CN101180074A - 通过施用组织因子通路抑制剂(tfpi)治疗严重社区获得性肺炎 - Google Patents

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Abstract

预防性或治疗性治疗严重肺炎的方法，包括给予患有或有患所述疾病风险的患者组织因子通路抑制剂(TFPI)或TFPI类似物。所述方法包括利用TFPI或TFPI类似物连续静脉输注，优选以低剂量输注以避免不良副作用。

Description

通过施用组织因子通路抑制剂(TFPI)治疗严重社区获得性肺炎
发明领域
本发明涉及一种治疗性治疗严重社区获得性肺炎的方法。更具体地，它涉及施用组织因子通路抑制剂蛋白质来削弱过强或过度的严重肺炎相关生理通路。
发明背景
肺炎是因肺的一个或多个功能性元件(包括肺泡腔和间质组织)急性感染所引起的疾病。美国每年约有200万人患肺炎，他们中有40,000-70,000人死亡。肺炎在所有引起死亡的疾病分类中排名第6，是最常见的致死性医院(医院获得性)感染。社区获得性肺炎(CAP)对美国的卫生保健费用有显著影响，每年的直接费用估计有140亿美元，工资损失达90亿美元。(Lynch J P，Martinez F J.Community-acquiredpneumonia(社区获得性肺炎).Curr Opin Pulm Med.1998；4：162-172)。在发展中国家，下呼吸道感染一般或是死亡的主要原因，或排名第2仅次于感染性腹泻。(The MerckManual，第73章，第6节，肺炎(Pneumonia)，2000)。
可按照各种组织包括美国胸科学会(American Thoracic Society，ATS)所提出的指南来定义称为“严重肺炎”的疾病。(Am J Respir Crit Care Med 2001；163：1730-1754)。例如，除了诊断严重肺炎的其它标准外，ATS还要求至少具有一条主要标准，例如需要机械换气或有败血休克。通常严重肺炎可由急性肺病、肺部炎症或由于例如炎症或凝血等因素引起的肺功能受到干扰所致。严重CAP的诊断的依据是因肺炎而被ICU专门收治的患者。流行病学统计发现，该患者群占所有被ICU收治患者的约10％。肺炎ICU患者在所有CAP患者中死亡率最高，为30％-40％，而与之相比普通CAP住院患者死亡率不到15％。
美国每年诊断约4百万成人患社区获得性肺炎(CAP)，其中600,000人需要住院治疗。Fine等，N.Engl.J.Med.336，243-50，1997。大体来说，CAP的发生随年龄而增加，最高流行率见于那些年龄65岁或更老的人群。Marston等，Arch InternMed.1997；157：1709-1718。在患有同类疾病(comorbidities)例如慢性阻塞性肺病、哮喘病、糖尿病、酒精中毒、免疫抑制、肾功能不全、慢性肝病和心脏病的患者中其发病率也增加。Marrie，Curr Opin Pulm Med.1996；2：192-197；Niedermann等，Am RevRespir Dis.1993；148：1418-1426。
在美国肺炎是感染引起死亡的主要原因，是所有死亡中排名第6的主要原因。肺炎相关死亡率从1979年到1992年增加了22％，1992年所有肺炎相关死亡中老年患者(65岁及以上)占89％。参见肺炎和流感死亡率—美国，1979-1992[发表的勘误见MMWR.1995；44：782中所示].MMWR.1995；44：535-537。Fine和他的同事(1997)报道了某些共存疾病(肿瘤疾病、充血性心脏衰竭(CHF)、脑血管病、肾病和肝病)和某些体检发现(精神状态改变、心率加快、呼吸速率加快、收缩期血压降低和体温异常降低或升高)也与CAP相关死亡率的增加相关。此外，CAP对美国卫生保健费用具有显著影响，每年的直接费用估计有140亿美元，工资损失达90亿美元。Lynch和Martinez，Curr Opin Pulm Med.1998；4：162-172。
组织因子通路抑制剂(TFPI)是一种存在于哺乳动物血浆中的蛋白质和丝氨酸蛋白酶抑制剂。Thomas，Bull.Johns Hopkins Hosp.81，26(1947)；Schneider，Am.J.Physiol.149，123(1947)；Broze和Miletich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，1886(1987)。TFPI还称为组织因子抑制剂、组织促凝血酶原激酶抑制剂、因子III抑制剂、外源性通路抑制剂(EPI)和脂蛋白相关凝血抑制剂(LACI)。1991年6月30日国际《血栓形成和止血》协会接受了其命名为“组织因子通路抑制剂”(TFPI)。
血液凝固是液体血液转变为固体凝胶或血块。此外，凝血蛋白酶的消耗将导致过度出血。虽然纤维蛋白本身仅占整个血凝块的0.15％，但凝血主要是可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白。这种转变是复杂的酶级联反应的最后一步。所述组分(因子)以酶原、即蛋白水解酶的无活性前体存在，可在特定部位通过蛋白水解断裂而转变成活化酶。级联反应时一种因子的少量活化可催化产生较多量的下一种因子，如此引起放大效应导致极迅速地形成纤维蛋白。
认为凝血的启动是由于血管损伤使因子VIIa接触内皮下细胞表达的组织因子(TF)所致。因子VIIa-TF复合物可切断因子X形成因子Xa和切断因子IX形成因子IXa。TFPI能结合因子VIIa和因子Xa。TFPI、因子VIIa(及其结合的TF)和因子Xa之间形成的复合物能抑制维持止血所需的因子Xa和IXa的进一步形成。Broze，Jr.，Ann.Rev.Med.46：103(1995)。
直接进入血流的细菌产物包括内毒素活化凝血级联反应可引起纤维蛋白广泛沉积于动脉表面而致耗尽纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、VIII和血小板。此外，可激活纤维蛋白溶解系统，导致进一步形成纤维蛋白降解产物。
看来与细菌产物(例如内毒素)启动凝血的同时，名为纤维蛋白溶解系统的抵消机制看似也被血块所活化。活化的因子VIII可将纤维蛋白溶酶原活化剂前体转变为纤维蛋白溶酶原活化剂，接着将纤维蛋白溶酶原转变为纤维蛋白溶酶，从而介导血凝块溶解。因此，血浆纤维蛋白溶解系统的活化也可导致出血倾向。
内毒素血症与组织纤维蛋白溶酶原活化抑制剂(PAI)的血循环水平增加相关。此抑制剂能迅速灭活组织纤维蛋白溶酶原活化剂(TPA)，使其不能通过活化纤维蛋白溶酶原产生纤维蛋白溶酶促使纤维蛋白溶解。纤维蛋白溶解的削弱可引起纤维蛋白沉积于血管中，因此导致与败血性休克相关的DIC。
努力鉴定令人满意的能预防或治疗严重肺炎及其相关凝血病理的干扰药物仍在继续。能阻断凝血通路的制剂并不一定能有效治疗或预防性治疗严重肺炎。例如，肝素是一种常用的抗凝血剂。然而，由于肝素可引起过度出血和发现其虽可减弱凝血异常但不能挽留生命，因此对肝素进行可控制的应用很困难。参见例如Aoki等，″AComparative Double-BLIND randomized Trial of Activated Protein C and UnfractionatedHeparin in the Treatment of Disseminated Intravascular Coagulation，″(用活化的蛋白质C和未分级肝素治疗弥散性血管内凝血的比较性双盲随机试验)Int.J.Hematol.75，540-47(2002)。几次临床试验，主要是在爆发性DIC为主要特征的脑膜炎球菌内毒素血症中，用肝素治疗来降低败血症死亡率证明已失败。参见例如Corrigan等，″Heparin Therapy in Septacemia with Disseminated IntravascularCoagulation.Effect on Mortality and on Correction of Hemostatic Defects，″(肝素治疗弥散性血管内凝血的败血症。对死亡率和对纠正止血缺陷的影响)N.Engl.J.Med.，283：778-782(1970)；Lasch等，“Heparin Therapy of Diffuse IntravascularCoagulation(DIC)″(肝素治疗弥散性血管内凝血(DIC))，Thrombos.Diathes.Haemorrh.，33：105(1 974)；Straub，″A Case Against Heparin Therapy of IntravascularCoagulation″(一个肝素治疗血管内凝血的案例)，Thrombos.Diathes.Haemorrh.，33：107(1974)。
易患严重社区获得性肺炎的患者是那些需要被重症监护病房(ICU)收治的社区获得性肺炎患者。社区获得性肺炎患者是临床上鉴定和/或经X光摄片和临床症状确认患有肺实质感染的患者。严重肺炎包括严重社区获得性肺炎，通常具有已知的病原体，包括肺炎链球菌、军团菌、流感嗜血杆菌(H.influenae)或各种革兰氏阴性菌。大部分严重社区获得性肺炎患者在CAP急性发作前居住在社区中，仅有约20％是从医院、私人医院或长期护理院转来而被ICU收治的。在美国严重CAP患者中男性约50％，女性约50％，但老龄居多。美国严重CAP患者中约17％年龄不到50岁；约24％年龄在50-64岁之间；约21％年龄在65-74岁之间和约38％年龄超过75岁。大多数严重CAP患者患有一种或多种显著的同类疾病。2003年接收ICU护理治疗的美国CAP患者中，通常患有相应的心脏病、COPD/囊性纤维化病、糖尿病、肾病、癌症、酒精中毒和/或药物成瘾。
给予重组人ala-TFPI(一种TFPI类似物)已证明能够改进败血症动物模型的存活率。参见例如美国专利第6,063,764号。作为一种内源性蛋白质，TFPI耐受良好。静脉输注或皮下注射TFPI显示能减少血凝块形成，表现为凝血酶原时间(PT)延长而证明。在动物和人类研究中，PT的延长与血浆TFPI的增加呈线性相关。A.A.Creasey，Sepsis(败血症)3：173(1999)。
本领域仍然需要能够抑制严重肺炎致死作用同时最大程度减少潜在严重副作用的治疗方法。
发明概述
本发明的一实施方式是治疗或预防严重肺炎的方法，包括给予患有或有患严重肺炎风险的患者TFPI或TFPI类似物。一些实施方式中，所述患者已被证明患有感染。
本发明的另一实施方式是治疗严重肺炎的方法，包括给患者连续静脉输注选自TFPI或TFPI类似物的制剂。一些实施方式中，所述患者已被证明患有感染。
本发明的另一实施方式是治疗或预防严重肺炎的方法，包括给予患有或有患严重肺炎风险的病人不会引起过度出血量的TFPI或TFPI类似物。
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，其中所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉输注给药，给药速率相当于以低于约2.0毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。优选实施方式中，所述给药速率相当于以约0.00025-2.0或约0.001-1.75毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。另一优选实施方式中，所述给药速率相当于以约0.005-1.50毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。在一更优选实施方式中，所述给药速率相当于以约0.010-0.75毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。在还要优选的实施方式中，给予所述TFPI或所述TFPI类似物的给药速率相当于以约0.2-0.8毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。另一优选实施方式中，以所述给药速率给药所提供的总剂量相当于给予参照品ala-TFPI约0.024-4.8mg/kg的总剂量。另一优选实施方式中，以所述给药速率给药所提供的日剂量相当于给予参照品ala-TFPI约0.006-1.2mg/kg的日剂量。
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，其中给予所述TFPI或TFPI类似物至少72小时。一优选实施方式中，给予所述TFPI或TFPI类似物至少96小时。
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，其中所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI.
