MX2008010612A - Bacteriofago filamentoso que exhibe proteina a como aglutinante de anticuerpos e inmunocomplejos para el suministro hacia el cerebro. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un vehículo de despliegue de fago que está compuesto por un bacteriófago filamentoso que despliega en su superficie, como una molécula de bacteriófago no filamentoso, la proteína A o un fragmento o variante de la misma que es capaz de unirse a la porción Fc de anticuerpo, y un anticuerpo o un inmunocomplejo de antígeno-anticuerpo unido a la proteína A o aun fragmento o variante de la misma por su porción Fc; el vehículo de despliegue de fago se formula en una composición farmacéutica y se puede utilizar para tratar/inhibir o para diagnosticar una enfermedad, trastorno o condición del cerebro.

Description

BACTERIOFAGO FILAMENTOSO QUE EXHIBE PROTEINA A COMO AGLUTINANTE DE ANTICUERPOS E INMUNOCOMPLEJOS PARA SUMINISTRO HACIA EL CEREBRO ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a un vehículo de exhibición de bacteriófagos filamentosos para suministro de anticuerpos e inmunocomplejos hacia el cerebro, y a su uso en diagnóstico y terapéutica.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Exhibición de fagos Las colecciones combinatorias de fagos que exhiben péptidos proveen un medio efectivo para estudiar interacciones de proteína: proteína. Esta tecnología depende de la producción de colecciones muy grandes de péptidos aleatorios asociados con sus anteproyectos genéticos correspondientes (Scott et al., 1990; Dower, 1992; Lañe et al., 1993; Córtese et al., 1994; Córtese et al., 1995; Córtese et al., 1996). La presentación de los péptidos aleatorios se logra con frecuencia construyendo proteínas quiméricas expresadas sobre la superficie exterior de bacteriófagos filamentosos tales como M13, fd y f1. Esta presentación hace que los repertorios sean sujetos a pruebas de unión y esquemas de identificación especializados (referidos como toma biopanorámica (Parmley et al., 1988)), que lleva al aislamiento e identificación de afinidad de péptidos con propiedades de unión deseadas. De esta manera, se han seleccionado eficientemente péptidos que se unen a receptores (Koivunen et al., 1995; Wrighton et al., 1996; Sparks et al., 1994; Rasqualini et al., 1996), enzimas (Matthews et al., 1993; Schmitz et al., 1996) o anticuerpos (Scott et al., 1990; Cwirla et al., 1990; Felici et al., 1991 ; Luzzago et ai, 1993; Hoess et ai, 1993; Bonnycastle et al., 1996). Los bacteriófagos filamentosos son bacteriófagos no Uticos específicos de individuos de sexo masculino que infectan a células de Escherichia coli que poseen un episoma F (para una revisión, véase Model et al., 1988). Las partículas de los fagos filamentosos aparecen como estructuras tubulares delgadas de 900 nm de longitud y 10 nm de espesor que contienen un genoma de ADN de cadena sencilla circular (la cadena +). El ciclo de vida del fago entraña la unión del fago al pilus F de la bacteria, seguida de la entrada del genoma de ADN de cadena sencilla en el hospedero. El ADN de cadena sencilla circular es reconocido por la maquinaria de replicación del hospedero, y la síntesis de la segunda cadena de ADN complementaria se inicia en la estructura ori(-) del fago. La forma de replicación del ADN de doble cadena, es el molde para la síntesis de genomas de fagos circulares de ADN de cadena sencilla, iniciando en la estructura ori(+). Estos son empacados finalmente en viriones, y las partículas del fago son extruidas de la bacteria sin que causen lisis o daño aparente al hospedero. Los sistemas de exhibición de péptidos han explotado dos proteínas estructurales del fago: la proteína plll (P3) y la proteína pVIII. La proteína plll existe en cinco copias por fago, y se encuentra exclusivamente en una punta del virión (Goldsmith et al., 1977). El dominio N-terminal de la proteína plll forma una estructura tipo protuberancia que se requiere para el proceso de infecciosidad (Gray et al., 1981 ). Permite la adsorción del fago a la punto del pilus F, y después la penetración y translocación de ADN del fago de cadena sencilla en la célula hospedera bacteriana (Holliger et al., 1997). La proteína plll puede tolerar modificaciones extensivas, y de esta manera se ha usado para expresar péptidos en su extremo N-terminal. Los péptidos extraños han sido de hasta 65 residuos de aminoácido de longitud (Bluthner et al., 1996; Kay et al., 1993) y, en algunos casos, incluso tan largos como proteínas de longitud completa (McCafferty et al., 1990; McCafferty et al., 1992), sin que afecten notablemente la función de plll. La cubierta de proteína cilindrica que rodea al ADN de cadena sencilla del fago está compuesta de 2700 copias de la proteína de cubierta principal, pVIII, una subunidad a-helicoidal que consiste de 50 residuos de aminoácido. Las proteínas pVIII mismas están dispuestas en un patrón helicoidal, con la a-hélice de la proteína orientada a un ángulo somero hacia el eje largo del virión (Marvin et al., 1994). La estructura primaria de esta proteína contiene tres dominios separados: (1 ) la parte N-terminal, enriquecida con aminoácidos ácidos y expuesta al ambiente exterior; (2) un dominio hidroíóbico central responsable de: (i) Interacciones subunidad: subunidad en la partícula del fago y (ii) funciones de transmembrana en la célula hospedera; y (3) el tercer dominio conteniendo aminoácidos básicos, agrupados en el extremo C-terminal, que está enterrado en el interior del fago y está asociado con ADN del fago. La proteína pVIII se sintetiza como una pre-proteína de cubierta que contiene un péptido guía de 23 aminoácidos, el cual es digerido tras translocación a través de la membrana interior de la bacteria, para dar la proteína de transmembrana madura de 50 residuos (Sugimoto et al., 1977). El uso de pVIII como un andamio de exhibición es impedido por el hecho de que puede tolerar la adición de péptidos no más largos de 6 residuos en su extremo N-terminal (Greenwood et al., 1991 ; lannolo et al., 1995). Inserciones más largas interfieren con el ensamble del fago. Sin embargo, la introducción de péptidos más largos es posible en sistemas en donde se producen fagos mosaico mezclando in vivo las proteínas pVIII recombinantes que contienen péptidos con pVIII de tipo silvestre (Felici et al., 1991 ; Greenwood et ai, 1991 ; Willis et ai, 1993). Esto permite la incorporación de las proteínas pVIII quiméricas a baja densidad (decenas a cientos de copias por partícula) sobre la superficie del fago entremezcladas con proteínas de cubierta de tipo silvestre durante el ensamble de las partículas del fago. Se han usado dos sistemas que permiten la generación de fagos mosaico; los sistemas "tipo 8+8" y "tipo 88" designados por Smith (Smith, 1993). El sistema "tipo 8+8" se basa en que tiene los dos genes de pVIII situados por separado en dos unidades genéticas diferentes (Felici et ai, 1991 ; Greenwood et al., 1991 ; Willis et al., 1993). El gen de pVIII recombinante se localiza en un fagémido, un plásmido que contiene, además de su propio origen de replicacion, los orígenes de replicacion y señal de empacado del fago. La proteína pVIII de tipo silvestre se provee superinfectando bacterias que albergan al fagémido con un fago auxiliar. Además, el fago auxiliar provee la maquinaria de replicacion y ensamble del fago que empaca tanto al fagémido como a los genomas auxiliares en viriones. Por lo tanto, dos tipos de partículas son secretadas por dichas bacterias, auxiliar y fagémido, las cuales se incorporan en una mezcla de proteínas pVIII de tipo silvestre y recombinante. El sistema "tipo 88" se beneficia conteniendo los dos genes de pVIII en un genoma infeccioso y el mismo genoma infeccioso del fago. De esta manera, esto evita la necesidad de un fago auxiliar y la superinfección. Además, sólo se produce un tipo de fago mosaico. El genoma del fago codifica para 10 proteínas (pl a pX), todas las cuales son esenciales para la producción de una progenie infecciosa (Felici et al., 1991 ). Los genes para las proteínas están organizados en dos unidades de transcripción apretadamente empacadas separadas por dos regiones no codificantes (Van Wezenbeek et al., 1980). Una región no codificante, denominada la "región intergénica" (que se define está situada entre los genes de pIV y pll), contiene los orígenes de replicacion de ADN (+) y (-) y la señal de empacado del fago, permitiendo el inicio de la formación de la cápside. Partes de esta región intergénica son dispensables (Kim et al., 1981 ; Dotto et al., 1984). Además, se ha encontrado que esta región es capaz de tolerar la inserción de moléculas de ADN extrañas en varios sitios (Messing, 1983; Moses et al., 1980; Zacher et al., 1980). La segunda región no codificante del fago se localiza entre los genes de pVIII y plll, y se ha usado también para incorporar genes recombinantes extraños, según fue ilustrado por Pluckthun (Krebber et al., 1995).

