CN101400365A - 利用tfpi治疗严重细菌感染 - Google Patents
利用tfpi治疗严重细菌感染 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101400365A CN101400365A CNA2006800153706A CN200680015370A CN101400365A CN 101400365 A CN101400365 A CN 101400365A CN A2006800153706 A CNA2006800153706 A CN A2006800153706A CN 200680015370 A CN200680015370 A CN 200680015370A CN 101400365 A CN101400365 A CN 101400365A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tfpi
- analog
- ala
- described method
- medicine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/55—Protease inhibitors
- A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
预防性或治疗性治疗有发生严重细菌感染风险或诊断为严重细菌感染的患者的方法,包括给予正患有或有发生所述症状风险的患者组织因子途径抑制剂(TFPI)或TFPI类似物。所述方法包括采用低剂量连续静脉输注TFPI或TFPI类似物以避免副作用。
Description
发明背景
严重细菌感染能引起各种并发症,包括威胁生命的败血病。本领域不断需要治疗严重细菌感染和/或降低由严重细菌感染引起的死亡风险的有效方法。
发明概述
本发明的一实施方式是治疗有发生严重细菌感染风险或诊断为严重细菌感染的患者的方法,包括给予有需要的患者TFPI或TFPI类似物。一些实施方式中,所述严重细菌感染引起肺炎、菌血症、深部组织感染、皮肤感染、软组织感染、牙周感染、腹膜炎、外科手术感染或脑膜炎。在其它实施方式中,所述肺炎是社区获得性肺炎或医院获得性肺炎并可由肺炎链球菌引起。
另一实施方式是降低因严重细菌感染引起的死亡风险的方法,包括给予有需要的患者含有TFPI或TFPI类似物的药物组合物。一些实施方式中,所述严重细菌感染引起肺炎、菌血症、深部组织感染、皮肤感染、软组织感染、牙周感染、腹膜炎、外科手术感染或脑膜炎。在其它实施方式中,所述肺炎是社区获得性肺炎或医院获得性肺炎并可由肺炎链球菌引起。
其它实施方式包括所述患者符合以下标准的任何上述实施方式:血液IL-6水平低于3,200pg/ml;国际标准化比率(INR)低于2.5;急性生理评分(APS)低于26;急性生理和慢性健康评估(APACHE II)评分低于38;MODS评分高于18。
其它实施方式包括所述TFPI和TFPI类似物为非糖基化的任何上述实施方式。其它实施方式包括其中低于约12%的TFPI或TFPI类似物分子为修饰分子的上述实施方式,所述修饰种类包含以下一种或多种:用反相色谱检测为氧化的TFPI或TFPI类似物分子;用阳离子交换色谱检测为氨甲酰化的TFPI或TFPI类似物分子;用Promega 试剂盒检测为脱氨化的TFPI或TFPI类似物分子;用氨基酸分析检测为包含半胱氨酸加合物的TFPI或TFPI类似物分子;用分子筛色谱法检测为聚集TFPI或TFPI类似物分子;用非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为错误折叠的TFPI或TFPI类似物分子。
其它实施方式包括低于约9%的TFPI或TFPI类似物分子被氧化的上述实施方式。
其它实施方式包括低于约3%的TFPI或TFPI类似物分子被氨甲酰化的上述实施方式。
其它实施方式包括低于约9%的TFPI或TFPI类似物分子被脱氨化的上述实施方式。
其它实施方式包括低于约2%的TFPI或TFPI类似物分子包含半胱氨酸加合物的上述实施方式。
其它实施方式包括低于约3%的TFPI或TFPI类似物分子被聚集的上述实施方式。
其它实施方式包括低于约3%的TFPI或TFPI类似物分子被错误折叠的上述实施方式。
其它实施方式包括所述TFPI或TFPI类似物是由含有TFPI或TFPI类似物的冻干组合物制备的上述实施方式。其它实施方式包括所述TFPI或TFPI类似物是以含有精氨酸的制剂形式施用的上述实施方式。其它实施方式包括所述TFPI或TFPI类似物可以含有柠檬酸盐的制剂形式施用的上述实施方式。
其它实施方式包括药物组合物含有0.01-1.0mg/ml TFPI或TFPI类似物的上述实施方式。其它实施方式包括药物组合物含有150-450mM L-精氨酸的上述实施方式。其它实施方式包括药物组合物含有0.1-50mM L-甲硫氨酸的上述实施方式。其它实施方式包括药物组合物含有5-50mM柠檬酸钠缓冲液的上述实施方式。其它实施方式包括药物组合物pH为5.0-6.0的上述实施方式。
其它实施方式包括方法包括利用含有0.15±15%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±15%mM L-精氨酸、5±15%mM L-甲硫氨酸和20±15%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±15%的药物组合物的上述实施方式。
其它实施方式包括方法包括利用含有0.15±10%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±10%mM L-精氨酸、5±10%mM L-甲硫氨酸和20±10%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±10%的药物组合物的上述实施方式。
其它实施方式包括方法包括利用含有0.15±5%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±5%mM L-精氨酸、5±5%mM L-甲硫氨酸和20±5%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±5%的药物组合物的上述实施方式。
其它实施方式包括方法包括利用含有0.45±15%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±15%mM L-精氨酸、5±15%mM L-甲硫氨酸和20±15%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±15%的药物组合物的上述实施方式。
其它实施方式包括方法包括利用含有0.45±10%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±10%mM L-精氨酸、5±10%mM L-甲硫氨酸和20±10%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±10%的药物组合物的上述实施方式。
其它实施方式包括方法包括利用含有0.45±5%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±5%mM L-精氨酸、5±5%mM L-甲硫氨酸和20±5%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±5%的药物组合物的上述实施方式。
其它实施方式包括以一给药速率通过连续静脉输注施用TFPI或TFPI类似物的上述实施方式,所述给药速率相当于以低于约0.66mg/kg/hr的给药速率施用参照ala-TFPI。
其它实施方式包括以一给药速率给予TFPI或TFPI类似物至少约72小时的上述实施方式,所述给药速率相当于以约0.00025-0.1mg/kg/hr的给药速率施用参照ala-TFPI。其它实施方式包括给药速率相当于以约0.010-0.1mg/kg/hr的给药速率施用参照ala-TFPI的上述实施方式。其它实施方式包括给予TFPI或TFPI类似物至少约96小时的上述实施方式。
其它实施方式包括通过连续静脉输注给予TFPI或TFPI类似物以提供一总剂量的上述实施方式,所述总剂量相当于施用约0.024-4.8mg/kg参照ala-TFPI的总剂量。其它实施方式包括以一给药速率通过连续静脉输注给予TFPI或TFPI类似物的上述实施方式,所述给药速率相当于以约0.02-1mg/kg/hr的给药速率施用参照ala-TFPI。其它实施方式包括通过连续静脉输注给予TFPI或TFPI类似物以提供一日剂量的上述实施方式,所述日剂量相当于施用约0.006-1.2mg/kg参照ala-TFPI的日剂量。
其它实施方式包括通过输注10-200小时、10-150小时或24-96小时给予TFPI或TFPI类似物的上述实施方式。
其它实施方式包括患者在给予TFPI或TFPI类似物之前至少8小时未接受过肝素治疗的上述实施方式。
其它实施方式包括还包括用活化的蛋白质C治疗患者的上述实施方式。
其它实施方式包括TFPI类似物为ala-TFPI的上述实施方式。
发明详述
TFPI是一种被认为具有消炎活性的强效抗凝剂。参见EP0643585。TEPI可用于抑制(例如)肿瘤相关的血管生成。参见EP0914830。发明人发现TFPI通过其对控制先天性免疫系统的炎症细胞因子的控制,还具有抗菌活性。发明人还发现TFPI看来会因为严重细菌感染而降解,并且在感染期间TFPI的消耗将损害所述系统。因此,虽然TFPI在对抗感染时起着极其重要的作用,但在严重感染期间内源性TFPI的变化将消耗尽TFPI的治疗功能。
