KR20080017021A - 중증 박테리아 감염을 치료하기 위한 ｔｆｐｉ의 용도 - Google Patents

중증 박테리아 감염을 치료하기 위한 ｔｆｐｉ의 용도 Download PDF

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Abstract

중증 박테리아 감염을 앓고 있거나 이러한 질환이 발전될 위험에 처한 환자에게 조직인자경로억제제(TFPI) 또는 TFPI 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 중증 박테리아 감염이 발전될 위험에 처해 있거나, 중증 박테리아 감염을 가진 것으로 진단받은 환자를 예방학적으로 또는 치료학적으로 치료하기 위한 방법이 기재된다. 이러한 방법은, 부작용을 피하기 위하여 저용량으로 TFPI 또는 TFPI 유사체를 연속적 정맥내 주입하는 것을 사용하는 것을 포함한다.
TFPI, 중증 박테리아 감염, 정맥내, 주입

Description

중증 박테리아 감염을 치료하기 위한 ＴＦＰＩ의 용도{USE OF TFPI TO TREAT SEVERE BACTERIAL INFECTIONS}
중증 박테리아 감염은 생명을 위협하는 패혈증을 포함한 각종 합병증을 유발할 수 있다. 중증 박테리아 감염을 치료 및/또는 중증 박테리아 감염으로부터의 사망률 위험을 감소시키기 위한 효과적인 방법이 당업계에 꾸준히 요구되어 오고 있는 실정이다.
발명의 개요
본 발명의 일 구체예는 필요로 하는 환자에게 TFPI 또는 TFPI 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 중증 박테리아 감염이 발전될 위험에 처해 있거나, 중증 박테리아 감염을 가진 것으로 진단받은 환자를 치료하는 방법이다. 일부 구체예에서, 중증 박테리아 감염은 폐렴, 균혈증, 심조직 감염, 피부 감염, 연조직 감염, 치주 감염, 복막염, 수술 감염, 또는 뇌막염을 유발한다. 추가의 구체예에서, 폐렴은 지역사회획득 폐렴이거나 병원획득 폐렴이며, S. 뉴모니아(S. pneumoniae)에 의해 유발될 수 있다.
다른 구체예는, 필요로 하는 환자에게 TFPI 또는 TFPI 유사체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 중증 박테리아 감염으로부터의 사망률 위험을 감소시키는 방법이다. 일부 구체예에서, 중증 박테리아 감염은 폐렴, 균혈증, 심조직 감염, 피부 감염, 연조직 감염, 치주 감염, 복막염, 수술 감염, 또는 뇌막염을 유발한다. 추가의 구체예에서, 폐렴은 지역사회획득 폐렴이거나 병원획득 폐렴이며, S. 뉴모니아(S. pneumoniae)에 의해 유발될 수 있다.
다른 구체예는 상기의 환자는 하기의 기준 중 임의의 것을 만족시키는 것인, 상기의 구체예를 포함한다: 3,200 pg/ml 미만의 혈액 IL-6 수준; 2.5 미만의 국제 표준화 비율(International Normalized Ratio, INR); 26 미만의 급성 생리학적 지수(acute physiology score, APS); 38 미만의 급성 생리학적 및 만성 건강 평가(APACHE II) 지수(Acute Physiology And Chronic Health Evaluation (APACHE H) score); 18보다 큰 MODS 지수.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체는 비(non)-당화된 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 12% 미만은 변형된 종이고, 이때 변형된 종은 하기 중 하나 이상을 포함하는, 상기의 구체예를 포함한다: 역상 크로마토그래피에 의해 검출되는 바와 같은 산화된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 검출되는 바와 같은 카르바밀화 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; Promega ISOQUANT® 키트에 의해 검출되는 바와 같은 탈아미드화된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; 아미노산 분석에 의해 결정되는 바와 같은 시스테인 부가물을 포함하는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출되는 바와 같은 응집된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; 비변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 검출되는 바와 같은 잘못 폴딩된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 9% 미만이 산화된 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 3% 미만이 카르바밀화된 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 9% 미만이 탈아미드화된 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 2% 미만이 시스테인 부가물을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 3% 미만이 응집된 상기 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 3% 미만이 잘못 폴딩된 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체가 TFPI 또는 TFPI 유사체를 포함하는 동결건조된 조성물로부터 제조되는 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체가 아르기닌을 포함하는 제제로서 투여되는 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체가 시트르산염을 포함하는 제제로서 투여될 수 있는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 제약 조성물이 0.01 내지 1.0 mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체를 포함하는 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 제약 조성물이 150-450 mM L-아르기닌을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 제약 조성물이 0.1-50 mM L-메티오닌을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 제약 조성물이 5-50 mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 제약 조성물이 5.0 내지 6.0의 pH를 가지는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 방법이 0.15 ± 15% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 15% mM L-아르기닌, 5 ± 15% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 15%에서 20 ± 15% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 제약 조성물을 사용하는 것을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 방법이 0.15 ± 10% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 10% mM L-아르기닌, 5 ± 10% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 10%에서 20 ± 10% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 제약 조성물을 사용하는 것을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 방법이 0.15 ± 5% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 5% mM L-아르기닌, 5 ± 5% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 5%에서 20 ± 5% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 제약 조성물을 사용하는 것을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 방법이 0.45 ± 15% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 15% mM L-아르기닌, 5 ± 15% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 15%에서 20 ± 15% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 제약 조성물을 사용하는 것을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 방법이 0.45 ± 10% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 10% mM L-아르기닌, 5 ± 10% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 10%에서 20 ± 10% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 제약 조성물을 사용하는 것을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 방법이 0.45 ± 5% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 5% mM L-아르기닌, 5 ± 5% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 5%에서 20 ± 5% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 제약 조성물을 사용하는 것을 포함하는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체는 약 0.66 mg/kg/hr 미만의 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 용량률로 연속 정맥내 주입함으로써 투여되는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 용량률은 약 0.00025 내지 약 0.1 mg/kg/hr의 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등하고, TFPI 또는 TFPI 유사체는 적어도 약 72시간 동안 투여되는 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 용량률은 약 0.010 내지 약 0.1 mg/kg/hr의 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 것인 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체가 적어도 약 96시간 동안 투여되는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체가 약 0.024 내지 약 4.8 mg/kg의 총 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 총 용량을 제공하기 위해, 연속 정맥내 주입함으로써 투여되는 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체가 약 0.02 내지 약 1 mg/kg/hr의 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 용량률로 연속 정맥내 주입함으로써 투여되는 상기의 구체예를 포함한다. 다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체가 약 0.006 mg/kg 내지 약 1.2 mg/kg의 1일 용량에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 1일 용량을 제공하기 위해 연속 정맥내 주입함으로써 투여되는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 또는 TFPI 유사체가 10-200 시간, 10-150 시간, 또는 24-96 시간의 기간 동안 주입함으로써 투여되는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 환자가 TFPI 또는 TFPI 유사체를 투여하기 전 적어도 8시간 동안 헤파린으로 치료받지 않은 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 활성형 단백질 C로 환자를 처리하는 것을 추가로 포함하는 상기의 구체예를 포함한다.
다른 구체예는 TFPI 유사체는 ala-TFPI인 상기의 구체예를 포함한다.
발명의 상세한 설명
TFPI는 항염증 활성을 가진 것으로 추측되는 강력한 항응고제이다. EP 0 643 585 참조. TFPI는 예를 들면 종양과 관련된 혈관신생을 억제하는데 사용될 수 있다. EP 0 914 830 참조. 본 발명자는, 또한 TFPI는 선천성 면역계를 조절하는 염증 사이토카인의 조절을 통해, 항박테리아 활성을 가지는 것도 발견하였다. 본 발명자는 또한 중증 박테리아 감염의 결과로서 TFPI가 감소되는 것과, 감염이 진행되는 동안에 TFPI가 고갈되는 것은 면역계의 기능을 발휘하지 못하게 한다는 것도 발견하였다. 즉 TFPI는 감염을 퇴치하는데 결정적인 역할을 하지만, 내생성 TFPI에는 중증 감염 TFPI의 치료 기능을 결손시키는 변동이 있게 된다.