Inmunización con exhibición de fagos Los péptidos sintéticos pequeños, que consisten de epítopes, son generalmente antígenos deficientes que requieren la síntesis química de un péptido, y necesitan ser acoplados a un vehículo grande, pero incluso entonces pueden inducir una respuesta inmune de baja afinidad. Un procedimiento de inmunización para producir anticuerpos anti-?ß?, usando como antígeno los fagos filamentosos que exhiben sólo el péptido EFRH, fue desarrollado en el laboratorio de los presentes inventores (Frenkel et al., 2000 y 2001 ). Se han usado extensivamente bacteriófagos filamentosos en años recientes para la "exhibición", sobre su superficie, de grandes repertorios de péptidos generados clonando oligonucleótidos aleatorios en el extremo 5' de los genes que codifican para la proteína de la cubierta del fago (Scott y Smith, 1990; Scott, 1992). Como se reportó recientemente, los bacteriófagos filamentos son vehículos excelentes para la expresión y presentación de péptidos extraños en una variedad de materiales biológicos (Greenwood et al., 1993; Medynski, 1994). La administración de fagos filamentosos induce una fuerte respuesta inmunologica hacia los sistemas de efectos de fagos (Willis et al., 1993; Meóla et al., 1995). Las proteínas plll y pVIII de la cubierta del fago discutidas anteriormente, son proteínas que se han usado con frecuencia para la exhibición de fagos. Debido a su estructura lineal, los fagos filamentosos tienen alta permeabilidad a diferentes tipos de membrana (Scott et al., 1990), y siguiendo el tracto olfatorio, llegan al área del hipocampo por medio del sistema límbico a sitios afectados objetivo. El tratamiento de fagos filamentosos con cloroformo, cambia la estructura lineal a una circular, que previene el suministro del fago hacia el cerebro.

Diseño de anticuerpos Se aplicaron métodos de diseño de anticuerpos para reducir al mínimo el tamaño de anticuerpos monoclonales (mAbs) (135-900 kDa), mientras que mantienen su actividad biológica (Winter et al., 1994). Estas tecnologías y la aplicación de la tecnología de PCR para crear grandes repertorios de genes de anticuerpos, hacen que la exhibición de anticuerpos en fagos sea una herramienta versátil para el aislamiento y la caracterización de anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv) (Hoogenboom et al., 1998). Los scFvs pueden ser exhibidos sobre la superficie del fago para manipulación adicional, o pueden ser liberados como un fragmento de scFv soluble (-25 kd). El laboratorio de los presentes inventores ha diseñado un svFv que exhibe propiedades anti-agregación similares a la molécula de IgM precursora (Frenkel et al., 2000a). Para la construcción del scFv, los genes de anticuerpo del hibridoma IgM 508 anti-?ß? fueron clonados. El anticuerpo secretado mostró actividad específica hacia la molécula de ?ß? para prevenir sus efectos tóxicos en células PC 12 cultivadas. Los anticuerpos Fv de cadena sencilla dirigidos a sitio, son el primer paso hacia la determinación del blanco de anticuerpos terapéuticos en el cerebro por medio de procedimientos intracelulares o extracelulares.

Proteína A La proteína A de Staphylococcus aureus es un constituyente de la pared celular caracterizado por su afinidad a la porción Fe de inmunoglobulinas, especialmente la clase de IgG (Goding, 1978). Se une a los anticuerpos de IgG de humanos, ratones, cerdos, conejillos de Indias y conejos. En ratones, la proteína A se une a anticuerpos de lgG2a e lgG2b con alta afinidad, pero se une menos bien a anticuerpos de lgG1 e lgG3 (Goudswaard et al., 1978). La proteína A es una proteína de 42 kDa que tiene cuatro dominios repetitivos ricos en ácidos aspártico y glutámico, pero carece de cisteínas. El dominio de unión de IgG (dominio B) consiste de tres alfa-hélices antiparalelas, la tercera de ellas siendo desorganizada cuando la proteína se combina con Fe (Graille et ai, 2000).

