BRPI0707871A2 - veÍculos de exibiÇço de fago, composiÇço farmacÊutica ,e, mÉtodos para o tratamento ou a inbiÇço e para o diagnàsticos de uma doenÇa, distébio ou condiÇço cerebral - Google Patents

Abstract

VEÍCULO DE EXIBIÇçO DE FAGO, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA, E, METODOS PARA O TRATAMENTO OU A INIBIÇçO E PARA O DIAGNàSTICO DE UMA DOENÇA, DISTURBIO OU CONDIÇçO CEREBRAL. A presente invenção refere-se a um veículo que exibe fago, composto de um bacteriófago filamentoso que exibe sobre a superficie, como uma molécula de bacteriófago não- filamentoso, a proteína A ou um fragmento ou variante da mesma, capaz de se ligar à porção Fc de anticorpos, e um anticorpo ou um imunocomplexo antigeno- anticorpo ligado à proteína A ou a um fragmento ou variante do mesmo através de sua porção Fc. O veículo que exibe fago é formulado como uma composição farmacêutica e pode ser usado para tratar! inibir ou para diagnosticar uma doença, distúrbio ou condição cerebral.

Description

"VEÍCULO DE EXIBIÇÃO DE FAGO, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA, E, MÉTODOS PARA O TRATAMENTO OU AINIBIÇÃO E PARA O DIAGNÓSTICO DE UMA DOENÇA, DISTÚRBIOOU CONDIÇÃO CEREBRAL"

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A invenção refere-se a um veículo que exibe um bacteriófagofilamentoso para o fornecimento de anticorpos e imunocomplexos ao cérebroe o seu uso em diagnóstico e terapêutica.

Descrição da Arte Relacionada

Exibição de Fago:

As coleções de peptídeo de exibição de fago combinatóriasfornecem um meio efetivo para o estudo de interações de proteína: proteína.Esta tecnologia está baseada na produção de conjuntos muito grandes depeptídeos aleatórios associados com as suas impressões genéticascorrespondentes (Scott et al., 1990; Dower, 1992; Lane et al., 1993; Cortese etal., 1994; Cortese et al. 1995; Cortese et al., 1996). A apresentação depeptídeos aleatórios é muitas vezes efetuada através da construção deproteínas quimérica expressadas sobre a superfície externa de bacteriófagosfilamentosos, tais que Ml3, fd e fl. Esta apresentação torna os repertóriospassíveis de ensaios de ligação e esquemas de varredura especializados(referidos como "biopanning" (Parmley et al., 1988), que conduzem aoisolamento por afinidade e à identificação de peptídeos com as propriedadesde ligação desejadas. Deste modo, os peptídeos que se ligam a receptores(Koivunen et al., 1995; Wrighton et al., 1996; Sparks et al., 1994; Rasqualiniet al., 1996), enzimas (Matthews et al., 1993; Schmitz et al., 1996) ouanticorpos (Scott et al., 1990; Cwirla et al., 1990; Felici et al., 1991; Luzzagoet al., 1993; Hoess et al., 1993; Bonnycastle et al., 1996) foram eficientementeselecionados.Bacteriófagos filamentosos são bacteriófagos específicosmachos não- líticos, que infectam as células Escherichia coli, que portam umepisoma F (para a revisão, vide Model et al., 1988). Partículas de fagofilamentoso aparecem como estruturas tubulares finas, de 900 nm decomprimento e 10 nm de espessura, contendo um genoma de DNA defilamento único circular (o filamento +). O ciclo de vida do fago acarreta aligação do fago ao pilo F da bactéria, seguido pela entrada do gnoma de DNAde filamento único no hospedeiro. DNA de filamento único circular éreconhecido pela maquinaria de replicação do hospedeiro e a síntese dosegundo filamento de DNA complementar é iniciada na estrutura ori(-) dofago. A forma replicante do DNA de filamento duplo é o gabarito para asíntese de genomas de fago circular de DNA de filamento único, que sãoiniciados na estrutura ori (+). Estes são finalmente compactados sob a formade vírions e as partículas de fago são extrusadas a partir da bactéria semcausar Iise ou dano aparente ao hospedeiro.

Os sistemas de exibição de peptídeo exploraram duas proteínasestruturais do fago; a proteína pIII (p3) e a proteína pVIII. A proteína pIIIexiste em 5 cópias por fago e é encontrada exclusivamente em uma ponta dovírion (Goldsmith et al., 1977). O domínio N-terminal da proteína ρ- III formauma estrutura tipo botão, que é requerida para o processo de infecção (Gray etal., 1981). Isto possibilita a adsorção do fago para a ponta do pilo F e,subseqüentemente, a penetração e a translocação do DNA do fago defilamento único ao interior da célula hospedeira bacteriana (Holliger et al.,1997). A proteína pIII pode tolerar modificações extensas e, deste modo, temsido usada para expressar peptídeos e seu término N. Os peptídeos estranhospossuem até 65 resíduos de aminoácido de comprimento (Bluthner et al.,1996; Kay et al., 1993) e, em alguns casos, até mesmo tão grandes quanto asproteínas de comprimento total (McCafferty et al., 1990; McCafferty et al.,1992) sem afetar, de um modo acentuado, a função de pIII.O envelope de proteína cilíndrico, que circunda o DNA dofago de filamento único, é composto de 2700 cópias da proteína derevestimento principal, pVIII, uma subunidade a- helicoidal, que consiste de50 resíduos de aminoácido. As proteínas pVIII, em si mesmas, são dispostasem um padrão helicoidal, com a hélice α da proteína orientada em um ângulopouco profundo para o eixo longo do vírion (Marvin et al., 1994). A estruturaprimária desta proteína contém três domínios separados: (1) a parte N-terminal, enriquecida com aminoácidos ácidos e exposta ao ambiente externo;(2) um domínio hidrofóbico central responsável por: (i) subunidade:interações de subunidade na partícula do fago e (ii) funções datransmembrana no células hospedeira; e (3) o terceiro domínio contendoaminoácidos básicos, aglomerados no término C, que é enterrado no interiordo fago e está associado com o DNA do fago. O pVIII é sintetizado comouma proteína de pré- revestimento contendo um peptídeo líder de 23aminoácidos, que é clivado mediante translocação através da membranainterna da bactéria, de modo a fornecer a proteína da transmembrana de 50resíduos madura (Sugimoto et al., 1977). O uso de ρ VIII como um tablado deexibição é impedido pelo fato de que ele não pode tolerar a adição depeptídeos em mais do que 6 resíduos em seu término N (Greenwood et al.,1991); Iannolo et al., 1995). Inserções maiores interferem com a montagemdo fago. A introdução de peptídeos maiores, no entanto, é possível emsistemas em que fagos mosaicos são produzidos através da mistura in vivo dasproteína pVIII contendo peptídeo, recombinantes, com o tipo selvagem pVIII(Felici et al., 1991; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993). Istopossibilita a incorporação das proteínas pVIII quiméricas em baixa densidade(dezenas a centenas de cópias por partícula) sobre a superfície do fago,entremeadas com proteínas de revestimento do tipo selvagem, durante amontagem das partículas de fago. Dois sistemas foram usados para permitir ageração de fagos mosaicos; o "tipo 8 + 8" e o "tipo 88", conforme designadospor Smith (Smith, 1993).

O sistema "tipo 8 + 8" é baseado em que existam dois genespVIII situados separadamente em duas diferentes unidades genéticas (Felici etal., 1991; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993). O gene pVIIIrecombinante está localizado em um fagemídeo, um plasmídeo que contém,em adição à sua própria origem de replicação, as origens de replicação dofago e o sinal de compactação. A proteína pVIII do tipo selvagem é supridapela superinfecção de bactérias que abrigam fagemídeo com um fagoauxiliador. Em adição, o fago auxiliador provê a replicação do fago e amaquinaria de montagem que compacta tanto o fagemídeo, como os genomasauxiliares, sob a forma de vírions. Portanto, dois tipos de partículas sãosecretados por tais bactérias, o auxiliador e o fagemídeo, ambas as quaisincorporam uma mistura de proteínas pVIII do tipo selvagem e recombinante.

O sistema "tipo 88" é beneficiado por conter os dois genespVIII em um e mesmo genoma de fago infeccioso. Deste modo, isto elimina anecessidade quando a um fago auxiliador e quanto à superinfecção. Alémdisso, apenas um tipo de fago mosaico é produzido.

O genoma do fago codifica 10 proteínas (pi a pX), todas asquais são essenciais para a produção da progenia infecciosa (Felici et al.,1991). Os genes para as proteínas são organizados em duas unidadestranscricionais intimamente compactadas, separadas por duas regiões de não-codificação (Van Wezenbeek et al., 1980). Uma região de não- codificação,denominada a "região intergênica "(definida como situada entre os genes pIVe pll) contém as origens (+) e (-) da replicação do DNA e o sinal decompactação do fago, que possibilita a iniciação da formação de capsídeo.Partes desta região intergênica são dispensáveis (Kim et al., 1981; Dotto et al.,1984). Além disso, foi verificado que esta região era capaz de tolerar ainserção de DNAs estranhos em vários sítios (Messing, 1983; Moses et al.,1980; Zacher e t al., 1980). A segunda região de não- codificação do fago estálocalizada entre os genes PVIII e pIII, e foi também usada para incorporar osgenes recombinantes estranhos, tal como ilustrado por Pluckthun (Krebber etal., 1995).

Imunização com Exibição de Fago:

Peptídeos sintéticos pequenos, que consistem de epítopos são,de um modo geral, antígenos fracos, que requerem a síntese química de umpeptídeo e precisam ser acoplados a um veículo grande, mas mesmo nestecaso eles podem induzir uma resposta imune com baixa afinidade. Umprocedimento de imunização para a criação de anticorpos anti- ΑβΡ, queutilizam como antígeno os fagos filamentosos que exibem apenas o peptídeoEFRH, foi desenvolvido nos laboratórios dos presentes inventores (Frenkel etal., 2000 e 2001). Os bacteriófagos filamentosos tem sido usados, de ummodo extensivo, em anos recentes, para a "exibição" sobre a sua superfície degrandes repertórios de peptídeos gerados pela clonagem de oligonucleotídeosaleatórios na terminação 5' dos genes que codificam para a proteína derevestimento do fago (Scott and Smith, 1990; Scott, 1992). Como relatadorecentemente, os bacteriófagos filamentosos são excelentes veículos para aexpressão e a apresentação de peptídeos estranhos em uma variedade deprodutos biológicos (Greenwood et al., 1993; Medynski, 1994). Aadministração de fagos filamentosos induz uma resposta imunológica fortepara os sistemas que produzem fago (Willis et al., 1993; Meola et al., 1995).As proteínas de revestimento de fago pIII e pVIII acima discutidas sãoproteínas que foram freqüentemente usadas para a exibição do fago.