패혈증 환자 군에서 몇가지 인자는 사망률을 예측한다. 여기에는 급성 생리학적 및 만성 건강 평가(APACHE II) 지수 시스템 (Knaus et ah, Crit Care Med. 1985;13:818-29), 급성 생리학적 지수(APS), 국제 표준화 비율 (INR) (R.S. Riley et ah, J. Clin. Lab. Anal. 14:101-114, 2000), 및 혈장 IL-6 농도가 포함된다. 지역사회획득 폐렴(CAP)에 걸린 환자 집단에서는, 본 발명자는 TFPI가 사망률을 감소시키는데 효과적임을 이미 발견한 바 있다. 상대 위험 감소율은 (100 x 절대 위험 감소율)/위약 사망률로서 결정한다. 본 발명자가 APACHE II 지수(도 20), 급성 생리학적 지수, INR, (도 22) 또는 혈장 IL-6 수준을 사용하여 심각도별로 CAP 환자를 나누었을 때, TFPI 치료로부터 혜택을 받은 자에는 가장 낮은 위약 사망률을 갖는 환자가 포함되는 것을 발견하였다. 예를 들면, APACHE II 지수로 나눈 CAP 하위군에서, 16점의 APACHE II 지수에서 5% 사망률 위험 감소가 있었는데, 이는 곧 32%의 상대 위험 감소율을 의미한다. 도 20은 36점 미만의 평균 APACHE II 지수를 가진 환자에서 감소된 사망률 위험을 증명한다. 기준선 TFPI 혈청 농도는 사망률 및 효능 모두를 예측한다.
1.2 미만의 INR 수준을 갖는 하위연구에서의 환자는 높은 INR 1차 연구에서의 환자보다 더 낮은 사망률 위험을 가졌고(전체 18% 대 34%), ala-TFPI는 1.2 미만의 INR 수준을 갖는 하위연구에서 효과적이었다(도 25). 평균 2.1 미만의 INR 수준을 갖는 환자의 CAP 하위군은 ala-TFPI로부터 혜택을 입었다(도 21). 이는 또한 헤파린으로 처리하지 않은 ala-TFPI 처리 환자에 대해서도 그러하였다.
도 20은 APACHE II와 전체 및 지역사회획득 폐렴(CAP) 위약군 간의 예측되는 상관관계를 도시한다(도 20). CAP 코호트(cohort)가 APACHE II 4분위수에 들어갈 때, 본 발명자는 모든 APACHE II 4분위수에서 효과가 있음을 발견하였다. 유사하게, APS, INR 및 IL-6는 모두 사망률과 비례적으로 상응하였다. 각 경우에 ala-TFPI는 이러한 매개변수에 의해 측정된 바와 같이 가장 낮은 위험군에서 생존율을 개선하였다(도 21, 22, 23). TFPI는 혈액으로부터 포지티브 박테리아 배양액을 갖는 환자에서 효과가 있었다(도 24). 다시 TFPI는 환자가 APACHE 지수에 의해 분리될 때 처음 3개의 4변위수에서 폭넓게 활성이었다.
따라서, 외생성 TFPI로 치료하는 것은 중증 박테리아 감염이 발전될 위험에 처해 있거나, 중증 박테리아 감염을 가진 것으로 진단받은 환자에 대해 치료적 혜택을 가지고, 이러한 감염으로부터 사망률의 위험을 낮추는데 유용하다. 중증 박테리아 감염은 일반적으로 급성 치료, 특히 입원을 요하는 감염을 말한다. 중증 박테리아 감염은 일반적으로 항감염 치료 및 보충 치료 또는 적극적인 의료적 개입을 요한다. 일반적인 중증 박테리아 감염은 한정하는 것은 아니지만, 폐렴(병원획득 폐렴 및 지역사회획득 폐렴 포함), 균혈증, 심조직 감염, 피부 감염, 연조직 감염, 치주 감염, 복막염, 수술 감염, 및 뇌막염을 포함한다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 환자는 하기의 기준 중 하나 이상을 만족한다: (a) 3,200 pg/ml 미만의 혈액 IL-6 수준 (예를 들면, 3,000, 2,500, 2,000, 1,500, 1,000, 500, 250, 100 또는 10 미만의 혈액 IL-6 수준); (b) 2.5 미만의 국제 표준화 비율(INR) (예를 들어 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 또는 1.1 미만의 INR 수준); (c) 26 미만의 급성 생리학적 지수(APS)(예를 들어 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 또는 16 미만의 APS 지수, 또는 16-19 사이의 APS 지수, 또는 20-23 사이의 APS 지수); (d) 38 미만의 급성 생리학적 및 만성 건강 평가(APACHE II) 지수 (예를 들어 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 또는 16 미만의 APACHE II 지수); 및 (e) 18보다 큰 다중 장기 부전(Multiple Organ Dysfunction, MODS) 지수(예를 들면, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24보다 큰 MODS 지수, 또는 20-21 사이의 MODS 지수, 또는 22-23 사이의 MODS 지수).
일 구체예에서, 환자는 3,200 pg/ml 미만의 혈액 IL-6 수준을 가진다. 다른 구체예에서, 환자는 2.5 미만의 국제 표준화 비율(INR)을 가진다. 다른 구체예에서, 환자는 26 미만의 급성 생리학적 지수(APS)를 가진다. 다른 구체예에서, 환자는 38 미만의 급성 생리학적 및 만성 건강 평가(APACHE II) 지수를 가진다. 다른 구체예에서, 환자는 18보다 큰 MODS 지수를 가진다.
TFPI 및 TFPI 유사체
TFPI는 처음에 자연발생의 항응고제로서 동정되었다. 단백질은 몇개의 기본적인 도메인을 가진다(도 1): Kunitz형의 3개의 세린 프로테아제 억제제 도메인(Kl, K2 및 K3)과, N-말단 도메인 및 C-말단 도메인(CTD)이 그것이다. K1 도메인은 응괴 인자인 VIIa-조직 인자(TF) 복합체를 억제한다. K2 도메인은 Xa 인자를 억제한다. 따라서 세린 프로테아제가 K3와 회합되지 않는 한, 최근의 실험결과는 K3이 세포 표면 상의 GPI 고정된 수용체에 TFPI를 결합시키는 작용을 할 것으로 제안하였다. Piro & Broze, Circulation. 2004 Dec 7;110(23):3567-72 참조. CTD는 또한 세포 회합, 헤파린 결합 및 최적의 Xa 억제에 관여한다.
TFPI는 혈액 및 다른 조직의 각종 세포 유형에서 자연 발생한다. 대부분의 TFPI는 혈관을 싸고 있는 내피 세포에서 만들어지는 것으로 생각된다. TFPI의 단편은 혈액에서 발견된다. 이러한 혈장 TFPI의 대부분은 다른 혈장 단백질과의 이황화물 교환에 의해 공유적으로 변형되거나 CTD를 제거하는 절단에 의해 변형된다. 이러한 형태의 TFPI는 생화학적 분석에서 활성이 떨어지고 세포와 효과적으로 결합하지 못하는데, 이것은 혈장 TFPI가 비활성이라는 것을 암시하는 것이다. 이와 일치하게 본 연구에서는, 혈장 TFPI의 반감기가 매우 짧다는 것과, 간에 의해 효과적으로 제거된다는 것을 증명하였다.
TFPI의 각종 관련된 세포 형태는 시험관내에서 최상의 활성을 갖는 것과 관련된 전길이 단량체 단백질들이다. 내피 세포 상에는 헤파린 처리에 의해 제거될 수 있는 TFPI의 작은 단편들이 존재한다. 다른 풀(pool)은 정점 표면 아래에 있는 소포내에 가라앉아 있는 것으로 보이고 세포가 트롬빈에 의해 자극되면 방출된다. 세포 표면 TFPI의 대부분은 카베올라(caveolae), 즉 다른 시스템에서의 신호전달과 관련된 세포소기관에서 발견된다. Lupu 등, JBC Papers in Press, published April 6, 2005 as Manuscript M503333200 참조. 카베올라에서의 TFPI는 내피 세포 상에 TF를 고정하는 TFPI인 것으로 보인다. 내피 세포가 박테리아에 노출되면, 이의 표면 상에 일반적으로 TF를 유도한다. TF는 VIIa와 결합하여 Xa를 발생시킨다. TF:VIIa는 카베올라로 재빨리 이동하여 여기에서 TFPI와 결합한다. 정상적인 내피 세포에서는 TFPI가 과량 존재하여, TF-발현 내피 세포가 병리학적 수준의 응괴 효소를 유도하지는 않도록 보장한다. 흥미롭게도, 일단 TF가 카베올라로 이동하면, 이는 안정해지는데, 이것은 TFPI에 의해 중화된 후 중요한 역할을 함을 암시하는 것이다.