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，其中所述TFPI类似物含有一由SEQID NO：1的氨基酸19-89组成的第一Kunitz结构域。一优选实施方式中，所述TFPI类似物还含有由SEQ ID NO：1的氨基酸90-160组成的第二Kunitz结构域。
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，其中所述TFPI类似物含有SEQ IDNO：1的氨基酸1-160，或所述TFPI类似物含有SEQ ID NO：1的氨基酸90-160组成的第二Kunitz结构域。
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，其中所述TFPI或TFPI类似物用含有TFPI或TFPI类似物的冻干组合物制备。
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，其中给予的所述TFPI或TFPI类似物为含精氨酸的制剂。
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，其中给予的所述TFPI或TFPI类似物为含柠檬酸盐的制剂。
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，其中制剂中所述TFPI或TFPI类似物的浓度为约0.15mg/ml，含有约300mM的盐酸精氨酸和约20mM柠檬酸钠，pH约为5.5。
其它实施方式包括任何一种上述实施方式，还包括在给予所述TFPI或TFPI类似物的24小时内同时给予一种选自：抗生素、抗体、内毒素拮抗剂、具有抗凝血活性的组织因子类似物、免疫刺激剂、细胞粘附阻断剂、肝素、BPI蛋白、IL-1拮抗剂、pafase(PAF酶抑制剂)、TNF抑制剂、IL-6抑制剂和补体的抑制剂的其它药物。一优选实施方式中，所述其它药物是能特异性结合选自TNF、IL-6和M-CSF的抗原的抗体。
本发明的其它实施方式在观看了以下参考附图并结合详细描述而可明白。
发明详述
给予TFPI或TFPI类似物可有效预防和治疗严重肺炎。连续低剂量给予TFPI或TFPI类似物(下文中以“给予低剂量TFPI”代替)也可有效预防和治疗严重肺炎。给予TFPI或TFPI类似物，特别是以低剂量给予，可抑制或减轻急性或慢性炎症，具体是严重肺炎。当连续至少3天给予低剂量TFPI时，死于严重肺炎的风险降低，而不良副作用引起的并发症，特别是出血病症的发生率降到最低。低剂量给予TFPI的另一优点是可避免耐受作用，所述耐受作用在足够高剂量时能降低TFPI的血浆浓度。在TFPI血浆浓度约为850ng/ml时激发的耐受效应可达半数最大值，而以低剂量给予TFPI时，其血浆水平通常维持在500ng/ml以下。低剂量给予TFPI常通过连续静脉输注TFPI或TFPI类似物来实现。
TFPI和TFPI类似物
本文使用的“TFPI”指具有如SEQ ID NO：1所示276个氨基酸残基序列分子量约为38,000道尔顿的成熟血清糖蛋白。它是组织因子活性和凝血活性的天然抑制剂。美国专利第5,110,730号描述了组织因子(TF)，美国专利第5,106,833号描述了TFPI。TFPI cDNA的克隆描述见Wun等，美国专利第4,966,852号。TFPI是一种蛋白酶抑制剂含有3个Kunitz结构域，已知其中的两个能分别与因子VII和Xa相互作用。第三个结构域的功能仍然未知。认为TFPI在体内能通过形成无活性的四分之一因子Xa：TFPIa：组织因子复合物来抑制凝血的启动。参见Rapaport，Blood 73：359-365(1989)和Broze等，Biochemistry 29：7539-7546(1990)的综述。可从其与其它已有充分研究的蛋白酶抑制剂的同源性来推断TFPI的许多结构特征。TFPI不是一种酶，因此它可能以化学计量方式抑制其靶蛋白酶，即TFPI的一个Kunitz结构域抑制一个蛋白酶分子。优选本发明TFPI分子存在Kunitz结构域1和/或2。Kunitz结构域3的功能未知。
“TFPI类似物”是含有一个或多个氨基酸添加或取代(通常为保守性取代)、一个或多个氨基酸缺失(如，TFPI片段)、或对一个或多个氨基酸中加入一个或多个化学基团的修饰的TFPI衍生物，只要这种修饰长度不破坏TFPI的生物学活性。制备多肽类似物的方法是本领域已知的，下面作进一步描述。优选的TFPI类似物是N-L-丙氨酰-TFPI(ala-TFPI)，其氨基酸序列见SEQ ID NO：2所示。用下面描述的生物活性试验测定，TFPI类似物具有TFPI的某些活性量。TFPI和类似物的优选生物活性试验是凝血酶原时间(PT)试验(见下)。
TFPI和TFPI类似物可以是糖基化或非糖基化的。TFPI类似物的描述见美国专利第5,106,833号。Ala-TFPI是一种TFPI类似物，已知某国际药物名为“替法可近(tifacogin)”。Ala-TFPI包括氨基酸末端有一个额外丙氨酸残基的成熟、全长人TFPI完整氨基酸序列。将ala-TFPI氨基酸末端丙氨酸残基经工程改造加入TFPI序列中以改进大肠杆菌表达同时有效切除了氨基酸末端的甲硫氨酸残基。参见美国专利第5,212,091号。
特别优选的TFPI类似物包含有保守性取代，即那些取代发生在同一氨基酸家族内的涉及侧链的取代。具体地说，氨基酸通常可分成4个家族：(1)酸性-天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归类为芳族氨基酸。例如，可合理预测用异亮氨酸或缬氨酸分别取代亮氨酸、用谷氨酰胺取代天冬酰胺、用丝氨酸取代苏氨酸、或用结构相关氨基酸类似保守性取代某氨基酸，对其生物学活性不会有重要影响。例如，只要该分子所需的功能保持完整，感兴趣的多肽可包括约1-70个保守或非保守性氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、6-50、15-25、5-10或1-70任何整数的取代。本领域技术人员不难确定感兴趣分子中具有保持本文定义生物学活性的合理可能性的可被修饰区域。
“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽部分之间的相似性百分比。当两条多肽序列的序列同源性或确定长度分子特定范围内的相同性百分比显示为至少约50％、优选至少约75％、更优选至少约80％-85％，优选至少约90％和最优选至少约95％-98％时，此二条多肽序列被此“基本同源”。本文采用的“基本同源”还指显示与特定多肽序列完全相同的序列。
总体上，“相同性”指两条多肽序列的氨基酸与氨基酸分别精确相对应。相同性百分比可通过序列排列对比，计算两个对比序列之间确切匹配数目，除以较短序列长度，结果再乘100而直接比较两个分子之间的序列信息来定。
优选天然或非天然产生的TFPI类似物的氨基酸序列与衍生自SEQ ID NO：1的TFPI至少70％、80％、85％、90％或95％或更高同源。更优选所述分子98％或99％同源。同源性百分比可采用Smith-Waterman同源性检索算法测定，该算法采用缺口开放罚分12，缺口延伸罚分2和BLOSUM距阵为62的仿射缺口检索。Smith-Waterman同源性检索算法可参见Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482-489(1981)。
TFPI和TFPI类似物的生物学活性可用凝血酶原试验测定。合适的凝血酶原试验的描述见美国专利第5,888,968号和WO96/40784。简单来说，凝血酶原时间可用血凝计(例如，Organon Teknika的Coag-A-Mate MTX II)测定。合适的试验缓冲液含有1mg/ml牛血清白蛋白、100mM的NaCl、pH调节到7.5的50mM的Tris。需要的其它试剂是正常人血浆(例如，Organon Teknika的“Verify 1”)、组织促凝血酶原激酶试剂(例如，Organon Teknika的“Simplastin Excel”)和TFPI标准溶液(例如，20μg/ml试验缓冲液的100％纯ala-TFPI)。通过分析(例如)终浓度为1-5μg/ml的TFPI标准溶液系列稀释液的凝固时间获得标准曲线。为了测定凝固时间，先将样品或TFPI标准品用试验缓冲液稀释。然后加入正常人血浆。通过加入组织促凝血酶原激酶试剂启动凝固反应。然后用仪器记录凝固时间。以凝固时间对数与TFPI浓度对数作图获得线性TFPI标准曲线。根据TFPI标准品纯度调整标准曲线使之对应于100％纯度标准品的等价TFPI浓度。例如，如果标准品是97％生物化学纯的ala-TFPI制品(即，含有3％重量的分子不具有TFPI生物学活性)，那么此标准品各稀释液的浓度要乘以0.97得到TFPI的真实浓度。因此，1.0μg/ml的97％纯度的制品每ml TFPI标准品的真正重量等价于或视同于浓度1.0×0.97或0.97μg/ml。
获得TFPI和TFPI类似物
可从细胞或组织中分离或纯化、化学合成或用原核或真核细胞重组制备用于本发明方法的TFPI和TFPI类似物。
分离TFPI有几种方法。例如，分泌TFPI的细胞包括用TNF处理约3-4天的衰老的内皮细胞和年轻的内皮细胞、肝细胞和肝癌细胞。TFPI可用常规方法纯化，包括层析方法，如Pedersen等，1990，J. Biol.Chem.265，16786-93，Novotny等，1989，J.Biol.Chem.264，18832-37，Novotny等，1991，Blood 78，394-400，Wun等，1990，J. Biol.Chem.265，16096-101和Broze等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，1886-90。TFPI出现在于血流中故可从血液中纯化，参见Pedersen等，1990。
制备TFPI或TFPI变体可用化学方法合成其氨基酸序列，如采用固相技术直接合成肽(Merrifield，J. Am.Chem.Soc.85，2149-2154，1963；Roberge等，Science 269，202-204，1995)。可用手工技术或自动化合成蛋白质。自动化合成可采用例如AppliedBiosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)来完成。任选采用化学方法分别合成TFPI或TFPI变体片段再组合产生全长分子。
可按美国专利号4,966,852所述重组制备TFPI和TFPI类似物。例如，可将所需蛋白质的cDNA加入到质粒中在原核或真核细胞中表达。美国专利号4,847,201提供了用特定DNA序列转化微生物和表达它们的细节。本领域普通技术人员知道有许多其它参考文献提供了用微生物表达蛋白质的细节。它们中的许多被美国专利号4,847,201所引用，如Maniatas等，1982，《Molecular Cloning(分子克隆)》，Cold SpringHarbor Press。
可利用已有的各种技术转化微生物用它们表达TFPI和TFPI类似物。以下仅是几种可能采用的方式的例子。必须分离TFPI DNA序列将其与合适的调控序列相连接。TFPI DNA序列见美国专利号4,966,852，可将其加入到质粒，如pUNC13或pBR3822中，这些质粒可从例如Boehringer-Mannheim等公司商品化购得。一旦将TFPI DNA插入载体中，可将载体克隆入合适的宿主细胞中。可通过授于Mullis的美国专利号4,683,202和Mullis等的美国专利号4,683,195中所述的技术扩增此DNA。TFPI cDNA可通过以下步骤获得：诱导细胞如肝癌细胞(如HepG2和SKHep)制备TFPI mRNA，然后鉴定和分离此mRNA并将其反转录以获得TFPI的cDNA。将此表达载体转化入宿主细胞如大肠杆菌后，可发酵细菌表达此蛋白质。细菌优选原核微生物尤其优选大肠杆菌。优选的可用于本发明的微生物是根据布达佩斯条约的规定，于1984年2月14日保存于ATCC的大肠杆菌K12、菌株MM294(登录号为39607)。
当然，也可在衍生自多细胞生物的真核宿主细胞培养中表达编码多肽的基因。参见如《Tissue Culture(组织培养)》，1973，Cruz和Patterson编，Academic Press。可用的哺乳动物细胞系包括鼠骨髓瘤N51、VERO、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS、C127、HepG2和SK Hep。还可在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达TFPI和TFPI类似物(也参见上述美国专利号4,847,201)。也参见Pedersen等，1990，J.ofBiological Chemistry，265：16786-16793。真核细胞表达载体一般包括启动子和与哺乳动物细胞相容的调控序列，例如常用的仙台病毒40(SV40)(Fiers等，1978，Nature，273：113)的早期和晚期启动子或其它病毒启动子如源自多瘤病毒、腺病毒2、牛乳头瘤病毒、或禽肉瘤病毒的启动子、或免疫球蛋白启动子和热激(蛋白)启动子的那些启动子。
