叠是符合一些X-射线和电子显微镜数据的唯一结构，且阿尔茨海默Aβ片段和变体的纤维可能由两个或三个同中心的圆柱形β折叠构成(Perutz等，2002)。完整的Aβ肽含有42个残基，即正好是集结成圆柱形壳的正确数量；该发现以及在缺乏脯氨酸条件下由Aβ肽构成的β折叠中的许多可能的强静电相互作用解释了在阿尔茨海默病患者中发现的Aβ肽形成细胞外淀粉状蛋白斑的倾向。如果该解释是正确的，则淀粉状蛋白由具有中心充水腔的细管(纳米管)组成。体外淀粉状蛋白斑生长的可逆性提示了斑和溶液中βA的稳定状态平衡(Maggio和Mantyh，1996)。为形成β折叠原纤维，βA聚合对肽-肽相互作用的依赖，以及其他蛋白质对该反应的刺激作用，提示了可以对淀粉状蛋白形成进行调节。已经进行了许多尝试，以发现能够干扰淀粉状蛋白形成的物质。研究最多的化合物中有抗体，由β-断裂(β-breaker)氨基酸如脯氨酸所组成的肽，带电基团向识别基序的添加和N-甲基化氨基酸作为结构单元的用途(由Gazit综述，2002)。

已经提出了用于预防或治疗患者中以淀粉状蛋白聚集为特征的疾病的方法，其包括使得针对淀粉状蛋白沉积物的肽成分的抗体接触到聚集的或可溶的淀粉状蛋白。见Schenk的WO99/27944和Solomon的美国专利5,688,651，将每一篇的全部内容引入本文作为参考。通过主动或被动的接种疫苗可以导致抗体接触到可溶的或聚集的淀粉状蛋白。在主动接种疫苗中，施用肽，所述肽可以是完整的淀粉状肽或其一部分，从而在体内产生抗体，该抗体应该与可溶的和/或聚集的淀粉状蛋白相结合。被动接种疫苗包括直接施用对淀粉状肽特异的抗体。这些程序通过减小淀粉状蛋白斑或减缓所述斑的沉积率优选地用于治疗阿尔茨海默病。

报告了Elan公司(Elan Corporation)和Wyeth-Ayerst实验室已经进行了疫苗的临床试验，从而测试所述过程。被测试的化合物是AN-1792。报告了该产品是β-淀粉状蛋白42形式。

本文中任何文献的引用不意欲承认该文献是相关的现有技术，或被认为是本申请任何权利要求的可专利性的材料。对任何文献的内容或日期的任何叙述都基于提交时申请人可获得的信息，且不构成对所述叙述正确性的承认。

发明概述

本发明提供噬菌体展示载体，所述噬菌体展示载体包含下列各项：丝状噬菌体，和通过抗体的Fc部分与蛋白质A或其片段或变体结合的抗体或抗原-抗体免疫复合物，其中在所丝状噬菌体表面上展示了作为非天然丝状噬菌体分子的蛋白质A或其能够与抗体Fc部分结合的片段或变体。

本发明还提供药物组合物，其含有本发明的噬菌体展示载体，以用作治疗剂或诊断剂。

本发明进一步提供用于治疗/抑制或用于诊断脑疾病，病症或疾病状况的方法，该方法通过向需要的受试者鼻内施用本发明的噬菌体展示载体实现。

附图简述

图1A显示引物ProtA-fwd(SEQ ID NO：1)和ProtA-rev(SEQ ID NO：2)，其用于蛋白质A变体的PCR合成。图1B显示蛋白质A变体的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。图1C显示蛋白质A变体的氨基酸开放阅读框(SEQ IDNO：4)。

图2是显示噬菌体-蛋白质A结合IgG1型抗体(196，10D5，6C6和2H3)的图。它还结合IgG2a(3D6)，并弱结合IgG2b(12B4)。

图3是显示与针对Aβ1-16的抗体结合的噬菌体-ProtA一旦当它们与Aβ1-16结合便不与蛋白质A分离的图。

图4是显示与mAb196结合的噬菌体-ProtA1的滴定的图。

图5A和5B是显示用两种单独浓度的抗体2H3滴定噬菌体的图。

图6是显示ELISA结果的图，以检查PEG沉淀后噬菌体蛋白质A与抗体196的解离。处理是：1，与5μg 196结合并PEG沉淀的噬菌体-蛋白质A；2，同1，但无PEG沉淀；3，仅是PEG沉淀的抗体196；4，如3中的，但无PEG沉淀；4，无抗体且无PEG沉淀的噬菌体-蛋白质A自身。

图7A和7B是显示噬菌体-prtA-抗胰岛素与胰岛素的结合(图7A)和用山羊抗小鼠抗体检测到的噬菌体-prtA-胰岛素-抗胰岛素免疫复合物的结合(图7B)的图。

图8是比较用噬菌体复合物处理的小鼠和对照未处理小鼠中的可溶及不可溶Aβ1-42和不可溶Aβ1-40的水平的图。

图9A和9B是显示与未处理对照小鼠相比，用噬菌体-196复合物处理的PDAPP小鼠中不可溶或可溶Aβ1-42的水平的图。

图10A和10B是显示在复合物处理的小鼠和非转基因及转基因对照小鼠中IL1β和IL10的细胞因子水平的图。

发明详述

丝状噬菌体具有线性结构，其能够使它们在鼻内施用时透入脑中。由于能够将它们加工成在其外壳蛋白上存在组合的(assorted)蛋白质或肽，所以它们能够用于递送抗体或分子(以与其特异性抗体的免疫复合物形式)进入哺乳动物受试者的脑中。P3是组装噬菌体外壳顶端之一的结构蛋白，噬菌体通过所述外壳侵袭细菌大肠杆菌。