본원에 사용된 "TFPI"는 SEQ ID NO:1에 제시된 276개의 아미노산 잔기 서열을 갖고, 약 38000 달톤의 분자량의 성숙한 혈청 당단백질을 언급하는 것이다. 미국특허 No. 5,106,833 참조. TFPI cDNA의 클로닝은 Wun 등, 미국특허 No. 4,966,852에 기술되어 있다. 본 발명에 사용된 TFPI는 당화되지 않을 수 있고, 아니면 당화될 수도 있다.
"TFPI 유사체"는 하나 이상의 아미노산 부가 또는 치환(일반적으로 자연계에서 보존성이고, 바람직하게는 Kunitz 도메인이 아닌 것, 또는 단백질의 C 말단 부분에서의 부가 또는 치환), 하나 이상의 아미노산 결실(예를 들어, TFPI 단편), 또는 하나 이상의 아미노산에 하나 이상의 화학 잔기의 부가를 이용하여 변형된 TFPI의 유도체이며, 단 이 변형은 TFPI의 생물학적 활성을 파괴하지 않는다. 바람직하게는, TFPI 유사체는 모든 세개의 Kunitz 도메인을 포함한다. TFPI 및 TFPI 유사체는 당화될 수도 있고, 아니면 당화되지 않을 수도 있다.
바람직한 TFPI 유사체는 N-L-알라닐-TFPI(ala-TFPI)이며, 이것의 아미노산 서열을 SEQ ID NO:2에 나타낸다. ala-TFPI는 국제적 약물명인 "티파코긴(tifacogin)"으로도 알려져 있다. ala-TFPI의 아미노 말단 알라닌 잔기는, E. coli 발현을 개선하고, 다른 상태에서는 아미노 말단 메티오닌 잔기였을 어떤 것의 절단을 행하도록 TFPI 서열에서 조작되었다. 미국특허 5,212,091 참고. 다른 TFPI의 유사체는 미국특허 제5,106,833호에 개시되어 있다. TFPI 유사체는 아래 설명된 생물활성 분석에 의해 측정된 TFPI 활성 측정치의 일부를 지닌다. TFPI 및 유사체에 대한 바람직한 생물활성 분석은 프로트롬빈 시간(PT) 분석이다(아래 참조).
TFPI 유사체는 자연계에서 보존적인 아미노산 치환, 즉 측쇄에 관련된 아미노산 패밀리 내에서 발생한 치환을 가질 수 있다. 보다 명확히, 아미노산은 일반적으로 4개 패밀리로 나눠진다: (1) 산성 - 아스파르트산염 및 글루탐산염; (2) 염기성 - 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 - 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 하전되지 않은 극성 - 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 티로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 예를 들어, 로이신을 이소로이신 또는 발린으로, 아스파르트산염을 글루탐산염으로, 트레오닌을 세린으로 대체하는 단독 대체, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 대체하는 유사한 보존성 대체는 생물학적 활성에 주요한 영향을 나타내지 않을 것임을 합리적으로 예측할 수 있다. 예를 들어, 관심의 폴리펩티드는 원하는 분자 기능이 그대로 남아 있는 한, 1-15개(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15)까지의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. TFPI의 바람직한 형태는 Kunitz 1, Kunitz 2 또는 Kunitz 3 도메인이 자연적인 사람 TFPI Kunitz 도메인과 정확히 상응하고, 더욱 바람직하게는 Kunitz 도메인이 자연적인 사람 TFPI Kunitz 도메인의 각각에 정확히 상응하는 TFPI 유사체를 포함한다.
바람직하게는 TFPI 유사체는 SEQ ID NO:1에 제시된 것과 같은 TFPI에 대해 적어도 95% 또는 더욱 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 분자는 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
TFPI 및 TFPI 유사체의 생물학적 활성은 프로트롬빈 분석에 의해 측정될 수 있다. 적합한 프로트롬빈 분석이 미국특허 5,888,968 및 WO 96/40784에 설명된다. 간단히 말해서, 프로트롬빈 시간은 혈액응고측정기(예를 들어, Organon Teknika의 Coag-A-Mate MTX II)를 사용하여 측정될 수 있다. 적합한 분석 완충액은 1mg/ml 소혈청알부민을 함유한 pH 7.5로 조정된 100mM NaCl, 50mM 트리스이다. 필요한 추가 시약은 정상 사람 혈장(예를 들어, Organon Teknika의 "Verify 1"), 트롬보플라스틴 시약(예를 들어, Organon Teknika의 "Simplastin Excel"), 및 TFPI 표준용액(예를 들어, 분석 완충액 ml 당 100% 순수한 ala-TFPI(또는 그의 동등물) 20㎍)이다. TFPI 표준용액의 일련의 희석용액, 예를 들어 1에서 5㎍/ml까지의 최종 농도로 희석된 희석용액의 응고 시간을 분석함으로써 표준 곡선이 얻어진다.
응괴형성 시간을 결정하기 위해 샘플 또는 TFPI 표준이 분석 완충액으로 먼저 희석된다. 다음에 정상 사람 혈장이 첨가된다. 응괴형성 반응은 트롬보플라스틴 시약의 첨가에 의해 시작된다. 다음에 기계가 응괴형성 시간을 기록한다. 로그값 응괴형성 시간 대 로그값 TFPI 농도의 플롯으로부터 직선 TFPI 표준 곡선이 얻어진다. TFPI 표준의 순도를 기준으로 표준 곡선을 조정하여, 100% 순수한 표준에 대한 등가의 TFPI 농도와 상응시킨다. 예를 들어, 표준이 97% 생화학적으로 순수한 ala-TFPI로 제조된 경우(즉, TFPI의 생물학적 활성이 없는 분자종을 3중량% 함유한다), 표준의 각 희석용액의 농도에 0.97을 곱하여 실제 TFPI 농도를 얻는다. 따라서, 97% 순수한 제조물 ml 당 실제 중량을 기준으로 1.0㎍/ml인 TFPI 표준은 1.0x0.97의 농도, 또는 0.97㎍/ml와 동등할 것이며, 이 농도로서 취급될 것이다.
TFPI 및 TFPI 유사체 얻기
본 발명의 방법에 사용된 TFPI 및 TFPI의 유사체는 세포나 조직으로부터 분리 정제되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 원핵세포나 진핵세포에서 재조합적으로 생성될 수 있다.
TFPI는 몇 가지 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, TFPI를 분비하는 세포는 노화 내피세포, 약 3-4일간 TNF로 처리된 젊은 내피세포, 간세포, 및 간암세포를 포함한다. TFPI는 종래의 방법들에 의해 정제될 수 있으며, 이 방법들에는 Pedersen 등 1990 J. Biol. Chem. 265, 16786-93, Novotny 등 1989 J. Biol. Chem. 264, 18832-37, Novotny 등 1991 Blood 78, 394-400, Wun 등 1990 J. Biol. Chem. 265, 16096-101, 및 Broze 등 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1886-90에 설명된 크로마토그래피법 등이 있다. TFPI는 혈류에서도 보이며, 혈액으로부터 정제될 수 있다. Pedersen 등, 1990 참조.
TFPI 또는 TFPI 변이체는 고체상 기술을 사용해 직접 펩티드를 합성하는 것과 같이, 화학적 방법을 사용하여 그것의 아미노산 서열을 합성함으로써 생성될 수 있다(Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge 등, Science 269, 202-204, 1995). 단백질 합성은 수동기술을 사용하거나 또는 자동으로 수행될 수도 있다. 자동 합성은, 예를 들어 Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 사용하여 달성될 수 있다. 선택적으로, TFPI 또는 TFPI 변이체의 단편들이 개별적으로 합성되고 화학적 방법을 사용하여 합쳐져 전길이 분자를 생성할 수 있다.
TFPI 및 TFPI 유사체는 미국특허 No. 4,966,852에 나타낸 대로 재조합적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 단백질의 cDNA가 원핵생물이나 진핵생물에서의 발현을 위해 플라스미드에 편입될 수 있다. 미국특허 No. 4,847,201는 특이적 DNA 서열로 미생물을 형질전환하고 그들을 발현하기 위한 상세한 설명을 제공한다. 미생물을 사용하여 단백질을 발현하는 것에 대한 상세한 설명을 제공하는 많은 다른 참고자료들이 당업자에게 알려져 있다. Maniatas 등 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press와 같은, 대부분의 참고자료가 미국특허 No. 4,847,201에서 인용된다.