有几种因素能预测败血病患者的死亡。这些包括急性生理和慢性健康评估(APACHEII)评分系统(Knaus等,Crit Care Med.1985;13:818-29)、急性生理评分(APS)、国际标准化比率(INR)(R.S.Riley等,J.Clin.Lab.Anal.14:101-114,2000)和血浆IL-6浓度。在社区获得性肺炎(CAP)患者中,发明人预先观察到TFPI能有效减少死亡率。相对风险降低由(100x绝对风险降低)/安慰剂死亡率所决定。当将CAP患者用APACHEII评分(图20)、急性生理评分、INR(图22)或血浆IL-6水平(图21)按其严重程度区分时,发现能从TFPI治疗中获益的患者包括具有最低安慰剂死亡率的患者。例如,在根据APACHEII评分区分的CAP亚组中,APACHEII评分为16的亚组的死亡率降低5%,这意味着相对风险降低了32%。图20显示平均APACHEII评分为36或更低的患者死亡风险降低。TFPI的基线血清浓度可同时预示死亡率和效力。
INR水平低于1.2的亚组中的患者比高INR主要研究组的患者死亡风险更低(总体为18%比34%),且ala-TFPI在INR水平低于1.2的亚组中有效(图25)。INR水平低于平均值2.1的CAP亚组患者从ala-TFPI中获益(图21)。对用ala-TFPI治疗的未经肝素治疗的患者也如此。
图20显示在全体和社区获得性肺炎(CAP)安慰剂组中APACHE II与死亡率之间的预期相关性(图20)。当将CAP群分为APACHE II四分位数时,观察到在所有APACHEII四分位数中均有效力。类似地,APS、INR和IL-6均与死亡率正相关。每种情况下,如这些参数测定的那样,ala-TFPI均能改善最低风险组的存活率(图21、22、23)。TFPI对血液细菌培养物为阳性的患者有效(图24)。当患者按APACHE评分区分时,TFPI再次对前三个四分位数具有广泛的活性。
因此,用外源性TFPI治疗对有发生严重细菌感染风险的患者或诊断为严重细菌感染的患者具有治疗益处,并且可用于降低由此类感染导致的死亡风险。严重细菌感染是常需要紧急医疗护理,特别是住院治疗的那些感染。严重细菌感染常需要抗感染治疗和支持性医疗护理或积极的医疗干预。常见的严重细菌感染包括但不限于:肺炎(包括医院获得性肺炎和社区获得性肺炎)、菌血症、深部组织感染、皮肤感染、软组织感染、牙周感染、腹膜炎、外科手术感染和脑膜炎。
本发明可治疗的患者应符合以下一种或多种标准:(a)血液IL-6水平低于3,200pg/ml(如血液IL-6水平低于3,000、2,500、2,000、1,500、1,000、500、250、100或10);(b)国际标准化比率(INR)低于2.5(如INR低于2.4、2.3、2.2、2.1、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2或1.1);(c)急性生理评分(APS)低于26(如APS评分低于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、或16-19、或20-23);(d)急性生理和慢性健康评估(APACHEII)评分低于38(如APACHE II评分低于37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17或16);和(e)多器官功能障碍(MODS)评分高于18(如MODS评分高于19、20、21、22、23或24、或20-21、或22-23)。
一实施方式中,患者血液IL-6水平低于3,200pg/ml。另一实施方式中,患者的国际标准化比率(INR)低于2.5。还有另一实施方式中,患者的急性生理评分(APS)低于26。还有另一实施方式中,患者的急性生理和慢性健康评估(APACHEII)评分低于38。还有另一实施方式中,患者的MODS评分高于18。
TFPI和TFPI类似物
最初分离得到的TFPI是一种天然发生的抗凝剂。所述蛋白质具有多种主要功能域(图1):Kunitz型的3种丝氨酸蛋白酶抑制剂功能域(K1、K2和K3)、N末端功能域和C末端功能域(CTD)。K1功能域抑制凝血因子VIIa-组织因子(TF)复合物。K2功能域抑制因子Xa。目前为止未有与K3结合的丝氨酸蛋白酶,然而近期试验提示K3在TFPI与细胞表面的GPI锚定受体结合中具有功能。Piro&Broze,Circulation.2004年12月7日;110(23):3567-72。CTD也参与细胞结合、肝素结合和优化Xa抑制。
TFPI由血液和其它组织中多种类型的细胞天然产生。大多数TFPI被认为是由血管内壁上的内皮细胞所产生。在血液中发现了TFPI片段。这种血浆TFPI中的大部分与其它血浆蛋白质经二硫键交换共价修饰或断裂除去CTD。TFPI的这些形式在生物化学实验中活性较差不能与细胞有效结合,提示血浆TFPI是失活的。与所述研究相一致显示血浆TFPI的半衰期非常短而且可被肝脏有效去除。
各种细胞结合形式的TFPI是结合的全长单体蛋白质,在体外具有最高活性。内皮细胞上的一种小片段TFPI可用肝素处理除去。另一群TFPI似乎位于顶端表面下的小泡内,当用凝血酶刺激细胞时释放。大部分细胞表面TFPI发现于胞膜窖(一种与其它系统信号传导相关的细胞器)中。Lupu等于2005年4月6日出版于JBC Papersin Press,手稿号为M503333200。胞膜窖中的TFPI似乎是与内皮细胞上的TF相接合的TFPI。当内皮细胞暴露于细菌时在其表面通常会诱生出TF。TF与VIIa结合产生Xa。TF:VIIa快速重定位到胞膜窖处在那里结合TFPI。正常内皮细胞含有过量的TFPI,以确保表达TF的内皮细胞不会诱导病理水平的凝血酶。奇怪的是,一旦TF转位到胞膜窖处时即刻变得稳定,提示在它被TFPI中和后还起作用。
本文所用的“TFPI”指具有SEQID NO:1所示276位氨基酸残基序列和分子量约38,000道尔顿的成熟的血清糖蛋白。参见美国专利号5,106,833。TFPI cDNA的克隆描述见Wun等,美国专利号4,966,852。本发明所用的TFPI可以是非糖基化的或糖基化的。
“TFPI类似物”是以一个或多个氨基酸加成或取代(通常本质保守的,优选位于非Kunitz功能域或蛋白质的C末端部分)、一个或多个氨基酸缺失(如TFPI片段)、或在一个或多个氨基酸上加成一种或多种化学基团而修饰的TFPI衍生物,只要所述修饰不破坏TFPI生物学活性即可。优选TFPI类似物包含所有3个Kunitz功能域。TFPI和TFPI类似物可以是糖基化的或非糖基化的。
优选的TFPI类似物为N-L-丙氨酰-TFPI(ala-TFPI),其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。也已知ala-TFPI列于国际药物命名“替法可近(tifacogin)”下。ala-TFPI的氨基末端丙氨酸残基经人工改造而加入TFPI序列中以改进大肠杆菌表达并影响不然会成为氨基末端甲硫氨酸残基的切割。参见美国专利5,212,091。TFPI的其它类似物描述于美国专利号5,106,833中。通过以下生物学活性实验可确定TFPI类似物拥有生物学活性一部分TFPI活性。优选的用于TFPI及类似物的生物学活性实验是凝血酶原时间(PT)实验(参见以下)。
TFPI类似物可以具有本质保守的氨基酸取代,即涉及侧链的氨基酸家族内部的取代。具体地说,氨基酸通常可分成4个家族:(1)酸性—天冬氨酸、谷氨酸;(2)碱性—赖氨酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和(4)不带电荷的极性氨基酸—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归类为芳族氨基酸。例如,可合理预测用异亮氨酸或缬氨酸孤立地替换亮氨酸、用谷氨酰胺替换天冬酰胺、用丝氨酸替换苏氨酸、或用结构相关氨基酸类似地保守替换氨基酸,对生物学活性不会产生重要影响。例如,只要分子所需功能保持完整,感兴趣的多肽可包括约1-15个保守或非保守氨基酸取代(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)。TFPI的优选形式包括TFPI类似物,其Kunitz 1、Kunitz 2、Kunitz 3功能域精确对应于天然的人TFPI Kunitz功能域,更优选各个Kunitz功能域精确对应于天然的人TFPI各自的Kunitz功能域。
优选TFPI类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示TFPI的序列至少95%或更多相同。更优选所述分子为96%、97%、98%或99%相同。
TFPI和TFPI类似物的生物学活性可通过凝血酶凝血酶原实验测定。合适的凝血酶原实验描述于美国专利5,888,968和WO 96/40784。简言之,可采用血凝度测量器(如来自Organon Teknika的Coag-A-Mate MTX II)来测定凝血酶酶原时间。合适的实验缓冲液为100mM NaCl、调整到pH7.5的50mM Tris,含有1mg/ml牛血清白蛋白。所需的加入试剂为正常人血浆(如Organon Teknik的“Verify 1”)、促凝血酶原激酶试剂(如Organon Teknik的“Simplastin Excel”)和TFPI标准溶液(如20μg/ml的100%纯ala-TFPI(或其等当量的)实验缓冲液)。通过分析系列稀释的TFPI标准溶液(如终浓度1-5μg/ml)的血凝时间来获得标准曲线。
为了确定血凝时间,首先用实验缓冲液稀释样品或TFPI标准液。然后加入正常人血浆。加入促凝血酶原激酶试剂启动凝血反应。然后用仪器记录血凝时间。以log血凝时间比log TFPI浓度作图获得线性TFPI标准曲线。基于TFPI标准液的纯度调整所述标准曲线使之对应于与100%生物化学纯等当量的TFPI浓度。例如,如果标准液为97%生物化学纯的ala-TFPI制备物(即其含有分子量3%无生物学活性的TFPI),可将所述标准液的各稀释液浓度乘0.97得出TFPI的实际浓度。因此,根据97%纯制备物每ml所含的实际重量,1.0μg/ml的TFPI标准液将与1.0x0.97或0.97μg/ml的浓度等当量或以所述浓度来处理。
获得TFPI和TFPI类似物
用于本发明方法的TFPI和TFPI类似物可从细胞或组织中分离或纯化、化学合成或从原核或真核细胞中重组制备。