本发明的一个方面涉及噬菌体展示载体，所述噬菌体展示载体包括丝状噬菌体，在其表面上展示了作为非天然丝状噬菌体分子的蛋白质A或其能够与抗体Fc部分结合的片段或变体，且述噬菌体展示载体还包括通过其Fc部分与蛋白质A或其片段或变体结合的抗体或抗原-抗体免疫复合物。在优选的实施方案中，所述丝状噬菌体还不通过连接体或直接与药物缀合，且所述抗体或抗原-抗体免疫复合物也不固定在固体载体上。在另一个优选的实施方案中，与在所述丝状噬菌体上展示的蛋白质A或其片段或变体结合的抗体对不作为靶点在细胞表面上呈递的分子特异，且该抗体不固定在固体载体上。

在本发明人的实验室中，使用了丝状噬菌体M13，f1和fd，其在结构和遗传水平上都得到了充分的理解(Greenwood等，1991)。该实验室最先显示了丝状噬菌体在保持载体惰性特性和携带外源分子能力的同时，表现出对中枢神经系统的渗透特性(Frenkel和Solomon，2002)。

丝状噬菌体是一组结构相关的病毒，其含有环形单链DNA基因组。它们在多产的感染过程中，不杀死它们的宿主。感染包含F质粒的大肠杆菌的噬菌体总体称为Ff噬菌体。它们不感染哺乳动物细胞。

丝状噬菌体是大约1-2微米长和直径6nm的柔软的杆，其具有围绕DNA核心的蛋白质亚基的螺旋壳。两种主要的外壳蛋白，即蛋白质pIII和主外壳蛋白pVIII，区别在于所展示的蛋白质的拷贝数。pIII以4-5个拷贝呈递，而发现pVIII以～3000个拷贝呈递。大约50个-残基的主外壳蛋白pVIII亚基主要是α-螺旋，且该α-螺旋的轴与病毒体的轴形成小角度。可以以三部分考虑蛋白质壳：外表面，其由所述亚基的N-末端区域占据，富含与周围溶剂相互作用并给予所述病毒体低等电位点的酸性残基；壳的内部，其包括极性侧链的19个-残基的片段，其中蛋白质亚基主要彼此间相互作用；和内表面，其由所述亚基的C-末端区域占据，富含与DNA核心相互作用的碱性残基。实际上全部蛋白质侧链相互作用是外壳蛋白阵列的不同亚基之间，而非在亚基内的事实使其成为用于研究大分子集合体中的α-螺旋亚基之间的相互作用的有效的模型系统。尽管其具有大约16.3MD的质量，丝状噬菌体的独特结构使其能够渗透进入脑，并可以有助于其干扰βA原纤维化的能力，原因在于噬菌体结构类似于淀粉状蛋白原纤维自身。

丝状噬菌体可以是任何丝状噬菌体，诸如M13、f1或fd。尽管在下文的实施例中使用了M13，预计任何其它丝状噬菌体以相似的方式表现和起作用，其原因在于它们具有相似的结构，且它们的基因组具有大于95％的基因组同一性。

在按照本发明所述的噬菌体展示载体中，蛋白质A、或其片段或变体展示在所述丝状噬菌体的表面上。该噬菌体展示包括表达蛋白质A或其片段或变体的cDNA克隆，所述蛋白质A或其片段或变体作为与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白。因此，遗传性修饰丝状噬菌体基因组，从而在其表面上展示非天然多肽或肽。展示外源蛋白质或肽作为与噬菌体外壳蛋白的融合的丝状噬菌体是本领域技术人员熟知的。可以使用许多噬菌体和外壳蛋白，其包括但不限于：M13蛋白III，M13蛋白VIII，M13蛋白VI，M13蛋白VI，M13蛋白IX和fd小外壳蛋白pIII(Saggio等，1995；Uppala和Koivunen，2000)。可以使用一大批载体(见Kay等，1996；Berdichevsky等，1999；和Benhar，2001)。在优选的实施方案中，蛋白质A或其片段或变体通过其与丝状噬菌体的小外壳蛋白(蛋白质III)的融合而展示。将外源编码序列插入到噬菌体基因中的方法是众所周知的(见，例如Sambrook等，1989；和Brent等，2003)。

金黄色葡萄球菌的蛋白质A是在本领域中用于结合抗体Fc部分的众所周知且充分使用的蛋白质。含有结合结构域的蛋白质片段在本领域中也是充分公认的。还存在很多关于具有与抗体(免疫球蛋白)Fc部分改进的结合(或与来自不同Ig种类和亚类的Fc的区别性结合)的蛋白质A变体的知识。优选地，与蛋白质A或其片段或变体结合的抗体属于IgG种类。蛋白质A变体的最优选实施方案是具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的变体。

蛋白质A或其能够结合抗体Fc部分的片段或变体展示在丝状噬菌体的表面上，以结合抗体或抗原-抗体免疫复合物，从而向脑递送。

本发明提供用于抑制或治疗脑疾病、病症或疾病状况的方法，该方法是通过将所述噬菌体递送载体引入到脑中而实现的。另外，本发明还提供用于诊断脑疾病、病症或疾病状况的方法，该方法是通过将可以被检测到的，即标记的噬菌体展示载体引入到脑中而进行的。所述方法包括向需要其的受试者引入/施用有效量的本发明的噬菌体展示载体。

为了本说明书和附加权利要求的目的，术语“患者”、“受试者”和“接受者”可互换地使用。它们包括作为预防或治疗处理，或诊断的对象的人和其他哺乳动物。

为了本说明书和附加权利要求的目的，术语“β淀粉状肽”与“β-淀粉状肽”、“淀粉状β肽”、“βAP”、“βA”和“Aβ”同义。全部这些术语指源自淀粉状蛋白前体蛋白的斑-形成肽。在优选的实施方案中，与展示在噬菌体表面上的蛋白质A(或其片段或变体)结合的抗体特异于(特异性结合于)淀粉状β肽。淀粉状β肽优选地是Aβ1-42或Aβ1-40。

