CN101406489B - 微生态复合菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

微生态复合菌剂的制备方法，它涉及一种微生态制剂的制备方法。它解决了现有的微生态制剂只能够在短时间内、暂时性的增加和补充人体肠道内益生菌的数量，竞争力差、生存能力差，往往停止服用一段时间后益生菌便消磨殆尽的问题。微生态复合菌剂主要由纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌、嗜酸乳杆菌和大豆低聚糖组成。制备方法：培养；扩大培养；转入高菌浓度培养液继续培养、离心；加入辅料，预冻、真空冷冻干燥，之后加入大豆低聚糖，即得到微生态复合菌剂。本发明微生态复合菌剂中有益菌活菌总数为1.0×10¹⁰～9.9×10¹⁰个/克，不仅单位数量巨大且2年后活菌存活率仍高于98％。

Description

微生态复合菌剂的制备方法 

技术领域

本发明涉及一种微生态制剂的制备方法。 

背景技术

随着生活节奏的加快、食品种类和样式的增加，以及环境污染、乱用抗生素等因素导致人体肠道内微生态环境紊乱，致使人体内积毒引发便秘、腹泻、肝炎和其他消化道疾病，严重的甚至会威胁生命。除了注意饮食卫生、均衡膳食、加强体育锻炼外，采用微生态制剂重新构建肠道内健康微生态环境是一种理想的方法。 

目前的微生态制剂中益生菌的活菌数量少(都低于3亿个/克)，且制备后益生菌的活菌数随时间的增加而降低(1.5年活菌数仅为制备之初的50％～55％)，因此现有的微生态制剂调节能力差、保质期短。(目前市场常用微生态制剂的指标如表1所示。) 

表1 

由于现有的微生态制剂中益生菌活菌的数量少，加之人体肠道内环境的紊乱已不利于益生菌的存活；所以，服用现有的微生态制剂只能够在短时间内、暂时性的增加和补充人体肠道内益生菌的数量，却不能使益生菌在人体肠道内“有效”的存活，因此益生菌难以在人体肠道内形成规模，导致竞争力差、生存能力差，往往停止服用一段时间后益生菌便消磨殆尽，只有继续补充新的益生菌才能达到“短暂”的缓解。因此，现有的微生态制剂并不能从根本上调节和改善人体肠道的内环境。 

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的微生态制剂只能够在短时间内、暂时性的增加和补充人体肠道内益生菌的数量，却不能使益生菌在人体肠道内“有效”的存活，导致益生菌难以形成规模，竞争力差、生存能力差，往往停止服用一段时间后益生菌便消磨殆尽的问题，而提供的一种微生态制剂的制备方法。 

微生态复合菌剂主要由纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌、嗜酸乳杆菌和大豆低聚糖组成；每克微生态复合菌剂中纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌和嗜酸乳杆菌的活菌总数为1.0×10¹⁰～9.9×10¹⁰个，纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌与嗜酸乳杆菌的菌落数比为1～3∶1～3∶1～3；微生态复合菌剂中大豆低聚糖的质量占微生态复合菌剂总质量的10％～30％。 

微生态复合菌剂按以下步骤进行制备：一、分别对纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌和嗜酸乳杆菌进行培养；二、扩大培养；三、将乳酸克鲁维酵母菌、嗜酸乳杆菌和纳豆芽孢杆菌分别转入相应的高菌浓度培养液继续培养至菌落浓度为1.0×10⁷～9.9×10⁹个/mL，然后在0～4℃、5000～10000r/min的条件下离心15～50min；四、将三种菌体离心沉淀物分别放入含有脱脂乳粉、海藻糖、甘油、蔗糖、谷氨酸钠的保护剂中，然后在-10～-70℃的环境中预冻10～24h，再在无菌条件下真空冷冻干燥，三种菌的冻干粉等质量混合后加入大豆低聚糖，即得到微生态复合菌剂；其中步骤四中大豆低聚糖的加入量占微生态复合菌剂总质量的10％～30％；步骤四中菌体离心沉淀物与保护剂的重量比为1～9∶10，保护剂中脱脂乳粉的质量浓度为10％、海藻糖的质量浓度为1％、甘油的质量浓度为1％、蔗糖的质量浓度为1％、谷氨酸钠的质量浓度为0.1％。 