Axel的美国专利号4,399,216对哺乳动物细胞宿主系统的转化作了全面描述。现在看来“增强子”区域对优化表达也很重要，它们一般是见于启动子区域上游的序列。如果需要，可从病毒中获得复制起点。然而，整合入染色体是真核生物中DNA复制的普遍机制。目前也已采用植物细胞作为宿主，并已有与植物细胞相容的调控序列，如胭脂氨酸合酶启动子和聚腺苷酸化信号序列(Depicker，A等，1982，J.MoI.Appl.Gen.，1：561)。转化植物细胞的方法和载体公开于WO 85/04899。
可用于纯化哺乳动物细胞表达的TFPI和TFPI类似物的方法包括依次应用：肝素琼脂糖、MonoQ、MonoS和反相HPLC层析。参见Pedersen等，同上；Novotny等，1989，J.Biol.Chem.264：18832-18837；Novotny等，1991，Blood，78：394-400；Wun等，1990，J.Biol.Chem.265：16096-16101；Broze等，1987，PNAS(USA)，84：1886-1890；美国专利号5,106,833；和美国专利号5,466,783。这些参考文献描述了纯化哺乳动物产生的TFPI的各种方法。
TFPI还可用哺乳动物细胞宿主表达为重组糖基化蛋白质，如用小鼠C127细胞(Day等，Blood 76，1538-45，1990)、乳仓鼠肾细胞(Pedersen等，1990)、中国仓鼠卵巢细胞和人SK肝癌细胞。C127细胞已用于动物研究显示在家兔中能有效抑制组织因子诱导的血管内凝血(Day等，同上)、能有效预防狗溶栓后动脉的重阻塞(Haskel等，Circulation 84：821-827(1991))、能有效降低狒狒大肠杆菌败血症模型的死亡率(Creasey等，J.Clin.Invest.91：2850(1993))。ala-TFPI还可用大肠杆菌宿主细胞表达为重组非糖基化蛋白质。通过体外重折叠大肠杆菌产生的所述重组蛋白质得到高活性ala-TFPI的方法已有报道。参见例如WO 96/40784。
还可在细菌和酵母中制备TFPI和TFPI类似物然后纯化。一般可采用美国专利号5,212,091；6,063,764和6,103,500或WO 96/40784中所示的方法。ala-TFPI和其它TFPI类似物可按照WO 96/40784和Gustafson等，Prot.Express.Pur. 5：233(1994)所述进行纯化、溶解和重折叠，这些文献纳入本文作为参考。例如，当按照WO96/40784的实施例9制备时，可获得占总蛋白质重量约85％-90％的成熟的、正确折叠的、具有生物学活性的ala-TFPI制品，其中约10％-15％为含有一个或多个氧化甲硫氨酸残基的ala-TFPI。用凝血酶原试验检测这些氧化形式的生物学活性与未衍生的ala-TFPI相当，并预计在本文公开的本发明制品中具有活性。其余物质含有各种修饰形式的ala-TFPI，包括二聚体、凝聚和乙酰化形式。
TFPI和TFPI类似物可含有显著数目的半胱氨酸残基，美国专利号4,929,700显示了关于TFPI重折叠的方法。可用各种层析方法(如上面提到的那些)从缓冲溶液中纯化得到TFPI和类似物。如果需要，可采用美国专利号4,929,700所示的方法。可用任何方法来纯化得到纯度和活性水平适合给予人的TFPI和TFPI类似物。
治疗方法和组合物
一般采用TFPI和TFPI类似物来治疗或预防因组织因子表达上调，因此TNF、IL-1或其它细胞因子激发TF活性而发生的那些疾病。TFPI的给药，具体是TFPI的低剂量给药，可降低患者体内细胞因子例如IL-6的浓度。一般低剂量TFPI给药可用于治疗炎症和凝血异常，包括急性和慢性炎症例如严重肺炎。
“严重肺炎”按美国胸科学会(American Thoracic Society)的指南定义。具体说，严重肺炎需要诊断为肺炎并存在a)两条主要标准之一；或b)三条次要标准中的两条；或c)英国胸科学会的4条标准中的两条(Thorax 2001；56[增刊FV]：1-64)。主要标准为1)需要机械换气和2)败血性性休克或需要升压剂＞4小时。次要标准为1)收缩压≤90mmHg，2)多叶性肺炎，和3)低血氧标准(PaO2/FiO2)＜250。英国胸科学会的标准为1)呼吸频率≥30次呼吸/分钟，2)舒张压≤60mmHg，3)血尿素氮(BUN)＞7.0mM(＞19.6mg/dL)和4)意识紊乱。如本领域所知，低血氧标准(PaO2/FiO2)指动脉氧分压与吸入氧分压之比表示气体交换损伤的水平。
严重肺炎患者宜具有可用本领域已知任何方法证明的感染。这些方法包括但不限于在血液或其它正常的无菌体液或组织培养中通过(例如)GRAM染色、培养、组织化学染色、免疫化学试验或核酸试验检测到致病性微生物。也可通过胸部X光摄片提供的肺炎诊断证据、以及感染的临床症状，包括但不限于呼吸频率＞/＝30次/分钟或PaCO2/FiO2＜250、血压下降和体温升高证明感染，从而构成全身抗感染治疗的理由。
TFPI和TFPI类似物的制剂
优选通过静脉输注给予TFPI和TFPI类似物的制剂。优选基本上连续的静脉输注。实现所述给药的方法是本领域技术人员已知的。输注可通过中线或外周线进行。虽然能避免给药速率的大波动，但给予TFPI后产生的血浆水平只要按本发明优选实施方式的恒速给药连续输注预期水平的20％以内，本发明给药速率的短时偏差可以接受。
在给予患者之前，可将配制材料加入到TFPI和TFPI类似物中。优选液体配制材料。可采用不同配方将TFPI和TFPI类似物配成不同浓度和与给药途径、溶解性和TFPI蛋白质稳定性相容的任何生理上适合的pH值。优选的静脉输注制剂包括约0.6mg/ml的ala-TFPI、300mM的盐酸精氨酸、和pH5.0-6.0的柠檬酸钠缓冲液。某些溶质如精氨酸、NaCl、蔗糖和甘露醇起着增溶和/或稳定ala-TFPI的作用。参见WO96/40784。尤其优选的静脉输注制剂包含约0.15mg/ml的ala-TFPI、300mM的盐酸精氨酸和pH5.5的20mM柠檬酸钠。也可用150mM NaCl和pH为5.5-7.2的20mM磷酸钠或其它缓冲液将TFPI和TFPI类似物配制成浓度约0.15mg/ml的溶液，任选含有0.005％或0.01％(w/v)的聚山梨酯80(吐温80)。其它制剂含有约0.5mg/ml的TFPI或TFPI类似物和含有150mM NaCl、8％(w/v)蔗糖或4.5％(w/v)甘露醇的pH为5.5的10mM醋酸钠溶液。TFPI和TFPI类似物还可用高盐配制成高达每毫升几毫克更高浓度的制剂。例如一种制剂包含有约6.7mg/ml的ala-TFPI、500mM NaCl和pH7.0的20mM磷酸钠。此外，TFPI制剂可包含甲硫氨酸，优选浓度范围在1-10mM的甲硫氨酸。
TFPI制剂的优选实施方式是约0.1-0.7mg/ml的ala-TFPI、200-500mM的L精氨酸、1-7mM的甲硫氨酸、pH5.0-6.0的5-50mM柠檬酸钠缓冲液，。TFPI制剂的优选实施方式是约0.1-0.5mg/ml的ala-TFPI、250-400mM的L-精氨酸、3-6.5mM的甲硫氨酸、pH5.0-6.0的15-30mM柠檬酸钠缓冲液。TFPI制剂的优选实施例中含有约0.15mg/ml的ala-TFPI、约300mM的L-精氨酸氢氧化物、5mM的甲硫氨酸、pH5.5的20mM柠檬酸钠缓冲液。TFPI制剂的另一优选实施方式包含约0.45mg/ml的ala-TFPI、约300mM的L-精氨酸氢氧化物、5mM的甲硫氨酸、pH5.5的20mM柠檬酸钠缓冲溶液。
TFPI和TFPI类似物配制材料的其它例子包括油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐类、缓冲剂、白蛋白、表面活性剂或膨松剂。优选的碳水化合物包括糖或糖醇如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉、和羧甲基纤维素、或其混合物。最优选蔗糖。糖醇定义为含-OH基团的C4-C8烃，包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。最优选甘露糖醇。上述这些糖或糖醇可单独或组合施用。只要这种糖或糖醇可溶于水相制备物，其用量没有固定限制。优选糖或糖醇的浓度在1.0w/v％和7.0w/v％之间，更优选在2.0和6.0w/v％之间。
优选的氨基酸包括左旋(L)形式的肉碱、精氨酸和甜菜碱；然而，可加入其它氨基酸。优选的聚合物包括：平均分子量2000-3000的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、或平均分子量3000-5000的聚乙二醇(PEG)。还优选在冻干前或重建后在该组合物中使用缓冲剂以最大程度减小溶液pH变化。可采用大多数的生理缓冲液，但优选柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐和谷氨酸盐缓冲液或其混合物。优选缓冲液浓度为0.01-0.3摩尔。可在该制剂中加入表面活性剂如欧洲专利号270,799和268,110所示。
此外，TFPI和TFPI类似物可(例如)通过共价偶联于聚合物进行化学修饰来延长其循环半衰期。优选的聚合物和将它们连接于肽的方法见美国专利第4,766,106、4,179,337、4,495,285和4,609,546号中所述。优选聚合物为聚氧乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG室温可溶于水具有通式：R(O--CH2--CH2)n--O--R，其中R可以是氢或保护性基团例如烷基或烷醇基团。优选保护性基团具有1-8个碳原子，更优选为甲基。符号n为正整数，优选为1-1,000，更优选为2-500。PEG的优选平均分子量为1000-40,000，更优选为2000-20,000，最优选为3,000-12,000。优选PEG具有至少一个羟基，更优选为末端羟基。优选活化所述羟基与抑制剂上的游离氨基基团反应。然而，应该理解为了获得本发明的共价偶联PEG/TFPI，可以改变反应基团的类型和数量。
水溶性聚氧乙烯多元醇也可用于本发明。它们包括聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯葡萄糖、聚氧乙烯甘油(POG)等。优选为POG。理由之一是聚氧乙烯甘油的甘油骨架与(例如)动物和人中天然产生的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯的骨架相同。因此，在体内这种分支化合物并不必然会被视作外来物质。POG的优选分子量范围与PEG相同。POG的结构见Knauf等，1988，J.Bio.Chem.263：15064-15070所述，有关POG蛋白偶联物的论述参见美国专利第4,766,106号。
TFPI或TFPI类似物的液态药物组合物制备好后，可冻干以防降解并无菌保存。冻干液态组合物的方法是本领域普通技术人员已知的。临用前，可用包含加入成分的无菌稀释液(如Ringer溶液、蒸馏水或无菌盐水)重建所述组合物。重建后，所述组合物优选通过连续静脉输注施用到对象。
TFPI和TFPI类似物的剂量
TFPI或TFPI类似物的给药浓度应能有效治疗或预防严重肺炎。此剂量对其它急性或慢性炎症和细胞因子上调组织因子表达所致的的常见疾病也有效。为实现此目的，TFPI或TFPI类似物宜通过静脉给药。给药方法是本领域普通技术人员已知的。一般，TFPI或TFPI类似物优选以1μg/kg和30mg/kg之间的剂量给予，更优选剂量在20μg/kg和25mg/kg之间，最优选在1和15mg/kg之间。
上述剂量给药通常持续一段时间，至少约150小时，优选持续至少约100小时。一实施方式中，连续施用TFPI约99-90小时，优选为约97-94小时，更优选为约96小时。以单剂或分次剂量给予宿主的每日总剂量为例如约2-20毫克/千克体重，优选约2-15毫克/千克体重，约4-10mg/kg。组合物的剂量单位可包含所述量或构成日剂量的分剂量。较低的日剂量可用于预防或其它目的，例如，1μg/kg-2mg/kg。可与运载体材料结合产生单剂量的活性成分的量随治疗患者和施用的具体模式而不同。
剂量方案应依据不同因素选择，包括药物类型、患者的年龄、体重、性别、饮食和医疗条件、疾病的严重性、给药途径、药理学的考虑如活性、效力、药物代谢动力学和毒性、是否采用药物递送系统以及化合物是否作为药物组合物的一部分施用。因此，实际采用的剂量方案可有很大不同并可偏离上述的优选剂量方案。优选TFPI或TFPI类似物的给药速率不应超过相当于ala-TFPI约0.66毫克/千克/小时的给药速率。
低剂量施用