用于本文时，“PrP蛋白”、“PrP”、“朊病毒”指在适当条件下能够诱导引起斑-形成疾病的聚集物形成的多肽。例如，在所述条件下，将正常细胞朊病毒蛋白(PrPC)转变为相应的痒病同种型(PrPSc)，所述痒病同种型引起斑-形成疾病，诸如但不仅限于牛海绵状脑病(BSE)、或疯牛病、猫的猫科海绵状脑病、库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、格-施-沙病(GSS)、和致死性家族失眠症(FFI)。在另一个优选的实施方案中，所述抗体对病原性PrPS同种型特异。

术语“治疗”意欲意指基本抑制、减缓或逆转疾病、病症或疾病状况的进程，基本改善疾病、病症或疾病状况的临床症状或基本预防疾病、病症或疾病状况临床症状的出现。

本发明的噬菌体递送载体和方法针对脑疾病、病症或疾病状况。优选地，所述脑疾病、病症或疾病状况是“斑-形成疾病”。

术语“斑形成疾病”指以在疾病，诸如但不仅限于，早发性阿尔茨海默病(AD)、迟发性阿尔茨海默病、产生症状前的阿尔茨海默病，SAA淀粉样变性病、遗传性冰岛综合症、衰老、多骨髓瘤和已知感染人和动物的朊病毒疾病中通过聚集蛋白(斑形成肽)引起的斑的形成为特征的疾病，所述聚集蛋白诸如但不限于β-淀粉状蛋白、血清淀粉状蛋白质A、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、IgGκ轻链或朊病毒蛋白；所述已知感染人的朊病毒疾病诸如例如，库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、格-施-沙病(GSS)和致死性家族失眠症(FFI)，和所述感染动物的朊病毒疾病诸如例如痒病和牛海绵状脑病(BSE)。

因为上文所述的大多数与斑-形成疾病相关的淀粉状蛋白斑(也称为淀粉状蛋白沉积物)位于脑内，所以任何提议的治疗形式必须证明穿越血脑屏障(BBB)的能力，以及溶解淀粉状蛋白斑的能力。通常，能够穿透BBB的平均分子大小是大约2kDa。

逐渐增多量的证据显示在AD临床过程的早期患有嗅觉缺陷和中枢嗅觉途径中的退化改变。而且，AD中涉及的解剖模式提出嗅觉途径可能是AD发育的最初阶段。

嗅觉受体神经元是位于鼻腔上皮内层中的双极性细胞。它们的轴突穿过筛板，并投射到脑嗅球中嗅觉途径的第一突触。来自鼻上皮的嗅神经元的轴突形成1000条无髓鞘纤维的束。这种构型使得它们成为高通路，通过该高通路病毒或其他被传输的物质可以穿越血脑屏障(BBB)获得对CNS的靠近。

如前所示，鼻内施药(Mathison等，1998；Chou等，1997；Draghia等，1995)允许病毒和大分子直接进入脑脊髓液(CSF)或CNS。

文献中报告了嗅觉受体神经元作为向脑递送腺病毒载体的位点的用途。据称，该方法导致受体基因在无明显毒性的条件下在脑中表达12天(Draghia等，1995)。

抗体或免疫复合物的直接脑递送通过使用嗅神经元作为向脑的转运而克服了穿越BBB。在嗅上皮中，初级嗅神经元的树突与鼻内腔接触，且通过轴突，这些神经元还与脑嗅球相连接。接触到嗅上皮的噬菌体能够被吸收到初级嗅神经元中，并转运到嗅球，且甚至进一步进入脑的其他区域。

按照本发明治疗/抑制或诊断的脑疾病、病症或疾病状况还包括脑肿瘤和脑炎症(brain inflammatory)疾病、病症或疾病状况。脑炎症导致在完整海马结构中新神经元的基底连续结构中和在对脑损伤响应增加的神经发生中的神经发生的抑制。神经发生的损害依赖于小胶质细胞的活化程度，而与周围组织中是否存在损害无关。脑炎症在除AD外的其他慢性神经变性病症的发病机理中可能起重要作用，其包括AβP病理作用，所述其它慢性神经变性病症如帕金森氏病、雷维小体痴呆、AIDS痴呆复征、外伤性脑损伤、青光眼等。

外伤性脑损伤(TBI)包括β-淀粉状蛋白沉积和痴呆的早期发作。尽管有该描述，但是几乎不知道这些变化发生的机制。在TBI中生成β-淀粉状肽的一个假设来源是β-淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的异常蛋白水解分裂，已经显示出所述β-淀粉状蛋白前体蛋白(APP)在外伤损伤的轴突中损害的轴浆运输位点处累积。实际上，最近在TBI的猪模型中发现伴随肿胀轴突的βA免疫反应性(Smith等，1999)，这提示外伤损伤的轴突中APP的积累可能是TBI中β-淀粉状肽形成的来源。

神经变性疾病和病症的非限制性实例包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病、雷维小体痴呆、AIDS痴呆复征、中风、和封闭性脑损伤和外伤性脑损伤，诸如枪伤、出血性中风、缺血性中风、脑缺血、由神经损害试剂如毒素、毒药、化学(生物战)试剂引起的损害或由外科手术诸如肿瘤切除引起的损害。

在优选的实施方案中，与噬菌体展示的蛋白质A(或其片段或变体)结合的抗体是特异于靶分子的单克隆抗体，所述靶分子与脑疾病、病症或疾病状况相关，诸如淀粉状β肽和PrPSc。所述抗体还可以是针对脑中炎性细胞因子诸如TNFα、IL6等的抗体，从而抑制/治疗由中风、脑损伤或其他神经变性疾病或病症引起的脑炎症。在用于诊断作为脑疾病、病症或疾病状况的脑肿瘤的情形中，抗体特异于脑肿瘤所特有的靶细胞，并且它的存在是对特殊脑肿瘤的诊断。