미생물을 형질전환하고 그들을 사용하여 TFPI 및 TFPI 유사체를 발현하는 다양한 기술들을 이용할 수 있다. 다음은 가능한 접근법들에 대한 단순한 예시이다. TFPI DNA 서열이 분리되어 적합한 대조 서열에 연결되어야 한다. TFPI DNA 서열은 미국특허 No. 4,966,852에 나타나며, Boehringer-Mannheim 같은 회사로부터 시중에서 입수할 수 있는 pUNC13 또는 pBR3822와 같은 플라스미드에 편입될 수 있다. 일단 TFPI DNA가 벡터로 삽입되면, 그것은 적합한 숙주에 클로닝될 수 있다. DNA는 미국특허 No. 4,683,202(Mullis) 및 미국특허 No. 4,683,195(Mullis 등)에 나타낸 것들과 같은 기술에 의해 증폭될 수 있다. TFPI cDNA는 간암세포(HepG2 및 SKHep 같은)와 같은 세포를 유도하여 TFPI mRNA를 제조한 후, mRNA를 확인 및 분리하고, 그것을 역으로 전사하여 TFPI의 cDNA를 얻음으로써 얻어질 수 있다. 발현 벡터가 E. coli와 같은 숙주로 형질전환된 후, 이 박테리아가 발효되고, 단백질이 발현될 수 있다. 박테리아가 바람직한 원핵 미생물이며, E. coli가 특히 바람직하다. 본 발명에 유용한 바람직한 미생물은 부다페스트 조약하에 1984년 2월 14일자로 ATCC에 기탁된 E. coli K-12, 균주 MM294(수탁번호 39607)이다.
다세포 유기체로부터 유래된 진핵 숙주세포 배양물에서 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 발현시키는 것도 물론 가능하다. 예를 들어, Tissue Culture,1973, Cruz 및 Patterson, 편저, Academic Press 참조. 유용한 포유동물의 셀라인은 쥐 골수종 N51, VERO, HeLa 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, COS, C127, Hep G2, 및 SK Hep를 포함한다. TFPI 및 TFPI 유사체는 또 바쿨로바이러스-감염된 곤충세포에서 발현될 수 있다(상기 언급된 미국특허 No. 4,847,201 참조). 또, Pedersen 등, 1990, J. of Biological Chemistry, 265:16786-16793 참조. 진핵세포용 발현 벡터는 보통, 포유동물 세포와 비교할 수 있는 프로모터 및 대조 서열을 포함하는데, 예를 들어 유인원 바이러스 40(SV40)에서 유래된 통상 사용되는 초기 및 후기 프로모터(Fiers, 등, 1978, Nature, 273:113), 또는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 소 유두종 바이러스, 또는 조류 육종 바이러스로부터 유래된 것들과 같은 다른 바이러스 프로모터, 또는 면역글로불린 프로모터 및 열충격 프로모터가 있다.
포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환에 대한 일반적인 구체예는 Axel에 의해서 미국특허 No. 4,399,216에 설명되었다. 지금은 "인핸서" 영역이 발현을 최적화하는데 중요하다는 것도 밝혀졌는데, 이들 영역은 일반적으로 프로모터 영역의 상류에서 발견된 서열이다. 필요하다면 복제 기원이 바이러스원으로부터 얻어질 수 있다. 그러나, 염색체로의 통합이 진핵세포에서 DNA를 복제하는 통상적인 메카니즘이다. 식물세포도 이제 숙주로서 이용할 수 있으며, 노팔린 신타제 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 서열(Depicker, A. 등, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1:561)과 같은 식물세포와 비교할 수 있는 대조 서열을 이용할 수 있다. 식물세포의 형질전환 방법 및 벡터는 WO 85/04899에 개시되었다.
포유동물 세포에서 발현된 TFPI 및 TFPI 유사체의 정제에 사용될 수 있는 방법은 헤파린-Sepharose, MonoQ, MonoS, 및 역상 HPLC 크로마토그래피의 연속적 사용을 포함한다. Pedersen 등, 상동; Novotny 등 1989, J. Biol. Chem. 264:18832-18837; Novotny 등, 1991, Blood, 78:394-400; Wun 등, 1990, 3. Biol. Chem. 265: 16096-16101; Broze 등, 1987, PNAS(USA) 84: 1886-1890; 미국특허 No. 5,106,833; 및 미국특허 No. 5,466,783 참조. 이들 참고자료는 포유동물로부터 생성된 TFPI를 정제하는 다양한 방법을 설명한다.
바람직한 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 제조 방법은 WO 05/019265에 개시되어 있다. 이 방법은 약 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0.5% 미만의 제조물이 "변형된 종"으로 구성되는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 제조물을 생성한다. "변형된 종"은 역상 크로마토그래피에 의해 검출되는 바와 같은 산화형 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 검출되는 바와 같은 카르바밀화 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; Promega ISOQUANT® 키트에 의해 검출되는 바와 같은 탈아미드화된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; 아미노산 분석에 의해 결정되는 바와 같은 시스테인 부가물을 포함하는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출되는 바와 같은 응집된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; 비변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 검출되는 바와 같은 잘못 폴딩된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자; 중 하나 이상을 포함한다. WO 05/019265에 기술된 방법을 사용하면, 약 9% 미만의 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자는 산화되고, 약 3% 미만의 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자는 카르바밀화되고, 약 9% 미만의 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자는 탈아미드화되고, 약 2% 미만의 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자는 시스테인 부가물을 포함하고, 약 3% 미만의 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자는 응집되며, 약 3% 미만의 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자는 잘못 폴딩된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자를 제조할 수 있다.
또한, TFPI는 마우스 C127 세포(Day 등, Blood 76, 1538-45, 1990), 아기 햄스터 신장세포(Pedersen 등, 1990), 중국 햄스터 난소세포 및 사람 SK 간암세포 같은 포유동물 세포 숙주를 사용하여 재조합 당화 단백질로서 발현될 수 있다. C127 TFPI는 동물 연구에서 사용되었는데, 토끼에서 조직인자-유도 혈관내 응고의 억제 (Day 등, 상동), 개에서 혈전용해 후 동맥 재폐색의 방지(Haskel 등, Circulation 84: 821-827(1991)), 그리고 개코원숭이에서 E. coli 폐혈증 모델에서의 사망률의 감소(Creasey 등, J. Clin. Invest. 91:2850(1993))에 효과적인 것으로 나타났다. ala-TFPI는 E. coli 숙주세포를 사용하여 재조합 비-당화 단백질로서 발현될 수 있다. E. coli에서 생성된 재조합 단백질의 시험관내 재폴딩에 의해 고도로 활성인 ala-TFPI를 얻는 방법이 설명되었다. 예를 들어, WO 96/40784 참조.
또한, TFPI 및 TFPI 유사체는 박테리아나 효모에서 생성된 후 정제될 수 있다. 일반적으로, 미국특허 No. 5,212,091; 6,063,764; 및 6,103,500 또는 WO 96/ 40784에 나타낸 과정이 사용될 수 있다. ala-TFPI 및 다른 TFPI 유사체들은 본원에 참고자료로 수록된 WO 96/40784 및 Gustafson 등, Prot. Express. Pur. 5:233 (1994)에 따라서 정제되고 용해되고 재폴딩될 수 있다. 예를 들어, WO 96/40784의 실시예 9에 따라 제조했을 때, 총 단백질의 약 85중량% 내지 90중량%를 성숙한 알맞게 폴딩된 생물학적으로 활성인 ala-TFPI로서 함유하며, 이 중 약 10% 내지 15%가 하나 이상의 산화된 메티오닌 잔기를 갖는 ala-TFPI의 제조물을 얻을 수 있다. 이들 산화된 형태는 프로트롬빈 분석에 의해 측정된 유도체화되지 않은 ala-TFPI의 생물학적 활성과 동등한 생물학적 활성을 가지며, 본원에 개시된 발명에서도 활성일 것으로 예상된다. 나머지 물질은 2량체화된 형태, 응집된 형태, 및 아세틸화된 형태를 포함하는 다양하게 변형된 형태의 ala-TFPI를 포함한다.