当TFPI或TFPI类似物的给药速率相当于以约0.00025-2.00毫克/千克/小时(0.00417-0.833μg/kg/min)的给药速率施用ala-TFPI时，可维持治疗严重肺炎和最低的不良副作用如出血。一优选实施方式中，ala-TFPI以约0.02-1.0毫克/千克/小时的给药速率施用，更优选为约0.24-0.8毫克/千克/小时。为了改进组合效力和安全性，给药速率优选相当于约0.010-0.045毫克/千克/小时(0.167-0.833μg/kg/min)的ala-TFPI的给药速率，或相当于约0.020-0.040毫克/千克/小时的ala-TFPI的给药速率，最优选相当于约0.025毫克/千克/小时(0.417μg/kg/min)的ala-TFPI的给药速率。给药途径通常为静脉施用，优选通过连续静脉输注。可给予输注至少约72、96、100、120或240小时。优选给予连续输注3-8天，更优选3-6天，最优选约4天。
“连续输注”施用意味着以处方规定的大致速率连续输注，在大部分处方规定的时间内基本不中断。或者，可采用间歇性静脉输注。如果采用间歇性输注，那么应所述采用与上述连续输注给药速率相当的平均时间给药速率。此外，间歇性输注程序产生的最大血清浓度必须不超过采用持续输注所获得的最大浓度的约20％。为了避免给患者带来不良副作用(具体的副作用包括出血)，给药速率应低于与持续静脉输注约为0.050毫克/千克/小时的ala-TFPI相当的给药速率。
由于用凝血酶原试验测定蛋白质浓度和生物学活性具有误差，本文中描述的所有剂量，包括给药速率和总剂量在实施中均可有10％的差异。因此，实际的施用剂量相比本文所述的剂量高10％或低10％均认为与所述剂量相当。由于所述原因，所有剂量均被称为“约”某一特定量。例如，称为“约0.025毫克/千克/小时”的剂量认为与范围在0.0225-0.0275毫克/千克/小时的任何实际剂量相当。
如果低剂量TFPI给药后，在实施中本发明还可采用TFPI或TFPI类似物的推注或简单讲更快输注速率。例如，推注或更快输注速率可用来缩短患者循环系统内施用TFPI或TFPI类似物的平衡时间。这么做，可更快速地达到TFPI的最终稳态血浆水平且能更快饱和TFPI受体。以约0.025毫克/千克/小时速度给予人2小时ala-TFPI能将TFPI(加ala-TFPI)的血浆水平从约80ng/ml增加到约125ng/ml、或增加约50％。如果加快输注速率或采用推注能更快到达相同水平。如果持续输注直到获得稳态，那么更快输注速率将引起更高水平。在患有严重细菌感染的患者中，已发现以约0.050毫克/千克/小时施用ala-TFPI所达到的稳态水平为约300ng/ml，而且已发现以约0.33或约0.66毫克/千克/小时施用ala-TFPI为约至少2μg/ml。
以单次连续输注或分多次输注剂量给予宿主的总日剂量可以如相当于每天施用约0.006mg/kg-1.2mg/kg的ala-TFPI，更常相当于每天施用约0.24mg/kg-1.2mg/kg的ala-TFPI，优选相当于每天约0.6mg/kg的ala-TFPI。这个范围内的较低量可用于预防或其它目的。超过所述范围的较高剂量可用于治疗严重CAP。本发明的剂量方案也可表示为给予患者的总剂量。总剂量是输注速率和输注总时间通过数学运算得到的产物。例如，ala-TFPI的优选给药速率为约0.025毫克/千克/小时，优选输注时间为96小时，总剂量是约2.4mg ala-TFPI/千克体重。一实施方式中，ala-TFPI的优选给药速率约为0.25毫克/千克/小时，优选的输注时间为96小时，总剂量时约24mgala-TFPI/kg体重。一优选实施方式中，ala-TFPI的优选给药速率为约0.75毫克/千克/小时，优选输注时间为96小时，总剂量是约72mg ala-TFPI/千克体重。另一优选实施方式中，本发明的TFPI给药总剂量相当于约0.75μg/kg-4.8mg/kg的ala-TFPI。优选总剂量相当于约1mg/kg-4.8mg/kg的ala-TFPI。更优选总剂量相当于约2.4mg/kg的ala-TFPI。
一种可用于调节所述剂量方案的因素是各个患者的凝血功能，通常采用凝血酶原时间(PT)试验或国际标准化比率(INR)进行检测。INR是标准化的PT试验，它利用国际参照品促凝血酶原激酶试剂校准所述试验。参见例如R.S.Riley等，J.Clin.Lab.Anal.14：101-114(2000)。如图3所示，健康献血者对ala-TFPI的INR反应与血浆浓度范围大致呈线性关系。大体上，血浆ala-TFPI浓度每增加1μg/ml，INR就改变1.2单位。
在药效模型中，INR对ala-TFPI的反应用log线性模型描述最好，其中logINR与ala-TFPI血浆浓度线性相关。所述反应的log线性性质意味着在循环ala-TFPI水平类似的情况下，基线INR高的对象相比低基线值的对象可能发生更高的抗凝血反应。
上述包括基于毫克/千克/小时的给药速率和总日剂量的剂量方案被表示为“相当于参照品ala-TFPI”的剂量。这意味着是通过归一化为“参照品ala-TFPI”剂量来定量定义它们，所述“参照品ala-TFPI”定义为成熟的、100％纯的(基于蛋白质)、正常折叠的、具生物学活性的、非糖基化的ala-TFPI。Ala-TFPI是其氨基酸序列为SEQ IDNO：2所示的TFPI的一种类似物。TFPI的其它形式也可用于本发明，包括成熟的、全长TFPI和其类似物。可通过根据特定形式TFPI的固有生物学活性调整并且基于所述制备物的生物化学纯度进一步调整本发明所述的参照品ala-TFPI的剂量范围来确定用TFPI形式而非ala-TFPI，以及用不到100％纯的ala-TFPI或另一种TFPI类似物的制备物来实施本发明所需的合适剂量范围。
一优选实施方式中，患者在接受第一次TFPI施用的10天内不接受抗凝血剂。优选实施方式中，患者在接受第一次TFPI施用的7天内不接受抗凝血剂。优选患者在接受第一次TFPI施用的24小时内不接受任何形式的肝素。一实施方式中，患者在10小时内，优选在接受第一次TFPI施用的12小时内未接受过未分级的肝素。一实施方式中，患者在20小时内，优选在接受第一次TFPI施用的24小时内未接受过低分子量的肝素。一实施方式中，患者在10小时内，优选在接受第一次TFPI施用的12小时内未接受过drotrecogin-α。
TFPI或TFPI类似物的固有生物学活性指成熟的、100％纯的、正确折叠的TFPI或TFPI类似物用凝血酶原实验确定的特定活性。因此，相当剂量计算如下：(参照品ala-TFPI剂量)/((相对固有活性)x(生物化学纯度))，其中相对固有活性指：(类似物的固有活性)/(参照品ala-TFPI的固有活性)。例如，如果某特定TFPI类似物的固有生物学活性为参照品ala-TFPI的80％，那么通过用0.8除参照品ala-TFPI的剂量值得到针对特定TFPI类似物的相当剂量。而且，如果施用到患者的制剂例如仅为90％生物化学纯，即所含的10％的分子种类缺乏TFPI生物学活性，可用0.9除剂量值对ala-TFPI的参照品剂量值作附加修正。因此，对于具有ala-TFPI80％的固有活性并以90％生物化学纯给药的假定的TFPI类似物而言，其相当于以0.025毫克/千克/小时给药速度施用参照品ala-TFPI的给药速率则为0.0347毫克/千克/小时(即0.025/(0.8×0.9))。
在不知道固有活性或生物化学纯度的情况下也可通过测定相对生物学活性来确定等当量剂量。相对生物学活性可通过用凝血酶原时间试验比较某特定TFPI类似物与TFPI标准的生物学活性来测定。例如，根据WO96/40784的实施例9方法产生约85％生物学活性TFPI分子种类的ala-TFPI，可用作TFPI生物学活性的标准。根据WO96/40784的实施例9的方法产生的ala-TFPI在凝血酶原实验中具有85％的参照品ala-TFPI活性。在绘制凝血酶原时间标准曲线时，以log血凝时间对logTFPI浓度绘图。如果TFPI生物学活性标准具有85％的参照品ala-TFPI活性，那么如果TFPI生物学活性标准的浓度在制图前先乘以0.85制备的标准曲线即相当于参照品ala-TFPI的活性曲线，因此所述活性曲线与100％纯参照品ala-TFPI的活性相当。当将某特定TFPI类似物的血凝时间与该标准曲线相比较时，可从曲线上读出参照品ala-TFPI的等当量浓度。
或者，如果标准曲线线性部分的斜率是由线性回归分析得到的，可根据与参照品ala-TFPI相比的TFPI生物学活性标准的活性来修正此斜率。某特定TFPI类似物的相对生物学活性因此等于参照品ala-TFPI活性与该类似物活性之比。例如，如果某特定类似物需要1.43μg才能产生与1.00μg参照品ala-TFPI相同的凝血酶原时间活性，那么所述类似物的相对生物学活性为1.00/1.43，或0.7。对所述类似物而言，与参照品ala-TFPI剂量等当量的剂量可用该类似物的相对生物学活性除参照品ala-TFPI剂量而得到。例如，参照品ala-TFPI的0.025毫克/千克/小时剂量与该类似物的0.0357毫克/千克/小时(即0.025/0.7)等当量。
尽管TFPI或TFPI类似物可作为唯一的活性抗凝药物施用，但这些分子也可与一种或多种辅助治疗剂联用以提供治疗严重肺炎的联合治疗。此类辅助治疗剂包括抗体如抗内毒素的单克隆抗体(如内毒素结合Mab)和抗TNF产品如抗TNF鼠Mab。TFPI和TFPI类似物还可与白介素1受体拮抗剂、杀菌/通透率增强(BPI)蛋白、免疫刺激剂、具有消炎活性的化合物如PAF拮抗剂和细胞黏附阻断剂(如抗血小板剂如GPIIb/IIIa抑制剂)联用。当联合施用时，所述治疗药物可配制成同时或不同时间给予的分离组合物。优选辅助治疗剂在相同时间(即在TFPI或TFPI类似物给药期间)或在TFPI或TFPI类似物给药期间的24小时内(即在TFPI或TFPI类似物的给药期间开始前24小时内、或结束后24小时内)给予。辅助治疗剂也可作为单一组合物与TFPI或TFPI类似物一起给予。
TFPI或TFPI类似物还可与对治疗严重细菌感染尤其是肺炎有效的其它试剂组合给予。例如，以下物质可与TFPI或TFPI类似物联用：能治疗基础性细菌感染的抗生素、针对细菌细胞壁组分的单克隆抗体、能参与严重肺炎通路的细胞因子形成复合体的受体、和通常能与细胞因子或其它活化的或放大的生理(反应)通路相互作用的任何药物或蛋白质，包括能缓解严重肺炎和/或其症状的补体蛋白。
有用的抗生素包括以下通用类型中的那些：β内酰胺环(盘尼西林)、糖苷键连接的氨基糖(氨基葡糖苷)、大环内酯环(大环内酯类)、亚萘基氨甲酰的多环衍生物(四环素)、二氯醋酸的硝基苯衍生物、肽(杆菌肽、短杆菌肽和多粘菌素)、含有共轭双键系统的大环(聚烯)、衍生自磺胺的磺胺药(氨苯磺胺)、5-硝基-2-呋喃组(硝基呋喃)、喹诺酮羧酸(萘啶酸)等。其它抗生素和上述特定抗生素的更多类型可在《化学技术百科全书》(Encyclopedia of Chemical Technology)，第3版，Kirk-Othymer(编)，第3卷，第1-78页，Zinsser；《微生物学》(MicroBiology)，第17版，W.Joldik等(编)，第235-277页(1980)；或Dorland的《医学字典图解》(Illustrated Medical Dictionary)，27版，W.B.Saunders Company(1988)中找到。
可以与TFPI或TFPI类似物联用的其它药物包括内毒素拮抗剂如E5531(一种脂质A类似物，参见Asai等，Biol.Pharm.Bull.22：432(1999))、具有抗凝血活性的TF类似物(参见Kelley等，Blood 89：3219(1997)和Lee和Kelley，J.Biol.Chem.273：4149(1998))、针对细胞因子的单克隆抗体如针对IL-6或M-CSF的那些单克隆抗体、参见于1989年12月15日递交的美国序列号07/451,218、和针对TNF的单克隆抗体(参见Cerami等，美国专利号4,603,106)、能将成熟的TNF激素原从产生它的细胞切下的蛋白质抑制剂(参见1989年8月16日递交的美国序列号07/395,253)、IL-1拮抗剂(参见1990年5月1日递交的美国序列号07/517,276)、IL-6细胞因子表达抑制剂如抑制素(参见美国专利5,942,220)和各种细胞因子如IL-1的基于受体的抑制剂。还可采用补体的抗体或补体的蛋白质抑制剂，如CR1、DAF和MCP。
本公开说明书中所引用的所有专利、专利申请和参考文献均以其全文纳入本文中作为参考。
现在，将通过参阅特别优选实施方式的以下实施例阐述本发明。然而，应注意这些实施方式的目的是说明，不以任何方式解释为限制本发明。
实施例
实施例1
用ala-TFPI治疗严重肺炎患者