Enfermedades formadoras de placas Las enfermedades formadoras de placas se caracterizan por la presencia de depósitos de placas amiloides en el cerebro, así como degeneración neuronal. Depósitos amiloides son formados por péptidos agregados en una masa insoluble. La naturaleza del péptido varía en diferentes enfermedades, pero en la mayoría de los casos, el agregado tiene estructura de lámina beta-plegada, y se tiñe con colorante rojo Congo. Además de la enfermedad de Alzheimer (AD), que incluye enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, enfermedad de Alzheimer de inicio tardío y enfermedad de Alzheimer presintomática, otras enfermedades caracterizadas por depósitos amiloides son, por ejemplo, amiloidosis SAA, síndrome islandés hereditario, mieloma múltiple y enfermedades causadas por priones. Las enfermedades causadas por priones más comunes en animales, son el scrapie de ovejas y cabras, y la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) del ganado (Wilesmith y Wells, 1991 ). Cuatro enfermedades causadas por priones se han identificado en humanos: (i) kuru, (ii) enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (iii) enfermedad de Gerstmann-Streussler-Sheinker (GSS), y (iv) insomnio familiar fatal (FFI) (Gajdusek, 1977; y Tritschler et al., 1992). Las enfermedades causadas por priones implican la conversión de la proteína celular normal del prión (PrPC) en la isoforma de scrapie correspondiente (PrPSc). Mediciones espectroscópicas demuestran que la conversión de PrPC en la isoforma de scrapie (PrPSc), implica una transición conformacional mayor, implicando que las enfermedades causadas por priones, al igual que otras enfermedades amiloidogénicas, son trastornos de conformación de proteínas. La transición de PrPC a PrPSc va acompañada de una disminución en la estructura secundaria a-helicoidal (de 42% a 30%), y un incremento notable en el contenido de lámina ß (de 3% a 43%) (Caughey et al., 1991 ; y Pan et al., 1993). Este reordenamiento está asociado con propiedades fisicoquímicas anormales, que incluyen insolubilidad en detergentes no desnaturalizantes y resistencia parcial a la proteólisis. Estudios previos han mostrado que un péptido sintético homólogo con los residuos 106 a 126 de PrP de humano (PrP106-126), exhibe algunas de las propiedades patogénicas y fisicoquímicas de PrPSc (Selvaggini et al., 1993; Tagliavini et al., 1993; y Forloni et al., 1993). El péptido muestra un polimorfismo conformacional notable, adquiriendo diferentes estructuras secundarias en varios ambientes (De Gioia et al., 1994). Tiende a adoptar una conformación de lámina ß en soluciones reguladas en su pH, y se agrega en fibrillas amiloides que son parcialmente resistentes a la digestión con proteasa. Estudios cristalográficos de rayos X de un complejo de anticuerpo 3F4 y su epítope del péptido (PrP 104-1 13), proveyeron una vista estructural de esta región flexible que se piensa es un componente del reordenamiento conformacional esencial para el desarrollo de enfermedades causadas por priones (Kanyo et al, 1999). La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad progresiva que resulta en demencia senil. Hablando ampliamente, la enfermedad pertenece a dos categorías: de inicio tardío, que ocurre en la edad madura (típicamente arriba de 65 años), y de inicio temprano, que se desarrolla bien antes del período senil, por ejemplo, entre 35 y 60 años. En ambos tipos de la enfermedad, la patología es similar, pero las anormalidades tienden a ser más severas y extendidas en casos que comienzan a una edad más temprana. La enfermedad se caracteriza por dos tipos de lesiones en el cerebro, placas seniles y marañas neurofibrilares. Las placas seniles son áreas de neutrófilos desorganizados de hasta 150 mm a través, con depósitos amiloides extracelulares en el centro, visibles por análisis microscópico de secciones de tejido del cerebro. Las marañas neurofibrilares son depósitos intracelulares de proteína tau que consisten de dos filamentos enrollados uno alrededor del otro en pares. El constituyente principal de las placas seniles es un péptido denominado péptido beta amiloide (?ß) o beta-amiloide (ß?? o ß?). El péptido beta amiloide es un fragmento interno de 39 a 43 aminoácidos de una proteína precursora denominada proteína precursora amiloide (APP). Varias mutaciones dentro de la proteína APP se han correlacionado con la presencia de enfermedad de Alzheimer (Goate et al. (1991 ), valina 717 a isoleucina; Chartier Harían et al. (1991 ), valina 717 a glicina; Murrell et al. (1991 ), valina 717 a fenilalanina; Mullan et al. (1992), una mutación doble que cambia lisina 595-metionina 596 a asparagina 595-leucina 596). Se piensa que dichas mutaciones causan la enfermedad de Alzheimer por procesamiento incrementado o alterado de APP a beta-amiloide, en particular procesamiento de APP a cantidades incrementadas de la forma larga de beta-amiloide (es decir, ?ß1 -42 y ?ß1 -43). Se piensa que mutaciones en otros genes, tales como los genes de presenilina, PS1 y PS2, afectan indirectamente el procesamiento de APP para generar cantidades incrementadas de beta-amiloide de forma larga (véase Hardy, TINS 20, 154, 1997). Estas observaciones indican que beta-amiloide, y en particular su forma larga, es un elemento causal en enfermedad de Alzheimer. Publicaciones sobre fibras amiloides, indican que láminas ß cilindricas son las únicas estructuras consistentes con algunos de los datos de microscopía electrónica y de rayos X, y las fibras de variantes y fragmentos ?ß de Alzheimer se forman quizá de dos o tres láminas ß cilindricas concéntricas (Perutz et al., 2002). El péptido ?ß completo contiene 42 residuos, apenas el número correcto para nuclear una cubierta cilindrica; este hallazgo y las muchas fuertes interacciones electrostáticas posibles en las láminas ß formadas del péptido ?ß en ausencia de prolinas, dan razón de la propensión del péptido ?ß para formar las placas amiloides extracelulares encontradas en pacientes con enfermedad de Alzheimer. Si esta interpretación es correcta, amiloide consiste de tubos estrechos (nanotubos) con una cavidad central llena de agua. La reversibilidad de la placa amiloide desarrollada in vitro, sugiere equilibrio de estado estable entre ß? en placas y en solución (Maggio y Mantyh, 1996). La dependencia de polimerización ß? en interacciones de péptido-péptido para formar una fibrilla de lámina ß plegada y la influencia estimuladora de otras proteínas sobre la reacción, sugieren que la formación amiloide puede estar sujeta a modulación. Se han hecho muchos intentos por encontrar sustancias capaces de interferir con la formación amiloide. Entre los compuestos más investigados están anticuerpos, péptido compuesto de aminoácidos rompedores beta tales como prolina, adición de grupos cargados al motivo de reconocimiento, y el uso de aminoácidos N-metilados como bloques estructurales (revisado por Gazit, 2002). Se han propuesto métodos para la prevención o el tratamiento de enfermedades caracterizadas por agregación de amiloide en un paciente, que implican hacer que anticuerpos contra un péptido componente de un depósito amiloide, entren en un contacto con amiloide agregado o soluble. Véase el documento W099/27944 de Schenk, y la patente de E.U.A. 5,688,651 de Solomon, cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia. Puede hacerse que los anticuerpos entren en contacto con el amiloide soluble o agregado por vacunación activa o pasiva. En la vacunación activa un péptido, el cual puede ser un péptido amiloide entero o una porción del mismo, se administra para producir anticuerpos in vivo, cuyos anticuerpos se unirán al amiloide soluble y/o agregado. La vacunación pasiva implica administrar directamente anticuerpos específicos para el péptido amiloide. Estos procedimientos se usan de preferencia para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer, disminuyendo la placa amiloide o retardando la velocidad de deposición de dicha placa. Se ha reportado que pruebas clínicas de una vacuna para poner a prueba dicho procedimiento, habían sido llevadas a cabo por Elan Corporation y Wyeth-Ayerst Laboratories. El compuesto siendo puesto a prueba era AN-1972. Se ha reportado que este producto es una forma de ß-amiloide 42. No se pretende que la cita de cualquier documento en la presente sea una admisión de que dicho documento es técnica anterior pertinente, o considerada como material para la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Cualquier declaración en cuanto a contenido o una fecha de cualquier documento, se basa en la información disponible para el solicitante al momento de la presentación, y no constituye una admisión en cuanto a la corrección de dicha declaración.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee un vehículo de exhibición de fagos que contiene un bacteriófago filamentoso que exhibe sobre su superficie proteína A, o un fragmento o variante de la misma capaz de unirse con la porción Fe de anticuerpos, como una molécula no nativa de bacteriófago filamentoso, y un anticuerpo o un inmunocomplejo de antígeno-anticuerpo unido a la proteína A o fragmento o variante de la misma por su porción Fe. La presente invención provee también una composición farmacéutica que contiene al vehículo de exhibición de fagos de la presente invención, para su uso como un agente terapéutico o de diagnóstico. Provistos además por la presente invención, son métodos para tratar/inhibir o para diagnosticar una enfermedad, trastorno o condición del cerebro, administrando intranasalmente el vehículo de exhibición de fagos de la presente invención a un sujeto que necesita del mismo.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1A muestra los iniciadores ProtA delantero (SEQ ID NO: 1 ) y ProtA inverso (SEQ ID NO: 2), usados para la síntesis por PCR de una variante de proteína A. La figura 1 B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) de la variante de proteína A. La figura 1 C muestra el marco de lectura abierto de aminoácidos de la variante de proteína A (SEQ ID NO: 4). La figura 2 es una gráfica que muestra que fago-proteína A se unen a anticuerpos de tipo lgG1 (196, 10D5, 6C6 y 2H3). Se unen también a lgG2a (3D6), y débilmente a lgG2b (12B4). La figura 3 es una gráfica que muestra que anticuerpos unidos a fago-ProtA para ?ß16-16, no se separaron de la proteína A una vez que se unen a ?ß1 -16. La figura 4 es una gráfica que muestra la titulación de fago-protAI que se unen al anticuerpo monoclonal 196. Las figuras 5A y 5B son gráficas que muestran la titulación del fago con dos concentraciones separadas de anticuerpo 2H3. La figura 6 es una gráfica que muestra los resultados de ELISA para verificar la disociación de fago-proteína A del anticuerpo 196, después de precipitación con PEG. Los tratamientos fueron: 1 , fago-proteína A combinados con 5 pg de mAb 196 y precipitados con PEG; 2, igual que 1 , sin precipitación con PEG; 3, sólo anticuerpo 196 - precipitados con PEG; 4, como en 3, pero sin precipitación con PEG; 4, fago-proteína A sólo sin anticuerpo y sin precipitación con PEG. Las figuras 7A y 7B son gráficas que muestran la unión de fago- PrtA-anti-insulina a insulina (figura 7A), y la unión de inmunocomplejos de fago-PrtA-insulina-anti-insulina detectados con anticuerpos anti-ratón de cabra (figura 7B). La figura 8 es una gráfica que compara los niveles de ?ß1 -42 soluble e insoluble y ?ß1 -40 insoluble, en ratones tratados con los complejos de fagos y ratones control no tratados. Las figuras 9A y 9B son gráficas que muestran los niveles de ?ß1 -42 soluble e insoluble en ratones PDAPP tratados con el complejo de fago-196 en comparación con ratones control no tratados. Las figuras 10A y 10B son gráficas que muestran los niveles de citocina de IL1 ß e IL10 en ratones tratados con el complejo y ratones control transgénicos y no transgénicos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los bacteriófagos filamentosos tienen una estructura lineal que les permite penetrar el cerebro cuando se aplican intranasalmente. Puesto que pueden diseñarse para presentar proteínas o péptidos distribuidos sobre sus proteínas de cubierta, pueden usarse para suministrar anticuerpos o moléculas (en la forma de un inmunocomplejo con sus anticuerpos específicos) en el cerebro del sujeto mamífero. P3 es una proteína estructural que asemeja una de las puntas de la cubierta del fago, a través de la cual el fago invade a la bacteria Escherichia coli. Un aspecto de la presente invención está dirigido a un vehículo de exhibición de fagos que incluye un bacteriófago filamentoso que exhibe sobre su superficie, como una molécula no nativa de bacteriófago filamentoso, proteína A o un fragmento o variante de la misma capaz de unirse a la porción Fe de anticuerpos, e incluye además un anticuerpo o inmunocomplejo de antígeno-anticuerpo unido a proteína A o un fragmento o variante de la misma por su porción Fe. En una modalidad preferida, el bacteriófago filamentoso no es tampoco conjugado a través de un enlazador o directamente a un fármaco, y el anticuerpo o el inmunocomplejo de antígeno-anticuerpo tampoco es inmovilizado sobre un vehículo sólido. En otra modalidad preferida, el anticuerpo unido a proteína A o un fragmento o variante de la misma exhibido sobre el bacteriófago filamentoso, es específico para una molécula que no es presentada como un objetivo sobre la superficie de una célula, y el anticuerpo no es inmovilizado sobre un vehículo sólido. En el laboratorio de los presentes inventores, se usaron los fagos filamentosos M13, f1 y fd, los cuales son bien conocidos a niveles estructural y genético (Greenwood et al., 1991 ). Este laboratorio mostró primero que los bacteriófagos filamentosos exhiben propiedades de penetración hacia el sistema nervioso central, mientras que preservan las propiedades inertes del vector y la capacidad para llevar moléculas extrañas (Frenkel y Solomon, 2002). Los bacteriófagos filamentosos son un grupo de virus estructuralmente relacionados que contienen un genoma de ADN de cadena sencilla circular. No destruyen a sus hospederos durante la infección productiva. Los fagos que infectan a Escherichia coli que contienen los plásmidos F, son referidos en conjunto como bacteriófagos Ff. No infectan a células de mamífero. Los bacteriófagos infecciosos son varillas flexibles de aproximadamente 1 a 2 mieras de longitud y 6 nm de diámetro, con una cubierta helicoidal de subunidades de proteína en torno a un núcleo de ADN. Las dos proteínas de cubiertas principales, proteína plll y la proteína de cubierta principal pVIII, difieren en el número de copias de la proteína exhibida. Mientras que plll se presenta en 4 a 5 copias, pVIII se encuentra en aproximadamente 3000 copias. La subunidad de la proteína de cubierta principal pVIII de aproximadamente 50 residuos es principalmente alfa-helicoidal, y el eje de la alfa-hélice hace un pequeño ángulo con el eje del virión. La cubierta de proteína puede considerarse en tres secciones: la superficie exterior, ocupada por la región N-terminal de la subunidad, rica en residuos ácidos que interactúa con el solvente circundante y le da al virión un bajo punto isoeléctrico; el interior de la cubierta, que incluye un tramo de 19 residuos de cadenas laterales polares, en donde las subunidades de proteína ¡nteractúan principalmente entre sí; y la superficie interior, ocupada por la región C-terminal de la subunidad, rica en residuos básicos que ¡nteractúan con el núcleo de ADN. El hecho de que virtualmente todas las interacciones de la cadena lateral de proteína son entre diferentes subunidades en la disposición de la proteína de cubierta, más que dentro de subunidades, hace de este un sistema modelo útil para estudios de interacciones entre subunidades alfa-helicoidales en un ensamble macromolecular. La estructura única del bacteriófago filamentoso permite su penetración en el cerebro, aunque tiene una masa de aproximadamente 16.3 MD, y puede contribuir a su capacidad para interferir con la fibrilización ß?, puesto que la estructura del fago asemeja una fibrilla amiloide misma. El bacteriófago filamentoso puede ser cualquier bacteriófago filamentoso, tal como M13, f1 o fd. Aunque se usó M 3 en el ejemplo más adelante, se espera que cualquier otro bacteriófago filamentoso se comporte y funcione en una manera similar, puesto que tienen una estructura similar, y puesto que sus genomas tienen más de 95% de identidad del genoma. En el vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la presente invención, la proteína A, o un fragmento o variante de la misma, es exhibida sobre la superficie del bacteriófago filamentoso. Esta exhibición del fago implica la expresión de un clon de ADNc de proteína A o un fragmento o variante de la misma como una proteína de fusión con una proteína de cubierta del fago. De esta manera, el genoma del bacteriófago filamentoso es genéticamente modificado para exhibir un péptido o polipéptido no nativo sobre su superficie. Bacteriófagos filamentosos que exhiben proteínas o péptidos extraños como una fusión con una proteína de cubierta del fago, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Puede usarse una variedad de fagos y proteínas de cubierta que incluyen, pero no están limitadas a: proteína III de M13, proteína VIII de M13, proteína VI de M13, proteína VI de M13, proteína IX de M13 y proteína de cubierta menor plll de fd (Saggio et al., 1995; Uppala y Koivunen, 2000). Una gran disposición de vectores está disponible (véase Kay et al., 1996; Berdichevsky et ai, 1999; y Benhar, 2001 ). En una modalidad preferida, la proteína A o un fragmento o variante de la misma es exhibida por su fusión con la proteína de cubierta menor (proteína III) de un fago filamentoso. Métodos para insertar secuencias codificantes extrañas en el gen de un fago, son bien conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; y Brent et ai, 2003). La proteína A de Staphylococcus aureus es una proteína bien conocida y bien usada en la técnica para la unión de la porción Fe de anticuerpos. Fragmentos de proteína que contienen a los dominios de unión, son bien reconocidos en la técnica. Existe también una riqueza de conocimiento concerniente a variantes de proteína A con unión mejorada (o unión diferencial a Fe de diferentes clases y subclases de Ig) a la porción Fe de anticuerpos (inmunoglobulinas). De preferencia, el anticuerpo unido a la proteína A o fragmento o variante de la misma, es de la clase de IgG. Una modalidad más preferida de una variante de proteína A, es la variante que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