TFPI 및 TFPI 유사체는 상당한 수의 시스테인 잔기를 가질 수 있으며, 미국특허 No. 4,929,700에 나타낸 과정이 TFPI 재폴딩에 관련된다. TFPI 및 유사체는 상기 언급된 것들과 같은 다양한 크로마토그래피법에 의해 완충액으로부터 정제될 수 있다. 원한다면 미국특허 No. 4,929,700의 방법이 사용될 수 있다. 사람에게 투여하는데 적합한 순도 및 활성 수준을 가져오는 모든 방법이 TFPI 및 TFPI 유사체를 정제하는데 사용될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
TFPI 및 TFPI 유사체는 중증 박테리아 감염이 발전될 위험에 처해 있거나, 중증 박테리아 감염을 가진 것으로 진단받은 환자를 치료하기 위하여, 또는 하나 또는 한 그룹의 환자에 대해 중증 박테리아 감염으로부터의 사망률 위험을 낮추기 위하여 유용하다.
"중증 폐렴"은 미국인후협회에서 제시한 가이드라인에 따라 정의된다. 보다 명확히, 중증 폐렴은 폐렴의 진단과 a) 2개의 주요 기준 중 1개, b) 3개의 이차적 기준 중 2개, 또는 c) 영국인후협회(Thorax 2001; 56[suppl IV]: 1-64)의 4개의 기준 중 2개를 만족할 것을 요구한다. 주요 기준은 1) 기계호흡의 필요 및 2) 폐혈쇼크 또는 4시간 이상 동안 승압제의 필요이다. 이차적 기준은 1) 수축기 혈압 ≤90mmHg 2) 다엽폐렴 및 3) 저산소혈증 기준(PaO2/FiO2) <250이다. 영국인후협회의 기준은 1) 호흡수 ≥30호흡/분 2) 확장기 혈압 ≤60mmHg 3) 혈액 요소질소(BUN) >7.0mM(>19.6mg/dL) 및 4) 착란이다. 본 분야에서 이해되는 바와 같이, 저산소혈증 기준(PaO2/FiO2)은 흡기산소분율에 대한 동맥산소의 부분압력으로 간주되며, 가스교환의 손상 수준을 나타낸다.
중증 폐렴을 가진 환자는 본 분야에 공지된 어떤 수단들에 의해 증명가능한 감염을 가진다. 이들 방법은, 제한은 없지만 혈액 배양물이나 다른 정상적으로 멸균된 체액 또는 조직에서, 예를 들어 GRAM 염색, 배양, 조직화학염색, 면역화학분석, 또는 핵산분석에 의한 병원성 유기체의 검출을 포함한다. 또한, 증명가능한 감염은 전신 항-감염 요법에 대한 이유를 구성하는 폐렴의 진단과 일치하는 흉부 방사선 사진뿐만 아니라, 제한되는 것은 아니지만, 호흡수 >/=30/분 또는 PaO2/FiO2 <250으로 증가, 혈압 감소, 및 체온 증가를 포함하는 감염의 어떤 임상적 증상에 의해 증명될 수 있다.
TFPI 및 TFPI 유사체의 제제
TFPI 및 TFPI 유사체의 제제는 정맥내 주입에 의해 투여된다. 본질적으로는 연속 정맥내 주입이 바람직하다. 이 투여를 달성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 주입은 중추라인 또는 말초라인을 통해 수행될 수 있다. 용량률의 큰 변동은 피해야 하지만, 투여된 TFPI의 결과의 혈장 수준이, 본 발명의 바람직한 구체예에 따르는 일정한 용량률로의 연속 주입으로부터 예상되는 것의 20% 이내라면 본 발명의 용량률로부터의 단기적 벗어남은 허용된다.
환자에게 투여하기 전에, 조제성분들이 TFPI 및 TFPI 유사체에 첨가될 수도 있다. 액상 제제가 바람직하다. TFPI 및 TFPI 유사체는 상이한 조제성분들을 사용하여 상이한 농도로, TFPI 단백질의 투여 경로, 용해도 및 안정성과 양립가능한 어떤 생리학적으로 적합한 pH로 조제될 수 있다. 정맥내 주입을 위한 바람직한 제제는 약 0.6mg/ml 이하의 ala-TFPI, 300mM 이하의 아르기닌 염산염, 및 pH 5.0-6.0의 시트르산 나트륨 완충액을 포함한다. 아르기닌, NaCl, 수크로스, 및 만니톨 같은 어떤 용질은 ala-TFPI를 용해 및/또는 안정화시키는 역할을 한다. WO 96/40784 참조.
약학적 제제는 예를 들면, 0.01 내지 1.0 mg/ml, 0.01 내지 0.8 mg/ml, 0.01 내지 0.5 mg/ml, 0.01 내지 0.3 mg/ml, 0.01 내지 0.2 mg/ml, 또는 0.01 내지 0.1 mg/ml ala-TFPI; 150-450 mM, 150-400 mM, 150-350 mM, 또는 150-300 mM L-아르기닌; 0.1-50 mM, 0.1-40 mM, 0.1-30 mM, 0.1-25 mM, 0.1-15 mM, 0.1-10 mM, 또는 0.1-5 mM L-메티오닌; 5-50 mM, 5-45 mM, 5-40 mM, 5-35 mM, 5-30 mM, 5-25 mM, or 5-20 mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함할 수 있다. 제제의 pH는 5.0-6, 5.0-5.8, 5.0-5.7, 5.0-5.6, 또는 5.0-5.5 범위일 수 있다. 바람직한 약학적 제제는 56O+/-11O mOsm/kg (± 15, 10, 또는 5 %)의 삼투압을 갖는, 300 mM (± 15, 10, 또는 5 %) L-아르기닌, 5 mM (± 15, 10, 또는 5 %) L-메티오닌, 20 mM (± 15, 10, 또는 5 %)시트르산 나트륨 완충액, pH 5.5 (± 15, 10, 또는 5 %) 중에, 0.15 mg/ml (± 15, 10, 또는 5 %) 또는 0.45 mg/ml (± 15, 10, 또는 5 %) 재조합 ala-TFPI를 포함한다.
정맥내 주입을 위한 특히 바람직한 제제는 약 0.15mg/ml의 ala-TFPI, 300mM의 아르기닌 염산염, 및 pH 5.5의 20mM 시트르산 나트륨을 함유한다. 또, TFPI 및 TFPI 유사체는 선택적으로 0.005% 또는 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 80(Tween 80)과 함께 pH 5.5-7.2의 150mM NaCl 및 20mM 인산나트륨 또는 다른 완충액 중에 약 0.15 mg/ml 이하의 농도로 조제될 수 있다. 다른 제제는 150mM NaCl, 또는 8%(w/v) 수크로스, 또는 4.5%(w/v) 만니톨을 함유하는 pH 5.5, 10mM 아세트산 나트륨 중에 약 0.5mg/ml 이하의 TFPI 또는 TFPI 유사체를 함유한다. TFPI 및 TFPI 유사체는 또한 고급염을 사용하여 수 mg/ml 이하의 더 높은 농도로 조제될 수 있다. 예를 들면, 한 제제는 pH 7.0의 500mM NaCl 및 20mM 인산나트륨 중에 ala-TFPI를 약 6.7mg/ml 이하로 함유한다.
TFPI 및 TFPI 유사체의 조제성분의 더 이상의 예들은 오일, 폴리머, 비타민, 탄수화물, 아미노산, 염, 완충액, 알부민, 계면활성제, 또는 벌크화제를 포함한다. 바람직하게, 탄수화물은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당 또는 당 알콜 또는 수용성 글루칸을 포함한다. 당류 또는 글루칸은, 프럭토스, 덱스트로스, 락토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 말토스, 수크로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 알파 및 베타 시클로덱스트린, 용해성 전분, 히드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로스 또는 그들의 혼합물을 포함할 수 있다. 수크로스가 가장 바람직하다. 당 알콜은 OH 기를 갖는 C4 내지 C8 탄화수소로 정의되며, 갈락티톨, 이노시톨, 만니톨, 크실리톨, 솔비톨, 글리세롤 및 아라비톨을 포함한다. 만니톨이 가장 바람직하다. 상기한 이들 당 및 당 알콜은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알콜은 수성 제제에 용해성인 한 사용량에 고정된 제한은 없다. 바람직하게, 당 또는 당 알콜의 농도는 1.0w/v% 내지 7.0w/v%이며, 더 바람직하게는 2.0 내지 6.0w/v%이다.