在相对同种组中通过评价患有严重肺炎的患者来研究ala-TFPI的潜在作用。如果研究者记录的一种败血症来源是肺炎，就可确定肺炎患者。还可能出现其它部位的感染。由于根据化学后遗症来区分感染的困难性，不包括患有吸入性肺炎的患者。然后将确定患有肺炎的患者分成培养阳性(任何感染证据例如培养或Gram染色)或培养阴性(阴性培养或未进行培养)。通过连续静脉输注配制于含有300mM的L-精氨酸、20mM的柠檬酸钠、pH5.5、重量克分子渗透浓度560+/-110mOsm的缓冲液中剂量为0.025mg/kg/h的大肠杆菌表达的非糖基化ala-TFPI来治疗患者。相同缓冲液组成的不含ala-TFPI的安慰剂以与研究药物相同速率输注。这些分析结果证明ala-TFPI对治疗那些培养阳性肺炎患者(表1)有阳性影响。证明对那些没有感染源证据的患者有阴性影响。
表1.各肺炎状态的死亡率
INR≥1.2           总共
安慰剂 TFPI p＝
肺炎培养阳性
(N＝) 236 268
死亡率％ 39.8％ 31.3％ 0.05
肺炎培养阴性
(N＝) 118 122
死亡率％ 30.5％ 45.1％ 0.02
表2.低INR肺炎状况的死亡率
INR＜1.2             总
安慰剂 TFPI  p＝
肺炎培养阳性
(N＝) 33  22
死亡率％ 30.3％ 13.6％  0.15
肺炎培养阴性
(N＝)   25  23
死亡率％   32.0％  8.7％ 0.08
高INR培养阴性组的死亡率增高看来发生在加有或没有添加施用肝素的患者群中，尽管应该注意到肺炎培养阴性、无肝素组的对象数目相对少(表3)。在培养阳性/无肝素组中观察到强阳性治疗效果。
表3.各肺炎状态和肝素的死亡率
INR≥1.2       肺炎培养阳性        肺炎培养阴性
安慰剂 TFPI ＝  安慰剂 TFPI p＝
基线或在定量给药期间有肝素
(N＝) 160 187  87 85
死亡率％ 32.5％ 31.6％ 0.84  36.8％ 56.5％ 0.01
基线或定量给药期间无肝素
(N＝) 76 81  31 37
死亡率％ 55.3％ 30.9％ 0.002  32.3％ 48.6％ 0.17
实施例2
研究疾病变量的基线严重性
评估一定数量疾病变量的基线严重性以判断是否存在组间不平衡可能解释观察到的结果。这些数据表明培养状态相关的结果间的差异不是由于基线不平衡。因此，看来所述结果代表感染或未感染患者生物学差异引起TFPI治疗的效果差异。尽管事实是严重性指标(例如，APACHE II评分或器官功能障碍评分)要么在安慰剂时相等或在TFPI治疗肺炎培养阴性组中较低，仍然证明培养阴性组的总死亡率最高(表4)。
表4
 INR≥1.2    肺炎培养阳性    肺炎培养阴性
安慰剂 TFPI 安慰剂 TFPI
 N＝ 236 268 118 122
 死亡率％ 39.8％ 31.3％ 30.5％ 45.1％
 APACHE II 25.8 25.9 24.3 25.2
 INR 1.53 1.50 1.52 1.45
 平均器官功能障碍 3.0 3.0 3.0 2.9
 CV-低血压 79％ 74％ 73％ 72％
 酸中毒 66％ 66％ 64％ 58％
 少尿 42％ 48％ 47％ 49％
 肺功能障碍 93％ 91％ 91％ 90％
 血小板减少 20％ 23％ 22％ 16％
IL-6是一种炎性细胞因子，在败血症早期即升高，反应炎性应答的强度并且与结果相关。基线时，IL-6水平在临床诊断患有肺炎但没有感染证据的患者中较低(表5)。这提示证明有肺炎感染源和无明显感染源的患者间存在生物学差异。矛盾的是，培养阴性TFPI组的基线IL-6水平最低而死亡率最高。败血症群中IL-6水平随时间下降。IL-6的下降速率在TFPI治疗的肺炎培养阴性对象中减缓(表5)。这提示TFPI的生物学影响在那些有或没有感染的患者中不同。
表5.各肺炎状态的IL-6
    INR≥1.2肺炎              基线           6小时(％Δ*)         24小时(％Δ*)           96小时(％Δ*)
  PL   TFPI   p＝     PL   TFPI   p＝     PL   TFPI   p＝     PL   TFPI   p＝
    培养阳性(n＝493)   494   489   0.96     (25％)   (27％)   0.75     (57％)   (63％)   0.26     (83％)   (84％)   0.69
    培养阴性(n＝236)   300   195   0.11     (21％)   (8％)   0.08     (54％)   (32％)   0.03     (98％)   (97％)   0.06
实施例3
通过证明的感染类型分析严重肺炎患者
如上所述，可在那些感染最明确即血液培养阳性的患者中观察到ala-TFPI治疗的综合疗效。通过证明的感染类型对严重肺炎患者进行分析时，在血液培养阳性对象中和那些具有其它证据的对象中均观察到可从ala-TFPI治疗中获益(表6)。在菌血症阳性组即感染可能性最高或最可证明的感染源中影响最大。
表6.各培养状态和肺炎状态的死亡率
    INR≥1.2              血液培养阳性              其它培养阳性          培养阴性/ND
  安慰剂   TFPI   p＝   安慰剂   TFPI   p＝     安慰剂   TFPI   p＝
    肺炎
    (N＝)   80   107   156   161     110   110
    死亡率％   38.8％   26.2％   0.07   40.4％   34.8％    0.30     30.9％   46.4％   0.02
如前所示，有感染证据(血液+“其它”)的患者在没有肝素时从TFPI治疗中获益。这个结果最主要是因为从肺炎组中获益(表7)。这个发现看来表明那些严重肺炎感染患者从内源抗凝血药获得的益处最大。
表7.感染状况、肺炎状况和肝素施用的死亡率
    INR≥1.2                      肝素                             无肝素
    安慰剂     TFPI     p＝     安慰剂     TFPI     p＝
    证明感染(血液+“其它”)
    N＝     433     442     211     207
    死亡率％     31.4％     31.9％     0.89     43.1％     32.4％     0.02
    肺炎(培养阳性)
    N＝     160     187     76     81
    死亡率％     32.5％     31.6％     0.84     55.3％     30.9％     0.002
    非肺炎证明性感染(证明的-肺炎)
    N＝     273     255     135     126
    死亡率％     30.8％     32.2％     0.73     36.3％     33.3％     0.62
为了进一步限制异质性，对社区获得性肺炎(CAP)也进行试验。在医院患上肺炎的患者(医院性肺炎)更可能受病原性微生物的侵害并患上其它肺部疾病使得诊断感染行肺炎更困难。而且，CAP患者比医院性肺炎患者更不可能接受过肝素。当在治疗前先对其停留医院的时间长度进行分析时，注意到住院≤天(社区获得性)的培养阳性患者和住院时间超过2天(医院性)的患者获益类似。主要在医院性组中可看到培养阴性患者中的阴性影响(表8)。
表8.肺炎状态和住院时间的死亡率
    INR≥1.2              肺炎培养阳性                   肺炎培养阴性
    安慰剂      TFPI     P＝     安慰剂     TFPI     P＝
                                             社区获得(≥2天)
    N＝     121      143     61     52
    死亡率％     38.8％      29.4％     0.10     27.9％     30.8％     0.74
                                              医院(＞2天)
    N＝     115      125     57     70
    死亡率％     40.9％      33.6％     0.24     33.3％     55.7％     0.01
实施例4
肺泡血纤维蛋白沉淀和血纤维蛋白溶液活性的改变是肺炎和急性肺损伤的标志。组织因子被认为是这个系统中的一种重要的凝固引发剂，组织因子通路抑制剂(TFPI)在动物模型中已被证明能防止或减少肺损伤。
重组组织因子通路抑制剂(替法可近)已在多种败血症中进行过研究并已完成了III期双盲的安慰剂-对照的随机试验(TFP007)。该项研究没有能够证明它可显著减少28天各种原因导致的死亡率。进行后续分析来评价由CAP引起的严重败血症患者是否能用替法可近治愈。同样，研究了可能的肝素相互作用和微生物证据的重要性。
材料和方法
TFP007采用的CAP为主要败血症诱因的患者(pts)被留来进行后续分析。确定所有CAP患者群的28天各种原因导致的死亡率和安全性。进一步分析协同施用肝素对深部静脉血栓形成预防的影响和微生物证据的重要性。
结果
TFP007包括1955位患者，其中435位患有CAP(TFPI 217，安慰剂218)。TFPI和安慰剂两组各自的基线特征类似(平均年龄是62.3比62；平均APACHE II是24.9比24；平均OD是3比3)(NS)。28天各种原因导致的死亡率数据如表9所示。特别是当没有协同施用肝素并有微生物证据存在时，用替法可近比用安慰剂治疗的患者死亡率降低。
严重出血时间发生在12位治疗患者(5.5％)比5位安慰剂患者(2.2％)中(NS)。第一个28天周期中，CNS出血在6位替法可近治疗患者(2.7％)比2位安慰剂治疗患者(1％)(NS)出现。
表9：协同肝素施用和微生物证据的CAP中28天各种原因导致的死亡率
    TFPI     安慰剂
    N   死亡率(％)     N   死亡率(％)     P值
 CAP全     217   27％     218   33％     0.15
 CAP+Hep     149   26.2％     142   28.2％     0.7
 CAP-Hep     68   29.4％     76   43.4％     0.08
 CAP+Me     153   28％     142   37％     0.09
 CAP-Me     64   25％     76   26％     0.85
Hep：肝素，Me：微生物证据
结论
从后续分析看来，替法可近减少了严重CAP患者的28天各种原因导致的死亡率。证明的CAP和/或没有协同施用肝素的患者看来获得更大的益处。包括严重CAP患者在内的III期临床研究正在评估替法可近的潜在益处。
TFP007以及各种亚群采用的所有患者发生的出血和严重出血在以下表9A-9F中给出。
表9A-9F
  表9A：TFP007群的TFP007出血(所有对象)
    肝素   TFPI         安慰剂   P值*
  N#     n(％)#     N     n(％)
    是   665     154(23％)     681     130(19％)
    否   298     81(27％)     311     63(20％)
    *卡方检验；+医院获得性肺炎#N＝对象数；n(％)＝出血(比率)数
    表9B：TFP007群的TFP007严重出血(所有对象)
    肝素          TFPI          安慰剂     P值*
    N#   n(％)#     N   n(％)
    是     665   43(6.5％)     681   31(4.6％)
    否     298   18(6.0％)     311   15(4.8％)
    *卡方检验；+医院获得性肺炎#N＝对象数；n(％)＝出血(比率)数
  表9C：CAP/HAP亚群的TFP007出血(所有对象)
  肝素     肺炎        TFPI        安慰剂   P值*
    N#   n(％)#     N  n(％)
  是     CAP     149   38(26％)     142  28(20％)
    HAP+     163   40(25％)     146  27(18％)
  否     CAP     68   14(21％)     76  13(17％)
    HAP+     55   13(24％)     48  10(21％)
*卡方检验；+医院获得性肺炎#N＝对象数；n(％)＝出血(比率)数
表9D：CAP/HAP亚群的TFP007严重出血(所有对象)
    肝素   肺炎                TFPI         安慰剂   P值*
    N#   n(％)#     N  n(％)