本发明微生态复合菌剂采用“三菌一剂”的生态构架：选用了能够产生吡啶二羧酸和抗菌肽的纳豆芽孢杆菌，具有生态夺氧、促进消化吸收作用的乳酸克鲁维酵母菌，人体内源性益生菌嗜酸乳杆菌，以及大豆低聚糖组成。本发明微生态复合菌剂中有益菌活菌总数为1.0×10¹⁰～9.9×10¹⁰个/克，不仅单位数量巨大且2年后活菌存活率仍高于98％。本发明微生态复合菌剂服用后在人体肠道内以菌促菌(不仅“三菌”之间相互促进，也同时促进人体肠道内其它有益菌的生长)、以菌治菌(抑制人体肠道内有害菌和条件致病菌的存活)，加之单位数量巨大且存活率高，可以在人体肠道内迅速壮大有益菌群数量，并有效的抑制有害菌的生长和繁殖，从而占据并主导人体肠道内环境，达到调节和改善人体肠道内环境的目的，克服了补充、消耗、再补充益生菌的不良循环，从根本上改善人体肠道内环境，实现了有益菌的长期有效。 

本发明微生态复合菌剂适用于婴幼儿、老年人和各种菌群失调症状的人群，有效率达96％以上，并可作为癌症和术后患者的辅助治疗，能有效增强患者体质、促进康复。本发明微生态复合菌剂可通过胃肠道、口腔进行给药，还 可以通过泌尿生殖道和皮肤给药用于调整泌尿生殖道及皮肤的微生态环境。 

本发明微生态复合菌剂的制备方法可以保证微生态复合菌剂中的活菌数量及存活率。 

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。 

具体实施方式一：本实施方式微生态复合菌剂主要由纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌、嗜酸乳杆菌和大豆低聚糖组成；每克微生态复合菌剂中纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌和嗜酸乳杆菌的活菌总数为1.0×10¹⁰～9.9×10¹⁰个，纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌与嗜酸乳杆菌的菌落数比为1～3∶1～3∶1～3；微生态复合菌剂中大豆低聚糖的质量占微生态复合菌剂总质量的10％～30％。 

根据急性毒性试验证明本实施方式微生态复合菌剂无任何毒副作用。本实施方式微生态复合菌剂的半数致死量为最大耐受量13g/(kg·bw)以上。 

本实施方式微生态复合菌剂能调整抗生素相关性腹泻引发的小鼠肠道菌群失调，对小鼠实验性具有明显的止泻作用，有效率达99％；而且对小鼠肠道内乳杆菌和双歧杆菌有显著扶持作用(P<0.01)，并能加速肠道正常菌群的恢复。 

本实施方式微生态复合菌剂在人体肠道内能够防止有害的胺和氨生成，维持肠道pH值和增强竞争拮抗作用，抑制致病菌，刺激机体建立完善的免疫系统，提高人体体质。 

本实施方式中使用的纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌和嗜酸乳杆菌均为可以购买得到的常用菌株。本实施方式中大豆低聚糖为双歧因子，可以促进双歧杆菌的生长。 

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌与嗜酸乳杆菌的菌落数比为1∶1∶1。其它与实施方式一相同。 

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：微生态复合菌剂中还包括占微生态复合菌剂总质量1～30％的脱脂乳粉、1～3％的海藻糖、 1～3％的甘油、1～3％的蔗糖和0.1～0.3％的谷氨酸钠。其它与实施方式一相同。 

本实施方式微生态复合菌剂对由使用抗生素引发的肠道菌群失调所致的腹泻的治愈率可达98％以上。本实施方式中将脱脂乳粉、海藻糖、甘油、蔗糖和谷氨酸钠溶于蒸馏水中制成保护剂，使保护剂中脱脂乳粉的质量浓度为10％、海藻糖的质量浓度为1％、甘油的质量浓度为1％、蔗糖的质量浓度为1％、谷氨酸钠的质量浓度为0.1％。本实施方式中菌体离心沉淀物与保护剂按1～9∶10重量比混合。 

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：每克微生态复合菌剂中纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌和嗜酸乳杆菌的活菌总数为2.0×10¹⁰个。其它与实施方式一相同。 