바람직하게, 아미노산은 카르니틴, 아르기닌, 및 베타인의 좌선성(L) 형태를 포함한다. 그러나, 다른 아미노산이 첨가될 수도 있다. 동결건조 전에 또는 복원 후에 용액의 pH 변화를 최소화하기 위해서 조성물에 완충액을 사용하는 것이 또한 바람직하다. 대부분의 어떤 생리학적 완충액도 사용될 수 있으나, 시트르산염, 인산염, 숙신산염, 및 글루탐산염 완충액 또는 그들의 혼합물이 바람직하다. 바람직하게, 완충액의 농도는 0.01 내지 0.3 molar이다. 제제에 사용될 수 있는 계면활성제는 EP No. 270,799 및 268,110에 나타나 있다.
TFPI 또는 TFPI 유사체의 액체 제약 조성물이 제조된 후, 그것은 변성을 방지하고 멸균상태를 보존하기 위해 동결건조될 수 있다. 액체 조성물을 동결건조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 사용하기 바로 전에 조성물은 추가 성분을 포함할 수 있는 멸균 희석용액(예를 들어, 링거액, 증류수 또는 멸균 식염수)으로 복원될 수 있다. 복원후 즉시 조성물은 바람직하게는 연속 정맥내 주입에 의해 피험자에게 투여된다.
TFPI 및 TFPI 유사체의 용량
TFPI 또는 TFPI 유사체는 중증 폐렴을 포함하는 중증 박테리아 감염을 치료 및 예방하는데 치료적으로 효과적인 농도로 투여된다. 그러한 용량은 또한 다른 급성 또는 만성 염증, 및 일반적으로 사이토카인이 조직인자 발현을 상향조절하는 질환에 대해서도 효과적이다. 이 목표를 달성하기 위해 TFPI 또는 TFPI 유사체는 바람직하게 정맥내 투여된다. 이런 투여를 달성하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, TFPI 또는 TFPI 유사체는 바람직하게는 1mg/kg 내지 20mg/kg, 더 바람직하게 2mg/kg 내지 15mg/kg, 가장 바람직하게 2 내지 10mg/kg으로 주어진다.
상기 투약량은 일반적으로 적어도 약 하루의 기간에 걸쳐서, 보통은 몇일의 기간에 걸쳐서, 숙주에게 한번에 또는 나누어서 투여되는 총 1일 용량이 예를 들면 1일 당 약 2 내지 약 15mg/kg체중, 바람직하게는 약 4 내지 약 10mg/kg의 양일 수 있도록 투여된다. 투약 단위 조성물은 이러한 양 또는 그것의 나눠진 양을 함유함으로써 1일 용량으로 조제될 수 있다. 1㎍/kg 내지 2mg/kg과 같은 더 적은 1일 용량이 예방적 목적이나 다른 목적들에 유용할 수 있다. 단일 제형을 생성하기 위해서 담체 물질에 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 환자와 특정 투여 방식에 따라서 변할 것이다.
투약 섭생은 환자의 종류, 나이, 체중, 성별, 식이요법 및 의학적 상태, 상태의 중한 정도, 투여 경로, 활성, 효능, 약동학 및 독물학 프로필과 같은 약물학적 고려사항, 약물 송달 시스템이 이용되는지의 여부, 및 화합물이 약물 조합의 일부로서 투여되는지의 여부를 포함하는 다양한 요인들에 따라 선택된다. 따라서, 실제 사용되는 투약 섭생은 광범하게 변할 수 있으며, 그러므로 상기 제시된 바람직한 투약 섭생에서 벗어날 수도 있다. 바람직하게, TFPI 또는 TFPI 유사체의 용량은 약 0.66mg/kg/hr의 ala-TFPI의 용량률과 동등한 용량률을 초과하지 않아야 한다. 용량률 뿐만 아니라, TFPI 또는 TFPI 유사체의 주입 기간은 각 개별적인 환자의 임상적 심각도에 따라 달라질 것이고, 적당한 기간의 결정은 통상의 당업계의 의사들에게는 자명한 것이다. 주입은 예를 들면, 10-200 시간, 10-150시간, 24-150 시간, 36-100시간 또는 24-96시간 동안 수행될 수 있다. 담당의사의 판단에 따라 하나 이상의 치료 코스, 전형적으로는 두개의 치료 코스를 수행할 수 있다.
TFPI 투약량 투여
약 0.00025mg/kg/hr(0.00417㎍/kg/분) 이상 약 0.50mg/kg/hr(8.33㎍/kg/분) 미만의 용량률로 ala-TFPI를 투여하는 것과 동등한 용량률로 TFPI 또는 TFPI 유사체가 주어졌을 때, 중증 폐렴의 치료에서 그 효능이 보유되며, 출혈과 같은 불리한 부작용이 최소화된다. 효능과 안정성을 함께 개선하기 위해서, 용량률은 바람직하게 약 0.010 mg/kg/hr(0.167㎍/kg/분) 이상 약 0.1mg/kg/hr(1.67㎍/kg/분) 미만의 ala-TFPI 용량률과 동등하거나, 또는 약 0.020mg/kg/hr 이상 약 0.080mg/kg/hr 미만의 ala-TFPI 용량률과 동등하거나, 가장 바람직하게는 약 0.025mg/kg/hr(0.417㎍/kg/분) 이상 약 0.075 mg/kg/hr(1.251㎍/kg/분) 미만의 ala-TFPI 용량률과 동등하다. 투여 경로는 일반적으로 정맥내 투여이며, 연속 정맥내 주입이 바람직하다. 주입은 적어도 약 72, 96, 120 또는 240시간 동안 투여될 수 있다. 바람직하게 연속 주입은 3 내지 8일, 더 바람직하게 3 내지 6일, 가장 바람직하게 약 4일간 투여된다.
"연속 주입에 의한" 투여는, 정해진 기간의 대부분 동안 실질적인 중단 없이 대략 정해진 속도로 주입이 유지된다는 의미이다. 또는 달리, 간헐적 정맥내 주입이 사용될 수 있다. 만일 간헐적 주입이 사용된다면, 연속 주입에 대해 상기 설명된 용량률과 동등한 시간-평균 용량률이 사용되어야 한다. 이에 더하여, 간헐적 주입 프로그램은 연속 주입을 사용하여 얻어진 최대 농도를 20% 이상으로 넘지 않는 최대 농도를 가져와야 한다. 환자에서 불리한 반응, 특히 출혈을 수반하는 부작용을 피하기 위해, 용량률은 약 0.1mg/kg/hr로 ala-TFPI를 연속 정맥내 주입하는 것과 동등한 용량률 미만이어야 한다.
용량률 및 총 용량을 포함하는 상기 설명된 모든 용량은 프로트롬빈 분석을 사용하여 단백질 농도 및 생물학적 활성을 측정하는데 있어서의 오차로 인해 실제에서는 10% 이하의 변동이 있다. 따라서, 본원에 기재된 용량보다 10%까지 더 많거나 10% 더 적은 어떤 실제 투여된 용량은 기재된 용량과 동등한 것이라고 생각된다. 이런 이유로, 모든 용량은 "약" 특정 용량으로서 기재되었다. 예를 들어, "약 0.025mg/kg/hr"로서 설명된 용량은 0.0225 내지 0.0275mg/kg/hr 범위의 어떤 실제 용량과 동등한 것으로 생각된다.
바람직한 투약 섭생은, 560+/-110 mOsm/kg 삼투압을 갖는, 300 mM L-아르기닌, 5 mM L-메티오닌, 20 mM 시트르산 나트륨 완충액, pH 5.5 중의 각각 0.15 mg/ml 또는 0.45 mg/ml 재조합체 ala-TFPI를 100 ml씩 2회 간헐적 투여하는 것을 포함한다.