Devido à sua estrutura linear, o fago filamentoso possui umaalta permeabilidade a diferentes tipos de membranas (Scott et al., 1990, eseguindo o trato olfativo, ele alcança a área do hipocampo através do sistemalímbico, de modo a objetivar os sítios afetados. O tratamento do fagofilamentoso com clorofórmio altera a estrutura linear para uma estruturacircular, que evita com que o fago seja fornecido ao cérebro.Engenharia de Anticorpo

Métodos de engenharia de anticorpo foram aplicados de modoa minimizar o tamanho dos mAbs (135- 900 kDa), o mesmo tempo em que asua atividade biológica é mantida (Winter et al., 1994). Estas tecnologias e aaplicação de tecnologia de PCR para criar repertórios de gene de anticorpograndes tornam a exibição do fago de anticorpo uma ferramenta versátil parao isolamento e a caracterização de anticorpos de cadeia única Fv (scFv)(Hogenboom et al., 1998). Os scFvs podem ser exibidos sobre a superfície dofago para a manipulação adicional, ou eles podem ser liberados como umfragmento scFv solúvel (—25 kd). O laboratório dos inventores da presenteinvenção produziram através de engenharia genética um scFv que exibepropriedades de antiagregação similares às da molécula IgM de origem(Frenkel et al., 2000a). Para a construção de scFv, os genes do anticorpo dohibridoma IgM 508 anti- ΑβΡ foram clonados. O anticorpo secretadodemonstrou atividade específica contra a molécula ΑβΡ na prevenção de seusefeitos tóxicos sobre as células PC 12 cultivadas. Os anticorpos Fv de cadeiaúnica dirigidos ao sítio são o primeiro estágio em direção a anticorposterapêuticos objetivados ao interior do cérebro, através de abordagensintracelulares ou extracelulares.

Proteína A:

A proteína A de Staphylococcus aureus é um constituinte deparede celular caracterizado por sua afinidade para a porção Fc deimunoglobulinas, em especial a classe IgG (Goding, 1978). Ela liga osanticorpos IgG a humanos, camundongos, porcos, porquinhos da guiné ecoelhos. Em camundongos, a proteína A se liga anticorpos IgG2a a IgG2bcom alta afinidade, mas se liga menos bem os anticorpos IgGl a IgG3(Goudawaard et al., 1978). A proteína A é uma proteína de 42 Kda, quepossui quatro domínios repetitivos, ricos em ácidos aspárticos e glutâmicos,mas isenta de cisteínas. O Domínio de ligação IgG (domínio B) consiste detrês alfa- hélices antiparalelas, a terceira das quais sendo rompida quando aproteína é complexada com Fc (Graille et al., 2000).

Doenças formadoras de placa:

As doenças formadoras de placa são caracterizadas pelapresença de depósitos da placa amilóide no cérebro, assim como peladegeneração neuronal. Os depósitos amilóides são formados pelo peptídeoagregado em uma massa insolúvel. A natureza do peptídeo varia emdiferentes doenças mas, na maior parte dos casos, o agregado possui umaestrutura em folha beta -pregueada e é manchado com o corante Congo Red.

Em adição ao mal de Alzheimer (AD), que inclui o início precoce do mal deAlzheimer, o início tardio do mal de Alzheimer, e o mal de Alzheimer pré -sintomático, outra doenças caracterizadas pelo depósitos amilóides são, porexemplo, a amiloidose SAA, a síndrome Icelândica hereditária, o mielomamúltiplo, e as doenças de prion. A maioria das doenças de prion usuais emanimais são a scrapie de ovelhas e cabras e a encefalopatia espongiformebovina (BSE) de gado (Wilesmith and Wells, 1991). Quatro doenças de prionforam identificadas em humanos: (I) kuru, (ii) Doença de Creutzfeldt - Jakob(CJD), (iii) Doença de Gerstmann- Streussler - Sheinkler (GSS), e (iv) insôniafamiliar fatal (FFI) (Gajdusek, 1977; e Tritschlet et al., 1992).

As doenças de prion envolvem a conversão da proteína deprion celular normal (PrPC) à forma de scrapie correspondente (PrPSc) Asmedições espectroscópicas demonstram que a conversão de PrPC à isoformade scrapie (PrPSc) envolve uma transição conformacional principal, queimplica em que as doenças de prion, tal como outras doençasamiloidogênicas, são distúrbios de conformação de proteína. A transição dePrPC para PrPSc é acompanhada por um decréscimo na estrutura secundáriaa- helicoidal (de 42% a 30%) e por um aumento notável no conteúdo da folhaβ (de 3% a 43%) (Caughey et al., 1991; e Pan et al., 1993). Este rearranjo estáassociado com propriedades fisioquímicas anormais, que incluem ainsolubilidade em detergentes não- desnaturantes e a resistência parcial àproteólise. Estudos prévios demonstraram que um peptídeo sintético,homólogo com os resíduos 106- 126 do PrP humano (PrP106 - 126) exibealgumas propriedades patogênicas e fisioquímicas de PrPSc (Selvaggini et al.,1993; Taglaivini et al., 1993; e Forloni et al., 1993). O peptídeo apresenta umpolimorfismo conformacional notável, que adquire diferentes estruturassecundárias em várias modalidades (De Gioia et al., 1994). Ele tende a adotaruma conformação de folha β em soluções tamponadas, e é agregado nasfibrilas amilóides, que são parcialmente resistentes à digestão com protease.Estudos cristalográficos de raio X de um complexo do anticorpo 3F4 e de seuepítopo de peptídeo (PrP 104- 113) forneceram uma perspectiva estruturaldesta região flexível, que é tida como sendo um componente do rearranjoconformacional, essencial ao desenvolvimento da doença de prion (Kanyo etal., 1999).

O mal de Alzheimer (AD) é uma doença progressiva, queresulta na demência senil. Considerando de um modo amplo, a doença recaiem duas categorias: início tardio, que ocorre em idade avançada (de um modotípico acima de 65 anos) e início precoce, em cujo caso se desenvolve bemantes do período senil, por exemplo, entre 35 e 60 anos. Em ambos os tipos dadoença, a patologia é similar, mas as anormalidades tendem a ser mais severase difundidas nos casos em que o início ocorre em uma idade precoce. Adoença é caracterizada por dois tipos de lesões no cérebro, placas senis efeixes neurofibrilares. As placas senis são áreas de neutrófilos desorganizadosde até 150 mm, com depósitos amilóides extracelulares no centro, visíveisatravés de análise microscópica de seções do tecido cerebral. Os feixesneurofibrilares são depósitos intracelulares da proteína tau, que consiste dedois filamentos torcidos um sobre o outro, em pares.

O principal constituinte das placas senis é um peptídeodenominado amilóide beta (Αβ) ou um peptídeo beta-amilóide (βΑΡ ou βΑ).O peptídeo beta amilóide é um fragmento interno de 39- 43 aminoácidos deuma proteína precursora, denominada a proteína precursora amilóide (APP).Várias mutações no interior da proteína APP tem sido correlacionados com apresença do mal de Alzheimer (Goate et al., 1991), valina717 para isoleucina;Chartier Harlan et al., fenilalanina; Mullan et al., (1992), uma mutação dupla,que altera lisina 595 -metionina596 para asparagina595- leucina596).

Tais mutações são tidas como causando o mal de Alzheimeratravés do processamento aumentado ou alterado de APP para beta-amilóide,de um modo particular através do processamento de APP para quantidadesaumentadas da forma longa do beta-amilóide (isto é, Αβ1-42 e Αβ1-43). Asmutações em outros genes, tais que os genes pressenilina, PSl e PS2, sãotidos como afetando indiretamente o processamento de APP, de modo a gerarquantidades aumentadas da forma beta-amilóide longa (vide Hardy, TINS 20,154, 1997). Estas observações indicam que o beta amilóide e, de modoparticular a sua forma longa, constituem um elemento de causa no mal deAlzheimer.

Publicações sobre as fibras amilóides indicam que as folhas βcilíndricas são a única estrutura consistente com alguns dos dados de raio χ ede microscopia eletrônica, e as fibras dos fragmentos Αβ de Alzheimer evariantes são constituídas, de um modo provável, de duas ou três folhas βcilíndricas (Perutz et al., 2002). O peptídeo Αβ completo contém 42 resíduos,justo o número correto para nuclear um invólucro cilíndrico; esta descoberta eas muitas possíveis interações eletrostáticas fortes nas folhas β, produzidas apartir do peptídeo Αβ na ausência de prolinas, são responsáveis pelapropensão do peptídeo Αβ para formar as placas amilóides extracelulares,encontradas no caso de pacientes com mal de Alzheimer. Se esta interpretaçãoestiver correta, o amilóide consistirá de tubos estreitos (nanotubos) com umacavidade preenchida com água central. A reversibilidade do crescimento daplaca amilóide in vitro sugere o equilíbrio de estado estável entre βΑ emplacas e em solução (Maggio e Mantyh, 1996). A dependência dapolimerização de βΑ sobre interações de peptídeo - peptídeo para formar umafibrila de folha com prega β, e a influência estimulatória de outras proteínassobre a reação, sugere que a formação amilóide pode ser submetida àmodulação. Muitas tentativas foram efetuadas para encontrar substânciascapazes de interferir com a formação amilóide. Dentre os compostos maisinvestigados estão os anticorpos, peptídeos compostos de aminoácidos querompem beta, tais que prolina, a adição de grupos carregados ao motivo dereconhecimento e o uso de aminoácidos N-metilados como blocos deconstrução (revisto por Gazit, 2002).

Foram propostos métodos para a prevenção ou o tratamento dedoenças caracterizadas pela agregação amilóide em um paciente, que causamcom que os anticorpos contra um componente de peptídeo de um compostoamilóide entre em contato com o amilóide agregado ou solúvel. Vide WO 99/27944 de Schenk e Patente US 5.688. 651 de Solomon, cujos conteúdos decada uma são incorporados a este, a título referencial. Pode ser causado comque os anticorpos entrem em contato com o amilóide solúvel ou agregadoatravés de vacinação ativa ou passiva. Na vacinação ativa, um peptídeo, quepode ser um peptídeo amilóide inteiro ou uma porção do mesmo, éadministrado de modo a desenvolver anticorpos in vivo, cujos anticorpos irãose ligar ao amilóide solúvel e/ ou agregado. A vacinação passiva envolve aadministração de anticorpos específicos para o peptídeo amilóide, de ummodo direto. Estes procedimentos são usados, de um modo preferido, para otratamento do mal de Alzheimer, através da diminuição da placa amilóide oudo retardamento da taxa de deposição de uma tal placa.

Foi relatado que os ensaios clínicos de uma vacina de modo atestar um tal processo foram empreendidos por Elan Corporation e Wyeth-Ayerst Laboratories. O composto sendo testado foi AN-1792. Este produto foirelatado como sendo uma forma de β-amilóide 42.A citação de qualquer documento neste não tem a intenção deadmitir que um tal documento pertence à arte antecedente, ou que o materialseja considerado para a patenteabilidade e qualquer reivindicação do presentepedido. Qualquer menção quanto ao conteúdo ou data de qualquer documentoé baseado na informação disponível para o requerente no momento dodepósito e não constitui uma admissão quanto à correção de uma tal menção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê um veículo de exibição de fago,contendo um bacteriófago filamentoso, que exibe sobre a sua superfície aproteína A, ou um fragmento ou variante do mesmo, capaz de se ligar àporção Fc de anticorpos, como uma molécula de bacteriófago filamentosonão- nativo, e um anticorpo ou um imunocomplexo antígeno - anticorpo,ligado à proteína A ou fragmento ou variante da mesma, através de sua porçãoFc.

A presente invenção também provê uma composiçãofarmacêutica tendo o veículo de exibição de fago da presente invenção para ouso como um agente terapêutico ou de diagnóstico.