备选地，展示蛋白质A(或其片段或变体)的噬菌体递送载体可以用于将免疫复合物递送进入脑中，其中所述蛋白质A(或其片段或变体)通过抗体的Fc部分与抗原-抗体免疫复合物相结合。免疫复合物中与抗体结合的抗原是能够治疗脑疾病、病症或疾病状况的分子。与抗体结合的抗原的非限制性实例包括胰岛素、能够降低神经元损伤和细胞死亡的促红细胞生成素(EPO)、干扰素和其他抗炎细胞因子诸如IL10和不穿越血脑屏障的神经元保护分子。

按照本发明用于诊断脑疾病、病症或疾病状况的方法包括向需要其的受试者鼻内施用本发明的噬菌体展示载体。当具有它的抗体成分的噬菌体展示载体和与脑疾病、病症或疾病状况相关的靶分子结合时，那么检测到脑疾病、病症或疾病状况的存在。可以可检测地标记与在丝状噬菌体表面上展示的蛋白质A(或其能够与抗体Fc部分结合的片段或变体)结合的抗体。

标记的抗体优选地是放射性标记的，从而用在针对脑肿瘤的治疗中或诊断性放射成像中。用于标记的放射性核素的非限制性实例包括¹¹¹In，¹²⁵I，¹³¹I和⁹⁹mTc。所述放射性标记的抗体，其优选地是放射性碘标记的抗体，通过用于放射性标记肽和蛋白质的标准方法制备，并且然后再与在丝状噬菌体表面上展示的蛋白质A(或其片段或变体)相结合。

其他合适的可检测标记包括造影剂诸如钆(Gd)，它是增强的动力学MRI的优选试剂，以及包括重元素(例如，Pt，Au，和Tl)的有机或无机化合物。

按照本发明所述的药物制剂包括本发明的噬菌体展示载体作为活性成分。所述药物制剂还可以是来自不同丝状噬菌体的噬菌体展示载体的混合物。

可以将按照本发明所述的制剂自身，或处于与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中，施用给生物体。

用于本文时，“药物组合物”指一种或多种本文所述的活性成分和其他化学成分诸如生理适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物向生物体的施用。

术语“活性成分”指对生物作用负责的制剂。在药物组合物用于诊断应用的情形中，术语“活性成分”意指靶向与脑疾病、病症或疾病状况相关分子的抗体。

在下文中，可以互换地使用的短语“生理用载体”和“药用载体”指这样的载体或稀释剂，其不对生物体引起显著刺激且不消除被施用的化合物的生物活性和性质。

术语“赋形剂”指向药物组合物添加的惰性物质，从而进一步促进活性成分的施用。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、不同的糖和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

在“雷明顿制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)”马克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)，PA，最新版本中可以找到用于药物配制和施用的技术，将其引入本文作为参考。

本发明的药物组合物可以通过本领域中熟知的过程制备，例如通过常规混合、溶解、粒化、糖衣丸制备、研末、乳化、包封、陷入或冻干过程。

由此，可以以常规方式配制按照本发明使用的药物组合物，所述常规方式利用一种或多种药用载体，包括赋形剂和助剂，其促进将所述活性成分加工到能被药用的制剂中。

为了通过鼻吸入施药，按照本发明使用的活性成分便利地以气雾喷雾剂的形式递送，其从使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳的压缩包装或喷雾器中喷出。鼻喷雾，其不需要如吸入喷雾中的压缩包装或喷雾器，可以备选地用于鼻内施药。在压缩气雾剂的情形中，通过提供用于定量递送的阀可以确定剂量单位。可以配制在分配器中使用的例如明胶胶囊或药筒，其包含所述化合物和合适粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。

适合于在本发明的情形中使用的药物组合物包括这样的组合物，其中包含有效获得预期目的的量的活性成分。更特别地，治疗有效量意指有效预防、减轻或改善疾病、病症或疾病状况症状或延长受治疗受试者生存的活性成分的量。

治疗或诊断有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文所提供的详细公开。

可以单独调节剂量的量和时间间隔，从而提供噬菌体展示载体的脑水平，其足以治疗或诊断具体的脑疾病、病症或疾病状况(最小有效浓度，MEC)。MEC针对每种制剂而不同，但是由体外数据估算。达到MEC必需的剂量应该取决于个体的特征。

利用MEC值还能够确定剂量时间间隔。应该利用这样的方案施用制剂，所述方案维持脑水平在10-90％，优选地在30-90％之间和最优选地50-90％的时间高于MEC。

依赖于待治疗疾病状况的严重性和反应，给药可以是单次或多次施药，其治疗过程持续数天到数周或直到达到治愈或实现疾病状态的减小。

当然，待施用组合物的量应该取决于接受治疗或诊断的受试者，痛苦的严重性，处方医师的判断，等。

如果需要，本发明的组合物可以存在于包装或分配器设备中，诸如FDA批准的试剂盒，其可以包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。包装可以，例如，包括金属或塑料薄片，诸如泡状包装。包装或分配器装置可以附加施用说明书。包装或分配器还可以适应于伴随着容器的注释，所述容器处于控制医药品制造、使用或销售的政府机构规定的形式，所述注释反映所述机构对组合物形式或人或兽医施药的批准。该注释，例如，可以是由美国食品和药品管理局对处方药物批准的标签或批准的产品插入页。如同上文进一步详述地，还可以制备包含配制在相容的药物载体中的本发明的制剂的组合物，将其置于适当的容器中，并标记用于治疗指定的疾病状况。