또, 저용량 TFPI 투여에 이어서라면, TFPI 또는 TFPI 유사체의 볼루스 주사나 또는 간단히 주입율을 더 높이는 것이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 볼루스 주사나 더 높은 주입율은 환자의 혈중에서 투여된 TFPI나 TFPI 유사체의 평형 시간을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 그렇게 해서, TFPI의 최종 정류상태 혈장 수준에 더 빠르게 도달할 수 있고, TFPI 수용체가 더 빨리 포화될 수 있다. 사람에게 2시간 동안 약 0.025mg/kg/hr로 ala-TFPI를 투여하는 것은 혈장 TFPI(ala-TFPI에 더해서) 수준을 약 80ng/ml 내지 약 125ng/ml로 증가시키거나 또는 대략 50% 증가시킨다. 주입 속도가 증가되거나 볼루스 주사가 사용된다면 동일한 수준에 더 빨리 도달할 것이다. 정류상태가 얻어질 때까지, 주입이 계속될 수록 더 높은 수준을 가져올 것이다. 중증 박테리아 감염으로 고통받는 환자에서 약 0.050mg/kg/hr의 ala-TFPI를 투여한 것에 대한 정류상태 수준은 약 300ng/ml인 것으로 밝혀졌고, 약 0.33 또는 약 0.66mg/kg/hr의 ala-TFPI의 투여에 대해서는 약 적어도 2㎍/ml으로 밝혀졌다.
단일 연속 주입 또는 분리된 주입 용량으로 숙주에게 투여되는 총 1일 용량은, 예를 들어 약 0.006mg/kg/일 이상 내지 약 1.2mg/kg/일 미만의 ala-TFPI 투여와 동등한, 더 통상적으로 약 0.24mg/kg/일 내지 약 1.2mg/kg/일의 ala-TFPI 투여와 동등한, 바람직하게는 약 0.6mg/kg/일의 ala-TFPI 투여와 동등한 양이다. 이 범위내에서 더 적은 양이 예방적 목적이나 다른 목적들에 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 용량계획 프로토콜은 환자에게 투여되는 총 용량으로 표현될 수 있다. 총 용량은 주입량과 총 주입시간의 수학적 결과이다. 예를 들어 ala-TFPI에 대해 약 0.025mg/kg/hr의 바람직한 용량률과 96시간의 바람직한 주입시간에서, 총 용량은 체중 kg 당 약 2.4mg ala-TFPI이다. 본 발명에 따라 투여된 TFPI의 총 용량은 약 0.75㎍/kg 이상 약 4.8mg/kg 미만의 ala-TFPI와 동등하다. 바람직하게, 총 용량은 약 1mg/kg 이상 약 4.8mg/kg 미만의 ala-TFPI와 동등하다. 더 바람직하게, 총 용량은 약 2.4mg/kg의 ala-TFPI와 동등하다.
mg/kg/hr에 기준한 용량률 및 총 1일 용량을 포함하는 상기 설명된 용량계획 섭생은 "기준 ala-TFPI의 투여와 동등한" 용량으로서 표현된다. 이것은 그것들이 성숙한 100% 순수한(단백질 기준으로) 알맞게 폴딩된 생물학적으로 활성인 비-당화된 ala-TFPI로 정의된 "기준 ala-TFPI"의 용량에 대한 정규화에 의해서 정량적으로 결정된다는 의미이다. ala-TFPI는 SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 TFPI의 유사체이다. 성숙한 전길이 TFPI 및 그의 유사체를 포함하는 다른 형태의 TFPI가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. ala-TFPI 이외의 다른 형태의 TFPI와 ala-TFPI 또는 다른 TFPI 유사체의 100% 미만으로 순수한 제조물을 사용하여 본 발명을 실시하는데 적합한 용량 범위를 결정하기 위해서, 기준 ala-TFPI에 대해 본원에 설명된 용량 범위가 특정한 형태의 TFPI에 고유한 생물학적 활성에 기초하여 조정될 수 있으며, 제조물의 생화학적 순도에 기초하여 더 조정될 수 있다.
TFPI 또는 TFPI 유사체의 고유한 생물학적 활성은 성숙한 100% 순수한 알맞게 폴딩된 TFPI 또는 TFPI 유사체의 프로트롬빈 분석에 의해 정의되는 특이적 활성으로 간주한다. 따라서, 동등한 용량은 (기준 ala-TFPI 용량)/((상대 고유 활성)x (생화학적 순도))에 따라 계산되며, 상대 고유 활성은 (유사체의 고유 활성)/(기준 ala-TFPI의 고유 활성)으로 간주된다. 예를 들어, 특정 TFPI 유사체가 기준 ala-TFPI의 80%인 고유 생물학적 활성을 가진다면, 특정 TFPI 유사체에 대한 동등한 용량은 기준 ala-TFPI의 용량값을 0.8로 나눔으로써 얻어진다. 더 나아가, 환자에게 투여되는 제제가, 예를 들어 단지 90% 생화학적으로 순수하다면, 즉 TFPI의 생화학적 활성이 없는 분자종을 10% 포함한다면, 용량값을 0.9로 나눔으로써 ala-TFPI의 기준 용량값의 추가적 보정이 수행된다. 따라서, ala-TFPI의 고유 활성의 80%를 가지며, 투여되는 것이 90% 생화학적으로 순수한, 가설상의 TFPI 유사체에 대해서, 0.025mg/kg/hr의 기준 ala-TFPI 투여와 동등한 용량률은 0.0347mg/kg/hr(즉, 0.025/(0.8x0.9))일 것이다.
또한, 동등한 용량은 고유 활성이나 생화학적 순도를 알지 못해도 상대 생물학적 활성을 결정함으로써 결정될 수 있다. 상대 생물학적 활성은 프로트롬빈 시간 분석을 사용하여 특정 TFPI 유사체와 TFPI 생물학적 활성 표준을 비교함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 약 85%의 생물학적 활성 TFPI 분자종을 함유하는, WO 96/40784의 실시예 9의 방법에 따라서 생성된 ala-TFPI가 TFPI 생물학적 활성 표준으로서 사용될 수 있다. WO 96/40784의 실시예 9의 방법에 따라 생성된 ala-TFPI는 프로트롬빈 분석에서 기준 ala-TFPI 활성의 약 85%를 가진다. 프로트롬빈 시간 표준 곡선을 작도하는데 있어서, 응괴형성 시간의 로그값이 TFPI 농도의 로그값에 대해 작도된다. TFPI 생물학적 활성 표준이 기준 ala-TFPI 활성의 85%를 갖는 경우, 작도 전에 TFPI 생물학적 활성 표준의 농도에 0.85를 곱한다면 기준 ala-TFPI에 대한 것과 동등한 표준 곡선이 작성될 수 있으며, 이로써 작도된 활성은 100% 순수한 기준 ala-TFPI의 활성과 동등하게 된다. 특정 TFPI 유사체에 대한 응괴형성 시간이 표준 곡선과 비교되는 경우, 동등한 농도의 기준 ala-TFPI는 곡선을 벗어나서 판독될 수 있다.
또는 달리, 표준 곡선의 직선 부분의 기울기가 선형회귀분석에 의해 얻어진다면, 기울기는 기준 ala-TFPI에 상대적인 TFPI 생물학적 활성 표준의 활성에 기초하여 보정될 수 있다. 따라서, 특정한 TFPI 유사체의 상대 생물학적 활성은 기준 ala-TFPI 활성 대 유사체의 활성의 비와 동등하다. 예를 들어, 특정한 유사체가 기준 ala-TFPI 1.00㎍과 동일한 프로트롬빈 시간 활성을 야기하는데 1.43㎍을 요한다면, 유사체의 상대 생물학적 활성은 1.00/1.43, 또는 0.7이다. 이 유사체에 대해서, 기준 ala-TFPI 용량을 유사체의 상대 생물학적 활성으로 나눔으로써 기준 ala-TFPI 용량과 동등한 용량이 얻어진다. 예를 들어, 기준 ala-TFPI에 대한 0.025mg/kg/hr 용량은 유사체의 0.0357mg/kg/hr과 동등할 것이다(즉, 0.025/0.7).
일부 구체예에서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 미리 헤파린 치료를 받은 환자에게 투여된다. 이러한 경우, 환자는 바람직하게는 TFPI 또는 TFPI 유사체의 투여 전 적어도 8시간 동안은 헤파린을 투여받지 않는다. 단편화되지 않은 헤파린으로 처리하는 것은 더 긴 "세척" 기간, 예를 들면 20, 21, 22, 23, 또는 24시간을 요할 수 있다. 저분자량 헤파린으로 처리한 환자에 대한 전형적인 세척 기간은 9, 10, 11 또는 12시간이다.