São ainda providos pela presente invenção métodos para otratamento/ inibição ou para o diagnóstico de uma doença cerebral, distúrbioou condição, através da administração intranasal do veículo de exibição defago da presente invenção a um paciente, que esteja em necessidade domesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura IA mostra os iniciadores ProtA- fwd (SEQ ID NO:1) e ProtA- ver (SEQ ID NO: 2), usados para a síntese de PCR de umavariante da proteína A. A Figura IB mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQID NO: 3) da variante da proteína A. A figura 1 C mostra o quadro de leituraaberto de aminoácido da variante da proteína A (SEQ ID NO: 4).

A Figura 2 é um gráfico, que mostra que o fago- proteína A seliga anticorpos do tipo IgGl (196, 10D5, 6C6 e 2H3). Ele também se liga aIgG2a (3D6) e, de um modo fraco a IgG2b (12B4).

A Figura 3 é um gráfico, que mostra que anticorpos ligadospor fago- ProtA a Αβί- 16 não se destacaram a partir da proteína A, uma vezligados a Αβί-16.

A Figura 4 é um gráfico, que exibe a titulação de ligação dofago- ProtAl a mAbl96;

As Figuras 5A e 5B são gráficos, que apresentam a titulaçãodo fago com duas concentrações separadas do anticorpo 2H3.

A Figura 6 consiste em um gráfico que mostra os resultados deELISA para verificar a dissociação da proteína A, a partir do anticorpo 196,seguindo-se à precipitação de PEG. Os tratamentos foram: 1, Fago- ProteínaA combinado com 5 μg de 196 e PEG precipitado; 2, o mesmo que em 1, sema precipitação de PEG; 3, apenas o anticorpo 106- PEG precipitado; 4, comoem 3, mas sem a precipitação de PEG; 4, Fago- proteína A apenas, semanticorpo e sem a precipitação de PEG.

As Figuras 7A e 7B consistem em gráficos, que mostram aligação dos imunocomplexos fago- PrtA- anti-insulina a insulina (Fig. 7A) e aligação do fago- PrtA-insulina- anti-insulina, detectados com anticorpos anti-camundongo de cabra (Fig. 7B).

A Figura 8 consiste em um gráfico, que compara os níveis deΑβί- 42 solúvel e insolúvel de Αβί- 40 em camundongos tratados com oscomplexos de fago e camundongos não- tratados de controle.

As Figuras 9A e 9B mostram gráficos, que apresentam osníveis de Αβί- 42 solúvel e insolúvel em camundongos PDAPP, tratados como complexo fago-196, comparados a camundongos de controle não- tratados.

As Figuras 1OA e 1OB consistem em gráficos, que mostram osníveis de citoquina de ELl β e ILlO em camundongos tratados com complexoe em camundongos de controle não- transgênicos e transgênicos.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Bacteriófagos filamentosos possuem uma estrutura linear, quepossibilita com que estes penetrem no cérebro, quando aplicados através devia intranasal. Como eles podem ser engenheirados de modo a apresentarproteínas ou peptídeos variados sobre as suas proteínas de revestimento, elespodem ser usados de modo a fornecer anticorpos ou moléculas (sob a formade um imunocomplexo com os seus anticorpos específicos) ao interior docérebro do paciente mamífero. A P3 é uma proteína estrutural, que conjugauma das pontas do revestimento do fago, através da qual o fago invade asbactérias Escherichia coli.

Um aspecto da presente invenção está dirigido a um veículo deexibição do fago, que inclui um bacteriófago filamentoso, que exibe sobre asua superfície, como uma molécula de bacteriófago filamentoso não- nativo, aproteína A ou um fragmento ou variante da mesma, capaz de ligação à porçãoFc de anticorpos, e que inclui ainda um anticorpo ou um imunocomplexoantígeno - anticorpo, ligado à proteína A ou a um fragmento ou variante damesma, através de sua porção Fe. Em uma modalidade preferida, obacteriófago filamentoso não está também conjugado através de um agente deligação ou diretamente a uma droga e o anticorpo ou o imunocomplexoantígeno - anticorpo não está também imobilizado sobre um veículo sólido.Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo ligado à proteína A ou a umfragmento ou variante da mesma, exibido sobre o bacteriófago filamentoso, éespecífico para uma molécula, que não é apresentada como um alvo sobreuma superfície celular e o anticorpo não está imobilizado sobre um veículosólido.

No laboratório dos presentes inventores, os fagos filamentososMl3, fl, e fd, que são bem entendidos tanto nos níveis estruturais e genéticos(Greenwood et al., 1991) foram usados. Este laboratório demonstrouprimeiramente que o bacteriófago filamentoso exibe propriedades depenetração ao sistema nervoso central, ao mesmo tempo em que preservatanto as propriedades inertes do vetor, como a capacidade de portar moléculasestranhas (Frenkel and Solomon, 2002).

Bacteriófagos filamentosos são um grupo de vírusestruturalmente relacionados, que contêm um genoma de DNA de filamentoúnico circular. Eles não exterminam o seu hospedeiro durante a infecçãoprodutiva. Os fagos que infectam Escherichia coli contendo os plasmídeos Fsão referidos, de um como coletivo, como a bacteriófagos Ff. Eles nãoinfectam as células de mamíferos.

Os bacteriófagos filamentosos são hastes flexíveis de acerca de1 a 2 mícrons de comprimento e 6 nm de diâmetro, com um invólucrohelicoidal de subunidades de proteína que circundam um núcleo de DNA. Asduas proteínas de revestimento principais, a proteína pIII e a proteína derevestimento pVIII principal, diferem no número de cópias da proteínaexibida. Embora pIII seja apresentado em 4-5 cópias, pVIII é encontrado em~ 3000 cópias. A subunidade de proteína de revestimento pVIII principal deaproximadamente 50 resíduos em amplamente alfa- helicoidal e o eixo daalfa- hélice perfaz um ângulo pequeno com o eixo do vírion. O invólucro daproteína pode ser considerado em três seções: a superfície externa, ocupadapela região N-terminal da subunidade, rica em resíduos ácidos que interagemcom o solvente circundante e proporcionam ao vírion um baixo pontoisoelétrico; o interior do invólucro, que inclui uma extensão de 19 resíduos decadeias laterais polares, em que as subunidades de proteína interagemprincipalmente uma com a outra; e a superfície interna, ocupada pela regiãoC-terminal da subunidade, rica em resíduos básicos, que interagem com onúcleo do DNA. O fato de que, virtualmente, todas as interações de cadeialateral de proteína estejam entre subunidades diferentes no conjunto deproteína de revestimento, preferivelmente do que no interior de subunidades,torna este um sistema e modelo útil para estudos de interações entresubunidades alfa- helicoidais em um conjunto macromolecular. A estruturaúnica do bacteriófago filamentoso possibilita a sua penetração do interior docérebro, embora ele possua uma massa de aproximadamente 16,3 MD e podecontribuir para a sua capacidade para interferir com a fibrilização de βΑ, poisa estrutura do fago se assemelha a uma fibrila amilóide em si mesma.

O bacteriófago filamentoso pode ser qualquer bacteriófagofilamentoso, tal que Ml3, fl, ou fd. Embora Ml3 tenha sido usado noExemplo abaixo descrito, é esperado que quaisquer outros bacteriófagosfilamentosos se comportem e funcionem de um modo similar, pois elespossuem uma estrutura similar e os seus genomas apresentam mais do que95% de identidade de genoma.

No veículo de exibição do fago de acordo com a presenteinvenção, a proteína A, ou um fragmento ou variante da mesma, é exibidosobre a superfície do bacteriófago filamentoso. Esta exibição do fago envolvea expressão de um clone de cDNA da proteína A ou um fragmento ou varianteda mesma como uma proteína de fusão com uma proteína de revestimento defago. Deste modo, o genoma de bacteriófago filamentoso é modificadogeneticamente de modo a exibir um peptídeo polipeptídeo não - nativo sobre asua superfície. Bacteriófagos filamentosos, que exibem peptídeos ou proteínasestranhas como uma fusão com uma proteína de revestimento de fago sãobem conhecidos na arte. Uma variedade de fagos e de proteínas derevestimento pode ser usada, incluindo, mas não limitadas a, proteína III deMl3, proteína VIII de Ml3, proteína VI de Ml3, proteína VI de Ml3,proteína IX de Ml3, e proteína de revestimento pIII secundária fd (Saggio etal., 1995; Uppala and Koivunen, 2000). Um grande conjunto de vetores estãodisponíveis (vide Kay et al., 1996; Berdichevsky et al., 1999; e Benhar, 2001).Em uma modalidade preferida, a proteína A ou um fragmento ou variante damesma é exibida através de sua fusão à proteína de revestimento secundária(proteína III) de um fago filamentoso. Métodos para a inserção de seqüênciasde codificação estranhas em um gene de fago são bem conhecidos (vide, porexemplo, Sambrok et al., 1989; e Brent et al., 2003).

A proteína A de Staphilococcus aureus é bem conhecida e éuma proteína bastante suada na arte para a ligação da porção Fc de anticorpos.

Os fragmentos de proteína contendo o(s) domínio(s) de ligação são tambémbastante reconhecidos na arte. Existe também uma riqueza de conhecimentosno que se refere à proteína A com ligação aperfeiçoada (ou ligação diferenciala Fc a partir de diferentes classes e subclasses de Ig) à porção Fc deanticorpos (imunoglobulinas). De um modo preferido, o anticorpo ligado àproteína A ou fragmento ou variante da mesma pertence à classe IgG. Umamodalidade mais preferida de uma variante da proteína A é a variante tendo aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4.

A proteína A ou um fragmento ou variante da mesma, capazde ligar a porção Fc de anticorpos, é exibido sobre a superfície de umbacteriófago filamentoso, de modo a ligar um anticorpo ou umimunocomplexo antígeno - anticorpo, para o fornecimento ao cérebro.

A presente invenção provê um método de inibir ou tratar umadoença, distúrbio ou condição cerebral, através da introdução de um veículode distribuição de fago ao cérebro. Em adição, o presente método provê aindaum método para o diagnóstico de uma doença, distúrbio ou condição cerebral,através da introdução de um veículo de exibição de fago ao cérebro, que podeser detectado, isto é, rotulado. Os presentes métodos envolvem aintrodução/administração, a um paciente, que esteja em necessidade damesma, de uma quantidade eficaz do veículo de exibição de fago da presenteinvenção.

Para os propósitos deste relatório e das reivindicações apensas,os termos "paciente", "sujeito" e "receptor" são usados de um modointercambiável. Eles incluem seres humanos e outros mamíferos, queconstituem o objeto ou de tratamento profilático ou terapêutico, ou dediagnóstico.

Para os propósitos deste relatório e das reivindicações anexas,os termos "peptídeo beta amilóide" é sinônimo de "peptídeo β-amilóide","peptídeo β amilóide", "βΑΡ", "βΑ", e "Αβ". Todos estes termos referem-sea um peptídeo formador de placa, derivado da proteína do precursor amilóide.Em uma modalidade preferida, o anticorpo ligado à proteína A (ou umfragmento ou variante da mesma), exibido sobre a superfície do fago, éespecífico para (se liga especificamente a) um peptídeo β amilóide. Opeptídeo β amilóide é, de modo preferido, Αβί- 42 ou Αβί- 40.