La proteína A o un fragmento o variante de la misma capaz de unirse con la porción Fe de anticuerpos, es exhibida sobre la superficie de un bacteriófago filamentoso que se une a un anticuerpo o un inmunocomplejo de antígeno-anticuerpo para suministro hacia el cerebro. La presente invención provee un método para inhibir o tratar una enfermedad, trastorno o condición del cerebro, introduciendo el vehículo de suministro de fagos hacia el cerebro. Además, el presente método provee además un método para diagnosticar una enfermedad, trastorno o condición del cerebro, introduciendo un vehículo de exhibición de fagos hacia el cerebro que puede ser detectado, es decir, marcado. Los presentes métodos implican introducir/administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad efectiva del vehículo de suministro de fagos de la presente invención. Para los propósitos de esta especificación y las reivindicaciones acompañantes, los términos "paciente", "sujeto" y "receptor" se usan recíprocamente. Incluyen humanos y otros mamíferos que son el objeto de tratamiento profiláctico o terapéutico, o de diagnóstico. Para los propósitos de esta especificación y las reivindicaciones acompañantes, el término "péptido amiloide beta" es sinónimo de "péptido amiloide ß", "péptido ß amiloide", "ß??", "ß?" y "?ß". Todos estos términos se refieren a un péptido formador de placas derivado de una proteína precursora amiloide. En una modalidad preferida, el anticuerpo que se une a la proteína A (o un fragmento o variante de la misma) exhibido sobre la superficie del fago, es específico para (se une específicamente a) un péptido ß amiloide. El péptido ß amiloide es de preferencia ?ß1 -42 o ?ß1 -40. Como se usa en la presente, el término "proteína PrP", "PrP" o "prión", se refiere a polipéptidos que son capaces, bajo condiciones adecuadas, de inducir la formación de agregados responsables de enfermedades formadoras de placas. Por ejemplo, la proteína de priones celular normal (PrPC) es convertida bajo dichas condiciones a la isoforma de scrapie correspondiente (PrPSc), que es responsable de enfermedades formadoras de placas tales como, pero no limitadas a, encefalopatía espongiforme bovina (BSE), o enfermedad de las vacas locas, encefalopatía espongiforme felina de los gatos, kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) e insomnio familiar fatal (FFI). En otra modalidad preferida, el anticuerpo es específico para la isoforma de PrPSc patogénica. Se pretende que el término "tratar" signifique sustancialmente inhibir, retardar o revertir la progresión de una enfermedad, trastorno o condición, sustancialmente mejorando los síntomas clínicos de una enfermedad, trastorno o condición, o sustancialmente previniendo la aparición de síntomas clínicos de una enfermedad, trastorno o condición. El vehículo de suministro de fagos y los métodos de la presente invención están dirigidos a una enfermedad, trastorno o condición del cerebro. De preferencia, la enfermedad, trastorno o condición del cerebro es una "enfermedad formadora de placas".