TFPI可通过各种方法进行分离。例如,分泌TFPI的细胞包括用TNF处理约3-4天的衰老的内皮细胞和年轻的内皮细胞、肝细胞和肝癌细胞。TFPI可用常规方法纯化,包括层析方法如:Pedersen等,1990,J.Biol.Chem.265,16786-93,Novotny等,1989,J.Biol.Chem.264,18832-37,Novotny等,1991,Blood 78,394-400,Wun等,1990,J.Biol.Chem.265,16096-101和Broze等,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,1886-90。TFPI看来存在于血流中并可从血液中纯化,参见Pedersen等,1990。
TFPI或TFPI变体可通过化学方法合成其氨基酸序列来制备,如通过利用固相技术进行直接的肽合成(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154,1963;Roberge等,Science 269,202-204,1995)。蛋白质合成可利用手工技术或通过自动化来进行。自动化合成可通过例如Applied Biosystems 431A肽合成器(PerkinElmer)来完成。可选采用化学方法分别合成TFPI或TFPI变体片段再结合以制备全长分子。
TFPI和TFPI类似物可如美国专利号4,966,852所述重组制备。例如,将所需蛋白质的cDNA整合进质粒中在原核或真核细胞中表达。美国专利号4,847,201提供了用特定DNA序列转化微生物及将其表达的细节。对本领域普通技术人员而言,已知有许多其它参考文献提供了利用微生物表达蛋白质的细节。它们中的许多被美国专利号4,847,201所引用,如Maniatas等,1982,《Molecular Cloning(分子克隆)》,Cold Spring Harbor Press。
可利用已有各种技术转化微生物并用它们表达TFPI和TFPI类似物。以下仅是几种可能采用的方式的例子。分离TFPI DNA序列并连接到合适的对照序列上。TFPIDNA序列显示于美国专利号4,966,852并可被整合入质粒,如pUNC13或pBR3822,其由例如Boehringer-Mannheim的公司商品化提供。一旦将TFPI DNA插入载体,它即能克隆进合适的宿主。DNA能通过如显示于Mullis的美国专利号4,683,202和Mullis等的美国专利号4,683,195中的技术进行扩增。TFPI cDNA可通过以下步骤获得:诱导细胞如肝癌细胞(如HepG2和SKHep)来制备TFPI mRNA,然后确定并分离所述mRNA并将其反转录以获得TFPI的cDNA。表达载体转化进宿主细胞如大肠杆菌后,可将细菌发酵并表达蛋白。细菌优选为原核微生物并且尤其优选大肠杆菌。优选的可用于本发明的微生物为根据布达佩斯条约的规定,于1984年2月14日保存于ATCC的大肠杆菌K12、菌株MM294(保藏号为39607)。
当然,还有可能在衍生自多细胞生物的真核宿主细胞培养物中表达编码多肽的基因。参见如《Tissue Culture(组织培养)》,1973,Cruz和Patterson编,AcademicPress。可用的哺乳动物细胞系包括鼠骨髓瘤N51、VERO、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS、C127、HepG2和SK Hep。TFPI和TFPI类似物还可表达于杆状病毒感染的昆虫细胞(也参见上述美国专利号4,847,201)。还参见Pedersen等,1990,J.of Biological Chemistry,265:16786-16793。真核细胞表达载体一般包括启动子和与以下哺乳动物细胞相容的调控序列:例如常采用的仙台病毒40(SV40)(Fiers等,1978,Nature,273:113)的早期和晚期启动子或其它病毒启动子如源自多瘤、腺病毒2、牛乳头状瘤病毒、或禽肉瘤病毒、或免疫球蛋白启动子和热休克启动子的那些启动子。
哺乳动物细胞宿主系统转化被Axel全面描述于美国专利号4,399,216。现在也已明白“增强子”区域对优化表达很重要,它们一般是在启动子区域上游找到的序列。如果需要,可从病毒中获得复制起点。然而,整合进染色体是真核生物中DNA复制的普遍机制。目前还提供植物细胞作为宿主,并提供与以下植物细胞相容的调控序列:如胭脂氨酸合酶启动子和聚腺苷酸化信号序列(Depicker,A等,1982,J.MoI.Appl.Gen.,1:561)。转化植物细胞的方法和载体公开于WO 85/04899。
可用于纯化哺乳动物细胞表达的TFPI和TFPI类似物的方法包括依次应用:肝素琼脂糖、MonoQ、MonoS和反相HPLC层析。参见Pedersen等,同上;Novotny等,1989,J.Biol.Chem.264:18832-18837;Novotny等,1991,Blood,78:394-400;Wun等,1990,J.Biol.Chem.265:16096-16101;Broze等,1987,PNAS(USA),84:1886-1890;美国专利号5,106,833;和美国专利号5,466,783。这些参考文献描述了纯化哺乳动物产生的TFPI的各种方法。
制备TFPI或TFPI类似物分子的优选方法公开于WO 05/019265。所述方法产生的TFPI或TFPI类似物分子制备物中低于约12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.5%的制备物是“修饰种类”。“修饰种类”包括以下一种或多种:用反相色谱检测为氧化的TFPI或TFPI类似物分子;用阳离子交换色谱检测为氨甲酰化的TFPI或TFPI类似物分子;用Promega 试剂盒检测为脱氨化的TFPI或TFPI类似物分子;用氨基酸分析检测为包含半胱氨酸加合物的TFPI或TFPI类似物分子;用分子筛色谱法检测为聚集TFPI或TFPI类似物分子;用非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为错误折叠的TFPI或TFPI类似物分子。采用公开于WO 05/019265的方法,TFPI或TFPI类似物分子制备物可制备成制备物中低于约9%的TFPI或TFPI类似物分子被氧化、低于3%的TFPI或TFPI类似物分子被氨甲酰化、低于约9%的TFPI或TFPI类似物分子被脱氨化、低于约2%的TFPI或TFPI类似物分子包含半胱氨酸加合物、低于约3%的TFPI或TFPI类似物分子被聚集、低于约3%的TFPI或TFPI类似物分子被错误折叠。
TFPI还可利用哺乳动物细胞宿主表达为重组糖基化蛋白质,如用小鼠C127细胞(Day等,Blood 76,1538-45,1990)、乳仓鼠肾细胞(Pedersen等,1990)、中国仓鼠卵巢细胞和人SK肝癌细胞。C127细胞已用于动物研究显示在家兔中能有效抑制组织因子诱导的血管内凝血(Day等,同上)、能有效预防狗溶栓后动脉的重阻塞(Haskel等,Circulation 84:821-827(1991))、能有效降低狒狒大肠杆菌败血症模型的死亡率(Creasey等,J.Clin.Invest.91:2850(1993))。ala-TFPI还可利用大肠杆菌宿主细胞表达为重组非糖基化蛋白质。通过体外重折叠大肠杆菌产生的所述重组蛋白质得到高活性ala-TFPI的方法已有报道。参见例如WO 96/40784。
TFPI和TFPI类似物还可在细菌和酵母中制备然后纯化。一般可采用美国专利号5,212,091;6,063,764和6,103,500或WO 96/40784中所示的方法。ala-TFPI和其它TFPI类似物可按照WO 96/40784和Gustafson等,Prot.Express.Pur.5:233(1994)进行纯化、溶解和再次折叠,这些文献纳入本文中作为参考。例如,当按照WO 96/40784的实施例9进行制备时,可获得占总蛋白质重量约85%-90%为成熟的、正确折叠的、具有生物学活性的ala-TFPI,占总蛋白质重量约10%-15%为具有一个或多个氧化甲硫氨酸残基的ala-TFPI制备物。用凝血酶原实验检测这些氧化形式生物学活性与未衍生的ala-TFPI相当,并预计在本文公开的本发明中具有活性。其余物质含有各种修饰形式的ala-TFPI,包括二聚体、聚集的和乙酰化形式。
TFPI和TFPI类似物可含有显著数目的半胱氨酸残基,美国专利号4,929,700中所示的方法与TFPI重折叠相关。TFPI和类似物可用各种层析方法(如上面提到的那些)从缓冲溶液中纯化。如果需要,可采用美国专利号4,929,700所示的方法。可用任何方法来纯化得到适合给予人的纯度和活性水平的TFPI和TFPI类似物。
治疗方法和组合物
可用TFPI和TFPI类似物来治疗有发生严重细菌感染风险或诊断为严重细菌感染的患者,或降低某位患者或患者群体由于严重细菌感染而死亡的风险。
严重细菌感染包括,例如按美国胸科学会(American Thoracic Society)给出的指南中所定义的“严重肺炎”。具体说,严重肺炎需要诊断为肺炎并符合a)两条主要标准之一;或b)三条次要标准中的两条;或c)英国胸科学会的4条标准中的两条(Thorax2001;56[增刊FV]:1-64)。主要标准为1)需要机械换气和2)败血性性休克或需要加压器>4小时。次要标准为1)收缩期血压≤90mmHg,2)多叶性肺炎,和3)低血氧标准(PaO2/FiO2)<250。英国胸科学会的标准为1)呼吸频率≥30次呼吸/分钟,2)舒张期血压≤60mmHg,3)血液尿素氮(BUN)>7.0mM(>19.6mg/dL)和4)意识紊乱。如本领域所知,低血氧标准(PaO2/FiO2)指动脉氧分压与吸入氧分压之比表示气体交换损伤的水平。
许多严重肺炎患者具有可用本领域已知的任何方法证明的感染。这些方法包括但不限于在血液或其它正常的无菌体液或组织中通过(例如)GRAM染色、培养、组织化学染色、免疫化学试验或核酸试验检测到致病性微生物。也可通过符合肺炎诊断的胸部X光摄片的证据、以及感染的任何临床症状包括但不限于呼吸频率>/=30次/分钟或PaCO2/FiO2<250、血压下降和体温升高来证明感染从而构成全身抗感染治疗的理由。
TFPI和TFPI类似物的制剂