具体实施方式五：本实施方式微生态复合菌剂按以下步骤进行制备：一、分别对纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌和嗜酸乳杆菌进行培养；二、扩大培养；三、将乳酸克鲁维酵母菌、嗜酸乳杆菌和纳豆芽孢杆菌分别转入相应的高菌浓度培养液继续培养至菌落浓度为1.0×10⁷～9.9×10⁹个/mL，然后在0～4℃、5000～10000r/min的条件下离心15～50min；四、将三种菌体离心沉淀物分别放入含有脱脂乳粉、海藻糖、甘油、蔗糖、谷氨酸钠的保护剂中，然后在-10～-70℃的环境中预冻10～24h，再在无菌条件下真空冷冻干燥，三种菌的冻干粉等质量混合后加入大豆低聚糖，即得到微生态复合菌剂；其中步骤四中大豆低聚糖的加入量占微生态复合菌剂总质量的10％～30％；步骤四中菌体离心沉淀物与保护剂的重量比为1～9∶10，保护剂中脱脂乳粉的质量浓度为10％、海藻糖的质量浓度为1％、甘油的质量浓度为1％、蔗糖的质量浓度为1％、谷氨酸钠的质量浓度为0.1％。 

经检测本实施方式制备的微生态复合菌剂中脱脂乳粉占微生态复合菌剂总质量的1～30％、海藻糖占微生态复合菌剂总质量的1～3％、甘油占微生态复合菌剂总质量的1～3％、蔗糖占微生态复合菌剂总质量的1～3％、谷氨酸钠占微生态复合菌剂总质量的0.1～0.3％。 

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤一中嗜酸乳杆菌在25～40℃、100～180r/min的条件下用乳清培养基旋转或振荡培养24～72h；步骤一中乳酸克鲁维酵母菌在25～40℃、100～180r/min的条件下用乳 清培养基旋转或振荡培养24～72h；步骤一中纳豆芽孢杆菌在25～40℃、100～180r/min的条件下用蔗糖肉胨液体培养基旋转或振荡培养24～72h。其它步骤及参数与实施方式五相同。 

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤一中用于培养嗜酸乳杆菌的乳清培养基按重量百分比由0.5％的酵母膏、0.03％的胱氨酸和余量波美度为5°BX的麦芽汁组成，并调节pH值为6.8。其它步骤及参数与实施方式六相同。 

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤一中用于培养乳酸克鲁维酵母菌的乳清培养基为波美度是10°BX的麦芽汁，并调节pH值为6.8。其它步骤及参数与实施方式六相同。 

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤一中用于培养纳豆芽孢杆菌的液体培养基按重量百分比由2.0％的麦芽糖、1.5％的大豆胰蛋白胨、0.2％的酵母膏、0.3％的K₂HPO₄、0.05％的MgSO₄.5H₂O、0.02％的CaCl₂.5H₂O和余量的蒸馏水组成，并调节pH值为7.0。其它步骤及参数与实施方式六相同。 

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤三中嗜酸乳杆菌的高菌浓度培养液按重量百分比由10％的乳清粉、1％的葡萄糖、0.03％的胱氨酸和余量的蒸馏水组成，并调节pH值为6.8。其它步骤及参数与实施方式五相同。 

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤三中乳酸克鲁维酵母菌的高菌浓度培养液按重量百分比由10％的乳清粉、1％的葡萄糖和余量的蒸馏水组成，并调节pH值为6.8。其它步骤及参数与实施方式五相同。 

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤三中纳豆芽孢杆菌的高菌浓度培养液按重量百分比由1％的蛋白胨、1％的蔗糖、1％的牛肉浸膏、0.5％的NaCl和余量的蒸馏水组成，并调节pH值为6.8。其它步骤及参数与实施方式五相同。 

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：微生态复合菌剂中大豆低聚糖的质量占微生态复合菌剂总质量的15％～25％。。其它与 实施方式一相同。 

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：微生态复合菌剂中大豆低聚糖的质量占微生态复合菌剂总质量的20％。其它与实施方式一相同。 