    是   CAP     149   9(6.0％)     142  3(2.1％)
  HAP+     163   14(8.6％)     146  8(5.5％)
    否   CAP     68   3(4.4％)     76  2(2.6％)
  HAP+     55   3(5.5％)     48  3(6.3％)
    *卡方检验；+医院获得性肺炎#N＝对象数；n(％)＝出血(比率)数
  表9E：ME证据的CAP/HAP亚群的TFP007严重出血(所有对象)
  肝素   肺炎     肺炎状态           TFPI         安慰剂     P值*
    N#     n(％)#     N     n(％)
  是   CAP     证明的     100     31(31％)     88     19(22％)     .1857
    未证明的     49     7(14％)     54     9(17％)     .7910
  HAP+     证明的     107     25(23％)     96     18(19％)     .4925
    未证明的     56     15(27％)     50     9(18％)     .3546
  否   CAP     证明的     53     9(17％)     54     11(20％)     .8049
    未证明的     15     5(33％)     22     2(9％)     .0953
  HAP+     证明的     30     4(13％)     31     6(19％)     .7315
    未证明的     25     9(36％)     17     4(24％)     .5046
  *Fisher精确检验；+医院获得性肺炎#N＝对象数；n(％)＝出血(比率)数
  表9F：亚群的TFP007严重出血(所有对象)
  肝素   肺炎     肺炎状态          TFPI        安慰剂   P值*
    N#     n(％)#   N   n(％)
  是   CAP     证明的     100     9(9％)   88   3(3％)   .1430
    未证明的     49     0(0％)   54   0(0％)   -
  HAP+     证明的     107     9(8％)   96   6(6％)   .6018
    未证明的     56     5(9％)   50   2(4％)   .4426
  否   CAP     证明的     53     2(4％)   54   2(4％)   1.000
    未证明的     15     1(7％)   22   0(0％)   .4054
  HAP+     证明的     30     1(3％)   31   2(7％)   1.000
    未证明的     25     2(8％)   17   1(6％)   1.000
*Fisher精确检验；+医院获得性肺炎#N＝对象数；n(％)＝出血(比率)数
  TFP007局部缺血性有害事件表
  对象编号 治疗组   逐字术语   优选术语 是否严重   严重程度   组     使用肝素 肺炎败血症源 住院时间
  1 安慰剂   左侧腔隙丘脑中风   脑血管意外损伤NOS 是   重度   高INR     基线无研究中无 无 ≤2天
  2 安慰剂   室周小血管缺血   大脑缺血 否   轻度   高INR     基线无研究中无 无 ＞2天
  3 安慰剂   后侧顶骨梗死X2   大脑梗死形成 是   威胁生命   高INR     基线无研究中无 无 ＞2天
  4 .025TFPI   亚急性脑梗死   大脑梗死形成 是   重度   高INR     基线或给药过程中施用肝素 有，确定 ＞2天
  5 .025TFPI   大脑血管意外损伤   脑血管意外损伤NOS 是   中度   高INR     基线无研究中无 无 ≤2天
  6 安慰剂   慢性小血管皮层缺血性疾病   大脑缺血 否   中度   高INR     基线无研究中无 有，确定 ≤2天
  7 安慰剂   亚急性右侧前侧腔隙(梗死形成)   大脑梗死形成 否   轻度   高INR     基线无研究中无 有，确定 ≤2天
  8 .025TFPI   多重右侧脑梗死   大脑梗死形成 否   轻度   高INR     基线或给药过程中施用肝素 有，未确定 ＞2天
  9 安慰剂   右侧半球梗死   大脑梗死形成 是   重度   高INR     基线无研究中无 有，确定 ≤2天
  10 安慰剂   两侧幕上梗死   大脑梗死形成 是   重度   高INR     基线或给药过程中施用肝素 有，确定 ＞2天
  11 安慰剂   可能的大脑血缺性事件   大脑缺血 是   重度   高INR     基线无研究中无 有，确定 ＞2天
  12 安慰剂   右侧中部大脑动脉梗   大脑梗死形成 是   重度   高     基线无 有，确定 ≤2天
    死   INR     研究中无
    13 .025TFPI     栓性中风 栓性中风   是   中度   高INR     基线或给药过程中施用肝素 无 ＞2天
    14 .025TFPI     无出血中风 脑血管意外损伤NOS   是   重度   高INR     基线或给药过程中施用肝素 有，确定 ＞2天
    15 .025TFPI     大脑血管意外损伤 脑血管意外损伤NOS   是   中度   高INR     基线无研究中无 有，确定 ≤2天
    16 安慰剂     两侧分水岭梗死 大脑梗死形成   是   重度   高INR     基线或给药过程中施用肝素 无 ＞2天
    17 .025TFPI     脑缺血 大脑缺血   否   中度   高INR     基线或给药过程中施用肝素 无 ≤2天
    18 安慰剂     CVA 脑血管意外损伤NOS   是   重度   高INR     基线或给药过程中施用肝素 有，确定 ≤2天
    19 .025TFPI     脑血管意外损伤 脑血管意外损伤NOS   是   中   高INR     基线或给药过程中施用肝素 无 ＞2天
    20 .025TFPI     脑梗死 大脑梗死形成   是   中 高INR     基线或给药过程中施用肝素 有，确定 ＞2天
    21 安慰剂     大脑缺血 大脑缺血   否   重   高INR     基线无研究中无 无 ≤2天
    22 安慰剂     脑血管意外损伤 脑血管意外损伤NOS   是   威胁生命   高INR     基线无研究中无 无 ≤2天
    23 安慰剂     小脑梗死 小脑梗死形成   是   威胁生命   高INR     基线无研究中无 有，确定 ＞2天
    24 安慰剂     枕叶梗死 大脑梗死形成   是   威胁生命   高INR     基线无研究中无 有，确定 ＞2天
    25 .025TFPI     大脑缺血 大脑缺血   否   中   高INR     基线或给药过程中施用肝素 无 ＞2天
    26 安慰剂     中风 脑血管意外损伤NOS   是   重   高INR     基线无研究中无 无 ≤2天
    27 安慰剂     大脑梗死形成，缺血 大脑梗死形成   是   重   高INR     基线或给药过程中施用肝素 无 ＞2天
    28 安慰剂     大脑梗死形成 大脑梗死形成   是   威胁生命   高INR     基线或给药过程中施用肝素 有，未确定 ≤2天
    29 安慰剂     多重(脑)两侧梗死形成 大脑梗死形成   是   重   低INR     基线无研究中无 无 ＞2天
    30 安慰剂     CVA 脑血管意外损伤NOS   否   轻   低INR     基线无研究中无 无 ≤2天
    31 .025TFPI     大脑血管意外损伤 脑血管意外损伤NOS   是   中   低INR     基线或给药过程中施用肝素 有，未确定 ＞2天
    32 安慰剂     左侧脑梗死 大脑梗死形成   否   中   低INR     基线或给药过程中施用肝素 有，确定 ≤2天
    33 .025TFPI     出血性和缺血性中风 大脑梗死形成   是   威胁生命   低INR     基线或给药过程中施用肝素 无 ≤2天
    34 .025TFPI     右侧基底神经节梗死形成 大脑梗死形成   是   重   低INR     基线或给药过程中施用肝素 无 ≤2天
    35 安慰剂     大脑梗死形成 大脑梗死形成   是   威胁生命   低INR     基线或给药过程中施用肝素 有，未确定 ≤2天
  TFP007凝血酶栓子有害事件表
  对象编号 治疗组   逐字术语   优选术语   是否严重   严重程度   组   使用肝素   肺炎败血症源 住院时间
  A 安慰剂   深部静脉血栓形成   下肢静脉血栓形成   否   轻度   高INR   基线无研究中无   无 ≤2天
  B 安慰剂   左上侧末端深静脉血栓形成   下肢静脉血栓形成   是   中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素   有，确定 ＞2天
  C .025TFPI   PHLEGMASIA CERULEADOLENS   血栓形成NOS   是   威胁生命   高INR   基线或给药过程中施用肝素   有，确定 ≤2天
  D 安慰剂   栓塞   血栓栓塞NOS   是   重度   高INR   基线无研究中无   无 ≤2天
  E .025TFPI   右侧头臂深静脉血栓形成   静脉血栓形成NOS   是   重度   高INR   基线无研究中无   无 ＞2天
  F 安慰剂   弥散性肺栓塞   肺栓塞   是   威胁生命   高INR   基线或给药过程中施用肝素   无 ＞2天
  G 安慰剂   左侧普通股静脉血栓   下肢静脉血栓形成   否   中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素   无 ＞2天
  H 安慰剂   下腔静脉，右侧肾静脉，髂静脉血块凝固   静脉血栓形成NOS   是   重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素   无 ≤2天
  I .025TFPI   肺栓塞   肺栓塞   是   重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素   无 ≤2天
  J 安慰剂   肺栓塞   肺栓塞   否   中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素   无 ≤2天
  K .025TFPI   右股中部非闭合血栓   血栓形成NOS   否   中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素   有，确定 ≤2天
  L .025TFPI   右侧深部静脉血栓形成   下肢静脉血栓形成   否   中度   高INR   基线无研究中无   无 ＞2天
    M 安慰剂   血栓左侧头静脉 肢静脉血栓形成NOS   否 重度   高INR   基线无研究中无     无 ≤2天
    N 安慰剂   血栓右侧肱静脉 肢静脉血栓形成NOS   否 重度   高INR   基线无研究中无     无 ≤2天
    O .025TFPI   肺栓塞 肺栓塞   否 中度   高INR   基线无研究中无     无 ≤2天
    P 安慰剂   两侧下肢深静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 中度   高INR   基线无研究中无     无 ≤2天
    Q 安慰剂   右侧上肢深静脉血栓症 下肢静脉血栓形成   否 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ≤2天
    R 安慰剂   深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   是 重度   高INR   基线无研究中无     无 ＞2天
    S .025TFPI   深部静脉血栓形成远端FEMEROL POPLITEAL 下肢静脉血栓形成   是 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