El término "enfermedad formadora de placas" se refiere a enfermedades caracterizadas por la formación de placas por una proteína de agregación (péptido formador de placas) tal como, pero no limitada a, beta-amiloide, amiloide A del suero, cistatina C, proteína de priones o cadena ligera kappa de IgG, en enfermedades tales como, pero no limitadas a, enfermedad de Alzheimer (AD) de inicio temprano, enfermedad de Alzheimer de inicio tardío, enfermedad de Alzheimer presintomática, amiloidosis SAA, síndrome islandés hereditario, senilidad, mieloma múltiple, y enfermedades causadas por priones que se sabe afectan a humanos como es el caso, por ejemplo, de kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) e insomnio familiar fatal (FFI), y a animales, como es el caso, por ejemplo, de scrapie y encefalitis espongiforme bovina (BSE). Debido a que la mayoría de las placas amiloides (conocidas también como depósitos amiloides) asociadas con las enfermedades formadoras de placas descritas anteriormente se localizan dentro del cerebro, cualquier modalidad de tratamiento propuesta debe demostrar una capacidad para cruzar la barrera hemoencefálica (BBB), así como una capacidad para disolver las placas amiloides. Normalmente, el tamaño promedio de las moléculas capaces de penetrar la BBB es de aproximadamente 2 kDa. Un cuerpo creciente de evidencia, muestra que déficits olfatorios y cambios degenerativos en las vías olfatorias centrales, son afectados tempranamente en el curso clínico de la AD. Además, los patrones anatómicos implicados en AD sugieren que la vía olfatoria puede ser la etapa inicial en el desarrollo de AD. Las neuronas receptoras olfatorias son células bipolares que residen en el revestimiento interior epitelial de la cavidad nasal. Sus axones atraviesan la placa cribiforme y protegen a la primera sinapsis de la vía olfatoria en el bulbo olfatorio del cerebro. Los axones de neuronas olfatorias del epitelio nasal forman haces de 1000 fibras amielínicas. Esta configuración las hace una vía por la cual virus u otras sustancias transportadas pueden lograr acceso hacia el SNC a través de la barrera hemoencefálica (BBB). Como se mostró previamente, la administración intranasal (Mathison et al., 1998; Chou et al., 1997; Draghia et al., 1995) permite la entrada directa de virus y macromoléculas en el fluido cerebroespinal (CSF) o SNC. El uso de neuronas receptoras olfatorias como un punto de suministro para un vector de adenovirus hacia el cerebro, se reporta en la literatura. Según se reporta, este método causa la expresión de un gen reportero en el cerebro por 12 días sin toxicidad aparente (Draghia et al., 1995). El suministro directo de anticuerpos o inmunocomplejos hacia el cerebro, supera el cruce de la BBB usando neuronas olfatorias como transportadores hacia el cerebro. En el epitelio olfatorio, las dendritas de las neuronas olfatorias primarias están en contacto con el lumen nasal, y por medio de los axones, estas neuronas están conectadas también con los bulbos olfatorios del cerebro. Fagos que estén en contacto con el epitelio olfatorio pueden ser absorbidos en las neuronas olfatorias primarias, y pueden ser transportados hacia los bulbos olfatorios, e incluso además en otras áreas del cerebro. Incluidos también en las enfermedades, trastornos o condiciones del cerebro, tratados/inhibidos o diagnosticados de conformidad con la presente invención, son tumores del cerebro y enfermedades, trastornos o condiciones inflamatorias del cerebro. La inflamación del cerebro causa inhibición de la neurogénesis tanto en la formación continua basal de nuevas neuronas en la formación hipocámpica intacta y en neurogénesis incrementada en respuesta a un ataque del cerebro. El deterioro de la neurogénesis depende del grado de activación de la microglia, sin tener en cuenta si existe o no daño en el tejido circundante. La inflamación del cerebro desempeña quizá una función importante en la patogénesis de otros trastornos neurodegenerativos crónicos además de la AD, que implican efectos patológicos de ?ß?, tales como enfermedad de Parkinson, demencia del cuerpo de Lewy, complejo de demencia-SIDA, lesión cerebral traumática, glaucoma, etc. La lesión cerebral traumática (TBI) incluye deposición ß-amiloide y el inicio temprano de demencia. A pesar de dichas descripciones, poco se sabe acerca de los mecanismos a través de los cuales estos cambios ocurren. Una fuente propuesta para la generación del péptido ß-amiloide en TBI, es la digestión proteolítica anormal de la proteína precursora ß-amiloide (APP) que se ha mostrado se acumula en sitios de transporte axoplásmico deteriorado dentro de axones traumáticamente lesionados. De hecho, se ha encontrado recientemente inmunorreactividad ß? con axones hinchados en un modelo de TBI en cerdos (Smith et al., 1999), que sugiere que la acumulación de APP en axones traumáticamente lesionados, puede ser una fuente para la formación de péptido ß-amiloide en TBI. Ejemplos no limitativos de enfermedades y trastornos neurodegenerativos, incluyen enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Parkinson, demencia del cuerpo de Lewy, complejo de demencia-SIDA, accidente cerebrovascular y lesiones cerradas de cabeza y lesión cerebral traumática, tales como heridas de bala, accidente cerebrovascular hemorrágico, accidente cerebrovascular isquémico, isquemia cerebral, daños causados por agentes que causan daño en nervios, tales como toxinas, venenos, agentes químicos (biowarfare), o daños causados por cirugía, tal como extirpación de tumor. En una modalidad preferida, el anticuerpo unido a la proteína A (o fragmento o variante de la misma) exhibida en el fago, es un anticuerpo monoclonal específico para una molécula objetivo asociada con una enfermedad, trastorno o condición del cerebro, tal como péptido ß amiloide y PrPSc. El anticuerpo puede ser también un anticuerpo contra citocinas inflamatorias en el cerebro, tales como FNTa, IL-6, etc., para inhibir/tratar inflamación del cerebro como resultado de accidente cerebrovascular, lesión del cerebro u otras enfermedades o trastornos neurodegenerativos. En el caso del método para diagnosticar un tumor del cerebro como la enfermedad, trastorno o condición del cerebro, el anticuerpo es específico para una molécula objetivo característica del tumor del cerebro, y cuya presencia sirve de diagnóstico para el tumor particular del cerebro. En forma alternativa, el vehículo de suministro de fagos que exhibe proteína A (o un fragmento o variante de la misma) unida a un inmunocomplejo de antígeno-anticuerpo por la porción Fe del anticuerpo, puede usarse para suministrar el inmunocomplejo en el cerebro. El antígeno unido por el anticuerpo en el inmunocomplejo, es una molécula que puede usarse para tratar una enfermedad, trastorno o condición del cerebro. Ejemplos no limitativos del antígeno unido por el anticuerpo incluyen insulina, eritropoyetina (EPO) que puede disminuir la lesión neuronal y la muerte de células, interferón y otras citocinas antiinflamatorias tales como IL-10 y moléculas protectoras neuronales que no pasan a través de la barrera hemoencefálica. El método para diagnosticar una enfermedad, trastorno o condición del cerebro de conformidad con la presente invención, implica administrar intranasalmente el vehículo de exhibición de fagos de la presente invención a un sujeto que necesita del mismo. Cuando el vehículo de exhibición de fagos con su anticuerpo componente es unido a una molécula objetivo asociada con una enfermedad, trastorno o condición del cerebro, se detecta entonces la presencia de la enfermedad, trastorno o condición del cerebro. El anticuerpo unido a la proteína A (o fragmento o variante de la misma capaz de unirse a la porción Fe de un anticuerpo) exhibida sobre la superficie del bacteriófago filamentoso, puede ser marcado detectablemente. Los anticuerpos que son marcados son de preferencia radiomarcados para su uso en la terapia contra tumores del cerebro, o en la formación de radioimágenes de diagnóstico. Ejemplos no limitativos de radionúclidos para marcación incluyen 11ln, 125l, 1311 y "mTc. Los anticuerpos radiomarcados, los cuales son de preferencia anticuerpos radioyodados, se preparan mediante métodos estándar para radiomarcar péptidos y proteínas, y son entonces unidos a proteína A (o un fragmento o variante de la misma) exhibida sobre la superficie del bacteriófago filamentoso. Otras marcas detectables adecuadas incluyen agentes de contraste tales como gadolinio (Gd), que es un reactivo preferido para MRI dinámica mejorada, y compuestos orgánicos o inorgánicos de un elemento pesado (por ejemplo, Pt, Au y TI). Una preparación farmacéutica de conformidad con la presente invención incluye, como un ingrediente activo, un vehículo de exhibición de fagos de la presente invención. La preparación farmacéutica puede ser también una mezcla de vehículos de exhibición de fagos de diferentes bacteriófagos filamentosos. La preparación de conformidad con la presente invención puede administrarse a un organismo per se, o en una composición farmacéutica en donde se mezcla con vehículos o excipientes adecuados.

Como se usa en la presente, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en la presente con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica, es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. El término "ingrediente activo" se refiere a la preparación responsable del efecto biológico. En el contexto de una composición farmacéutica para su uso en una aplicación de diagnóstico, se pretende que el término "ingrediente activo" sea el anticuerpo que determina como blanco una molécula asociada con una enfermedad, trastorno o condición del cerebro. En lo sucesivo, las frases "vehículo fisiológicamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable", las cuales pueden usarse recíprocamente, se refieren a un vehículo o un diluyente que no causa irritación significativa a un organismo, y no suprime la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. El término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica que facilita adicionalmente la administración de un ingrediente activo. Ejemplos no limitativos de excipientes, incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles. Técnicas para la formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, ultima edición, cita que se incorpora en la presente como referencia. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, formación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, entrampado o liofilización. Las composiciones farmacéuticas para su uso de conformidad con la presente invención pueden formularse de este modo en una manera convencional, usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprendan excipientes y auxiliares, que faciliten el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que puedan usarse farmacéuticamente. Para administración por inhalación nasal, los ingredientes activos para su uso de conformidad con la presente invención se suministran convenientemente en la forma de una presentación de rocío en aerosol a partir de un empaque sometido a presión o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano o dióxido de carbono. Un rocío nasal, que no requiere un empaque o nebulizador sometido a presión como en un rocío de inhalación, puede usarse en forma alternativa para administración intranasal. En el caso de un aerosol sometido a presión, la unidad de dosificación puede determinarse proveyendo una válvula que suministre una cantidad dosificada. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un dispensador, conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente invención, incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito deseado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de ingredientes activos efectiva para prevenir, aliviar o mejorar síntomas de una enfermedad, trastorno o condición, o prolongar la supervivencia del sujeto que está siendo tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente o diagnósticamente efectiva está bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada provista en la presente. La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proveer niveles en el cerebro del vehículo de exhibición de fagos que sean suficientes para tratar o diagnosticar una enfermedad, trastorno o condición particular del cerebro (concentración mínima efectiva, MEC). La MEC variará para cada preparación, pero puede estimarse a partir de datos in vitro. Dosificaciones necesarias para lograr la MEC, dependerán de características individuales. Los intervalos de dosificación pueden determinarse también usando el valor de MEC. Deben administrarse preparaciones usando un régimen que mantenga niveles en el cerebro arriba de la MEC por 10 a 90% del tiempo, de preferencia entre 30 y 90%, y más preferiblemente 50 a 90%. Dependiendo de la severidad y sensibilidad de la condición que se va a tratar, la dosificación puede ser de una administración individual o una pluralidad de administraciones, durante el curso de tratamiento de varios días a varias semanas, o hasta que se efectúe la cura o se logre la disminución del estado de enfermedad. La cantidad de una composición que se va a administrar dependerá, de hecho, del sujeto que está siendo tratado o diagnosticado, la severidad de la enfermedad, el juicio del médico que prescribe, etc. Las composiciones de la presente invención pueden presentarse, si se desea, en un empaque o dispositivo dispensador, tal como un equipo aprobado por la FDA, que pueda contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen al ingrediente activo. El empaque puede comprender, por ejemplo, hoja delgada de plástico o metal, tal como un empaque de burbuja. El empaque o dispositivo dispensador puede estar acompañado de instrucciones para la administración. El empaque o dispensador puede ser acomodado también por una nota asociada con el contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, el uso o venta de formulaciones farmacéuticas, cuya nota refleje la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o la administración en humanos u otros animales. Dicha nota, por ejemplo, puede ser de marcación aprobada por la U.S. Food and Drug Administration para fármacos de prescripción, o de una inserción del producto aprobado. Pueden prepararse también composiciones que comprendan una preparación de la invención formulada en un vehículo farmacéutico compatible, puestas en un contenedor adecuado, y marcadas para tratamiento de una condición indicada, como se detalló anteriormente. Habiendo descrito ahora generalmente la invención, la misma se entenderá más fácilmente haciendo referencia al siguiente ejemplo, que se provee por medio de ilustración, y no se pretende que sea limitativo de la presente invención.