现已一般性地描述了本发明，将通过参考下列实施例更容易地对其进行理解，所述实施例是通过举例说明的方式提供的，且不意欲限制本发明。

实施例

在该研究中，构建了在P3上展示蛋白质A变体的丝状噬菌体。先前的工作使用了这一基本观点，然而，是以不同的方式：Li等(1998)使用了展示蛋白质A的B结构域的噬菌体，所述蛋白质A的B结构域与scFv分子融合。Djojonegoro等(1994)仅使用了在M13噬菌体上展示的蛋白质A的B结构域，且Sampath等(1997)使用了B结构域来证明丝状噬菌体能够用作克隆工具。全部这些先前的研究使用了噬菌体展示技术，从而能够通过蛋白质AIgG结合结构域与人IgG的结合，对在噬菌体上展示的蛋白质A的改进形式进行容易的选择。下文所述的本研究的实验表明，展示蛋白质A变体的噬菌体结合小鼠抗体，主要是IgG1型和它们的配体。通过鼻内应用将这些复合物施用于hAPP tg小鼠。它们进入小鼠的脑部，并发挥下文讨论的作用。

材料和方法

合成蛋白质A变体

所使用的蛋白质A的部分包含四个重复结构域，包括结构域B。合成了两种引物，即具有ATG密码子和Nco I限制性位点的正向引物，和不具终止密码子并具有Not I限制性位点的反向引物(图1A)。利用下列方案进行了PCR：在1x Qiagen Taq聚合酶缓冲液中组合2μg金黄色葡萄球菌基因组DNA和20μM的各种引物。向100μl反应体积加入dNTPs(0.2mM)，和2.5单位的聚合酶。PCR条件是：在94℃起始变性3分钟，随后以进行30个周期：在94℃变性30秒，在55℃退火1分钟和在72℃聚合1分钟。用Nco I和Not I消化，凝胶纯化PCR产物，并将其克隆到预先用Nco I和Not I线性化的载体pCANTAB 5E中。将蛋白质A基因的这一部分克隆到该载体中产生蛋白质A与丝状噬菌体(M13)的基因3的翻译融合。利用辅助噬菌体产生了展示蛋白质A-P3融合的噬菌体，其称为噬菌体protA。

ELISA

通过ELISA测量噬菌体蛋白质A与不同IgG抗体的结合：在0.1M磷酸钠，pH8.5中混合10¹¹个展示蛋白质A的噬菌体和10μg(15nmols)抗体。在37℃轻轻摇动该混合物30分钟，然后一式四份地将50μl等分试样添加到ELISA孔中，所述孔预先由兔抗噬菌体抗体包被，并用3％的牛奶封闭。山羊抗-小鼠-HRP缀合的抗体用作第二抗体。用OPD和过氧化物进行HRP反应。将结果描述为在492nm处的OD。

通过下列步骤检验了抗原结合后噬菌体-蛋白质A-抗体复合物的稳定性：在0.1M磷酸钠，pH8.5中混合10¹¹个展示蛋白质A的噬菌体和10μg(15nmols)抗体。在37℃轻轻摇动该混合物30分钟，并且然后将与抗体的摩尔比为50∶1的抗原(0.32nmols生物素酰化的Aβ1-16)加入到噬菌体-蛋白质A和抗体的混合物中，再持续30分钟。一式四份地将50μl等分试样添加到ELISA孔中，所述孔预先由兔抗噬菌体抗体包被，并用3％的牛奶封闭。使用抗生物素蛋白-HRP缀合物检测与ELISA平板结合的复合物。只有仍然与抗原结合的噬菌体-抗体复合物将与抗生物素蛋白-HRP缀合物反应。这些实验中使用的稀释了1∶1000的血清取自具有针对ERFH表位的滴度的小鼠。

为了滴定与不同量的抗体结合所需要的噬菌体的数量，将表现出与蛋白质A的最佳结合能力的抗体196以3种不同浓度(50，100和250ng/孔)用来包被ELISA平板，随后用3％的牛奶对孔进行封闭。加入不同浓度(10⁹/ml-10¹²/ml)的噬菌体-蛋白质A，并通过兔抗-噬菌体抗体和山羊抗-兔-HRP抗体检测所结合的噬菌体。

抗体-抗原复合物与噬菌体-蛋白质A的结合滴定如下：将10⁹/ml-10¹²/ml的噬菌体与两种独立浓度的抗体2H3，即10ng或50ng，和1∶2摩尔比的抗体：抗原(对每个抗体分子有两个抗原分子)混合。将混合物在37℃轻轻摇动30分钟，然后添加到ELISA孔中，所述孔预先用兔抗噬菌体抗体包被，并由在PBS中3％的牛奶包被。用抗生物素蛋白-HRP缀合物检测结合的噬菌体，所述抗生物素蛋白-HRP缀合物仅能与生物素酰化的抗原结合。

还检测了噬菌体-蛋白质A抗体复合物的PEG沉淀是否引起它们的解离：在4℃，用20μg/ml抗生物素蛋白包被ELISA孔过夜，并再用1μg/ml生物素酰化的Aβ1-16肽在室温下包被ELISA孔30分钟。用在PBS中的3％的牛奶封闭该孔。在1ml 0.1M Na₂HPO₄中将10¹²噬菌体与1μg或5μg抗体196相混合，并且在37℃轻轻摇动1小时。利用PEG-NaCl沉淀该混合物的一半，随后如前重新混悬在500μl 0.1M Na₂HPO₄中，并且在不沉淀的条件下使用另一半。在37℃，将两种混合物都应用于前述ELISA平板(50μl混合物/孔)1小时。用小鼠抗-噬菌体和山羊抗-小鼠-HRP缀合物进行结合的噬菌体的检测。