    T 安慰剂   左侧中部腓肠深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
    U 安慰剂   右侧下肢深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
    V .025TFPI   深静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   是 重度   高INR   基线无研究中无     有，确定 ≤2天
    W 安慰剂   两侧深静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   是 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
    X 安慰剂   左小腿深静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   是 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ≤2天
    Y .025TFPI   深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，未确定 ≤2天
  Z   .025TFPI     右侧腋静脉血栓 肢静脉血栓形成NOS   否 轻度   高INR   基线无研究中无     有，确定 ＞2天
  AA   安慰剂     深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   是 中度   高INR   基线无研究中无     有，确定 ＞2天
  BB   安慰剂     血栓形成 血栓形成NOS   是 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
  CC   .025TFPI     深部静脉血栓形成右小腿 下肢静脉血栓形成   是 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ≤2天
  DD   .025TFPI     肺栓塞(推定) 肺栓塞   是 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ≤2天
  EE   .025TFPI     右侧下肢深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 中度   高INR   基线无研究中无     无 ≤2天
  FF   安慰剂     两侧下肢深静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   是 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ≤2天
  GG   安慰剂     深部静脉血栓形成两侧上肢 下肢静脉血栓形成   否 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  HH   安慰剂     右臂血栓 血栓形成NOS   否 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
  II   .025TFPI     NON OCCULSIVE左侧小腿深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 轻度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
  JJ   .025TFPI     右侧股静脉血栓 肢静脉血栓形成NOS   否 轻度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ≤2天
  KK   .025TFPI     肺栓塞 肺栓塞   是 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ≤2天
  LL   .025TFPI     肺栓塞 肺栓塞   否 轻度   高INR   基线无研究中无     无 ＞2天
  MM   安慰剂   深静脉血栓形成   下肢静脉血栓形成   否 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ≤2天
  NN   .025TFPI   肺栓塞   肺栓塞   是 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  OO   .025TFPI   两侧锁骨下血栓   血栓形成NOS   否 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  PP   .025TFPI   两侧肺栓塞   肺栓塞   是 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ≤2天
  QQ   .025TFPI   深静脉血栓形成   下肢静脉血栓形成   否 中度   高INR   基线无研究中无     有，确定 ≤2天
  RR   安慰剂   肺栓塞   肺栓塞   是 威胁生命   高INR   基线无研究中无     无 ≤2天
  SS   安慰剂   左臂深静脉血栓形成   下肢静脉血栓形成   否 中度   高INR   基线无研究中无     无 ＞2天
  TT   安慰剂   (右)小腿右侧深静脉血栓形成   下肢静脉血栓形成   否 轻度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
  UU   .025TFPI   肺栓塞   肺栓塞   是 威胁生命   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
  VV   .025TFPI   可能的肺栓塞   肺栓塞   否 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，未确定 ＞2天
  WW   安慰剂   静脉血栓形成的诊断   静脉血栓形成NOS   否 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  XX   .025TFPI   腓肠血栓形成   血栓形成NOS   否 轻度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  YY   安慰剂   静脉炎(左侧股静脉)   深部血栓性静脉炎   否 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  ZZ   安慰剂     肺栓塞 肺栓塞   是 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  AAA   .025TFPI     浮动血栓 血栓形成NOS   否 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ≤2天
  BBB   .025TFPI     肺栓塞 肺栓塞   是 威胁生命   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ≤2天
  CCC   .025TFPI     腓肠静脉血栓形成 肢静脉血栓形成NOS   否 中度   高INR   基线无研究中无     有，未确定 ＞2天
  DDD   安慰剂     肺栓塞 肺栓塞   是 中度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ≤2天
  EEE   .025TFPI     肺栓塞 肺栓塞   是 威胁生命   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ≤2天
  FFF   安慰剂     左臂静脉血栓形成 肢静脉血栓形成NOS   否 中度   高INR   基线无研究中无     无 ≤2天
  GGG   .025TFPI     肺栓塞 肺栓塞   是 威胁生命   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
  HHH   安慰剂     深静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 轻度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  III   .025TFPI     肺栓塞 肺栓塞   是 威胁生命   高INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
  JJJ   .025TFPI     疑似急性肺栓塞 肺栓塞   是 重度   高INR   基线或给药过程中施用肝素     有，未确定 ≤2天
  KKK   安慰剂     多重静脉血栓症 静脉血栓形成NOS   是 威胁生命   低INR   基线无研究中无     无 ≤2天
  LLL   .025TFPI     左侧头静脉血块凝固 肢静脉血栓形成NOS   否 轻度   低INR   基线或给药过程中施用肝素     有，未确定 ＞2天
  MMM   安慰剂     深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   是 重度   低INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  NNN   安慰剂     肺栓塞 肺栓塞   是 重度   低INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  OOO   安慰剂     深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 轻度   低INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
  PPP   安慰剂     肺栓塞 肺栓塞   是 重度   低INR   基线或给药过程中施用肝素     无 ＞2天
  QQQ   安慰剂     两侧肺栓塞 肺栓塞   是 中度   低INR   基线无研究中无     无 ≤2天
  RRR   .025TFPI     左侧下肢深部静脉血栓形成 下静脉血栓形成肢   否 重度   低INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  SSS   .025TFPI     两侧下肢深部静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 中度   低INR   基线无研究中无     有，未确定 ≤2天
  TTT   .025TFPI     急性肺栓塞 肺栓塞   是 中度   低INR   基线无研究中无     无 ＞2天
  UUU   .025TFPI     左侧深静脉血栓形成 下肢静脉血栓形成   否 中度   低INR   基线无研究中无     无 ＞2天
  VVV   安慰剂     肺栓塞 肺栓塞   是 威胁生命   低INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
  WWW   安慰剂     肺栓塞 肺栓塞   是 重度   低INR   基线或给药过程中施用肝素     有，未确定 ＞2天
  XXX   .025TFPI     头臂静脉血栓形成 静脉血栓形成NOS   是 重度   低INR   基线或给药过程中施用肝素     有，确定 ＞2天
表12
 TFPI(全部患者)   安慰剂(全部患者)
 N  死亡率 N  死亡率 P值
 CAP  217  27％ 218  33％ 0.1532
 CAP+hep  149  26.20％ 142  28.20％ 0.7022
 CAP-hep  68  29.40％ 76  43.40％ 0.0818
 CAP+ME  153  28％ 142  37％ 0.0913
 CAP-ME  64  25％ 76  26％ 0.8592
 TFP007全部 963  32.29％ 992  32.56％ NS
TFP-007BL特征结合所有INR
TFPI  安慰剂
平均年龄 62.3  62