EJEMPLO Se construyeron en este estudio fagos filamentosos que exhiben una variante de proteína A sobre P3. Sin embargo, estudios previos han usado esta idea básica, de diferentes formas: Li et al. (1998) usaron un fago que exhibe el dominio B de proteína A fusionado con una molécula de scFv. Djojonegoro et al. (1994) usaron sólo el dominio B de proteína A exhibido sobre el fago M13, y Sampath et al. (1997) usaron el dominio B para demostrar que pueden usarse fagos filamentosos como herramientas de clonación. Todos estos estudios previos usaron técnicas de exhibición de fagos que permiten la selección fácil de formas mejoradas de proteína A exhibidas sobre el fago por unión del dominio de unión de IgG de proteína A a moléculas de IgG humanas. Los experimentos presentados a continuación en este estudio muestran que fagos que exhiben la variante de proteína A se unen con anticuerpos de ratón, principalmente del tipo de lgG1 y sus ligandos. Estos complejos se administraron por aplicación intranasal a ratones hAPP transgénicos. Entraron al cerebro de los ratones, y ejercieron efectos que se discuten a continuación.

Materiales y métodos Síntesis de la variante de proteína A La porción de proteína A que se usó contiene los cuatro dominios repetitivos, incluyendo el dominio B. Se sintetizaron dos iniciadores, el iniciador delantero con un codón de ATG y un sitio de restricción Ncol , y un iniciador inverso sin un codón de detención y con un sitio de restricción Notl (figura 1 A). Se realizó PCR usando el siguiente protocolo: Se combinaron 2 pg de ADN genómico de Staphylococcus aureus con 20 µ? de cada iniciador en 1 x regulador de pH de ADN polimerasa de Thermus aquaticus de Qiagen. Se añadieron dNTPs (0.2 mM) y 2.5 unidades de la polimerasa al volumen de reacción de 100 µ?. Las condiciones de PCR fueron: desnaturalización inicial por 3 minutos a 94°C, seguida de 30 ciclos de desnaturalización por 30 segundos a 94°C, unión por 1 minuto a 55°C y polimerización por 1 minuto a 72°C. El producto de PCR fue digerido con Ncol y Notl, purificado en gel y clonado en el vector pCANTAB 5E que fue linealizado previamente con Ncol y Notl. La clonación de esta porción del gen de proteína A en este vector generó una fusión de traducción de proteína A con el gen 3 del fago filamentoso (M13). Mediante el uso del fago auxiliar, se produjeron fagos que exhibían la fusión de proteína A-P3, designada como fago-protA.

ELISA La unión de fago-proteína A a diferentes anticuerpos de IgG, se midió por ELISA: 101 fagos que exhiben proteína A se mezclaron con 10 pg (15 nmoles) de anticuerpo en fosfato de sodio 0.1 M, pH 8.5. La mezcla se agitó suavemente a 37°C por 30 minutos, y se añadieron entonces alícuotas de 50 µ? por cuadruplicado a cavidades de ELISA recubiertas previamente con anticuerpo anti-fago de conejo y bloqueadas con leche a 3%. Se usó anticuerpo conjugado con HRP anti-ratón de cabra como un anticuerpo secundario. Se llevó a cabo reacción de HRP con OPD y peróxido. Los resultados se muestran como DO a 492 nm. La estabilidad de los complejos de fago-proteína A-anticuerpo después de la unión del antígeno, se verificó por el siguiente procedimiento: 1011 fagos que exhiben proteína A se mezclaron con 10 pg (15 nmoles) de anticuerpo en fosfato de sodio 0.1 M, pH 8.5. La mezcla se agitó suavemente a 37°C por 30 minutos, y el antígeno (0.32 nmoles de Abeta 1- 6 biotinilada) a relación molar de 50:1 en favor del anticuerpo, se añadió entonces a la mezcla de fago-proteína A y anticuerpos por otros 30 minutos. Se añadieron alícuotas (50 µ?) por cuadruplicado a placas de ELISA recubiertas previamente con anticuerpo anti-fago de conejo y bloqueadas con leche a 3%. Se usó conjugado de HRP-avidina para detectar complejos que se unieran a la placa de ELISA. Sólo los complejos de fago-anticuerpo que estuvieran aún unidos al antígeno reaccionarían con el conjugado de HRP-avidina. El suero usado en estos experimentos a una dilución de 1 :1000 se extrajo de un ratón con título contra epítope de ERFH. Para titular el número de fagos requeridos para unir diferentes cantidades de anticuerpos, se usó el anticuerpo 196, que demostró la mejor capacidad de unión a la proteína A, para recubrir las placas de ELISA en 3 diferentes concentraciones (50, 100 y 250 ng/cavidad), seguida de bloqueo de las cavidades con leche a 3%. Se añadieron fago-proteína A en diferentes concentraciones (109/ml-1012/ml), y los fagos unidos fueron detectados por anticuerpos anti-fago de conejo y anticuerpos de HRP anti-conejo de cabra. La unión de los complejos de anticuerpo-antígeno a fago-proteína A se tituló de la manera siguiente: 109/ml a 1012 mi de fagos se combinaron con dos concentraciones separadas de anticuerpo 2H3, 10 ng o 50 ng, y relaciones molares de 1 :2 de anticuerpo: antígeno (dos moléculas de antígeno por cada molécula de anticuerpo). Las mezclas se agitaron suavemente a 37°C por 30 minutos, y se añadieron entonces a cavidades de ELISA previamente recubiertas con anticuerpos anti-fago de conejo y recubiertas con leche a 3% en PBS. La detección de los fagos unidos se hizo con conjugado de HRP-avidina, que sólo puede unir los antígenos biotinilados. Se verificó también si la precipitación con PEG de complejos de fago-proteína A-anticuerpo causa o no su disociación: se recubrieron cavidades de ELISA con 20 pg/ml de avidina durante la noche a 40°C, y entonces con 1 pg/ml de péptido ?ß 1 -16 biotinilado, por 30 minutos a temperatura ambiente. Las cavidades fueron bloqueadas con leche a 3% en PBS. Se combinaron 1012 fagos con 1 pg o con 5 pg de anticuerpo 196 en 1 mi de Na2HP04 0.1 M, y se agitaron suavemente por 1 hora a 37°C. La mitad de la mezcla se precipitó usando PEG-NaCI, seguida de resuspensión en 500 µ? de Na2HPO4 0.1 M como se hizo anteriormente, y la otra mitad se usó sin precipitación. Ambas mezclas se aplicaron a la placa de ELISA descrita previamente (mezcla de 50 µ?/cavidad) por 1 hora a 37°C. La detección de los fagos unidos se llevó a cabo con conjugado de HRP anti-ratón de cabra y antifago de ratón. Se verificó también fago-proteína A para la generación de complejos de IgG anti-insulina. Se combinaron fago-proteína A (1012/ml) con diferentes concentraciones de anticuerpo anti-insulina, y se agitaron suavemente a 37°C por 30 minutos. Los complejos fueron precipitados con PEG antes de ser aplicados a las placas de ELISA que fueron recubiertas con 0.25 mg/ml de insulina durante la noche a 4°C. Los fagos unidos se detectaron con anticuerpos anti-ratón de cabra y anti-fago de ratón, o sólo con anti-ratón de cabra. Este segundo método de detección se usó para demostrar que el anticuerpo anti-insulina estuvo por supuesto presente en el complejo junto con fago-proteína A.

Estudios in vivo Se administraron a ratones PDAPP de nueve meses los complejos de fago-protA (con Ab 196 o con Ab anti-insulina más insulina) cada 2 semanas (4 tratamientos), y entonces cada mes en los siguientes 6 tratamientos, para un total de 10 tratamientos. Los complejos se dieron por aplicación intranasal, 20 microlitros divididos entre los dos nostrilos. Al final de los tratamientos, los ratones fueron sometidos a eutanasia y sacrificados. El hemisferio cerebral izquierdo de cada ratón se congeló en nitrógeno líquido. Cada hemisferio se homogenizó y se dividió en fracciones solubles e insolubles. Las fracciones solubles se solubilizaron después con clorhidrato de guanidina. Ambas fracciones se mantuvieron congeladas hasta su análisis. Se llevó a cabo la identificación de beta-amiloide 1 -42 por ELISA en sandwich, usando anticuerpo de captura y anticuerpo de detección, específico para ?ß 1 -42. La determinación de los niveles de citocinas se llevó a cabo con equipos específicos para IL-1 beta o IL-10 (R&D systems).

Resultados y discusión La variante de proteína A se sintetizó usando los iniciadores descritos en la figura 1 A. El producto de PCR se secuenció para verificar su integridad, y fue clonado entonces en pCANTAB5E. Se produjeron fagos que expresan la variante de proteína A fusionada con plll del fago, y se usaron en ELISA.

Fagos que exhiben la variante de proteína A unida principalmente a anticuerpos de lgG1 Se verificaron por ELISA fagos-protA para su unión a anticuerpos tipo IgG. En la figura 2, se muestra la unión de 1011 partículas de fago a 15 nmoles de diferentes anticuerpos.