具体实施方式十五：本实施方式微生态复合菌剂按以下步骤进行制备：一、分别对纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌和嗜酸乳杆菌进行培养；二、扩大培养；三、将纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌和嗜酸乳杆菌分别转入相应的高菌浓度培养液继续培养至菌落浓度为1.0×10⁸个/mL，然后在0℃、8000r/min的条件下离心30min；四、将三种菌体离心沉淀物分别放入含有脱脂乳粉、海藻糖、甘油、蔗糖和谷氨酸钠的保护剂中，然后在-20～-50℃的环境中预冻15～20h，再在无菌条件下真空冷冻干燥，三种菌的冻干粉等质量混合后加入大豆低聚糖，即得到微生态复合菌剂；其中步骤四中大豆低聚糖的加入量占微生态复合菌剂总质量的10％～30％；步骤四中菌体离心沉淀物与保护剂的重量比为3∶10，保护剂中脱脂乳粉的质量浓度为10％、海藻糖的质量浓度为1％、甘油的质量浓度为1％、蔗糖的质量浓度为1％、谷氨酸钠的质量浓度为0.1％。 

本实施方式微生态复合菌剂通过“生态夺氧”在人体肠道内制造厌氧内环境，产生具有抵抗和抑制腐败菌生长的有机酸和细菌素。 

将本实施方式制得的微生态复合菌剂与可溶性膳食纤维按3∶1的重量比混合，然后灌制胶囊，即得到微生态复合菌剂胶囊，也可以采用包埋技术制备微生态复合菌剂胶囊。 

由于益生菌的生存形态有“三怕”——怕水、怕氧、怕胃酸的特性，因此本实施方式肠溶类胶囊型微生态制剂产品可有效的避免水、氧和胃酸的侵袭将微生态复合菌剂送到肠道。 

通过动物实验的方式对本实施方式微生态复合菌剂的治疗效果进行验证： 

1.采用昆明种SPF小鼠，雄性，体质量20±2g/只共270只(由哈尔滨医科大学实验动物学部(中心)提供。实验动物使用许可证号SYXK(黑)2006-033)。作为受试动物。 

2.采用氨苄青霉素钠口服胶囊(商品名：安必仙香港联邦制药厂有限公司出品。生产日期：20060914规格：250mg/盒×24粒/盒)作为模型构建药 物。 

3.采用灌胃的方法，构建实验性小鼠腹泻及肠道菌群失调整的动物模型。小鼠每日灌胃量0.16622mg/只，每只灌胃量为0.2mL。除了健康组(10只小鼠)之外，260只小鼠均需要制成模型，每日共需要氨苄青霉素43.2172mg，则总灌胃液量52mL。灌胃天数为10天，观察小鼠出现腹泻的情况。 

4.健康对照组基础数据测定： 

随机取健康小鼠10只，颈椎脱臼处死后，在无菌条件下进行剖解，剪取10mm的盲肠并将内容物置入10mL的无菌生理盐水中，振荡洗涤，使肠内容物充分稀释，制成稀释匀浆液，然后连续10倍梯度稀释，吸取稀释度10^-4、10^-5、10^-6和10^-7的稀释液0.1mL，分别滴入EMB和EC及TSC和改良GAM培养基中；吸取10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的稀释液0.1mL，分别滴入BBL和LBS培养基中；每种菌做2个平行平皿。其中BBL、TSC、改良GAM置入厌氧袋中，37℃厌氧培养，BBL、改良GAM培养48h，TSC培养24h。EMB、EC和LBS置入37℃恒温培养箱，EC和LBS培养48h，EMB培养24h。然后观察结果，计算肠杆菌、肠球菌、乳杆菌双歧杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌和拟杆菌的菌落数，进行肠道菌群分析。 

5.模型确立： 

随机选取具腹泻代表性的小鼠10只，颈椎脱臼处死后，在无菌条件下进行剖解，剪取10mm的盲肠并将内容物置入10mL的无菌生理盐水中，振荡洗涤，使肠内容物充分稀释，制成稀释匀浆液，然后连续10倍梯度稀释，吸取稀释度10^-6、10^-7、10^-8和10^-9的稀释液0.1mL，分别滴入EMB和EC及TSC和改良GAM培养基中；吸取10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的稀释液0.1mL，分别滴入BBL和LBS培养基中；每种菌做2个平行平皿。其中BBL、TSC、改良GAM置入厌氧袋中，37℃厌氧培养，BBL、改良GAM培养48h，TSC培养24h。EMB、EC和LBS置入37℃恒温培养箱，EC和LBS培养48h，EMB培养24h。然后观察菌落生长情况，进行菌落计数，计算肠杆菌、肠球菌、乳杆菌双歧杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌和拟杆菌的菌落数，进行肠道菌群分析。 