TFPI和TFPI类似物的制剂优选通过静脉输注施用。优选基本上连续的静脉输注。实现所述施用的方法本领域技术人员已知的。输注可通过中线或外周线进行。只要能够避免给药速率的大波动,给予的TFPI产生的血浆水平只要是在本发明优选实施方式以持续给药速率进行连续输注所期望的20%以内,本发明给药速率的短时偏差还是可以接受的。
在给予患者之前,可将配制材料加入到TFPI和TFPI类似物中。优选液体配制材料。TFPI和TFPI类似物可采用不同配方以不同浓度和与给药途径、溶解性和TFPI蛋白质稳定性相容的任何生理上适合的pH配制。优选的静脉输注制剂包括高达约0.6mg/ml的ala-TFPI、高达300mM的精氨酸氢氧化物、和pH5.0-6.0的柠檬酸钠缓冲液。某些溶质如精氨酸、NaCl、蔗糖和甘露醇起着增溶和/或稳定ala-TFPI的作用。参见WO 96/40784。
药物制剂可包括,例如0.01-1.0mg/ml、0.01-0.8mg/ml、0.01-0.5mg/ml、0.01-0.3mg/ml、0.01-0.2mg/ml或0.01-0.1mg/ml的ala-TFPI;150-450mM、150-400mM、150-350mM或150-300mM L-精氨酸;0.1-50mM、0.1-40mM、0.1-30mM、0.1-25mM、0.1-15mM、0.1-10mM或0.1-5mM L-甲硫氨酸;5-50mM、5-45mM、5-40mM、5-35mM、5-30mM、5-25mM或5-20mM的柠檬酸钠缓冲液。制剂的pH范围为5.0-6、5.0-5.8、5.0-5.7、5.0-5.6或5.0-5.5。优选的药物制剂包含0.15mg/ml(±15、10或5%)或0.45mg/ml(±15、10或5%)的重组ala-TFPI、300mM(±15、10或5%)L-精氨酸、5mM(±15、10或5%)L-甲硫氨酸、20mM(±15、10或5%)的柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5(±15、10或5%)、重量克分子渗透男女高度为560+/-110mOsm/kg(±15、10或5%)。
尤其优选的静脉输注制剂包含约0.15mg/ml的ala-TFPI、300mM的精氨酸氢氧化物和pH为5.5的20mM柠檬酸钠。也可用150mM NaCl和pH为5.5-7.2的20mM磷酸钠或其它缓冲液将TFPI和TFPI类似物配制成浓度高达约0.15mg/ml的溶液,任选含有0.005%或0.01%(w/v)的聚山梨酯80(吐温80)。其它制剂含有高达约0.5mg/ml的TFPI或TFPI类似物和含有150mM NaCl、8%(w/v)蔗糖或4.5%(w/v)甘露醇的pH为5.5的10mM醋酸钠溶液。TFPI和TFPI类似物还可用高盐配制成高达每毫升几毫克更高浓度的制剂。例如一种制剂包含有约6.7mg/ml的ala-TFPI、500mM NaCl和pH7.0的20mM磷酸钠。
TFPI和TFPI类似物配制材料的其它例子包括油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐类、缓冲剂、白蛋白、表面活性剂或膨松剂。优选的碳水化合物包括糖或糖醇如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉、和羧甲基纤维素、或其混合物。最优选蔗糖。糖醇定义为含-OH基团的C4-C8烃,包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。最优选甘露糖醇。上述这些糖或糖醇可单独或组合施用。只要这种糖或糖醇可溶于水相制备物,其用量没有固定限制。优选糖或糖醇的浓度在1.0w/v%和7.0w/v%之间,更优选在2.0和6.0w/v%之间。
优选的氨基酸包括左旋(L)形式的肉碱、精氨酸和甜菜碱;然而,可加入其它氨基酸。还优选在冻干前或重建后在该组合物中使用缓冲剂将溶液中pH变化降到最小。可采用大多数的生理缓冲液,但优选是柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐和谷氨酸盐缓冲液或其混合物。优选缓冲液浓度为0.01-0.3摩尔。可加入该制剂的表面活性剂如欧洲专利号270,799和268,110所示。
TFPI或TFPI类似物的液态药物组合物制备好后,可冻干以防降解并无菌保存。冻干液态组合物的方法是本领域普通技术人员已知的。临用前,可用包含加入成分的无菌稀释液(如Ringer溶液、蒸馏水或无菌盐水)重建所述组合物。重建后,所述组合物优选通过连续静脉输注施用到个体。
TFPI和TFPI类似物的剂量
TFPI或TFPI类似物以能治疗或预防严重细菌感染包括严重肺炎的治疗有效量的浓度施用。此剂量对其它急性或慢性炎症和细胞因子上调组织因子表达的常规疾病也有效。为实现所述目的,TFPI或TFPI类似物优选通过静脉施用。实现所述施用的方法是本领域普通技术人员已知的。一般,TFPI或TFPI类似物优选以1mg/kg和20mg/kg之间的剂量给予,更优选剂量在2mg/kg和15mg/kg之间,最优选在2和10mg/kg之间。
上述剂量通常在一段时间内施用,至少约1天,通常为几天,以单剂或分次剂量给予宿主的总日剂量在例如2-15毫克/千克体重每天,优选约4-10毫克/千克体重。剂量单位组合物可包含所述量或其次倍量以补足日剂量。更低的日剂量可用于预防性或其它目的,例如,1μg/kg-2mg/kg。可与运载体材料结合产生单剂量的活性成分的量随治疗患者和施用的具体模式而不同。
剂量方案应依据不同因素选择,包括药物类型、患者的年龄、体重、性别、饮食和医疗条件、疾病的严重性、给药途径、药理学的考虑如活性、效力、药物代谢动力学和毒性、是否采用药物递送系统以及化合物是否作为药物组合物的一部分施用。因此,实际采用的剂量方案可有很大不同并可偏离上述的优选剂量方案。优选TFPI或TFPI类似物的剂量不应超过与ala-TFPI的约0.66mg/kg/hr给药速率相当的给药速率。除给药速率外,TFPI或TFPI类似物输注的持续时间取决于每位患者的临床严重程度,对适当的给药时间的确定是普通医生技能之内。输注可进行例如10-200小时、10-150小时、24-120小时、36-100小时或24-96小时。根据主治医师的判断,可进行一个或多个疗程,一般为两个疗程。
施用TFPI剂
当TFPI或TFPI类似物的给药速率相当于以约0.00025-0.50mg/kg/hr(0.00417-8.33μg/kg/min)的给药速率施用ala-TFPI时,可维持治疗严重细菌感染的效力并将不良副作用如出血降到最低。为了改进组合效力和安全性,给药速率优选相当于约0.010-0.1mg/kg/hr(0.167-1.67μg/kg/min)的ala-TFPI的给药速率,或相当于约0.020-0.080mg/kg/hr的ala-TFPI的给药速率,最优选相当于约0.025-0.070mg/kg/hr(0.417-1.251μg/kg/min)的ala-TFPI的给药速率。给药途径通常为静脉施用,优选通过连续静脉输注。可给予输注至少约72、96、100、120或240小时。优选给予连续输注3-8天,更优选3-6天,最优选约4天。
“连续输注”施用意味着输注大致保持所述速率,在大部分所述持续时间内基本不中断。或者,可采用间歇性静脉输注。如果采用间歇性输注,那么应所述采用与上述连续输注给药速率相当的平均时间给药速率。此外,间歇性输注程序产生的最大血清浓度必须不超过采用持续输注所获得的最大浓度的约20%。为了避免给患者带来不良副作用(具体的副作用包括出血),给药速率应小于相当于约为0.1mg/kg/hr的ala-TFPI的持续静脉输注的给药速率。
由于用凝血酶原实验判断蛋白质浓度和生物学活性具有误差,本文中描述的所有剂量,包括给药速率和总剂量,在实践中均可有10%的差异。因此,实际的施用剂量相比本文所述的剂量高10%或低10%均认为与所述剂量相当。由于所述原因,所有剂量均被描述为“约”某一特定量。例如,描述成“约0.025mg/kg/hr”的剂量认为与范围在0.0225-0.0275mg/kg/hr的任何实际剂量相当。
优选的剂量方案包括每次100ml的两次静脉剂量,每次含0.15mg/ml或0.45mg/ml的重组ala-TFPI、300mM L-精氨酸、5mM L-甲硫氨酸、20mM柠檬酸钠缓冲液、pH5.5、重量克分子渗透浓度为560+/-110mOsm/kg。
如果低剂量TFPI给药时,在实践中本发明还可采用TFPI或TFPI类似物的推注或简单讲更快输注速率。例如,推注或更快输注速率可用来缩短患者循环系统内施用TFPI或TFPI类似物的平衡时间。这么做,可更快速地达到TFPI的最终稳态血浆水平且能更快饱和TFPI受体。以约0.025mg/kg/hr速度给予人2小时ala-TFPI能将TFPI(加ala-TFPI)的血浆水平从约80ng/ml增加到约125ng/ml、或增加约50%。如果加快输注速率或采用推注能更快到达相同水平。如果持续输注直到获得稳态,那么更快输注速率将引起更高水平。在患有严重细菌感染的患者中,已发现以约0.050mg/kg/hr施用ala-TFPI所达到的稳态水平为约300ng/ml,而且已发现以约0.33或约0.66mg/kg/hr施用ala-TFPI为约至少2μg/ml。
以单次连续输注或分多次输注剂量给予宿主的总日剂量可以如相当于每天施用约0.006mg/kg-1.2mg/kg的ala-TFPI,更常相当于每天施用约0.24mg/kg-1.2mg/kg的ala-TFPI,优选相当于每天约0.6mg/kg的ala-TFPI。这个范围内的较低量可用于预防或其它目的。本发明的剂量方案也可表示为给予患者的总剂量。总剂量是输注速率和输注总时间通过数学运算得到的产物。例如,ala-TFPI的优选给药速率为约0.025mg/kg/hr,优选输注时间为96小时,总剂量是约2.4mgala-TFPI/千克体重。本发明的TFPI给药总剂量相当于约0.75μg/kg-4.8mg/kg的ala-TFPI。优选总剂量相当于约1mg/kg-4.8mg/kg的ala-TFPI。更优选总剂量相当于约2.4mg/kg的ala-TFPI。