还检验了噬菌体-蛋白质A与抗-胰岛素IgG生成复合物的情况。在37℃，将噬菌体-蛋白质A(10¹²/ml)与不同浓度的抗-胰岛素抗体混合，并在37℃轻轻摇动30分钟。在应用到ELISA平板前，PEG沉淀该复合物，所述ELISA平板在4℃用0.25mg/ml胰岛素包被过夜。用小鼠抗-噬菌体和山羊抗-小鼠抗体，或只用山羊抗小鼠抗体，检测所结合的噬菌体。该第二检测方法用于证明抗胰岛素抗体确实与噬菌体蛋白质A一起存在于复合物中。

体内研究

向年龄为9个月的PDAPP小鼠供给噬菌体-protA复合物(与Ab 196或与抗-胰岛素Ab加胰岛素)，每2周一次(4次治疗)，并在随后的6个月内每月一次，总共为10次治疗。通过鼻内施用供给复合物，将20微升分为2个鼻孔施用。治疗结束时，对小鼠进行安乐死和处死。在液氮中冷冻来自每只小鼠左脑半球。将每个半球匀浆，并分为可溶和不可溶级分。随后，用胍-HCl溶解不可溶级分。在进行分析之前保持两种级分冷冻。利用对Aβ1-42特异的捕获抗体和检测抗体，通过夹心式ELISA进行β淀粉状蛋白1-42检测。用IL1β或IL10的特异性试剂盒进行细胞因子水平的确定(R & D系统(R & D systems))。

结果和讨论

利用图1A中描述的引物合成了蛋白质A变体。对PCR产物进行测序，从而证实其完整性，并将其克隆到pCANTAB5E中。产生表达与噬菌体PIII融合的蛋白质A变体的噬菌体，并用在ELISA中。

展示蛋白质A变体的噬菌体主要与IgG1抗体结合

由ELISA检验protA噬菌体与IgG型抗体的结合。

在图2中，呈现了10¹¹个噬菌体颗粒与15nmol不同抗体的结合。

噬菌体-protA-结合的抗体在与它们的抗原结合后不从所述噬菌体中分离出来

检验抗体，从而确定它们在与其抗原结合后是否从所述噬菌体中解离出来。使用了来自β-淀粉状肽N末端的氨基酸残基1-16的生物素酰化肽作为抗原，。图2中总结了该实验的结果。对于该实验，在0.1M磷酸钠，pH8.5中混合10¹¹个展示蛋白质A的噬菌体和10μg(15nmols)抗体。在37℃轻轻摇动该混合物30分钟，并且然后将与抗体的摩尔比为50∶1的抗原(0.32nmols生物素酰化的Aβ1-16)加入到噬菌体-蛋白质A和抗体的混合物中，再持续30分钟。将该复合物添加到ELISA孔中，所述孔预先由兔抗噬菌体抗体包被，并由3％的牛奶封闭。使用缀合的抗生物素蛋白-HRP检测与ELISA平板结合的复合物。只有在结合抗原后仍然连接的噬菌体-抗体复合物将与抗生物素蛋白-HRP缀合物反应。这些实验中使用的血清取自具有针对ERFH表位滴度的小鼠。

图3证明了当蛋白质A-结合的抗体与它们识别的抗原结合时，它们不与蛋白质A分开。从平板-结合的噬菌体-protA中分离的抗体-抗原复合物将被洗掉，并且将不与抗生物素蛋白-HRP反应。如图2中所示，12B4与噬菌体-proA弱结合。它在此不反应，因为它不结合肽1-16，并将其用作另一个阴性对照。当用PBS缓冲液，pH6.0洗涤ELISA平板时，结合结果不变。较低的pH没有导致抗体-抗原复合物从噬菌体-ProtA中的解离。

滴定蛋白质A与mAb 196的结合

滴定了结合不同量抗体所需的噬菌体的数量，以证实结合是特异性的。在该实验中，将表现出对蛋白质A的最佳结合能力的抗体196以3种不同浓度用来包被ELISA平板，随后用3％的牛奶封闭孔。加入不同浓度的噬菌体-蛋白质A，且由兔抗-噬菌体抗体检测结合的噬菌体(图4)。由图4，明显地，噬菌体-蛋白质A与抗体196的结合是特异性的；其作为噬菌体数量和抗体浓度的函数得到增强。在该实验设置中，没有观察到饱和结合。为了估算展示蛋白质A的噬菌体的数量，用提高的噬菌体浓度包被ELISA孔，并与抗-噬菌体抗体反应(未显示)。通过比较该分析和图4中呈现的在先分析之间在492nm处的OD，能够确定大约30％-36％的噬菌体展示蛋白质A。

为了确定结合特定量的噬菌体所需要的抗体的量(其应该也指示应该被结合的抗原的量)，进行了另一个实验，其中将提高数量的噬菌体与2种独立浓度的抗体(2H3)，及1∶2的抗体：抗原摩尔比(对于每个抗体分子有2个抗原分子)相混合(图5A)。将混合物添加到ELISA孔中，所述孔预先由兔抗噬菌体抗体包被，并由在PBS中3％的牛奶包被。用抗生物素蛋白-HRP缀合物检测所结合的噬菌体，所述抗生物素蛋白-HRP缀合物仅能与生物素酰化的抗原结合。

因为对与每种抗体浓度观察到的值在不同噬菌体浓度之间区别不大，所以也能够将结果总结为“平均值的平均值”，且如图5B中所示绘图。

这些结果证明抗体浓度，而非噬菌体浓度，是该实验设置中的限制因素：在10⁹/ml噬菌体-蛋白质A(每个ELISA孔中使用5x10⁷个噬菌体/50μl)时，存在充足的蛋白质A分子结合50ng，这是大约70pmol，且它们不足以饱和5x10⁷个噬菌体-蛋白质A分子。