6.通过采用灌胃的方式，对本实施方式微生态复合菌剂进行实验性小鼠模型腹泻及菌群紊乱的治疗实验：

6.1灌胃剂量的计算： 

经过模型构建后，已构建成功的小鼠体重普遍增长至30～40g，故每只鼠的灌胃量会有不同程度的增加，则每只鼠大约灌胃量为0.3～0.4mL。 

剂量组的设计：将成人正常推荐量3次/日×2粒×0.5g/粒÷70kg＝0.4286mg/10g·bw的5倍设定为小剂量组、10倍设定为中剂量组、20倍设定为大剂量组。 

小剂量组50只： 

0.4286mg/10g·bw×5倍×4倍bw×10只×5组＝428.6mg灌胃0.1mL/只，配成5mL 

中剂量组50只： 

0.4286mg/10g·bw×10倍×4倍bw×10只×5组＝857.2mg灌胃0.2mL/只，配成10mL 

大剂量组50只： 

0.4286mg/10g·bw×20倍×4倍bw×10只×5组＝1714.4mg灌胃0.4mL/只，配成20mL 

合计150只共需3000.2mg药粉配成35mL，为方便操作，取6粒本实施方式微生态复合菌剂配成35mL。 

灌胃天数为分别为3、7、10、14、17天。灌胃器及所用容器均需无菌处理。 

对照组的设计：由于机体内的肠道菌数量和种类会随着抗菌素的停用及体能的增强而部分逐渐恢复的特点，因此本实验分别设定了自愈对照组50只和灌胃生理盐水为安慰剂的盐水对照组50只，分别设定为灌胃天数为3、7、10、14、17天的5个组。 

6.2实验方法： 

将抗生素氨苄青霉素相关性腹泻小鼠模型已构建成功的小鼠随机分为5组：自愈对照组50只、盐水对照组50只、小剂量组50只、中剂量组50只、大剂量组50只，分别设定为灌胃3、7、10、14、17天的5个组，每组10只。每天灌胃一次，观察小鼠腹泻、饮食、精神及活动等健康状况。分别在灌胃本实施方式微生态复合菌剂的第3、7、10、14、17天测定相应天数组的2个对 照组和3个剂量组的小鼠的盲肠内容物中的6种肠道菌的活菌数，进行肠道菌分析，方法与模型组肠道菌群的测定方法相同。 

7.统计学处理 

各组实验数据经整理后用mean±SD表示，采用JMTJFX统计学软件对实验数据进行两样本均数t检验或t′检验分析或单因素多个样本均数比较的t检验或t′检验分析。 

8.实验结果 

8.1实验性小鼠腹泻及肠菌群失调症模型的构建结果： 

通过对模型小鼠健康对照组10只小鼠和模型组260只小鼠灌胃氨苄青霉素10天中腹泻、饮食、精神及活动等健康状况的观察，发现健康组和在进行氨苄青霉素造模前，100％小鼠为正常大便(无腹泻)；造模第7天时，98.85％为重度(III度)或中度(II度)腹泻，有萎靡症状，皮毛不光滑；造模第10天，100％模型小鼠出现重度腹泻，精神萎靡，不爱活动，有部分小鼠出现不同程度的臀部皮肤溃烂的症状。结果见表2。 

表2实验性小鼠腹泻情况的观察结果 

结论：从表2可看出与不灌胃的健康组比较，SPF小鼠在灌胃第7天时出现腹泻的小鼠数量已相当显著，已表明造模成功。为了巩固模型的稳定，维持到第10天时，已有100％的小鼠出现腹泻，证明小鼠腹泻模型构建成功。 

此外，通过对小鼠的盲肠内容物中的6种肠道菌的活菌数的测定，并采用JMTJFX统计学软件对实验数据进行了两样本均数t检验或t′检验分析。与健康对照组相比较，模型小鼠肠菌群中肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌及拟杆菌数量显著增高(P<0.01)；而双歧杆菌和乳杆菌显著减少(P<0.01)。证实模型小鼠出现了菌群失调症。结果见表3。 

表3实验性小鼠腹泻及肠菌群失调症模型的构建结果(单位CFU/mL) 

  

组别

肠杆菌(EMB)

肠球菌(EC)

双歧菌(BBL)

乳杆菌(LBS)

荚膜梭菌(TSC)