Como aqui usado, "proteína de Prp", "PrP", "prion", refere-sea polipeptídeos, que são capazes, sob condições apropriadas, de induzir aformação de agregados responsáveis por doenças de formação de placa. Porexemplo, a proteína de prion celular normal (PrPC) é convertida, sob taiscondições, à isoforma de sacrapie (PrPSc), que é responsável por doenças deformação de placa, tais que, mas não limitadas a, encefalopatia espongiformebovina (BSE), ou doença da vaca louca, encefalopatia espongiforme felina degatos, kuru, Doença de Creutzfeldt - Jakob (CJD), doença de Gerstmann-Straussler - Scheinker (GSS) e insônia familiar fatal (FFI). Em uma outramodalidade, o anticorpo é específico para o isoforma de PRPSc Patogênica.

O termo "tratar" tem a intenção de significar inibirsubstancialmente, retardar ou reverter a progressão de uma doença, distúrbioou condição, melhorar substancialmente os sintomas clínicos de uma doença,distúrbio ou condição, ou prevenir substancialmente o aparecimento desintomas clínicos de uma doença, distúrbio ou condição.

O veículo de fornecimento do fago e os métodos da presenteinvenção são dirigidos a uma doença, distúrbio ou condição cerebral. De ummodo preferido, a doença, distúrbio ou condição cerebral é uma "doençaformadora de placa".

O termo "doença formadora de placa" refere-se a doençascaracterizadas pela formação de placas através de uma proteína de agregação(peptídeo formador de placa), tal que, mas não limitado a, beta-amilóide,amilóide do soro A, cistatina C, cadeia leve Kapa IgG ou proteína de prion,em doenças tais que, mas não limitadas a, mal de Alzheimer de início precoce(AD), mal de Alzheimer de início tardio, mal de Alzheimer pré- sintomático,amiloidose de SAA, síndrome Icelândica hereditária, senilidade, mielomamúltiplo, e a doenças de prion que são conhecidas como capazes de afetarhumanos, por exemplo, kuru, doença de Creutzfeldt- Jakob (CJD), doença deGerstmann-Straussler- Scheinker (GS S), e insônia familiar fatal (FFI) eanimais, tais como, por exemplo, scrapie e encefalite espongiforme bovina(BSE).

Como a maioria das placas amilóides (também conhecidascomo depósitos amilóides), associadas com as doenças formadoras de placaacima descritas, estão localizadas no interior do cérebro, qualquer modalidadede tratamento proposta precisa demonstrar uma capacidade para cruzar abarreira cerebral sangüínea (BBB), assim como uma capacidade paradissolver as placas amilóides. Normalmente, o tamanho médio das moléculascapazes de penetrar no BBB é de, aproximadamente, 2 kDa.

Um corpo crescente de evidência mostra que os déficitsolfativos e as alterações degenerativas nas vias olfativas centrais são afetados,de um modo precoce, no curso clínico de AD. Além disso, os padrõesanatômicos envolvidos em AD sugerem que o trajeto olfativo pode constituiro estágio inicial no desenvolvimento de AD.

Neurônios receptores olfativos são células bipolares, queresidem no revestimento epitelial da cavidade nasal. Os seus axôniosatravessam a placa cribiforme e são projetados para a primeira sinapse da viaolfativa no bulbo olfativo do cérebro. Os axônios dos neurônios olfativos apartir do epitélio nasal formam feixes de 1000 fibras amielínicas. Estaconfiguração os torna uma via expressa, pela qual vírus de outras substânciastransportadas podem obter acesso ao CNS através da barreira cerebralsangüínea (BBB).

Como previamente mostrado, a administração intranasal(Mathison et al., 1998; Chou et al., 1997; Draghia et al., 1995) possibilita aentrada direta de vírus e macromoléculas ao interior do fluido cerebroespinhal(CSF) ou CNS.

O uso de neurônios receptores olfativos como um ponto dedistribuição de um vetor de adenovírus ao cérebro é relatado na literatura.Este método causa, conforme já relatado, a expressão de um gene repórter nocérebro durante 12 dias, sem toxicidade aparente (Draghia et al., 1995).

A distribuição cerebral direta de anticorpos e imunocomplexosultrapassa o cruzamento da BBB através do uso de neurônios olfativos comoagentes de transporte para o cérebro. No epitélio olfativo, os dendritos dosneurônios olfativos primários estão em contato com o lúmen nasal, e atravésdos axônios, estes neurônios são também conectados aos bulbos olfativos docérebro. Os fagos que entram em contato com o epitélio olfativo podem serabsorvidos nos neurônios olfativos primários e podem ser transportados aosbulbos olfativos, e ainda mais adiante, ao interior de outras áreas do cérebro.

Estão também incluídos nas doenças, distúrbios ou condiçõescerebrais tratadas/ inibidas ou diagnosticadas de acordo com a presenteinvenção os tumores cerebrais e as doenças, distúrbios ou condiçõesinflamatórias cerebrais. A inflamação do cérebro causa a inibição daneurogênese, tanto na formação contínua basal de novos neurônios naformação hipocampal intacta e na neurogênese aumentada, em resposta a umainjúria cerebral. O dano da neurogênese depende do grau de ativação demicroglia, independentemente de se existe dano, ou não, no tecidocircundante. A inflamação cerebral desempenha, de um modo preferido, umafunção importante na patogênese de outros distúrbios neurodegenerativoscrônicos, além de AD, que envolvem efeitos patológicos de ΑβΡ, tais que omal de Parkinson, Demência do Corpo de Lewy, Complexo de AIDSDemência, injúria cerebral traumática, glaucoma, etc.

A injúria cerebral traumática (TBI) inclui uma deposição β-amilóide e o início precoce da demência. A despeito de tais descrições, poucoé conhecido acerca dos mecanismos, através dos quais estas alteraçõesocorrem. Uma fonte proposta para a geração do peptídeo β-amilóide em TBIé a clivagem proteolítica anormal da proteína precursora β-amilóide (APP),que foi demonstrada como sendo acumulada em sítios de transporteaxoplásmico prejudicado no interior de axônios injuriados de um modotraumático. De fato, a imunorreatividade de βΑ foi recentemente verificadano caso de axônios inflamados em um modelo de porco de TBI (Smith et al.,1999) sugerindo que o acúmulo de APP em axônios injuriados de um modotraumático pode constituir uma fonte para a formação do peptídeo β-amilóideem TBI.

Exemplos não- limitativos de doenças e distúrbiosneurodegenerativos incluem o mal de Alzheimer (AD), mal de Parkinson,Demência de Corpo de Lewy, Complexo de AIDS Demência, derrame, einjúrias de cabeça fechadas e injúria cerebral traumática, tais que feridas derevólver, derrame hemorrágico, derrame isquêmico, isquemia cerebral, danoscausados por agentes de danificação de nervo, tais que toxinas, venenos,agentes químicos (biowarfare) ou danos causados através de cirurgias, taisque a excisão de tumor.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo ligado à proteína Aexibida no fago (ou fragmento ou variante da mesma) é um anticorpomonoclonal específico para uma molécula alvo, associada com uma doença,distúrbio ou condição cerebral, tal que um peptídeo β Amilóide e PrPSc. Oanticorpo pode ser também um anticorpo contra citoquinas inflamatórias nocérebro, tais que TNFa, IL6, etc., de modo a inibir / tratar a inflamaçãocerebral como um resultado de derrame, injúria cerebral ou outra doença oudistúrbio neurodegenerativo. No caso do método para o diagnóstico de umtumor cerebral, tal que a doença, distúrbio ou condição cerebral, o anticorpo éespecífico para uma molécula objetivada, característica do tumor cerebral, ecuja presença consiste em diagnóstico para o tumor cerebral particular.

De um modo alternativo, o veículo de distribuição do fago,que exibe a proteína A (ou um fragmento ou variante da mesma) ligado a umimunocomplexo de antígeno - anticorpo através da porção Fc do anticorpo,pode ser usado para fornecer o imunocomplexo ao cérebro. O antígeno ligadopelo anticorpo no imunocomplexo é uma molécula, que pode tratar umadoença, distúrbio ou condição cerebral. Exemplos não - limitativos doantígeno ligado pelo anticorpo incluem insulina, eritropoietina (EPO), quepode diminuir a injúria neuronal e a morte celular, interferona e outrascitoquinas antiinflamatórias, tais que ILlO e moléculas protetoras neuronais,que não passam a través da barreira cerebral sangüínea.

O método para o diagnóstico de uma doença, distúrbio oucondição cerebral, de acordo com a presente invenção, envolve aadministração intranasal do veículo de exibição de fago da presente invençãoa um paciente que esteja em necessidade do mesmo. Quando o veículo deexibição de fago com o seu componente de anticorpo é ligado a uma moléculaalvo, associada com uma doença, distúrbio ou condição cerebral, a presençada doença, distúrbio ou condição cerebral é então detectada. O anticorpoligado à proteína A (ou fragmento ou variante da mesma capaz de ligação àporção Fc de um anticorpo) exibido sobre a superfície do bacteriófagofilamentoso pode ser rotulado de um modo detectável.

Os anticorpos, que são rotulados, são preferivelmenteradiorrotulados para o uso em terapia contra tumores cerebrais ou emdiagnóstico através de radioimagem. Exemplos não- limitativos deradionucleotídeos para a rotação incluem 111In, 125I, 131I e "mTc. Osanticorpos radiorrotulados, que são, de um modo preferido, anticorposradioiodados, são preparados através de métodos convencionais para aradiorrotulação de peptídeos e proteínas e então ligados à proteína A (ou umfragmento ou variante da mesma) exibido sobre a superfície do bacteriófagofilamentoso.

Outros rótulos detectáveis adequados incluem agentes decontraste, tais que gadolínio (Gd), que é um reagente preferido para o MRIdinâmico aumentado, e compostos orgânicos ou inorgânicos de um elementopesado (por exemplo, Pt, Au e TI).

Uma preparação farmacêutica de acordo com a presenteinvenção inclui, como um ingrediente ativo, um veículo de exibição de fagoda presente invenção. A preparação farmacêutica pode também ser umamistura de veículos de exibição de fago de diferentes bacteriófagosfilamentosos.

A preparação de acordo com a presente invenção pode seradministrada a um organismo per se, ou em uma composição farmacêutica,em que ela é misturada com veículos ou excipientes adequados.

Como aqui usado, uma "composição farmacêutica "refere-se àpreparação de um ou mais dos ingredientes ativos aqui descritos com outroscomponentes químicos, tais que veículos ou excipientes fisiologicamenteadequados. O propósito de uma composição farmacêutica é o de facilitar aadministração de um composto a um organismo.

O termo "ingrediente ativo" refere-se à preparação, à qual oefeito biológico pode ser atribuído., No contexto de uma composiçãofarmacêutica para o uso em uma aplicação de diagnóstico, o termo"ingrediente ativo "tem a intenção de constituir o anticorpo que objetiva umamolécula associada com uma doença, distúrbio ou condição cerebral.

A seguir, as frases "carreador fisiologicamente aceitável" e"carreador farmaceuticamente aceitável ", que podem ser usados de um modointercambiável, referem-se a um carreador ou diluente, que não causa irritaçãoa um organismo e não diminui a atividade biológica e as propriedades docomposto administrado.

O termo "excipiente" refere-se a uma substância inerte,adicionada a uma composição farmacêutica de modo a facilitar, ainda mais, aadministração do ingrediente ativo, exemplos não- limitativos de excipientesincluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos deamido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis.