PEG-NaCl沉淀没有导致大规模的噬菌体-抗体解离

还检验了噬菌体-蛋白质A-抗体复合物的PEG沉淀是否导致它们的解离。用抗生物素蛋白和1μg/ml生物素酰化1-16肽包被ELISA孔。用在PBS中的3％的牛奶封闭孔。在0.1M Na₂HPO₄中混合10¹²个噬菌体与1μg或5μg抗体196，并且在37℃轻轻摇动1小时。利用PEG-NaCl沉淀该混合物的一半，随后以与先前相同的缓冲液和相同体积对其进行重新混悬，并且在不沉淀的条件下使用另一半。在37℃，将两种混合物都应用于前述ELISA平板(50μl混合物/孔)1小时。用小鼠抗-噬菌体和山羊抗-小鼠-HRP缀合物进行结合的噬菌体的检测。图6显示PEG沉淀导致大约20％的噬菌体蛋白质A-抗体复合物解离。

噬菌体蛋白质A结合抗-胰岛素抗体和胰岛素的免疫复合物

将噬菌体蛋白质A和抗-胰岛素IgG混合，并将该复合物用到ELISA平板上，所述板由0.25mg/ml的胰岛素包被。在应用到ELISA平板前，PEG沉淀该复合物。用小鼠抗-噬菌体和山羊抗-小鼠抗体(图7A)或仅用山羊抗-小鼠(图7B)检测结合的噬菌体。该第二检测方法用于证明抗胰岛素抗体确实与噬菌体蛋白质A一起存在于复合物中。

将噬菌体-蛋白质A(10¹²/ml)与不同浓度的抗-胰岛素抗体相混合，且在37℃轻轻摇动30分钟。在应用到ELISA平板前，PEG沉淀该复合物。用小鼠抗-噬菌体，以及随后通过山羊抗-小鼠抗体检测所结合的噬菌体。

图7A中显示了相似测定的结果，但图7B中显示了仅用山羊抗-小鼠抗体的检测。

总之，产生了展示蛋白质A变体的丝状噬菌体，所述蛋白质A变体能够结合IgG型抗体。与强烈结合小鼠IgG2a和IgG2b的金黄色葡萄球菌的天然蛋白质A相反，该重组蛋白质A结合小鼠IgG1分子，IgG1分子为最丰富的类型并且更好。这些噬菌体能够在体外用于纯化抗体，或例如，能够在体内用来向脑递送某些抗体。

体内研究

噬菌体-protA-196.如在材料和方法部分所解释地，将噬菌体-protA-196复合物应用到PDAPP转基因小鼠中。检验了可溶和不可溶级分(用胍-HCl溶解的聚集的肽和膜)中β-淀粉状肽1-42的水平，和不可溶级分中Aβ1-40的水平。与转基因未处理对照相比，在处理的小鼠中观察到在可溶和不可溶级分中Aβ1-42的量减少大约20％。然而，该结果不是显著的(图8)。在Aβ1-40中，在与对照未处理小鼠相比，在用噬菌体复合物处理的小鼠间没有观察到差别。

噬菌体-protA-抗-胰岛素-胰岛素.用噬菌体-抗体-胰岛素复合物处理PDAPP小鼠。在图9A中，与Tg未处理小鼠或用噬菌体-196复合物处理的小鼠相比，在用该复合物处理的小鼠中观察到不可溶Aβ1-42水平更显著的差别，即大约60％的减少。仅用噬菌体处理的小鼠具有平均23％的Aβ1-42水平减少。与对照相比，在处理的小鼠中可溶Aβ1-42水平的减少甚至更加显著且达到80％(图9B)。

检验了IL1β，即促炎细胞因子，和IL10，即抗炎细胞因子的水平。转基因未处理小鼠中IL1β水平比非转基因小鼠中IL1β水平高大约36％(图10A)，这意味着疾病引起以较高IL1β浓度显示的炎症。然而，所述复合物处理的小鼠含有与非转基因小鼠中的IL1β水平相似的水平，这提示处理的小鼠没有发展脑炎症。在抗炎细胞因子，IL10的浓度中观察到相同的现象(图10B)。于此，再一次，与含有平均少18％的IL10的转基因对照小鼠相比，在非转基因小鼠和转基因处理的小鼠中IL10的水平相似。接受噬菌体-protA-196的PDAPP小鼠的细胞因子水平在处理的小鼠和转基因对照之间没有显示出差别(数据未显示)。

在先研究提示胰岛素通过鼻内胰岛素施药途径对记忆功能的急性改善效应，已知所述鼻内胰岛素施药途径提供物质进入脑脊髓液室的直接通路(Strachan，2005)。先前的结果表明了边缘和海马区域中胰岛素受体的普遍性，以及用系统胰岛素对记忆的改善。将胰岛素与噬菌体混合，从而证明了将增多数量的噬菌体引入到脑中，这导致淀粉状蛋白负担的有效降低。该效果伴随着脑中细胞因子分布的改善。这种累积作用可能是通过胰岛素作为AD保护治疗，而获取噬菌体的抗聚集性质加更好的渗透性的有效方法。

现已完整地描述了本发明，本领域技术人员应该理解在不偏离本发明的精神和范围且不需要过度实验的条件下，可以在宽范围的等价参数、浓度和条件范围内实现相同的目的。

虽然已经结合其具体实施方案描述了本发明，但是应该理解能够进一步对其进行改变。该申请意欲包括本发明的任意变化、用途或修改，其通常按照本发明的原则并包括本发明的这样的背离，即所述背离来自本发明所属领域中已知或习惯的实践，和可以适用于如在后附的权利要求的范围中阐述的上述基本特征。