平均APACHE 24.9  24.8
平均o/fs 3  3
已经通过参考特定实施方式描述了本发明。然而，在不背离随附权利要求的精神和范围时，这一应用包括本领域那些技术人员可进行的那些改变和替换。
序列CWU 1
2 1 276 PRT Homo sapiens 1 Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr
Glu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 20
25 30 Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr 35 40 45 Arg Gln
Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn 50 55 60 Arg Phe Glu Ser Leu
Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr
Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe 85 90 95 Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys
Arg Gly Tyr Ile Thr Arg 100 105 110 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg
Phe Lys Tyr Gly 115 120 125 Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu
Glu Cys Lys 130 135 140 Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr
Gly 145 150 155 160 Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys
165 170 175 Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro 180 185
190 Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn 195 200 205 Ser
Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly 210 215 220 Asn Glu Asn
Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys 225 230 235 240 Lys Gly Phe Ile
Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys 245 250 255 Arg Lys Arg Lys Lys Gln
Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe 260 265 270 Val Lys Asn Met 275 2 277 PRT
Homo sapiens 2 Ala Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu 1 5 10
15 Leu Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp 20 25 30 Asp Gly
Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe 35 40 45 Thr Arg Gln Cys Glu
Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln 50 55 60 Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu
Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 65 70 75 80 Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu
Gln Gln Glu Lys Pro Asp 85 90 95 Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly
Tyr Ile Thr 100 105 110 Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys
Tyr 115 120 125 Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys
130 135 140 Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr 145 150
155 160 GlyThr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr 165 170 175
Lys Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr 180 185 190 Pro Ala
Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr 195 200 205 Asn Ser Val Ile
Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly 210 215 220 Gly Asn Glu Asn Asn Phe
Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys 225 230 235 240 Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg
Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr 245 250 255 Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val
Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile 260 265 270 Phe Val Lys Asn Met 275

Claims (43)

1.一种治疗或预防严重肺炎的方法，包括：通过连续静脉输注给予患有或有患严重肺炎风险的患者TFPI或TFPI类似物，给药速率等效于以小于约1.0毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI，并且所述患者在给予TFPI或TFPI类似物的24小时内未接受过抗凝血药物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者已被证明有感染。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉输注给药，给药速率等效于以小于约0.80毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述给药速率等效于以约0.025-0.10毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI，并且给予所述TFPI或TFPI类似物至少约72小时。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述给药速率等效于以约0.010-0.10毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述给药速率等效于以约0.020-0.08毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，给予所述TFPI或所述TFPI类似物至少96小时。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉输注给予以提供一总剂量，所述总剂量等效于以约0.025-2.5mg/kg的总剂量给予参照品ala-TFPI。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉输注给予，给药速率等效于以约0.02-0.09毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉输注给予以提供一日剂量，所述日剂量等效于以约0.06-4mg/kg的日剂量给予参照品ala-TFPI。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物包含由SEQ ID NO：1的氨基酸19-89组成的第一Kunitz结构域。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物还包含由SEQ IDNO：1的氨基酸90-160组成的第二Kunitz结构域。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-160。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物包含由SEQ ID NO：1的氨基酸90-160组成的第二Kunitz结构域。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物是由含有TFPI或TFPI类似物的冻干组合物制备出的。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物作为含有精氨酸的制剂给药。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物作为含有柠檬酸盐的制剂给药。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物在包含约300mM精氨酸盐酸化物和约20mM柠檬酸钠并具有约5.5的pH的制剂中的浓度约为0.15mg/ml。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
31.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在给予所述TFPI或TFPI类似物同时或24小时内给予以下另外的物质：抗生素、抗体、内毒素拮抗剂、具有抗凝血活性的组织因子类似物、免疫兴奋剂、细胞粘附细胞粘附阻断剂、肝素、BPI蛋白、IL-1拮抗剂、pafase(PAF酶抑制剂)、TNF抑制剂、IL-6抑制剂和补体的抑制剂。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述另外的物质是抗体，所述抗体特异性结合抗原TNF、IL-6和M-CSF。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
35.一种治疗严重肺炎的方法，包括：给予患者(i)TFPI或TFPI类似物和(ii)选自抗生素、单克隆抗体、细胞因子抑制剂和补体抑制剂的另外的物质。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述患者已被证明有感染。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉输注给药，给药速率等效于以小于约1.0毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述给药速率等效于以约0.001-0.090毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述给药速率等效于以约0.002-0.050毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述给药速率等效于以约0.002-0.010毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述给药速率等效于以约0.0025-0.075毫克/千克/小时的给药速率给予参照品ala-TFPI。
43.一种治疗或预防严重肺炎的方法，包括给予患有或有患严重肺炎风险的人类患者不会诱发过量出血的量的TFPI或TFPI类似物。
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