上述包括基于mg/kg/hr的给药速率和总日剂量的剂量方案被表示为“相当于参照ala-TFPI”的剂量。这意味着是通过归一化为“参照ala-TFPI”剂量来定量定义它们,所述“参照ala-TFPI”定义为成熟的、100%纯的(基于蛋白质)、正常折叠的、具生物学活性的、非糖基化的ala-TFPI。Ala-TFPI是其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的TFPI的一种类似物。TFPI的其它形式也可用于本发明,包括成熟的、全长TFPI和其类似物。可通过根据特定形式TFPI的固有生物学活性调整并且基于所述制备物的生物化学纯度进一步调整本发明所述的参照ala-TFPI的剂量范围来确定用TFPI形式而非ala-TFPI,以及用不到100%纯的ala-TFPI或另一种TFPI类似物的制备物来实施本发明所需的合适剂量范围。
TFPI或TFPI类似物的内在生物学活性指成熟的、100%纯的、正确折叠的TFPI或TFPI类似物用凝血酶原实验确定的特定活性。因此,相当剂量计算如下:(参照ala-TFPI剂量)/((相对固有活性)x(生物化学纯度)),其中相对固有活性指:(类似物的固有活性)/(参照ala-TFPI的固有活性)。例如,如果某特定TFPI类似物的固有生物学活性为参照ala-TFPI的80%,那么通过用0.8除参照ala-TFPI的剂量值得到针对特定TFPI类似物的相当剂量。而且,如果施用到患者的制剂例如仅为90%生物化学纯,即所含的10%的分子种类缺乏TFPI生物学活性,可用0.9除剂量值对ala-TFPI的参照剂量值作附加修正。因此,对于具有ala-TFPI80%的固有活性并以90%生物化学纯给药的假定的TFPI类似物而言,其相当于以0.025mg/kg/hr给药速度施用参照ala-TFPI的给药速率则为0.0347mg/kg/hr(即0.025/(0.8x0.9))。
在不知道固有活性或生物化学纯度的情况下也可通过测定相对生物学活性来确定等当量剂量。相对生物学活性可通过用凝血酶原时间试验比较某特定TFPI类似物与TFPI标准的生物学活性来测定。例如,根据WO96/40784的实施例9方法产生约85%生物学活性TFPI分子种类的ala-TFPI,可用作TFPI生物学活性的标准。根据WO96/40784的实施例9的方法产生的ala-TFPI在凝血酶原实验中具有85%的参照ala-TFPI活性。在绘制凝血酶原时间标准曲线时,以log血凝时间对logTFPI浓度绘图。如果TFPI生物学活性标准具有85%的参照ala-TFPI活性,那么如果TFPI生物学活性标准的浓度在制图前先乘以0.85制备的标准曲线即相当于参照ala-TFPI的活性曲线,因此所述活性曲线与100%纯参照ala-TFPI的活性相当。当将某特定TFPI类似物的血凝时间与该标准曲线相比较时,可从曲线上读出参照ala-TFPI的等当量浓度。
或者,如果标准曲线线性部分的斜率是由线性回归分析得到的,可根据与参照ala-TFPI相比的TFPI生物学活性标准的活性来修正此斜率。某特定TFPI类似物的相对生物学活性因此等于参照ala-TFPI活性与该类似物活性之比。例如,如果某特定类似物需要1.43μg才能产生与1.00μg参照ala-TFPI相同的凝血酶原时间活性,那么所述类似物的相对生物学活性为1.00/1.43,或0.7。对所述类似物而言,与参照ala-TFPI剂量等当量的剂量可用该类似物的相对生物学活性除参照ala-TFPI剂量而得到。例如,参照ala-TFPI的0.025mg/kg/hr剂量与该类似物的0.0357mg/kg/hr(即0.025/0.7)等当量。
一些实施方式中,将TFPI或TFPI类似物给予先前曾用肝素治疗的患者。这种情况下,患者优选在施用TFPI或TFPI类似物之前至少8小时未接受过肝素。用未分级的肝素治疗可能需要更长的“清除”时间,如20、21、22、23或24小时。曾用低分子量肝素治疗过的患者的一般清除时间为9、10、11或12小时。
尽管TFPI或TFPI类似物可作为唯一的活性抗凝药物施用,但这些分子也可与一种或多种辅助治疗剂联用以提供治疗严重肺炎的联合治疗。此类辅助治疗剂包括抗体如抗内毒素的单克隆抗体(如内毒素结合Mab)和抗TNF产品如抗TNF鼠Mab。TFPI和TFPI类似物还可与白介素1受体拮抗剂、杀菌/通透率增强(BPI)蛋白、免疫刺激剂、具有消炎活性的化合物如PAF拮抗剂和细胞黏附阻断剂(如抗血小板剂如GPIIb/IIIa抑制剂)联用。
APACHE II评分低于38高于25(如25-37,或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37)的患者还可用活化的蛋白质C(如)辅助治疗。一般活化的蛋白质C以24μg/kg/hr的输注速率施用总共96小时。技术精通的医生可视各患者的临床表现调整所述剂量方案。
当联合施用时,所述治疗药物可配制成同时或不同时间给予的分离组合物。优选辅助治疗剂在相同时间(即在TFPI或TFPI类似物给药期间)或在TFPI或TFPI类似物给药期间的24小时内(即在TFPI或TFPI类似物的给药期间开始前24小时内、或结束后24小时内)给予。辅助治疗剂也可作为单一组合物与TFPI或TFPI类似物一起给予。
TFPI或TFPI类似物还可与对治疗严重细菌感染尤其是肺炎有效的其它试剂组合给予。例如,以下物质可与TFPI或TFPI类似物联用:能治疗基础性细菌感染的抗生素、针对细菌细胞壁组分的单克隆抗体、能参与严重肺炎通路的细胞因子形成复合体的受体、和通常能与细胞因子或其它活化的或放大的生理(反应)通路相互作用的任何药物或蛋白质,包括能缓解严重肺炎和/或其症状的补体蛋白。
有用的抗生素包括以下通用类型中的那些:β内酰胺环(盘尼西林)、糖苷键连接的氨基糖(氨基葡糖苷)、大环内酯环(大环内酯类)、亚萘基氨甲酰的多环衍生物(四环素)、二氯醋酸的硝基苯衍生物、肽(杆菌肽、短杆菌肽和多粘菌素)、含有共轭双键系统的大环(聚烯)、衍生自磺胺的磺胺药(氨苯磺胺)、5-硝基-2-呋喃组(硝基呋喃)、喹诺酮羧酸(萘啶酸)等。其它抗生素和上述特定抗生素的更多类型可在《化学技术百科全书》(Encyclopedia of Chemical Technology),第3版,Kirk-Othymer(编),第3卷,第1-78页,Zinsser;《微生物学》(MicroBiology),第17版,W.Jol dik等(编),第235-277页(1980);或Dorland的《医学字典图解》(Illustrated Medical Dictionary),27版,W.B.Saunders Company(1988)中找到。
可以与TFPI或TFPI类似物联用的其它药物包括内毒素拮抗剂如E5531(一种脂质A类似物,参见Asai等,Biol.Pharm.Bull.22:432(1999))、具有抗凝血活性的TF类似物(参见Kelley等,Blood 89:3219(1997)和Lee和Kelley,J.Biol.Chem.273:4149(1998))、针对细胞因子的单克隆抗体如针对IL-6或M-CSF的那些单克隆抗体、参见于1989年12月15日递交的美国序列号07/451,218、和针对TNF的单克隆抗体(参见Cerami等,美国专利号4,603,106)、能将成熟的TNF激素原从产生它的细胞切下的蛋白质抑制剂(参见1989年8月16日递交的美国序列号07/395,253)、IL-1拮抗剂(参见1990年5月1日递交的美国序列号07/517,276)、IL-6细胞因子表达抑制剂如抑制素(参见美国专利5,942,220)和各种细胞因子如IL-1的基于受体的抑制剂。还可采用补体的抗体或补体的蛋白质抑制剂,如CR1、DAF和MCP。
本公开说明书中所引用的所有专利、专利申请和参考文献均以其全文纳入本文中作为参考。
现在,将通过参阅特别优选实施方式的以下实施例阐述本发明。然而,应注意这些实施方式的目的是说明,不以任何方式解释为限制本发明。
实施例1
材料
抗TFPI的Kunitz功能域1(4904)或Kunitz功能域2(4903)的单克隆抗体购自American Diagnostica Inc.(Greenwich,CT)。发明人制备了另外的单克隆抗体(抗Kunitz功能域1的2H8和抗C末端的17)。对照小鼠IgG1购自JacksonImmunoResearch Lab Inc。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自Clonetics(San Diego,CA)在EBM-2培养基(Clonetics)中37℃培养。大肠杆菌脂多糖(LPS)购自Sigma(L-2654)。
在以下实施例中,所有外源性TFPI均为ala-TFPI。
实施例2
全血试验
在血小板活性最低的条件下不用抗凝剂抽取健康献血者的血液。献血者选择排除使用过阿司匹林或其它血液稀释剂、降胆固醇药物、消炎药、抗组胺药和抗生素的人。将含或不含ala-TFPI的含有10ng/ml LPS和不同浓度mAb的试剂混合物预先装入96孔盘中。采血后10分钟内加入总体积200μl的用含或不含10%FBS的RPMI-1640培养基达到1:10稀释的血液。将所述稀释血液样品在细胞培养箱中37℃培养16-20小时,用IL-6 ELISA试剂盒(Biosource)分析等份细胞上清液中的炎性细胞因子分泌。用细胞因子试剂盒(LINCO Research)检测其它细胞因子的释放。
实施例3
全血加HUVEC试验
试验前一天将HUVEC细胞以5000-7000细胞/96孔接种在含有10ng/ml LPS的EBM-2培养基中。试验当天,除去所述培养基更换预先配制的含或不含ala-TFPI的含有10ng/ml LPS和不同浓度mAb的含或不含10%FBS的RPMI-1640培养基的试剂混合物。然后以1:10的比例加入血液。如上所述进行全血试验。
实施例4
患者基线TFPI与死亡率相关
在用ala-TFPI治疗多种原因引起的严重败血症的大规模的III期临床试验中,发现大部分患者亚组明显从ala-TFPI治疗中获益。特别是发明人注意到CAP患者表现甚好。在所述试验进行的分析中,发明人用ELISA测量了TFPI的基线血浆浓度。如图2所示,患者的基线TFPI与死亡率有关。对全体或对CAP亚组都如此。所述结果提示,随着败血症恶化,TFPI失活并从血细胞中释放。外源性ala-TFPI虽然替代了感染过程中损失的内源性TFPI。
实施例5