拟杆菌 (改GAM)

健康组

3.37x104±0.12

1.21x105±0.18

6.84x108±1.79

8.45x108±1.80

0.00x106±0.00

0.00x107±0.00

模型组

14.31x108 ±6.62**↑

11.69x107 ±0.64**↑

3.47x108  ±2.05**↓

1.82x108  ±1.72**↓

8.80x106  ±1.21**↑

7.82x107  ±2.11**↑

注：“^**↑”表示增加极显著(P<0.01)，“^**↓”表示减少极显著(P<0.01) 

结论：由表3可见氨苄青霉素造成小鼠肠道内6种主导菌群的数量与正常健康组比较明显改变，并发生紊乱，肠道菌群失调，致使出现中、重度腹泻体征，证明该实验性小鼠腹泻及肠道菌群失调症的模型构建成功。 

8.2本实施方式微生态复合菌剂对实验性小鼠模型腹泻及菌群紊乱的治疗结果： 

8.2.1本实施方式微生态复合菌剂对实验性小鼠腹泻模型的治疗结果： 

通过对小鼠2个对照组和3个实验组分别灌胃3、7、10、14、17天时腹泻、饮食、精神及活动等健康状况的观察发现，各给药组中在治疗第3天起腹泻症状已有明显好转，至第10天时已有90％～99％的小鼠排出正常便。结果见表4。 

表4本实施方式微生态复合菌剂灌胃3～17天治疗腹泻情况观察结果(单位：只/％) 

由表4可见与自愈组和生理盐水2个对照组相比较，各给药组在治疗第3天时已有70％～80％的小鼠排正常便，自愈组和生理盐水组只有10％排正常便；治疗第7给药组中有80％～90％的小鼠排正常便，自愈组和生理盐水组仅为50％；治疗第10天给药组中有90％～100％的小鼠排正常便，自愈组和生理盐水组仅为80％。 

结论：本实施方式微生态复合菌剂对抗生素所致的实验性小鼠腹泻模型有显著的治疗效果。 

8.2.2本实施方式微生态复合菌剂对实验性小鼠模型菌群失调症的治疗结果：

通过对小鼠2个对照组和3个实验组分别灌胃3、7、10、14、17天时SPF小鼠10mm盲肠内容物稀释液中6种肠道主导菌的活菌数的测定，并将各组实验数据经整理后用mean±SD表示，采用JMTJFX统计学软件对实验数据进行两样本均数t检验或t′检验分析，计算结果见表5。 

表5实验组与模型组肠道菌活菌数的显著性比较结果(单位CFU/mL) 

注：“^**↑”表示增加极显著(P<0.01)，“^**↓”表示减少极显著(P<0.01)“^*↑”表示增加显著(P<0.05)，“^*↓”表示减少显著(P<0.05)， “↓”表示减少但不显著(P>0.05)，“↑”表示增加但不显著(P>0.05)。 

通过统计学软件对实验数据分析，由表5可见： 

1、与模型组相比较，各实验组在治疗第3天起，6种肠道主体菌开始恢复，肠杆菌、肠球菌、荚膜菌及拟杆菌的数量已经发生显著或极显著下降，双岐菌和乳杆菌显著或极显著增加。 

2、2个对照组对肠杆菌、肠球菌和拟杆菌的显著下降，但对荚膜菌是从第10天才有显著下降；而双岐菌和乳杆菌数量的增加却不显著。 

3、在各给药组中，治疗第7天给药组中有80％～90％的小鼠排正常便，自愈组和生理盐水组仅为50％；治疗第10天给药组中有90％～100％的小鼠排正常便，自愈组和生理盐水组仅为80％。肠道菌群分析结果表明，在治疗第3天开始定植，停药第11天后消失，定植期为10天左右。与模型组相比较各给药组在治疗第3天肠道菌群开始恢复，第7天均已显著升高(P<0.01)。治疗第10天、14天、17天之间略有差异，但不显著(P>0.05)。而自愈组和生理盐水组的恢复比各给药组显著的慢(P<0.01)。 

结论：本实施方式微生态复合菌剂能调整抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群失调，对小鼠实验性腹泻有明显的止泻作用，对乳杆菌和双歧杆菌有显著扶持作用，并能加速肠道菌群的恢复。 