Los anticuerpos unidos a fago-protA no se separan del fago después de que se unen a sus antígenos Se verificaron los anticuerpos para saber si se disocian o no del fago después de la unión a su antígeno. Como antígeno, se usó un péptido biotinilado de los residuos de aminoácido 1 a 16 del extremo N-terminal del péptido ß-amiloide. Los resultados de este experimento se resumen en la figura 2. Para este experimento, se mezclaron 1011 fagos que exhiben proteína A con 10 pg (15 nmoles) de anticuerpo en fosfato de sodio 0.1 M, pH 8.5. La mezcla se agitó suavemente a 37°C por 30 minutos, y entonces el antígeno (0.32 nmoles de ?ß 1 -16 biotinilada) a una relación molar de 50:1 en favor del anticuerpo se añadió a la mezcla de fago-proteína A y anticuerpos por otros 30 minutos. Los complejos se añadieron a cavidades de ELISA previamente recubiertas con anticuerpos anti-fago de conejo, y bloqueadas con leche a 3%. Se usó HRP-avidina conjugada para detectar complejos que se unieran a la placa de ELISA. Sólo los complejos de fago-anticuerpo que estuvieran unidos aún después de la unión del antígeno reaccionarían con el conjugado de HRP-avidina. El suero usado en estos experimentos se obtuvo de un ratón con título contra epítope de ERFH. La figura 3 demuestra que cuando los anticuerpos unidos a proteína A se unen con un antígeno que reconocen, no se separan de la proteína A. Los complejos de anticuerpo-antígeno que se separen de la placa de fago unido-protA serán arrastrados, y no reaccionarán con HRP-avidina. Como se mostró en la figura 2, 12B4 se unió débilmente a fago-protA. No reaccionó debido a que no se une al péptido 1 -16, y se usó como otro control negativo. Los resultados de unión no cambiaron cuando la placa de ELISA fue lavada con regulador de pH de PBS a pH 6.0. El pH menor no causó la disociación del complejo de anticuerpo-antígeno de fago-protA.

Titulación de la unión de proteína A a mAb 196 El número de fagos necesarios para unir diferentes cantidades de anticuerpos, se tituló para verificar que la unión sea específica. En este experimento, se usó anticuerpo 196, que demostró la mejor capacidad de unión a la proteína A, para recubrir placas de ELISA en 3 diferentes concentraciones, seguida de bloqueo de las cavidades con leche a 3%. Se añadieron diferentes concentraciones de fagos-proteína A, y los fagos unidos fueron detectados por anticuerpos anti-fago de conejo (figura 4). De la figura 4, es evidente que la unión de fago-proteína A al anticuerpo 96 es específica; es intensificada como una función del número de fagos y la concentración de anticuerpo. En este ambiente experimental, no se observó unión saturada.

Para estimar el número de fagos que exhiben proteína A, se recubrieron cavidades de ELISA con concentraciones elevadas de fago, y se hicieron reaccionar con anticuerpos anti-fago (no mostrados). Mediante la comparación de la DO a 492 entre este análisis y el análisis previo mostrado en la figura 4, pudo determinarse que aproximadamente 30% a 36% de los fagos exhiben la proteína A. Para determinar la cantidad de anticuerpo que se necesita para unir una cierta cantidad de fagos (que indicará también la cantidad de antígeno que se unirá), se llevó a cabo otro experimento en el cual se combinaron números elevados de fagos con dos concentraciones separadas de anticuerpo (2H3), y relaciones molares de 1 :2 de anticuerpo: antígeno (2 moléculas de antígeno por cada molécula de anticuerpo) (figura 5A). Las mezclas se añadieron a cavidades de ELISA, previamente recubiertas con anticuerpos anti-fago de conejo, y recubiertas con leche a 3% en PBS. La detección de los fagos unidos se hizo con conjugado de HRP-avidina, que sólo puede unir los antígenos biotinilados. Debido a que los valores observados para la unión a cada concentración de anticuerpo no difirieron mucho entre las diferentes concentraciones de fagos, los resultados pueden resumirse también como "promedio de promedios" y graficados como se muestra en la figura 5B. Estos resultados demuestran que la concentración del anticuerpo es el factor limitativo en este ambiente experimental, y no la concentración del fago: a 109/ml de fago-proteína A (5x107 fagos/50 µ? usados por cavidad de ELISA), existen suficientes moléculas de proteína A que se unen a 50 ng que es aproximadamente 70 pmoles, y no son suficientes para saturar 5x107 fagos-moléculas de proteína A.

La precipitación con PEG-NaCI no causó disociación masiva de fagos-anticuerpos Se verificó también si la precipitación con PEG de complejos de fago-proteína A-anticuerpo causa o no su disociación. Se recubrieron cavidades de ELISA con avidina y 1 pg/ml de péptido 1 -16 biotinilado. Las cavidades fueron bloqueadas con leche a 3% en PBS. Se combinaron 1012 fagos con 1 pg o con 5 pg de anticuerpo 196 en Na2HP04 0.1 M, y se agitaron suavemente por 1 hora a 37°C. Se precipitó la mitad de la mezcla usando PEG-NaCI, seguida de resuspensión en el mismo regulador de pH y el mismo volumen como se hizo anteriormente, y la otra mitad se usó sin precipitación. Ambas mezclas se aplicaron a la placa de ELISA descrita previamente (mezcla de 50 pg/cavidad) por 1 hora a 37°C. Se llevó a cabo detección de los fagos unidos con conjugado de HRP anti-ratón de cabra y anti-fago de ratón. La figura 6 muestra que las precipitaciones con PEG hicieron que aproximadamente 20% de los complejos de fago-proteína A-anticuerpo se disociaran.

Faqo-proteína A se unen al inmunocomplejo de anticuerpo antiinsulina e insulina Se combinaron fago-proteína A con IgG anti-insulina, y los complejos se usaron en placas de ELISA que se recubrieron con 0.25 mg/ml de insulina. Los complejos fueron precipitados con PEG antes de ser aplicados a la placa de ELISA. Los fagos unidos se detectaron con anticuerpos anti-ratón de cabra y anti-fago de ratón (figura 7A) o sólo con antiratón de cabra (figura 7B). Este segundo método de detección se usó para demostrar que el anticuerpo anti-insulina estuvo por supuesto presente en el complejo con fago-proteína A. Se combinaron fago-proteína A (1012/ml) con anticuerpos antiinsulina a diferentes concentraciones, y se agitaron suavemente a 37°C por 30 minutos. Los complejos fueron precipitados con PEG antes de ser aplicados a las placas de ELISA. Los fagos unidos se detectaron con anticuerpos anti-fago de ratón seguidos de anticuerpos anti-ratón de cabra. Los resultados de una prueba similar como se muestra en la figura 7A, pero detectada sólo con anticuerpos anti-ratón de cabra, se muestran en la figura 7B. En resumen, se generó un fago filamentoso que exhibe una variante de proteína A que puede unirse a anticuerpos del tipo de IgG. Opuestamente a la proteína A nativa de Staphylococcus aureus que se une fuertemente a lgG2a e lgG2b de ratón, esta proteína A recombinante se une a moléculas de lgG1 de ratón, que son el tipo más abundante y mejor. Estos fagos pueden usarse in vitro para purificar anticuerpos o, por ejemplo, pueden usarse in vivo para suministrar ciertos anticuerpos hacia el cerebro.