在全血败血症模型中模拟TFPI转换并诱导TFPI降解
发明人通过将血清加入到正常血中创建败血症的血液模型。这迅速引起凝血并诱导多种细胞因子的脂多糖(LPS)依赖型分泌,创建状况与从败血症患者血液中观察到状况相类似。
当将ala-TFPI加入到全血时它的C末端保持完整。然而,在发明人的败血症模型中,所述C末端功能域从加入的ala-TFPI上切离。所述结果如图3所示。所述数据表明活化凝血和诱导血液炎性细胞因子的状态可引起TFPI的C末端功能域的切离。高达95%的正常血浆TFPI具有C末端缺失。C末端切除的TFPI在血液试验中几乎没有活性。
实施例6
加入的ala-TFPI对内源性TFPI水平不同的患者的存活率的影响
加入的ala-TFPI显示对基线TFPI异常的患者有效(图4)。当按照基线TFPI水平对CAP患者进行分类时,发明人发现ala-TFPI对正常基线TFPI以下的患者和基线TFPI提高的患者有效。加入的ala-TFPI改善基线TFPI升高患者的病情的事实与显示血浆TFPI失活且所述ala-TFPI药物为完全活性形式的数据相一致。
实施例7
发明人研究了健康献血者的稀释全血中的TFPI活性。发明人发现几种活性与通过炎性细胞因子调控抗菌活性的信号传导复合物组成部分的TFPI相一致。正常血液中的炎性细胞因子水平非常低且当加入外源性ala-TFPI时仍低(图5)。如所预期的那样,在正常血液中加入LPS导致炎性细胞因子包括IL-6、IL-1β和TNF-α的增加。所述反应对血浆TFPI浓度敏感,功能性TFPI的任何丧失都将削弱所述反应。
出乎预料,LPS还能使血液对TFPI敏感,因而加入丙氨酸TFPI诱导了干扰素γ(IFN-γ)、IL-6、IL-1β和TNF-α(图6、7A);IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-1β的增加可用小剂量的抗TFPI逆转(图7B)。此细胞因子谱与巨噬细胞活化相关可增强其抗菌活性。
就目前对细胞免疫的理解而言,细胞免疫受TH1细胞介导。TH1细胞的活化需要相关T细胞的抗原识别和克隆扩增,此过程需要一周时间。ala-TFPI驱动的诱导发生在数小时后,提示所述活化形式在适应性免疫系统完全参与工作前的感染关键性早期中可能起着重要作用。
这些结果表明TFPI的功能似乎是作为信号传导级联反应的配体而非凝血级联反应中的蛋白酶抑制剂。
实施例8
最近文献提出Kunitz功能域3(K3)是TFPI与其受体相互作用的必须功能域,然而看起来,K3对抑制凝血并不重要。Piro和Broze,Circulation.2004 Dec7;110(23):3567-72。利用全血试验发明人绘制了TFPI诱导细胞因子所需的TFPI功能域图。所述结果如图8所示。发明人发现C末端缺失的TFPI仍然具有活性;而C末端功能域和K3均缺乏的缺失突变无活性。这些数据与提出的TFPI通过K3锚定于受体的信号传导活性相一致。
实施例9
如上所述,将血清加到含有LPS的血中可诱导许多细胞因子;包括IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10但不包括IFN-γ。这种集合与活化巨噬细胞产物相匹配。外源加入3-10nMala-TFPI能抑制这些血清诱导的细胞因子(图7和9)。
实施例10
由因子Xa驱动的TFPI对IL-6产生的抑制
TFPI对IL-6产生的所述抑制活性看来是通过TFPI抑制Xa产生的能力而实现。图10显示用全血试验检测存在不同抑制剂时(抑制剂DEGR-VIIa、DEGR-Ixa和DEGR-Xa写成:VIIai、Ixai和Xai),LPS和血清触发产生IL-6的结果。发明人检测了几种抑制剂后发现位点失活的VIIa没有活性,显示所述细胞因子不受组织因子(TF)介导凝血活化的驱动。与预期的相反,位点失活的Ixa效力几乎与TFPI相当,表明该细胞因子的分泌涉及通过固有的凝血级联反应驱动因子Xa的形成。根据文献,Xa应所述通过其产生凝血酶的能力而诱生细胞因子。与此相反,发明人发现位点失活的Xa不具效力。
这些结果显示这些细胞因子可由Xa直接驱动,并且在这种类型的反应中,TFPI以其抑制Xa产生的能力而发挥作用。
实施例11
因为TFPI和APC(活化的蛋白质C)均能抑制凝血酶的产生,它们对凝血的影响非常相似(图11)。然而,如果细胞因子的诱生受因子Xa驱动,那么这些药物对IL-6诱生应具有不同的作用。APC通过破坏因子VIIIa而抑制Xa的产生,但对TF驱动Xa的产生没有作用。在发明人观察的败血症血液模型中,当发明人在反应中加入少量TF后,确实可观察到这种结果(图12)。在IXa驱动IL-6产生的反应中,发明人发现两种蛋白质均可抑制以IL-6水平反映的血清驱动炎症。如预期的那样,APC抑制通过该固有通路诱导的IL-6产生。然而,在存在TF时,只有TFPI能抑制IL-6的产生。
实施例12
已知血细胞的表面上存在TFPI。为了测定此种TFPI的活性,发明人用抗TFPI抗体抑制其功能并检测了细胞因子(图13)。与加入ala-TFPI所看到的抑制明显相反,抗TFPI还能抑制IL-6分泌。这些数据与将ala-TFPI加入到有LPS的正常血液时得到的结果类似。从这些数据发明人的结论为TFPI是信号传导复合物的组成部分。
一种将TF:VIIa:Xa复合物重定位到与TFPI结合的胞膜窖处的模型如图14所示。所述复合物依赖于Xa才能形成。然而不希望受所述机制的束缚,发明人猜测所述复合物的功能是活化细胞因子的分泌并增强细菌清除机制。因为所述复合物的形成依赖于Xa,过量的TFPI将作为中和抗体将阻止复合物的形成。
与所述模型一致,发明人发现蛋白酶活化受体(PAR)诱导的细胞因子的调控依赖于因子Xa的产生,甚至当PAR-1被某一激动剂肽活化时也如此。由于阻断PAR-1活性的抗体抑制IL-6的分泌,PAR-1似乎是在发明人的败血症血液模型中诱导IL-6分泌的信号传导系统的一部分(图16)。进一步加入PAR-1激动剂增强IL-6的分泌。这些事件均与关于PAR负责炎性细胞因子的产生的文献数据相一致。由于PAR活化位于凝血级联反应的下游,PAR激动剂应所述在所述系统中很重要。相反发明人发现TFPI能使PAR激动剂失效,这与本发明的模型即Xa依赖的TFPI复合物调控细胞因子相一致。
实施例13
大部分TFPI位于胞膜窖发现于内皮细胞。有人提出这些细胞通过其对表面快速诱生TF而在血液感染时充当着卫士的作用。如上所述,发明人发现血液对LPS的反应是适度爆发释放IL-6(图17)。类似地,内皮细胞对LPS的反应是产生少量细胞因子。发明人发现混合血液和内皮细胞可引起对LPS的协同反应。发明人确定这种协同反应限于IL-6和IL-8;这与内皮细胞作为报警系统的作用相匹配。
为了再一次探究TFPI在所述反应中的作用,发明人加入了中和抗TFPI抗体(图18)。发明人发现高浓度的抗TFPI抑制IL-6的产生。为了验证所述抑制是由TFPI引起的,发明人用低浓度ala-TFPI预培育抗TFPI,发现10nMala-TFPI部分抵消了600nM抗TFPI的影响(图19)。
序列表
Y.戴
<110>
S.哈迪
<120>利用TFPI治疗严重细菌感染
<130>PP028089.0004
<140>PCT/US2006/
<141>2006-05-08
<150>60/678465
<151>2005-05-06
<160>2
<170>Windows Version 4.0的FastSEQ
<210>1
<211>276
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>277
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Claims (39)
1.一种治疗有发生严重细菌感染风险或诊断为严重细菌感染的患者的方法,包括给予符合以下一种或多种标准的有需要的患者TFPI或TFPI类似物:
(a)血液IL-6水平低于3,200pg/ml;
(b)国际标准化比率(INR)低于2.5;
(c)急性生理评分(APS)低于26;
(d)急性生理和慢性健康评估(APACHE II)评分低于38;和
(e)MODS评分高于18。
2.一种降低由严重细菌感染引起的死亡风险的方法,包括给予符合以下一种或多种标准的有需要的患者含有TFPI或TFPI类似物的药物组合物:
(a)血液IL-6水平低于3,200pg/ml;
(b)国际标准化比率(INR)低于2.5;
(c)急性生理评分(APS)低于26;
(d)急性生理和慢性健康评估(APACHE II)评分低于38;和
(e)MODS评分高于18。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述严重细菌感染引起肺炎、菌血症、深部组织感染、皮肤感染、软组织感染、牙周感染、腹膜炎、外科手术感染或脑膜炎。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述严重细菌感染引起肺炎,所述肺炎为社区获得性肺炎或医院获得性肺炎。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述肺炎由肺炎链球菌引起。
6.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI和TFPI类似物为非糖基化的。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,低于约9%的TFPI或TFPI类似物分子被氧化。
9.如权利要求7所述的方法,其特征在于,低于约3%的TFPI或TFPI类似物分子被氨甲酰化。
10.如权利要求7所述的方法,其特征在于,低于约9%的TFPI或TFPI类似物分子被脱氨化。
11.如权利要求7所述的方法,其特征在于,低于约2%的TFPI或TFPI类似物分子包含半胱氨酸加合物。
12.如权利要求7所述的方法,其特征在于,低于约3%的TFPI或TFPI类似物分子被聚集。