Técnicas para a formulação e a administração de drogaspodem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", MackPublishing Co., Easton, PA, última edição, que é incorporada a este a títuloreferencial.

As composições farmacêuticas da presente invenção podemser manufaturadas através de processos bem conhecidos na arte, por exemplo,por meio de mistura convencional, dissolução, granulação, produção dedrágeas, pulverização, emulsificação, encapsulação, colocação em redes ousacos, ou processos de liofilização.

As composições farmacêuticas para o uso de acordo com apresente invenção podem, deste modo, ser formuladas de um modoconvencional, usando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis, quecompreendem excipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dosingredientes ativos sob a forma de preparações que podem ser usadasfarmaceuticamente.

Para a administração através de inalação nasal, os ingredientesativos para o uso de acordo com a presente invenção são fornecidos, de ummodo conveniente, sob a forma de uma apresentação de pulverização emaerossol, a partir de uma embalagem pressurizada ou de um nebulizador, como uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorofluorometano,triclorofluorometano, dicloro- tetrafluoroetano ou dióxido de carbono. Umpulverizador nasal, que não requer uma embalagem pressurizada ou umnebulizador como um pulverizador por inalação, pode ser usado, de um modoalternativo, para a administração intranasal. No caso de um aerossolpressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada através doprovimento de um válvula para fornecer uma quantidade dosada. Cápsulas ecartuchos de, por exemplo, gelatina, para o uso em um distribuidor, podem serformuladas contendo uma mistura de pó do composto e uma base de póadequada, tal que lactose ou amido.

Composições farmacêuticas, adequadas para o uso no contextoda presente invenção, incluem composições, em que os ingredientes ativosestão contidos em uma quantidade eficaz para que seja alcançado o propósitointencionado. De um modo mais específico, uma quantidade terapeuticamenteeficaz significa uma quantidade de ingredientes ativos eficaz para evitardiminuir ou melhorar os sintomas de uma doença, distúrbio ou condição, ouprolongar a sobrevivência do paciente sendo tratado.

A determinação de uma quantidade eficaz para a terapia ou odiagnóstico está bem dentro da capacidade daqueles versados na arte, emespecial à luz da exposição detalhada aqui provida.

A quantidade e o intervalo de dosagem podem ser ajustados deum modo individual para prover os níveis cerebrais do veículo de exibição defago, que sejam suficientes para tratar ou diagnosticar uma doença, distúrbioou condição cerebral particular (concentração eficaz mínima, MEC). A MECirá variar para cada preparação, mas pode ser estimada a partir de dados invitro. As dosagens necessárias para que a MEC seja alcançada irão dependerdas características individuais.

Os intervalos de dosagem podem ser também determinadosusando o valor da MEC. As preparações devem ser administradas usando umregime, que mantenha os níveis cerebrais acima da MEC durante 10- 90% dotempo, de modo preferido entre 30- 90% e de modo mais preferido de 50-90%.Dependendo da severidade e da resposta da condição a sertratada, a dosagem pode ser única ou uma pluralidade de administrações, como curso do tratamento durando de vários dias a várias semanas, ou até que sejaefetuada a cura, ou até que seja alcançada uma diminuição do estado dedoença.

A quantidade de uma composição a ser administrada irá,naturalmente, depender do paciente sendo tratado ou diagnosticado, daseveridade da aflição, do julgamento do médico clínico, etc.

As composições da presente invenção podem, se desejado, serapresentadas em uma embalagem ou dispositivo distribuidor, tal que um kitaprovado pela FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagemcontendo o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreenderuma folha de plástico ou metálica, tal que uma embalagem em bolha. Aembalagem ou o dispositivo distribuidor pode ser acompanhado porinstruções para a administração. A embalagem ou o dispositivo distribuidorpodem ser também acomodadas com uma nota associada ao recipiente, emuma forma descrita por uma agência governamental, que regule a manufatura,o uso, ou a venda de substâncias farmacêuticas, cuja nota reflita a aprovaçãoda agência quanto à forma das composições ou a administração humana ouveterinária. Uma tal nota, por exemplo, pode ser constituída por um rótulo,aprovado pela US Food and Drug Administration para drogas sob prescriçãoou por uma inserção de aprovação do produto. Composições, quecompreendem uma preparação de acordo com a invenção, formuladas em umveículo farmacêutico compatível, podem ser também preparadas, colocadasem um recipiente adequado, e rotuladas para o tratamento de uma condiçãoindicada, como já detalhado acima.

Tendo agora descrito a invenção de um modo genérico, amesma será prontamente entendida Através de referência ao exemplo que sesegue, que é provido apenas a título ilustrativo, e que não tem a invenção deser limitativo à presente invenção.

EXEMPLO

Fagos filamentosos, que exibem uma variante da proteína Aem P3, foram construídos neste estudo. Trabalhos anteriores utilizaram estaidéia básica, no entanto, de vários modos diferentes: Li et ai. (1998) usaram ofago que exibe o domínio B da proteína A fundida a uma molécula de scFv.Djojonegoro et al. (1994) usou apenas o domínio B para demonstrar que osfagos filamentoso podem ser usados como ferramentas de clonagem. Todosestes estudos prévios utilizaram técnicas de exibição de fago, de modo apossibilitar uma fácil seleção de formas aperfeiçoadas de proteína A exibidasobre fago, através da ligação do domínio de ligação IgG da proteína A aIgGs humanos. Os experimentos abaixo apresentados neste estudodemonstram que fagos que exibem uma variante da proteína A se ligam aanticorpos de camundongos, principalmente do tipo IgGl e seus ligantes.Estes complexos foram administrados através de aplicação intranasal acamundongos hAPP tg. Eles penetraram no cérebro dos camundongos eexerceram efeitos que são discutidos abaixo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Síntese da variante da proteína A

A porção da proteína A, que foi usada, contém os quatrodomínios repetitivos, incluindo o domínio B. Os dois iniciadores foramsintetizados, o primeiro iniciador com um códon ATG e um sítio de restriçãoNcoI, e um iniciador reverso sem um códon de interrupção e com um sítio derestrição NotI (Fig. IA). PCR foi executado usando o protocolo que se segue:2 μg de DNA genômico de Staphylococcus aureus foram combinados com 20μΜ de cada iniciador em 1 χ tampão de polimerase Qiagen Taq. DNTPs (0,2mM), e 2,5 unidades de polimerase foram adicionados a 100 μΐ do volume dereação. As condições de PCR foram: desnaturação inicial de 3 minutos a94°C, seguida por 30 ciclos de 30 segundos de desnaturação a 94°C, 1 minutode recozimento a 55°C e 1 minuto de polimerização a 72°C. O produto dePCR foi digerido com NcoI e NotI, purificado com gel e clonado no vetorpCANTAB 5E, que foi previamente linearizado com NcoI e NOtI. Aclonagem desta porção do gene de proteína A neste vetor gerou uma fusãotranslacional da proteína A com o gene 3 no fago filamentoso (Ml3). Usandofago auxiliar, foram produzidos fagos que exibem a fusão da proteína A-P3,designados por fago ProtA.

ELISA

A ligação da proteína A do fago a diferentes anticorpos IgG foimedida através de ELISA: IO11 fagos que exibiam a proteína A forammisturados com 10 μg (15 nmols) de anticorpo em fosfato de sódio 0,1 M, pHde 8,5. A mistura foi brandamente agitada a 37°C durante 30 minutos, ealíquotas de 50 μΐ foram então adicionadas em quatro réplicas a reservatóriosELISA previamente revestidos com anticorpo anti- fago de coelho ebloqueados com 3% de leite. O anticorpo conjugado anti- camundongo-HRPde cabra foi usado como um anticorpo secundário. A reação de HRP foiexecutada com OPD e peróxido. Os resultados estão ilustrados como OD a492 nm.

A estabilidade de complexos fago- proteína A- anticorpo,seguindo-se à ligação do antígeno, foi verificada através do procedimento quese segue: IO11 fagos, que exibem a proteína A, foram misturados com 10 μg(15 nmols) de anticorpo em fosfato de sódio 0, 1 M, pH de 8,5. A mistura foiagitada brandamente a 37°C durante 30 minutos e o antígeno, (0,32 nmols deAbeta 1-6 biotinilado), em uma razão molar de 50:1, a favor do anticorpo, foientão adicionado à mistura de fago- proteína A e anticorpos, durante umperíodo adicional de 30 minutos. Alíquotas (50 μΐ) foram adicionadas emquatro réplicas a reservatórios ELISA previamente revestidos com anticorpoanti- fago de coelho e bloqueados com 3% de leito. O conjugado Avidina -HRP foi usado para detectar complexos que ligaram a placa ELISA. Apenascomplexos fago- anticorpo, que estavam ainda ligados ao antígeno, poderiamreagir com o conjugado Avidina - HRP. O soro usado nestes experimentos,em uma diluição de 1: 1000, foi extraído a partir de um camundongo comtitulação contra o epítopo ERFH.

Para titular o número de fagos requerido para ligar diferentesquantidades de anticorpos, o anticorpo 196, que demonstrou a melhorcapacidade de ligação à proteína A, foi usado para revestir placas ELISA em3 diferentes concentrações (50, 100 e 250 ng/ reservatório), seguido pelobloqueio dos reservatórios com 3% de leite. Fago - proteína A em diferentesconcentrações (IO9/ ml - 10 12/ ml) foram adicionados e os fagos ligadosforam detectados através de anticorpos anti- fago de coelho e anticorpos anti -coelho - HRP de cabra.

A ligação dos complexos anticorpo - antígeno a fago -ProteínaA foi titulada como se segue: IO9/ ml a IO12/ ml de fagos foram combinadoscom duas concentrações separadas de anticorpo 2H3, 10 ng ou 50 ng, e razõesmolares de 1:2 de anticorpo:antígeno (duas moléculas de antígeno para cadamolécula de anticorpo). As misturas foram agitadas brandamente a 37°Cdurante 30 minutos e então adicionadas a reservatórios ELISA, previamenterevestidos com anticorpos anti- fago de coelho e revestidos com 3% de leiteem PBS. A detecção dos fagos ligados foi executada com o conjugadoAvidina - HRP, que pode ligar apenas os antígenos biotinilados.

Foi também verificado se a precipitação de PEG doscomplexos de fago - proteína A causa a sua dissociação: os reservatóriosELISA foram também revestidos com 20 μg/ ml de avidina durante a noite a40°C e então com 1 μg/ ml de peptídeos 1-16 Αβ biotinilados, durante 30minutos, em temperatura ambiente. Os reservatórios foram bloqueados com3% de leite em PBS. 10 12 fagos foram combinados com 1 μg ou com 5 μg deanticorpo 196 em 1 ml de Na2HP04 e brandamente agitados durante 1 hora a37°C. Metade da mistura foi precipitada usando PEG -NaCl, seguido pelaressuspensão em 500 Ql de Na2HPCU como acima, e a outra metade foi usadasem precipitação. Ambas as misturas foram aplicadas às placa ELISApreviamente descrita (50 ml de mistura / reservatório), durante 1 hora, a 37°C.A detecção dos fagos ligados foi executada com anti- fago de camundongo econjugado anti-camundongo-HRP de cabra.