Estudios in vivo Fago-protA-196. Se aplicaron complejos de fago-protA-196 a ratones transgénicos PDAPP, como se explica en la sección de materiales y métodos. Se verificaron los niveles de péptido ß-amiloide 1 -42 en las fracciones solubles e insolubles (péptidos agregados y membranas que fueron solubilizados con clorhidrato de guanidina) y los niveles de ?ß 1 -40 en las fracciones insolubles. Se observó una reducción aproximada de 20% en la cantidad de ?ß 1 -42 en las fracciones solubles e insolubles en ratones tratados, en comparación con controles no tratados transgénicos. Sin embargo, los resultados no fueron significativos (figura 8). En ?ß 1 -40, no se observaron diferencias entre los ratones tratados con los complejos de fago en comparación con ratones no tratados control. Fago-protA-anti-insulina-insulina. Se trató a ratones PDAPP con complejos de fago-anticuerpo-insulina. En la figura 9A, se observó una diferencia más dramática en el nivel de ?ß 1 -42 insoluble, una reducción de aproximadamente 63% en ratones tratados con complejo, en comparación con ratones Tg no tratados o para ratones tratados con complejos de fago-196. Los ratones tratados sólo con fago tuvieron una reducción promedio de 23% en los niveles de ?ß 1 -42. La reducción en el nivel de ?ß 1 -42 soluble en ratones tratados fue incluso más dramática, y alcanzó 80% en comparación con los controles (figura 9B). Se verificaron los niveles de IL-? ß, una citocina proinflamatoria, e IL-10, una citocina antiinflamatoria. Los niveles de IL-? ß en ratones transgénicos no tratados fueron aproximadamente 36% mayores que los niveles de IL- ß en ratones no transgénicos (figura 10A), significando que la enfermedad causó inflamación que se manifiesta en mayores concentraciones de IL-? ß. Sin embargo, los ratones tratados con complejo, tenían un nivel similar a los niveles de 1L-1 ß en ratones no transgénicos, sugiriendo que los ratones tratados no desarrollaron inflamación del cerebro. El mismo fenómeno se observó en las concentraciones de la citocina antiinflamatoria, IL-10 (figura 10B). Aquí, de nuevo, los niveles de IL-10 fueron similares en los ratones no transgénicos y en los ratones transgénicos tratados, en comparación con ratones transgénicos control que tenían en promedio 18% menos IL-10. Los niveles de citocina en ratones PDAPP que recibieron fago-protA-196 no mostraron diferencia entre ratones tratados y controles transgénicos (datos no mostrados). Estudios previos han sugerido un efecto precisamente de mejora de la insulina sobre la función de memoria por medio de la vía intranasal de administración de insulina que se sabe provee acceso directo de la sustancia hacia el compartimiento de fluido cerebroespinal (Strachan, 2005). Estudios previos indican una prevalencia de receptores de insulina en las regiones límbica e hipocámpica, así como mejoras en la memoria con insulina sistémica. Se combinó insulina con fagos para demostrar que un número incrementado de fagos se introducen hacia el cerebro, llevando a reducción efectiva en la carga amiloide. El efecto va acompañado de mejora en el perfil de citocinas en el cerebro. Este efecto acumulativo puede ser una forma eficiente de tomar propiedades anti-agregación de los fagos, más mejor penetración por medio de la insulina, como un tratamiento protector ante la AD. Habiendo descrito ahora completamente esta invención, los expertos en la técnica apreciarán que la misma puede realizarse dentro de una amplia escala de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes sin que se aparten del espíritu y alcance de la invención y sin experimentación indebida. Mientras que esta invención se ha descrito con relación a modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de sufrir otras modificaciones. Se pretende que esta solicitud abarque cualquier variación, uso o adaptación de las invenciones siguientes, en general, los principios de la invención, incluyendo dichas desviaciones de la presente descripción como aparecen dentro de la práctica conocida o acostumbrada dentro de la técnica a la cual la invención pertenece, y como pueden aplicarse a las características esenciales expuestas anteriormente como se desprende en el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo artículos o resúmenes de revistas, solicitudes de patente de E.U.A. o extranjeras publicadas o correspondientes, patentes de E.U.A. o extranjeras expedidas, o cualquier otra referencia, se incorporan enteramente en la presente como referencia, incluyendo todos los datos, cuadros, figuras y texto presentados en las referencias citadas. Además, el contenido entero de las referencias citadas dentro de las referencias citadas en la presente, se incorpora también en la presente como referencia. La referencia a pasos de métodos conocidos, pasos de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales, de ninguna manera es una admisión de que cualquier aspecto, descripción o modalidad de la presente invención se describe, enseña o sugiere en la técnica relevante. La descripción anterior de las modalidades específicas revelará completamente de esta manera la naturaleza general de la invención que otros pueden, aplicando el conocimiento dentro de la aptitud de la técnica (incluyendo el contenido de las referencias citadas en la presente), modificar y/o adaptar fácilmente varias aplicaciones a dichas modalidades específicas, sin experimentación indebida, sin que se aparten del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que dichas adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado y la escala de equivalentes de las modalidades descritas, con base en la enseñanza y guía presentadas en la presente. Se entenderá que la fraseología o terminología de la presente es con el propósito de descripción, y no de limitación, de modo que la terminología o fraseología de la presente especificación será interpretada por los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas y guía presentadas en la presente, en combinación con el conocimiento del experto en la técnica.

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - Un vehículo de exhibición de fagos, que comprende un bacteriófago filamentoso que exhibe sobre su superficie como una molécula no nativa de bacteriófago filamentoso, proteína A, o un fragmento o variante de la misma, capaz de unirse a la porción Fe de anticuerpos, y un anticuerpo o un inmunocomplejo de antígeno-anticuerpo unido a dicha proteína A o fragmento o variante de la misma por su porción Fe, con la condición de que el bacteriófago filamentoso no sea tampoco conjugado a través de un enlazador o directamente a un fármaco, y que el anticuerpo o inmunocomplejo no sea tampoco inmovilizado sobre un vehículo sólido. 2. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el bacteriófago filamentoso se selecciona del grupo que consiste de bacteriófago M13, f1 y fd, y cualquier mezcla de los mismos. 3. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el bacteriófago filamentoso es M13. 4.- El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo es de la clase de IgG. 5.- El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo unido a dicha proteína A o fragmento o variante de la misma, es un anticuerpo monoclonal. 6. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal producido contra o específico para el péptido ß amiloide de ?ß 1 -42 o ?ß 1-40. 7. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal es específico para una molécula objetivo asociada con una enfermedad, trastorno o condición del cerebro. 8. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicha enfermedad, trastorno o condición del cerebro es una enfermedad o trastorno formador de placas. 9. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal es marcado. 10. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho inmunocomplejo unido a dicha proteína A o un fragmento o variante de la misma, es un inmunocomplejo de insulina y un anticuerpo anti-insulina. 1 1. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha molécula no nativa de bacteriófago filamentoso exhibida sobre la superficie de dicho bacteriófago filamentoso consiste de proteína A, o un fragmento o variante de la misma capaz de unirse a la porción Fe de anticuerpos, unida a un anticuerpo o inmunocomplejo de antígeno-anticuerpo. 12. - Un vehículo de exhibición de fagos, que comprende un bacteriófago filamentoso que exhibe sobre su superficie como una molécula no nativa de bacteriófago filamentoso, proteína A, o un fragmento o variante de la misma, capaz de unirse a la porción Fe de anticuerpos, y un anticuerpo unido a dicha proteína A o fragmento o variante de la misma por su porción Fe, en donde dicho anticuerpo es específico para una molécula que no es presentada como un objetivo sobre la superficie de una célula, y con la condición de que el anticuerpo no sea tampoco inmovilizado sobre un vehículo sólido. 13. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el bacteriófago filamentoso se selecciona del grupo que consiste de bacteriófago M13, f1 y fd, y cualquier mezcla de los mismos. 14. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el bacteriófago filamentoso es M13. 15.- El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el anticuerpo es de la clase de IgG. 16.- El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el anticuerpo unido a dicha proteína A o fragmento o variante de la misma, es un anticuerpo monoclonal. 17. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal producido contra o específico para el péptido ß amiloide de ?ß 1 -42 o ?ß 1 -40. 18. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal es específico para una molécula objetivo asociada con una enfermedad, trastorno o condición del cerebro. 19. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha enfermedad, trastorno o condición del cerebro es una enfermedad o trastorno formador de placas. 20. - Una composición farmacéutica que comprende el vehículo de exhibición de fagos de la reivindicación 1 o la reivindicación 12, y un vehículo, excipiente, diluyente o agente auxiliar farmacéuticamente aceptable. 21. - El uso del vehículo de exhibición de fagos de la reivindicación 1 o la reivindicación 12, para preparar un medicamento administrable intranasalmente útil para tratar o inhibir una enfermedad, trastorno o condición del cerebro en un sujeto que necesita del mismo. 22. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde dicha enfermedad, trastorno o condición del cerebro es una enfermedad o trastorno formador de placas. 23. - El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde la enfermedad o trastorno formador de placas es enfermedad de Alzheimer. 24. - El uso como se reclama en la reivindicación 23, en donde el anticuerpo unido a dicha proteína A o fragmento o variante de la misma exhibido sobre el vehículo de exhibición de fagos, es un anticuerpo específico para un péptido ß amiloide. 25. - El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde dicho anticuerpo es específico para el péptido ß amiloide 1 -42 o 1-40. 26. - El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde la enfermedad o trastorno formador de placas es una enfermedad causada por priones. 27. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde dicha enfermedad, trastorno o condición del cerebro es un tumor del cerebro. 28. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde dicha enfermedad, trastorno o condición del cerebro es una enfermedad, trastorno o condición inflamatoria del cerebro. 29. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde el sujeto es un mamífero. 30. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde el sujeto es un humano. 31. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde dicho inmunocomplejo unido a dicha proteína A o fragmento o variante de la misma, es un inmunocomplejo de insulina y un anticuerpo anti-insulina. 32. - El uso de un vehículo de exhibición de fagos de la reivindicación 1 o la reivindicación 12 para preparar una composición administrable intranasalmente útil para diagnosticar una enfermedad, trastorno o condición del cerebro en un sujeto que necesita del mismo; en donde dicho vehículo de exhibición de fagos es detectable con su anticuerpo componente unido a una molécula objetivo asociada con una enfermedad, trastorno o condición del cerebro. 33. - El uso como se reclama en la reivindicación 32, en donde el anticuerpo es marcado detectablemente. 34.- El uso como se reclama en la reivindicación 33, en donde el anticuerpo es marcado detectablemente con un radionúclido. 35. - El uso como se reclama en la reivindicación 33, en donde el anticuerpo es marcado detectablemente con un agente de contraste. 36. - El vehículo de exhibición de fagos de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho anticuerpo es específico para IL-6. 37. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque dicho anticuerpo es específico para IL-6. 38.- El uso como se reclama en la reivindicación 28, en donde dicho anticuerpo es específico para IL-6, y la inflamación del cerebro es el resultado de accidente cerebrovascular, lesión del cerebro u otra enfermedad neurodegenerativa.