13.如权利要求7所述的方法,其特征在于,低于约3%的TFPI或TFPI类似物分子被错误折叠。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI或TFPI类似物由含有TFPI或TFPI类似物的冻干组合物制备。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI或TFPI类似物作为含有精氨酸的制剂施用。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI或TFPI类似物作为含有柠檬酸盐的制剂施用。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物包含0.01-1.0mg/ml、0.01-0.8mg/ml、0.01-0.5mg/ml、0.01-0.3mg/ml、0.01-0.2mg/ml或0.01-0.1mg/ml的TFPI或TFPI类似物。
18.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物包含150-450mM、150-400mM、150-350mM或150-300mM的L-精氨酸。
19.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物包含0.1-50mM、0.1-40mM、0.1-30mM、0.1-25mM、0.1-15mM、0.1-10mM、0.1-5mM的L-甲硫氨酸。
20.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物含有5-50mM、5-45mM、5-40mM、5-35mM、5-30mM、5-25mM或5-20mM的柠檬酸钠缓冲液。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物的pH为5.0-6、5.0-5.8、5.0-5.7、5.0-5.6或5.0-5.5。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物包含0.15±15%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±15%mM L-精氨酸、5±15%mM L-甲硫氨酸和20±15%mM柠檬酸钠缓冲液,pH为5.5±15%。
23.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物包含0.15±10%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±10%mM L-精氨酸、5±10%mM L-甲硫氨酸和20±10%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±10%。
24.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物包含0.15±5%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±5%mM L-精氨酸、5±5%mM L-甲硫氨酸和20±5%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±5%。
25.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物包含0.45±15%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±15%mM L-精氨酸、5±15%mM L-甲硫氨酸和20±15%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±15%。
26.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物包含0.45±10%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±10%mM L-精氨酸、5±10%mM L-甲硫氨酸和20±10%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±10%。
27.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其特征在于,所述药物组合物包含0.45±5%mg/ml TFPI或TFPI类似物、300±5%mM L-精氨酸、5±5%mM L-甲硫氨酸和20±5%mM柠檬酸钠缓冲液、pH为5.5±5%。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI或TFPI类似物以一给药速率通过连续静脉输注给药,所述给药速率相当于以低于约0.66mg/kg/hr的给药速率施用参照ala-TFPI。
29.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其特征在于,所述给药速率相当于以约0.00025-0.1mg/kg/hr的给药速率施用参照ala-TFPI的,并且施用所述TFPI或TFPI类似物至少72小时。
30.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其特征在于,所述给药速率相当于以约0.010-0.1mg/kg/hr的给药速率施用参照ala-TFPI。
31.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其特征在于,所述给药速率相当于以约0.02-1mg/kg/hr的给药速率施用参照ala-TFPI。
32.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其特征在于,施用所述TFPI或TFPI类似物至少96小时。
33.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉输注给药以提供一总剂量,所述总剂量相当于施用约0.024-4.8mg/kg参照ala-TFPI的总剂量。
34.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI或TFPI类似物以一给药速率通过连续静脉输注给药,所述给药速率相当于以约0.02-1mg/kg/hr给药速率施用参照ala-TFPI。
35.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉输注施用以提供一日剂量,所述日剂量相当于施用约0.006-1.2mg/kg参照ala-TFPI的的日剂量。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI或TFPI类似物通过输注10-200小时、10-150小时或24-96小时给药。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法,其特征在于,所述患者在给予TFPI或TFPI类似物之前至少8小时内未接受过肝素治疗。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法,其特征在于,用活化的蛋白质C治疗患者。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法,其特征在于,所述TFPI类似物为ala-TFPI。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US67846505P | 2005-05-06 | 2005-05-06 | |
US60/678,465 | 2005-05-06 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101400365A true CN101400365A (zh) | 2009-04-01 |
Family
ID=37103012
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2006800153706A Pending CN101400365A (zh) | 2005-05-06 | 2006-05-08 | 利用tfpi治疗严重细菌感染 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090214506A1 (zh) |
EP (1) | EP1877081A2 (zh) |
JP (1) | JP2008540460A (zh) |
KR (1) | KR20080017021A (zh) |
CN (1) | CN101400365A (zh) |
AU (1) | AU2006244053A1 (zh) |
BR (1) | BRPI0611049A2 (zh) |
CA (1) | CA2607293A1 (zh) |
IL (1) | IL187111A0 (zh) |
MA (1) | MA29489B1 (zh) |
MX (1) | MX2007013876A (zh) |
NO (1) | NO20076245L (zh) |
RU (1) | RU2007145202A (zh) |
TN (1) | TNSN07413A1 (zh) |
WO (1) | WO2006122139A2 (zh) |
ZA (1) | ZA200709520B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105777875A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-07-20 | 青岛农业大学 | 一种抗菌肽cstc24及其应用 |
CN105777876A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-07-20 | 青岛农业大学 | 一种抗菌肽tc38及其应用 |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080124355A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