O fago- proteína A foi também verificado quando à geração decomplexos com IgG anti- insulina. Os fagos- proteína A (IO12/ ml) foramcombinados com diferentes concentrações de anticorpo anti- insulina ebrandamente agitados a 37°C, durante 30 minutos. Os complexos foramprecipitados com PEG antes de serem aplicados a placas ELSIA, que foramrevestidas com 0, 25 mg/ ml de insulina durante a η noite a 4°C. Os fagosligados foram detectados ou com anticorpos anti- fago de camundongo ouanti- camundongo de cabra, ou apenas com anti- camundongo de cabra. Estesegundo método de detecção foi usado para demonstrar que o anticorpo anti-insulina estava, de fato, presente no complexo, junto com fago- proteína A.

Estudos in vivo

A camundongos PDAPP de nove meses de idade foramadministrados os complexos fago- protA (com Ab 196 ou com Ab anti-insulina acrescido de insulina), a cada 2 semanas (4 tratamentos) e então acada mês, durante os próximos 6 tratamentos, durante um total de 10tratamentos. Os complexos foram fornecidos através de aplicação intranasal,20 microlitros divididos pelas duas narinas. No final dos tratamentos, oscamundongos foram eutanizados e sacrificados. O hemisfério cerebralesquerdo de cada camundongo foi congelado em nitrogênio líquido. Cadahemisfério foi homogeneizado e dividido em frações solúveis e insolúveis. Asfrações insolúveis foram posteriormente solubilizadas com guanidina - HCl.Ambas as frações foram mantidas congeladas, até que analisadas. Betaamilóide 1-2 foi executado através de ELISA em sanduíche, usando anticorpode captura e anticorpo de detecção, específico para Αβ 1- 42. A determinaçãodos níveis de citoquina foi executada com kits específicos para cada um deIL1 beta ou IL10 (R & D Systems).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A variante da proteína A foi sintetizada usando os iniciadoresilustrados na Figura IA. O produto de PCR foi seqüenciado de modo averificar a sua integridade e então clonado em pCANTAB5E. Os fagos queexpressam a variante da proteína A fundida a PIII do fago foram produzidos eusados em ELISA.

Fagos que exibem uma variante de proteína A se ligamprincipalmente a anticorpos IgG1

Os fagos protA foram verificados através de ELISA quanto àsua ligação a anticorpos do tipo IgG.

Na figura 2, é apresentada a ligação de IO11 partículas de fagoa 15 nmol de diferentes anticorpos.

Anticorpos ligados por fago- protA não se desconectam dofago após serem ligados a seus antígenos.

Foi verificado se os anticorpos se dissociam, ou não, a partirdo fago seguindo-se à sua ligação a seu antígeno. Como antígeno, umpeptídeo biotinilado dos resíduos de aminoácido 1-16 do término N dopeptídeo β-amilóide foram usados. Os resultados deste experimento sãosumariados na Figura 2. Para este experimento, IO11 fagos, que exibem aproteína A, foram misturados com 10 μg de anticorpo (15 nmols) em fosfatode sódio 0,1 M, pH 8,5. A mistura foi agitada brandamente a 37°C durante 30minutos e então o antígeno (0,32 nmols de Αβ biotinilado 1-16) em uma razãode 50:1, a favor do anticorpo, foram adicionados à mistura de fago- proteínaA e os anticorpos, durante um período adicional de 30 minutos. Os complexosforam adicionados a reservatórios ELISA previamente revestidos comanticorpos anti-fago de coelho e bloqueados com 3% de leite. Avidina - HRPconjugado foi usado para detectar complexos, que se ligaram à placa ELISA.Apenas complexos fago- anticorpo, que estavam ainda conectados após aligação do antígeno, poderiam reagir com o conjugado Avidina - HRP. O sorousado nestes experimentos foi extraído a partir de um camundongo comtitulação contra o epítopo ERFH.

A figura 3 demonstra que, quando anticorpos ligados aproteína A se ligam a um antígeno que eles reconhecem, eles não se destacama partir da proteína A. Complexos de anticorpo- antígeno, que se destacam apartir do fago- ProtA ligado à placa serão enxaguados e não irão reagir comAvidina - HRP. Como mostrado na Figura 2, o fago- ProtA se ligou a 12B4fracamente. Ele não reagiu neste caso porque ele não se liga aos peptídeos 1-16 e foi usado como um controle negativo. Os resultados de ligação nãoforam alterados quando a placa ELISA foi lavada com o tampão PBS em pHde 6,0. O pH inferior não causou a dissociação do complexo anticorpo-antígeno a partir do fago - Prot A.

A titulação da ligação da proteína A a mAb 196.

O número de fagos necessários para ligar diferentesquantidades de anticorpos foi titulado de modo a verificar que a ligação éespecífica. Nesta modalidade, o anticorpo 196, que demonstrou a melhorcapacidade de ligação à proteína A, foi usado para revestir placas ELISA em3 concentrações diferentes, seguido pelo bloqueio dos reservatórios com 3%de leite. Diferentes concentrações de fagos- proteína A foram adicionadas e osfagos ligados foram detectados através de anticorpos anti- fago de coelho(Figura 4). A partir da Figura 4, é evidente que a ligação do fago- proteína Aao anticorpo 196 é específica; ela é aumentada como uma função do númerode fagos e da concentração do anticorpo. Neste ajuste experimental, a ligaçãosaturada não foi observada. De modo a estimar o número de fagos que exibema proteína A, os reservatórios ELISA foram revestidos com concentrações defago elevadas e reagidos com anticorpos anti- fago (não mostrados). Atravésda comparação d e OD em 492 entre esta análise e aquela prévia apresentadana Figura 4, poderia ser determinado que aproximadamente 30% - 36% dosfagos exibissem a proteína A.

De modo a determinar a quantidade de anticorpo requeridapara ligar uma certa quantidade de fagos (que irão também indicar aquantidade de antígeno que será ligada), outro experimento foi executado, noqual números elevados de fagos foram combinados com 2 concentraçõesseparadas de anticorpo (2H3), e razões molares de 1:2 de anticorpo: antígeno(2 moléculas de antígeno para cada molécula de anticorpo) (Figura 5A). Asmisturas foram adicionadas a reservatórios ELISA previamente revestidoscom anticorpos anti-fago de coelho, e revestidos com 3% de leite em PBS. Adetecção dos fagos ligados foi executada com o conjugado Avidina - HRP,que pode apenas ligar os antígenos biotinilados.

Como os valores observados para a ligação a cadaconcentração de anticorpo não diferiram muito entre as diferentesconcentrações de fago, os resultados podem ser também sumariados como"média das médias" e representados graficamente, tal como mostrado naFigura 5 B.

Os resultados demonstram que a concentração de anticorpo é ofator limitativo neste ajuste experimental e não a concentração de fago: em10 ml de fago- proteína A (5 χ 10 fagos / 50 μl usados por reservatórioELISA) existiam moléculas de proteína A suficientes para ligar 50 ng, queconstituem aproximadamente 70 pmol, e que não são suficientes para saturar5 x 10 moléculas de fago-proteína A.

A precipitação de PEG- NaCl não causou a dissociação defago- anticorpo maciça

Foi também verificado se a precipitação de PEG de complexosde fago- proteína A -anticorpo causaram, ou não, a sua dissociação. Osreservatórios ELISA foram revestidos com Avidina e 1 μg / ml de peptídeos1-16 biotinilados. Os reservatórios foram bloqueados com 3% de leite emPBS. 10^12 fagos foram combinados com 1 μ§ ou 5 μg do anticorpo 196 emNa2HPO4 0,1 M e brandamente agitados durante 1 hora, a 37°C. Metade damistura foi precipitada usando PEG- NaCl, seguido pela ressuspensão nomesmo tampão e volume do que antes, e a outra metade foi usada semprecipitação. Ambas as misturas foram aplicadas à placa ELISA previamentedescrita (50 μΐ de mistura / reservatório) durante 1 hora, a 37°C. A detecçãodos fagos ligados foi executada com anti- fago de camundongo e conjugadoanti- camundongo- HRP de cabra. A Figura 6 mostra que as precipitações dePEG causaram com que cerca de 20% dos complexos de fago proteína A-anticorpo fossem dissociados.

O fago proteína A liga o imunocomplexo do anticorpo anti-insulina e insulina.

O fago- proteína A foi combinado com IgG anti- insulina, e oscomplexos foram usados sobre placas ELISA, que foram revestidas com 0,25mg/ ml de insulina. Os complexos foram precipitados com PEG antes deserem aplicados à placa ELISA. Os fagos ligados foram detectados ou com oanti- fago de camundongo e anticorpos anti- camundongo de cabra (Figura7A) ou apenas com anti- camundongo de cabra (Figura 7B). Este segundométodo de detecção foi usado para demonstrar que o anticorpo anti- insulinaestava, de fato, presente no complexo com fago- proteína A.

O fago - proteína A (IO12/ ml) foi combinado com anticorposanti- insulina em diferentes concentrações e agitados brandamente a 37°C,durante 30 minutos. Os complexos foram precipitados por PEG antes deserem aplicados às placas ELISA. Os fagos ligados foram detectados comanti- fago de camundongo, seguido por anticorpos anti- camundongo decabra.

Os resultados de um ensaio similar, tal como mostrado naFigura 7A, mas detectados apenas com anticorpos anti- camundongo de cabra,são apresentados na Figura 7B.Em resumo, foi gerado um fago filamentoso, que exibe umavariante da proteína A, que pode ligar anticorpos do tipo IgG. Em posição àproteína nativa A de Staphylococcus aureus, que se liga fortemente a IgG2a eIgG2b de camundongo, esta proteína recombinante A se liga ainda melhor amoléculas de IgGl de camundongo, que são do tipo mais abundante. Estesfagos podem ser usados, in vitro, para a purificação de anticorpos ou, porexemplo, podem ser usados in vivo para fornecer certos anticorpos ao cérebro.

Estudos in vivo

Fago- protA-196. Os complexos fago- protA-196 foramaplicados a camundongos transgênicos PDAPP, conforme explicado na seçãoMateriais e Métodos neste. Os níveis do peptídeo β-amilóide 1-42 nas fraçõessolúveis e insolúveis (peptídeos agregados e membranas que foramsolubilizadas com guanidina -HC1) e os níveis de Αβ 1-40 nas fraçõesinsolúveis foram verificados. Uma redução aproximada de 20% na quantidadede Αβ 1-41, tanto nas frações solúveis como insolúveis, foi observada noscamundongos tratados, comparados a controles não- tratados transgênicos. Noentanto, os resultados não foram significativos (Figura 8). Em Αβ 1-40, nãofoi observada diferença entre os camundongos tratados com os complexos defago, comparados com os camundongos não- tratados de controle.

Fago- protA- anti- insulina- insulina. Camundongos PDAPPforam tratados com complexos de fago- anticorpo- insulina. Na Figura 9A, foiobservada uma diferença mais dramática no nível de Αβ 1-41- insolúvel, umaredução de cerca de 63% em camundongos tratados com o complexocomparados a camundongos não tratados com Tg ou a camundongos tratadoscom complexos fago- 196. Camundongos tratados com fago apenasapresentaram uma média de 23% de redução nos níveis Αβ 1-42. A reduçãode Αβ 1-42 solúvel nos camundongos tratados foi ainda mais dramática ealcançou a 80%, comparada com os controles (Figura 9B).