将本文引用的全部参考文献，包括杂志文章或摘要、公布的或相应的美国或外国专利申请、授权的美国或外国专利、或任何其他参考文献，完整引入本文作为参考，包括引用的参考文献中描述的全部数据、表格、附图和正文。另外，也将本文引用的参考文献中引用的参考文献的完整内容完整引入，作为参考。

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Claims (35)

1.噬菌体展示载体，其包括下列各项：丝状噬菌体，和通过其Fc部分与蛋白质A或其片段或变体结合的抗体或抗原-抗体免疫复合物，其中在所述丝状噬菌体表面上展示了作为非-天然丝状噬菌体分子的所述蛋白质A或其能够与抗体Fc部分结合的片段或变体，所述噬菌体展示载体符合下列条件：所述丝状噬菌体还不(not also)通过连接体与药物缀合或直接与药物缀合，且所述抗体或免疫复合物也不(not also)固定在固体载体上。

2.权利要求1的噬菌体展示载体，其中所述丝状噬菌体选自由M13、f1和fd噬菌体，及其任意混合物组成的组。

3.权利要求1的噬菌体展示载体，其中所述丝状噬菌体是M13。

4.权利要求1的噬菌体展示载体，其中所述抗体属于IgG种类。

5.权利要求1的噬菌体展示载体，其中与所述蛋白质A或其片段或变体结合的抗体是单克隆抗体。

6.权利要求5的噬菌体展示载体，其中所述单克隆抗体是针对淀粉状β肽Aβ1-42或Aβ1-40产生的或对淀粉状β肽Aβ1-42或Aβ1-40特异的单克隆抗体。

7.权利要求5的噬菌体展示载体，其中所述单克隆抗体对与脑疾病、病症或疾病状况相关的靶分子特异。

8.权利要求7的噬菌体展示载体，其中所述脑疾病、病症或疾病状况是斑-形成疾病或病症。

9.权利要求7的噬菌体展示载体，其中所述单克隆抗体是标记的。

10.权利要求1的噬菌体展示载体，其中与所述蛋白质A或其片段或变体结合的所述免疫复合物是胰岛素和抗-胰岛素抗体的免疫复合物。

11.权利要求1的噬菌体展示载体，其中在所述丝状噬菌体表面上展示的所述非-天然丝状噬菌体分子由与抗体或抗原-抗体免疫复合物结合的蛋白质A、或其能够结合抗体Fc部分的片段或变体组成。

12.噬菌体展示载体，其包括下列各项：丝状噬菌体，和通过其Fc部分与所述蛋白质A或其片段或变体结合的抗体，其中在所述丝状噬菌体表面上展示了作为非-天然丝状噬菌体分子的蛋白质A或其能够结合抗体Fc部分的片段或变体，其中所述抗体对不在细胞表面上作为靶标呈递的分子特异，且符合这样的条件：所述抗体还不固定在固体载体上。

13.权利要求12的噬菌体展示载体，其中所述丝状噬菌体选自由M13、f1和fd噬菌体，及其任意混合物组成的组。

14.权利要求12的噬菌体展示载体，其中所述丝状噬菌体是M13。

15.权利要求12的噬菌体展示载体，其中所述抗体属于IgG种类。

16.权利要求12的噬菌体展示载体，其中与所述蛋白质A或其片段或变体结合的抗体是单克隆抗体。

17.权利要求16的噬菌体展示载体，其中所述单克隆抗体是针对淀粉状β肽Aβ1-42或Aβ1-40产生的或对淀粉状β肽Aβ1-42或Aβ1-40特异的单克隆抗体。

18.权利要求16的噬菌体展示载体，其中所述单克隆抗体对与脑疾病、病症或疾病状况相关的靶分子特异。

19.权利要求18的噬菌体展示载体，其中所述脑疾病、病症或疾病状况是斑-形成疾病或病症。

20.药物组合物，其包括权利要求1或权利要求12的噬菌体展示载体和药用载体、赋形剂、稀释剂或助剂。

21.用于治疗或抑制脑疾病、病症或疾病状况的方法，其包括向需要其的受试者鼻内施用有效量的权利要求1或权利要求12的噬菌体展示载体，从而抑制或治疗所述脑疾病、病症或疾病状况。

22.权利要求21的方法，其中所述脑疾病、病症或疾病状况是斑-形成疾病或病症。

23.权利要求22的方法，其中所述斑-形成疾病或病症是阿尔茨海默病。

24.权利要求23的方法，其中与在所述噬菌体展示载体上展示的所述蛋白质A或其片段或变体结合的抗体是对淀粉状β肽特异的抗体。

25.权利要求24的方法，其中所述抗体对淀粉状β肽1-42或1-40特异。

26.权利要求22的方法，其中所述斑-形成疾病或病症是朊病毒疾病。

27.权利要求21的方法，其中所述脑疾病、病症或疾病状况是脑肿瘤。

28.权利要求21的方法，其中所述脑疾病、病症或疾病状况是脑炎症(brain inflammatory)疾病、病症或疾病状况。

29.权利要求21的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

30.权利要求21的方法，其中所述受试者是人。

31.权利要求21的方法，其中与所述蛋白质A或其片段或变体结合的所述免疫复合物是胰岛素和抗-胰岛素抗体的免疫复合物。

32.用于诊断脑疾病、病症或疾病状况的方法，其包括：

向需要其的受试者鼻内施用权利要求1或权利要求12的噬菌体展示载体；和

检测所述噬菌体展示载体，从而诊断脑疾病、病症或疾病状况的存在，所述噬菌体展示载体的抗体成分与脑疾病、病症或疾病状况相关的靶分子结合。

33.权利要求32的方法，其中所述抗体是可检测地标记的。

34.权利要求33的方法，其中所述抗体是用放射性核素可检测地标记的。

35.权利要求33的方法，其中所述抗体是用造影剂可检测地标记的。

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