WO2009129164A1 (en) * | 2008-04-15 | 2009-10-22 | Novartis Ag | Pharmaceutical combinations of tfpi-fragments and an antibiotic |
US8241623B1 (en) | 2009-02-09 | 2012-08-14 | David Bermudes | Protease sensitivity expression system |
GB0916578D0 (en) * | 2009-09-22 | 2009-10-28 | Malmsten Nils M | Polypeptides and uses thereof |
US9597379B1 (en) | 2010-02-09 | 2017-03-21 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies |
US8771669B1 (en) | 2010-02-09 | 2014-07-08 | David Gordon Bermudes | Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria |
US8524220B1 (en) | 2010-02-09 | 2013-09-03 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria |
US9593339B1 (en) | 2013-02-14 | 2017-03-14 | David Gordon Bermudes | Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment |
US10457743B2 (en) | 2013-07-19 | 2019-10-29 | Novo Nordisk A/S | Antibodies recognizing the N-terminal part of tissue factor pathway inhibitor capable of eliciting pro-coagulant activity |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11572295B1 (en) * | 2019-06-11 | 2023-02-07 | Swamp Fox Innovations, LLC | Compositions and methods for reduction of free chlorine and related odor |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003055442A2 (en) * | 2001-10-15 | 2003-07-10 | Chiron Corporation | Treatment of sepsis by low dose administration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
CA2535562A1 (en) * | 2003-08-13 | 2005-03-03 | Chiron Corporation | Improved method of purifying tfpi and tfpi analogs |
-
2006
- 2006-05-08 CA CA002607293A patent/CA2607293A1/en not_active Abandoned
- 2006-05-08 CN CNA2006800153706A patent/CN101400365A/zh active Pending
- 2006-05-08 MX MX2007013876A patent/MX2007013876A/es not_active Application Discontinuation
- 2006-05-08 US US11/918,662 patent/US20090214506A1/en not_active Abandoned
- 2006-05-08 WO PCT/US2006/017956 patent/WO2006122139A2/en active Application Filing
- 2006-05-08 AU AU2006244053A patent/AU2006244053A1/en not_active Abandoned
- 2006-05-08 KR KR1020077028364A patent/KR20080017021A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-05-08 BR BRPI0611049-5A patent/BRPI0611049A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-05-08 EP EP06770141A patent/EP1877081A2/en not_active Withdrawn
- 2006-05-08 JP JP2008510330A patent/JP2008540460A/ja not_active Withdrawn
- 2006-05-08 RU RU2007145202/14A patent/RU2007145202A/ru not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-11-01 IL IL187111A patent/IL187111A0/en unknown
- 2007-11-05 ZA ZA200708936A patent/ZA200709520B/xx unknown
- 2007-11-05 TN TNP2007000413A patent/TNSN07413A1/en unknown
- 2007-11-29 MA MA30427A patent/MA29489B1/fr unknown
- 2007-12-04 NO NO20076245A patent/NO20076245L/no not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105777875A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-07-20 | 青岛农业大学 | 一种抗菌肽cstc24及其应用 |
CN105777876A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-07-20 | 青岛农业大学 | 一种抗菌肽tc38及其应用 |
CN105777875B (zh) * | 2016-05-26 | 2020-02-11 | 青岛农业大学 | 一种抗菌肽cstc24及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008540460A (ja) | 2008-11-20 |
US20090214506A1 (en) | 2009-08-27 |
NO20076245L (no) | 2007-12-06 |
EP1877081A2 (en) | 2008-01-16 |
CA2607293A1 (en) | 2006-11-16 |
AU2006244053A1 (en) | 2006-11-16 |
RU2007145202A (ru) | 2009-06-20 |
MA29489B1 (fr) | 2008-05-02 |
BRPI0611049A2 (pt) | 2010-08-10 |
WO2006122139A2 (en) | 2006-11-16 |
ZA200709520B (en) | 2008-11-26 |
WO2006122139A3 (en) | 2007-04-26 |
TNSN07413A1 (en) | 2009-03-17 |
MX2007013876A (es) | 2008-04-02 |
IL187111A0 (en) | 2008-02-09 |
KR20080017021A (ko) | 2008-02-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101400365A (zh) | 利用tfpi治疗严重细菌感染 | |
JP2006008706A (ja) | 組織因子経路インヒビター(tfpi)の投与による重症な肺炎の処置 | |
AU2002340183A1 (en) | Treatment of severe pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) | |
CA2191065A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of tumors | |
AU706582B2 (en) | Angiogenic inhibitor containing tissue factor pathway inhibitor | |
US20080286279A1 (en) | Treatment of Severe Community-Acquired Pneumonia by Administration of Tissue Factor Pathway Inhibitor (Tfpi) | |
CN101180074A (zh) | 通过施用组织因子通路抑制剂(tfpi)治疗严重社区获得性肺炎 | |
AU2007202500A1 (en) | Treatment of sepsis by low dose administration of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090401 |