Os níveis de ILl β, uma citoquina proinflamatória, e IL10,uma citoquina antiinflamatória, foram verificados. Os níveis de ILl β emcamundongos não- tratados transgênicos foram de cerca de 36% mais altos doque os níveis de LLl β em camundongos não- transgênicos (Figura 10A),significando que a doença causou a inflamação que é manifestada emconcentrações de ILl β mais altas. Os camundongos tratados com o complexo,no entanto, continham um nível similar aos níveis de ILl β em camundongosnão- transgênicos, sugerindo que os camundongos tratados nãodesenvolveram a inflamação cerebral. O mesmo fenômeno foi observado nasconcentrações de citoquina antiinflamatória, ILlO (Figura 10B). Neste caso,de novo, os níveis de ILlO foram similares em ambos os camundongos não-transgênicos e nos camundongos tratados transgênicos, comparados com oscamundongos de controle transgênicos, que continham, em média, 18%menos IL10. Os níveis de citoquina nos camundongos PDAPP que receberamo fago- protA- 196 não apresentaram diferença entre os camundongos tratadose os controles transgênicos (dados não mostrados).

Estudos prévios sugeriram um efeito de aperfeiçoamentoagudo de insulina sobre a função da memória através da via intranasal deadministração de insulina, conhecida com proporcionando o acesso direto dasubstância ao compartimento do fluido cerebroespinhal (Strachan, 2005). Osresultados prévios indicam uma prevalência dos receptores de insulina nasregiões límbica e hipocampal, assim como aperfeiçoamentos na memória coma insulina sistêmica. A insulina foi combinada com fagos, de modo ademonstrar que um número crescente de fagos são introduzidos no cérebro,conduzindo a uma redução eficaz na carga amilóide. O efeito é acompanhadopor um aperfeiçoamento no perfil de citoquinas no cérebro. Este efeitocumulativo pode ser um modo eficiente de tomar as propriedades deantiagregação dos fagos, acrescidas de uma melhor penetração, por meio dainsulina, como um tratamento protetor de AD.

Tendo assim descrito inteiramente esta invenção, seráapreciado por aqueles versados na arte que a mesma foi ser executada dentrode uma ampla faixa de parâmetros, concentrações e condições equivalentes,sem que haja afastamento do espírito e do escopo da invenção, e semexperimentação indevida.

Embora esta invenção tenha sido descrita em conexão commodalidades específicas da mesma, será entendido que ela é suscetível demodificações adicionais. Este pedido tem a intenção de abranger quaisquervariações, usos, ou adaptações da invenção seguindo, de um modo geral, osprincípios da invenção e incluindo tais afastamentos da presente exposiçãocomo estando dentro da prática usual ou conhecida dentro da arte, à qual ainvenção pertence e podendo ser aplicados às características essenciais aquiantes expostas, como se segue no escopo das reivindicações apensas.

Todas as referências aqui citadas, incluindo artigos de jornalou resumos, pedidos de patente US ou estrangeiros publicados oucorrespondentes, patentes US ou estrangeiras emitidas ou quaisquer outrasreferências, são inteiramente incorporados a este a título referencial, incluindotodos os dados, tabelas, figuras e textos apresentados nas referência citadas.Em adição, a totalidade dos conteúdos das referências citadas nas referênciasaqui mencionadas são também incorporados, em sua totalidade, a títuloreferencial.

A referência a estágios de método conhecidos, estágios demétodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais nãoconsiste, de modo algum, na admissão de que qualquer aspecto, descrição oumodalidade da presente invenção seja exposta, ensinada ou sugerida na arterelevante.

A descrição precedente das modalidades preferidas irá, destemodo, revelar a natureza geral da invenção, que outros podem, através daaplicação dos conhecimentos dentro da habilidade da arte (incluindo osconteúdos das referências aqui citadas), prontamente modificar e/ ou adaptarpara várias aplicações de tais modalidades específicas, sem experimentaçãoindevida, sem que haja afastamento do conceito geral da presente invenção.Portanto, tais adaptações e modificações têm a intenção de recair dentro dosignificado e da faixa de equivalentes das modalidades expostas, com basenos ensinamentos e na orientação aqui apresentados. Deve ser entendido que afraseologia ou a terminologia neste destinam-se ao propósito de descrição enão de limitação, de tal modo que a terminologia ou a fraseologia do presentepedido devam ser interpretados por aquele versado na arte, à luz dosensinamentos e da orientação aqui apresentados, em combinação com oconhecimento daquele de habilidade ordinária na arte.

REFERÊNCIAS

Adzamil et al., Invés. Radiol. 26 (2): 143- 8, 1991.

Benhar et al., Phage Display of single-chain antibodies. In: J.Colligen (Ed.), Current Protocols in Immunology, Vol.10, 19 B, John Wiley& Sons, Inc. USA (2001).

Berdichevsky et al., J. Immunol. Methods, 228: 151-62 (1999).

Bluthner et al. "Mapping of epitopes recognized by PM/ Sclautoantibodies with gene- fragment phage display libraries", J. Immunol.Methods 198: 187- 198 (1996).

Bonnycastle et al., "Probing the basis of antibody reactivitywith a panei of constrained peptide libraries displayed by filamentous phage.J. Mol. Biol., 24; 258 (5): 747-62 (1996).

Brent et al., Curret Protocols in Molecular Biology, JohnWiley & Sons Inc. (2003).

Caughey et al., "Secondary structure analysis of the scrapie-associated protein PrP 27- 30 in water by infrared spectroscopyBiochemistry 30: 7672 - 7680 (1991).

Chartier Harlan et al., Nature 353: 844 (1991).

Chou et al., Biopharm DrugDispos. 18 (4): 335- 46 (1997).Cortese et al., "Epitope discovery using peptide libraríesdispalayed on phage", Trends Biotechnol. 12: 262- 267 (1994).

Cortese et al., "Identification of biologically active peptidesusing random libraríes displayed on phage", Curr. Opin. Bioteehnol. 6: 73-80(1995).

Cortese et al., "Selecton of biologically active peptides byphage display of random peptide libraríes", Curr Opin. Bioteehnol. 7: 616 -621 (1996).

Cwirla et al., "Peptides on phage: a vast library of peptides foridentifying ligands", Proe. Natl. Aead. Sei. USA 87; 6378 - 6382 (1990).

De Gioia et al., "Conformational Polymorfism of theamyloidogenic and neurotoxic peptide homologous to residues 106-126 of theprion protein", J. Biol Chem. 269: 7859-7862 (1994).

Djojonegoro BM, Bndik MJ, Willson RC., "Bacteriophagesurface display of an immunoglobulin- binding domain of Sataphylococcusaureus protein A", Bioteehnology 12 (2): 69-71 (1994).

Dotto et al., "The functional origin of bacteriophage fl DNAreplication: Its Signal and domains", J. Mol. Biol. 172:507 - 521 (1984).

Dower WJ, "Phage power", Curr. Biol. 2:251-253 (1992).

Dotto et al., "The funcional origin of bacteriophage fl DNAreplication: Its Signal and domains", J. Mol. Biol. 172: 507- 521 (1984).

Dower WJ., "Phage power", Curr. Biol. 2: 251- 253 (1992).

Draghia et al., Gene Therapy 2: 418- 423 (1995).

Felici et al., "Selection of antibody ligands from a large libraryof oligopeptides expressed on a multivalent exposition vector", J. Mol. Biol.,222: 301 -310(1991).

Frenkel et al., "N-terminal EFRH sequence of Alzheimer's β-amiloid peptide represents the epitope of its anti-aggregating antibodies ", J.Neuroimmunology 88:85-90 (1998).Frenkel, D., Solomon, B and Benhar, I. "Modulation ofAlzheimer's β-amyloid nurotoxicity by site - directed single- chain antibody"J. Neuroimmunol., 106: 23-31 (2000 a).

Frenkel, D., Katz, O. and Solomon, B. "Immunization againstAlzheimer's β-amyloid plaques via EFRH phage administration" PNAS 97(21): 11455 - 11459(2000 b).

Frenkel, D., Kariv, N. and Solomon, B. "Generation of auto-antibodies towards Alzheimer disease vaccination ", Vaccine 19, 2615 - 2619(2001).

Frenkel and Solomon, PNAS, 99: 5675 - 5679 (2002).

Gajdusek, Science, 197: 943 - 960 (1991).

Gazit E., "Mechanistic studies of the process of amyloid fibrilsformation by the use of peptide fragments and analogues: implication for thedesign of fibrillization inhibitors".

Curr. Med. Chem. 9 (19): 1725 - 35 (2002).

Goding JW., "Use of staphylococcal protein A as animmunological reagent "J. Immunol. Methods. 20: 241- 53 (1978).

Goldsmith et al., "Adsortion protein of bacteriophage fd:Isolation, molecular properties, and location in virus", Biochemistry 16: 2686-2694(1977).

Goate et al., Nature 349: 704 (1991).

Goudswaard J., van der Dok JA, Noordzij A, van Dam RH,Vaerman immunoglobulins ", J. Scan Immunol., 8(1): 21 - 8 (1978).

Graille M., Stura EA, Corper AL., Sutton BJ, Taussig MJ,Charbonnier JB, Silverman GJ. "Crystal structure of a Staphylococcus aureusprotein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgMantibody: structural basis for recognition of B- cell receptors and superantigenactivity", Proe. Natl. Aead. Sei. USA 97 (10): 5399 - 404 (2000).

Gray et al. "Adsortion complex of filamentous fd virus", J.Mol Biol. 146: 621 - 627 (1981).

Greenwood et al., "Multiple display of foreign peptides on afilamentous bacteriophage J. Mol. Biol. 220: 821 - 827 (1991).

Hardy, TINS, 20: 154 (1997).

Hoess et al., "Identification of a peptide which binds to thecarbohydrate - specific monoclonal antibody B3", Gene 128: 43- 49 (1993).

Holliger et al., "A conserved infection pathway forfilamentous bacteriophages is suggested by the structure of the membranepenetration domain of the minor coat protein g3p from phage fd", Structure 5:265 - 275 (1997).

Hoogenboom, H. R., de Bruine, A. P. Hufton, S. E., Hoet, R.M. Arends, J. W. and Roovers, R. C. "Antibody phage display technology andits applications iiImmunotechnology 4:1-20 (1998).

Horiuchi and Caughey, "Specific binding of normal prionprotein to the scrapie form via a localized domain initiates its conversion tothe protease- resistent state", EMBO J. 18: 3193 - 3203 (1999).

Iannolo et al., "Modifying filamentous phage capsid: limits inthe size of the major capsid protein", J. Mol. Biol., May 12; 248 (4): 835- 44(1995).

Kay et al., "An Ml3 phage library displaying 38-amino-acidpeptides as a source of novel sequences with affinity to selected targets",Gene 128: 59 - 65 (1993).

Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins, ALaboratory Manual, Academic Press (1996).

Kanyo et al., "Antibody binding defines a structure for anepitope that participates in the PrPC -» PrPSc conformational change", J.Mol. Biol. 293: 855 - 863 (1999).

Kim et al., "Viable deletions of the Ml 3 complementary strandorigin", Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 6784 - 6788 (1981).Koivunem et al., "Phage libraries displaying cyclic peptideswith different ring sizes: ligasnd specifities of the RGD- directed integrins ",Biotechnology, 13:265- 270 (1995).

Krebber et al., "Co-selection of cognate- antigen pairs byselectively - infective phages", FEBS Lett. 377: 227 - 231 (1995).

Li Y, Cockburn W., Whitelam GC, Filamentous bacteriophagedisplay of a bifunctional protein A: scFv fusion. MoL Biotechnol., 1998, Jun;9(3): 187-93.