本实施方式制备的微生态复合菌剂能调整抗生素相关性腹泻引发的小鼠肠道菌群失调，对小鼠实验性具有明显的止泻作用，有效率达99％；而且对小鼠肠道内乳杆菌和双歧杆菌有显著扶持作用(P<0.01)，并能加速肠道正常菌群的恢复。 

本实施方式制备的微生态复合菌剂中有益菌活菌总数为1.0×10¹⁰～9.9×10 ¹⁰个/克，制备后2年后活菌存活率为98.1％。 

本实施方式制备的微生态复合菌剂急性毒性实验： 

体质量为20±2g的20只昆明种SPF小白鼠(雌雄各半)，用最大浓度(65％w/v)、最大容量0.4mL/10g·bw、一次性灌胃，观察七天，无一只死亡。在七天内小白鼠活动自如，饮食、两便正常，无死亡。说明本实施方式制备的微生态复合菌剂半数致死量在13g/(kg·bw)以上。根据急性毒性试验证明本实施方式制备的微生态复合菌剂无任何毒副作用。

Claims (4)

1.微生态复合菌剂的制备方法，其特征在于微生态复合菌剂按以下步骤进行制备：一、分别对纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌和嗜酸乳杆菌进行培养；二、扩大培养；三、将乳酸克鲁维酵母菌、嗜酸乳杆菌和纳豆芽孢杆菌分别转入相应的高菌浓度培养液继续培养至菌落浓度为1.0×10⁷～9.9×10⁹个/mL，然后在0～4℃、5000～10000r/min的条件下离心15～50min；四、将三种菌体离心沉淀物分别放入含有脱脂乳粉、海藻糖、甘油、蔗糖、谷氨酸钠的保护剂中，然后在-10～-70℃的环境中预冻10～24h，再在无菌条件下真空冷冻干燥，三种菌的冻干粉等质量混合后加入大豆低聚糖，即得到微生态复合菌剂；其中步骤四中大豆低聚糖的加入量占微生态复合菌剂总质量的10％～30％；步骤四中菌体离心沉淀物与保护剂的重量比为1～9∶10，保护剂中脱脂乳粉的质量浓度为10％、海藻糖的质量浓度为1％、甘油的质量浓度为1％、蔗糖的质量浓度为1％、谷氨酸钠的质量浓度为0.1％。

2.根据权利要求1所述的微生态复合菌剂的制备方法，其特征在于步骤一中嗜酸乳杆菌在25～40℃、100～180r/min的条件下用乳清培养基旋转或振荡培养24～72h；步骤一中乳酸克鲁维酵母菌在25～40℃、100～180r/min的条件下用乳清培养基旋转或振荡培养24～72h；步骤一中纳豆芽孢杆菌在25～40℃、100～180r/min的条件下用蔗糖肉胨液体培养基旋转或振荡培养24～72h。

3.根据权利要求2所述的微生态复合菌剂的制备方法，其特征在于用于培养嗜酸乳杆菌的乳清培养基按重量百分比由0.5％的酵母膏、0.03％的胱氨酸和余量的波美度为5°BX的麦芽汁组成，并调节pH值为6.8；用于培养乳酸克鲁维酵母菌的乳清培养基为波美糖度是10°BX的麦芽汁，调节pH值为6.8；用于培养纳豆芽孢杆菌的液体培养基按重量百分比由2.0％的麦芽糖、1.5％的大豆胰蛋白胨、0.2％的酵母膏、0.3％的K₂HPO₄、0.05％的MgSO₄.5H₂O、0.02％的CaCl₂.5H₂O和余量的蒸馏水组成，并调节pH值为7.0。

4.根据权利要求1所述的微生态复合菌剂的制备方法，其特征在于步骤三中嗜酸乳杆菌的高菌浓度培养液按重量百分比由10％的乳清粉、1％的葡萄糖、0.03％的胱氨酸和余量的双蒸馏水组成，并调节pH值为6.8；步骤三中乳酸克鲁维酵母菌的高菌浓度培养液按重量百分比由10％的乳清粉、1％的葡萄糖和余量的双蒸馏水组成，并调节pH值为6.8；步骤三中纳豆芽孢杆菌的高菌浓度培养液按重量百分比由1％的蛋白胨、1％的蔗糖、1％的牛肉浸膏、0.5％的NaCl和余量的蒸馏水组成，并调节pH值为6.8。