Luzzago et al., "Mimicking of descontinous epitopes by phagedisplayed peptides, a. Epitope mapping of human H ferritin using a phagelibrary of constrained peptides", Gene, 128: 51 -57 (1993).

Maggio JE, Mantyh, PW, "Brain amyloid - a physicochemicalperspective iiBrain Pathol. 6 (2): 147- 62 (1996).

Marvin et al., "Molecular Model and structural comparisons ofnative and mutant class filamentous bacteriophages Ff (fd, fl, Ml3), fl e Ke",J. Mol. Biol. 235: 260 - 286 (1994).

Mathison et al., J. Drug Target, 5 (6): 415-441 (1998).

Matthews et al., "Substrate phage: selection of proteasesubstrates by monovalent phage display", Science 260: 1113-1116 (1993).

McCafferty et al., "Phage enzymes: expression and affinitychromatography of functional alkaline phosphatase on the surface ofbacteriophage ", Protein Eng. 4: 955 - 961 (1992).

McCafferty et al., "Phage antibodies: filamentous phagedisplaying antibody variable domains ", Nature, 348 (6301): 552- 4 (1990).

Medynski, D. "Phage display: ali dressed up and ready torole", Biol. Technol. 12, 1134 - 1136 (1994).

Meola, A., Delmastro, P., Monaci, P., et al. "Derivation ofvaccines from mimotopes: Immunological properties of human B virassurface antigen minotopes displayed on filamentous phage " J. Immuno 154:3162-3172(1995).

Messing J. "New Ml3 vectors for cloning", Methods Enzymol.101:20- 78 (1983).

Model et al. "Filamentous bacteriophage", em TheBacteriophages, Calendar R. (ed.), Plenum Press, New York and London,Vol. 2, p. 375 (1988).

Monaci P., et al., Curr. Opin. Mol. Ther., 3 (2): 159 - 69(2001).

Moses et al., "Restructuring the bacteriophage fl genome:Expression of gene VIII in the intergenic space ", Virology 104: 267- 278(1980).

Mullan et al., Nature Genet. 1:345 (1992).

Murrell et al., Science 254: 97 (1991).

Pan et al., "Conversion of alpha- helices into beta- sheetsfeatures in the formation of the scrapie prion proteins", Proc. Natl. Acad. Sei.USA 90: 10962- 10966 (1993).

Parmley et al., "Antibody - selectable filamentous fd phagevectors: affinity purification of taqrget genes", Gene 73: 305 - 318 (1988).

Peretz et al., "A conformational transition at the N terminus ofthe prion protein features in formation of the scrapie isoform", J. Mol. Biol.273: 613- 622(1997).

Rasqualini et al., "Organ targeting in vivo using phage displaypeptide libraries", Nature 380: 364 - 366 (1996).

Saggio et al., Gene, 152: 35- 39 (1995).Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Sampath A., Abrol S., Chaudary VK., "Versatile vectors fordirect cloning and ligation - independent cloning of PCR - amplifiedfragments for surface display on filamentous bacteriophages", Gene, 190 (1):5- 10(1997).

Schmitz et al., "Catalitic specificity of phosphotyrosinekinases Blk5 Lyn5 c-Src e Syk as assessed by phage display", J. Mol. Biol.260: 664 -677 (1996).

Scott et al., "Searching for peptide ligands with an epitopelibrary", Science, 249: 386- 390 (1990).

Scott, J. K. "Discovering peptide ligands using epitopelibraries" Trends in Biochem. Sei, 241- 245 (1992).

Selvaggini et al., "Molecular characteristics of a protease-resistent, amyloidogenic and neurotoxic peptide homologous to residues 106-126 of the prion protein", Biochem Biophys., Res. Commun. 194: 1380 - 1386(1993).

Silen and Agard, "The alpha- lytic protease pro- region doesnot require a physical linkage toa ctivate the protease domain in vivo". Nature341:462-464(1989).

Smith GP "Surface display and Peptide libraries", Gene 128:1-2 (1993).

Smith DH. Et al. "Accumulation of Amyloid and Tau and theFormation of Neurofilament Inclusions Following Diffuse Brain Injury in thePig", J. Neuropathol., Exp. Neurol., 58 (9): 982 - 992 (1999).

Sparks et al., "Identification and characterization of Src SH3ligands from phage - displayed random peptide libraries", J. Biol. Chem. 269:23853 -23856(1994).

Strachan M. W. J. "Insulin and cognitive funetion in humans:experimental data and therapeutic considerations", Bioehemieal SoeietyTransactions. 33: 1037- 1040 (2005).

Sugimoto et al., "Studies on bacteriophage fd DNA. IV. Thesequence of messenger RNA for the major coat protein gene "V. Mol. Biol.111:487- 507(1977).Taglaivini et al., "Synthetic peptides homologous to prionprotein residues 106- 147 form amyloid-like fibrils in vitro", Proc. NatLAcad. Sei. USA 90: 9678 - 9682 (1933).

Uppala and Koivunen, Chem. High Throughput Screen, 3: 373- 392 (2000).

Van Wezenbeek et al., "Nucleotide sequence of thefilamentous bacteriophage Ml3 DNA genome; comparison with phage fd",Gene 11:129- 148 (1980).

Wilesmith and Wells, Curr. Top Mierobiol. Immunol. 172: 21-38(1991).

Willis et al., "Immunological properties of foreign peptides inmultiple display on a filamentous bacteriophage", Gene 128: 79 -83 (1993).

Winter, G., Griffiths, A. D. Hawkins, R. E. and Hoogenboom,H. R. "Making antibody by phage display technology iiAnnu. Rev. Immunol.,12:433 -455 (1994).

Wrighton et al., "Small peptides as potent mimeties of theprotein hormone erythropoietin", Science 273: 458 - 463 (1996).

Zacher et al., "A new filamentous phage cloning vector: fd-tet", Gene 9: 127- 140 (1980).

Claims (35)

1. Veículo de exibição de fago, caracterizado pelo fato de quecompreende um bacteriófago filamentoso, que exibe sobre a sua superfíciecomo uma molécula de bacteriófago filamentosa não-nativa, proteína A, ouum fragmento ou variante da mesma, capaz de se ligar à porção Fc dosanticorpos, e um anticorpo ou imunocomplexo antígeno- anticorpo ligado àreferida proteína A ou fragmento ou variante da mesma através de sua porçãoFc, com a condição de que o bacteriófago filamentoso não está tambémconjugado através de um agente de ligação ou diretamente a uma droga e queo anticorpo ou imunocomplexo não está também imobilizado sobre umcarreador sólido.

2. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o bacteriófago filamentoso é selecionado apartir do grupo que consiste do bacteriófago Ml3, fl e fd, e qualquer misturados mesmos.

3. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o bacteriófago filamentoso é Ml3.

4. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo pertence à classe IgG.

5. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ligado à referida proteína A oufragmento ou variante da mesma é um anticorpo monoclonal.

6. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal é umanticorpo monoclonal desenvolvido contra ou específico para o peptídeo βamilóide de Αβ 1-42 ou Αβ 1-40.

7. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal é específicopara uma molécula alvo, associada com uma doença, distúrbio ou condiçãocerebral.

8. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação-7, caracterizado pelo fato de que a referida doença, distúrbio ou condiçãocerebral é uma doença ou distúrbio formador de placa.

9. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação-7, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal é rotulado.

10. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que o referido imunocomplexo ligado à referidaproteína A ou a um fragmento ou variante da mesma é um imunocomplexo deinsulina e um anticorpo anti- insulina.

11. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de bacteriófagofilamentoso não- nativo exibida sobre a superfície do referido bacteriófagofilamentoso, consiste da proteína A ou de um fragmento ou variante damesma, capaz de se ligar à porção Fc de anticorpos, de ser ligado a umanticorpo ou a um imunocomplexo antígeno- anticorpo.

12. Veículo de exibição de fago, caracterizado pelo fato de quecompreende um bacteriófago filamentoso, que exibe sobre a sua superfíciecomo uma molécula de bacteriófago filamentoso não- nativo, proteína A, ouum fragmento ou variante da mesma, capaz de se ligar à porção Fc deanticorpos, e um anticorpo ligado à referida proteína A ou a um fragmento ouvariante da mesma através de sua porção Fc, em que o referido anticorpo éespecífico para uma molécula, que não é apresentada como um alvo sobreuma superfície celular e com a condição de que o anticorpo não está tambémimobilizado sobre um carreador sólido.

13. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação-12, caracterizado pelo fato de que o referido bacteriófago filamentoso éselecionado a partir do grupo, que consiste do bacteriófago Ml3, fl e fd e dequalquer mistura dos mesmos.

14. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o bacteriófago filamentoso é Ml3.

15. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo pertence à classe IgG.

16. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ligado à referida proteína A oufragmento ou variante da mesma é um anticorpo monoclonal.

17. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal é umanticorpo desenvolvido contra ou específico para o peptídeo β amilóide de Αβ 1-42 ou Αβ 1-40.

18. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal éespecífico para uma molécula alvo, associada com uma doença, distúrbio oucondição cerebral.

19. Veículo de exibição de fago de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida doença, distúrbio ou condiçãocerebral é uma doença ou distúrbio formador de placa.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende o veículo de exibição de fago como definido na reivindicação 1ou reivindicação 12, e um carreador farmaceuticamente aceitável, excipiente,diluente ou agente auxiliar.

21. Método para o tratamento ou a inibição de uma doença,distúrbio ou condição cerebral, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar, por via intranasal, uma quantidade eficaz do veículo de exibiçãode fago como definido na reivindicação 1 ou reivindicação 12, a um pacienteque esteja em necessidade do mesmo, de modo a inibir ou tratar a doença,distúrbio ou condição cerebral.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a referida doença, distúrbio ou condição cerebral é umadoença ou distúrbio formador de placa.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a doença ou distúrbio formador de placa é o mal deAlzheimer.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que o anticorpo ligado à referida proteína A ou fragmento ouvariante da mesma, exibido sobre o veículo de exibição de fago, é umanticorpo específico para um peptídeo amilóide β.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo é específico para o peptídeo amilóide β-1-42 ou 1-40.

26. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a referida doença ou distúrbio formador de placa é umadoença de prion.

27. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a referida doença, distúrbio ou condição cerebral é um tumorcerebral.

28. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a referida doença, distúrbio ou condição cerebral é umadoença, distúrbio ou condição inflamatória cerebral.

29. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o referido paciente é um mamífero.

30. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o referido paciente é um ser humano.

31. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o referido imunocomplexo ligado à referida proteína A ou aum fragmento ou variante da mesma é um imunocomplexo de insulina e umanticorpo anti- insulina.

32. Método para o diagnóstico de uma doença, distúrbio oucondição cerebral, caracterizado pelo fato de que compreende:administrar, por via intranasal, o veículo de exibição de fagocomo definido na reivindicação 1 ou reivindicação 12 a um paciente queesteja em necessidade do mesmo; edetectar o veículo de exibição de fago com o seu componentede anticorpo ligado a uma molécula alvo, associada com uma doença,distúrbio ou condição cerebral, de modo a diagnosticar a presença da doença,distúrbio ou condição cerebral.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo é rotulado de um modo detectável.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é rotulado de um modo detectável com umradionuclídeo.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é rotulado de um modo detectável com um agentede contraste.