TFPI 또는 TFPI 유사체는 유일한 활성 항응고 약제로서 투여될 수 있고, 한편으로 이들 분자는 또한 한가지 이상의 추가 치료제와 조합하여 중증 폐렴의 치료에 조합요법을 제공할 수 있다. 이러한 추가 치료제, 예를 들어 항내독소, 모노클로날 항체(예를 들면, 내독소-결합 모노클로날 항체)와 같은 항체와 항-TNF 쥐 모노클로날 항체와 같은 항-TNF 산물을 포함한다. TFPI 및 TFPI 유사체는 또한 인터루킨-I 수용체 길항제, 살균제/침투성 증가(BPI) 단백질, 면역자극제, PAF 길항제와 같은 항염증 활성을 갖는 화합물 및 세포부착 차단제(예를 들면 GPIIb/IIIa 억제제와 같은 항혈소판제)와 조합될 수 있다.
38 미만 25 이상의 APACHE II 지수(예를 들면, 25 내지 37, 또는 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37)를 갖는 환자는 추가로 활성형 단백질 C(예를 들면 XIGRIS®)로 처리할 수 있다. 활성형 단백질 C는 전형적으로는 총 96시간 동안에 24 ㎍/kg/hr의 주입 속도로 투여될 수 있다. 이러한 투약 섭생의 조정은 개개의 환자의 임상의의 의견에 따라 숙련의사에 의해 조정될 수 있다.
조합물로서 투여될 때 치료제는 동시에 또는 상이한 시간에 제공되는 별도의 조성물로서 조제될 수 있다. 바람직하게, 추가의 치료제는 동시에(즉, TFPI 또는 TFPI 유사체의 투여 기간 중에) 또는 TFPI 또는 TFPI 유사체의 투여 기간의 24시간 이내에(즉, TFPI 또는 TFPI 유사체의 투여기간의 개시 24시간 내에, 또는 끝난 후 24시간 내에) 주어진다. 추가의 치료제는 또한 TFPI 또는 TFPI 유사체와 함께 단일 조성물로서 주어질 수 있다.
TFPI 또는 TFPI 유사체는 또한 중증 박테리아 감염, 특히 폐렴을 치료하는데 효과적일 다른 약제와 조합하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 다음의 것들, 즉 잠재적인 박테리아 감염을 치료할 수 있는 항생제, 박테리아 세포벽 성분에 대한 모노클로날 항체, 중증 폐렴 경로에 수반되는 사이토카인과 복합체를 형성할 수 있는 수용체, 그리고 일반적으로 사이토카인 또는 중증 폐렴 및/또는 그 증상들을 약화시키는 보체 단백질을 포함하는 다른 활성화되거나 또는 증폭된 생리학적 경로와 상호작용할 수 있는 어떤 약제나 단백질을, TFPI 또는 TFPI 유사체와 조합하여 투여할 수도 있다.
유용한 항생제는 베타-락탐 고리(페니실린), 글리코시드 결합의 아미노당(아미노글리코시드), 거대고리 락톤 고리(매크로리드), 나프타센카르복사니드의 폴리시클릭 유도체(테트라사이클린), 디클로로아세트산의 니트로벤젠 유도체, 펩티드(바시트라신, 그라미시딘, 및 폴리믹신), 콘쥬게이트 이중결합 시스템을 갖는 큰 고리(폴리엔), 술파닐리드로부터 유래된 설파제(술폰아미드), 5-니트로-2-푸라닐기(니트로푸란), 퀴놀론카르복실산(날리딕스산) 등의 일반적 부류의 것들을 포함한다. 다른 항생제 및 상기한 특정 항생제들의 더 많은 다양한 것들을 Encyclopedia of Chemical Technology, 3판, Kirk-Othymer(편저), 2권 782-1036페이지 (1978) 및 3권, 1-78페이지, Zinsser, MicroBiology, 17판 W. Joldik 등(편저) 235-277페이지 (1980), 또는 Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 27판, W. B. Saunders Company (1988)에서 볼 수 있다.
TFPI 또는 TFPI 유사체와 조합될 수 있는 다른 약제는 E5531와 같은 내독소 길항제(지질 A 유사체, Asai 등, Biol. Pharm. Bull. 22:432 (1999) 참조), 항응고 활성을 갖는 TF 유사체(예를 들어, Kelley 등, Blood 89:3219 (1997) 및 Lee & Kelley, J. Biol. Chem. 273:4149 (1998) 참조), 사이토카인에 관한 모노클로날 항체, 예를 들어, IL-6 또는 M-CSF에 관한 이들 모노클로날 항체, 1989년 12월 15일에 출원된 미국출원 No. 07/451,218 참조, 그리고 TNF에 관한 모노클로날 항체(Cerami 등, 미국특허 No. 4,603,106 참조), 그 단백질을 생성한 세포로부터 성숙한 TNF 프로호르몬을 절단하는 단백질의 억제제(1989년 8월 16일자로 출원된 미국출원 No. 07/395,253 참조), IL-1의 길항제(1990년 5월 1일 출원된 미국출원 No. 07/517,276 참조), 인히빈과 같은 IL-6 사이토카인 발현의 억제제(미국특허 5,942, 220 참조), 그리고 IL-1와 같은 여러가지 사이토카인의 수용체 기제 억제제를 포함한다. 보체에 대한 항체 또는 보체에 대한 단백질 억제제, 예를 들면 CR1, DAF, 및 MCP도 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허, 특허출원 및 참고자료는 그들의 전체가 참고자료로 본원에 수록된다.
도 1 내지 도 25는 본 발명의 구체예를 예시하는 도면이다.
이제 본 발명은 특히 유리한 구체예를 제시하는 다음의 실시예들을 참조하여 예시될 것이다. 그러나, 이들 구체예는 본 발명의 예시이며 본 발명을 어떤 식으로도 제한하지 않는다는 것을 주지해야 한다.
실시예 1
재료
TFPI의 Kunitz 도메인 1 (4904) 또는 Kunitz 도메인 2 (4903)에 대한 모노클로날 항체를 American Diagnostica Inc. (Greenwich, CT)으로부터 구입하였다. 본 발명자는 추가의 모노클로날 항체(2H8, Kunitz 도메인 1에 대한 것, 17, C-말단에 대한 것)를 만들었다. 대조군 마우스 IgG1는 Jackson ImmunoResearch Lab Inc.로부터 구입하였다. 사람 제대혈 내피 세포(HUVEC)는 Clonetics (San Diego, CA)로부터 구입하여 EBM-2 배지(Clonetics) 중에서 37℃에서 배양하였다. E. coli 유래 지질다당체(LPS)는 Sigma (L-2654)로부터 구입하였다.
하기의 실시예에서, 모든 외생성 TFPI는 ala-TFPI이다.
실시예 2
전혈분석
혈액은 건강한 수여자로부터 뽑은 것으로서 항응고제가 없는 것이고 혈소판 활성화를 최소화시킨 조건 하에 있는 것이었다. 아스피린이나 기타 항응고제, 콜레스테롤 감소 약물, 항염증제, 항히스타민제, 및 항생제를 사용한 수여자는 선택하지 않았다. ala-TFPI가 존재하거나 그렇지 않은, 10 ng/ml LPS 및 상이한 농도의 mAb를 함유하는 반응물 혼합물을 96-웰 디쉬에 미리 만들어 두었다. 혈액을 뽑은지 10분 안에, 총 200 ㎕의 부피의, 10% FBS가 존재하거나 존재하지 않는 RPMI-1640 배지내에 1:10 비율로 첨가하였다. 희석된 혈액 샘플을 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 16 내지 20 시간 동안 인큐베이팅하였고, 세포 상층액의 분취액을 IL-6 ELISA 키트 (Biosource)를 사용하여 염증 사이토카인의 분비에 대해 분석하였다. 기타 사이토카인의 방출도 LINCOPLEX® 사이토카인 키트(LINCO Research)를 사용하여 측정하였다.
실시예 3
전혈분석과 함께 HUVEC 분석
실험 하루 전에 10 ng/ml LPS를 함유한 EBM-2 배지 중에 5000-7000 세포/96 웰로, HUVEC 세포를 플레이팅하였다. 실험 당일에, 배지를 제거하고, 이를 10% FBS가 존재하거나 존재하지 않는 RPMI-1640 배지 중에, ala-TFPI가 존재하거나 존재하 지 않는, 10 ng/ml LPS 및 상이한 농도의 mAb를 함유하는 미리 만들어둔 반응물 혼합물로 교체하였다. 이어서 혈액을 1:10의 비율로 첨가하였다. 전혈분석은 상기에 기술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 4
환자 기준선 TFPI 는 사망률과 상응함
ala-TFPI를 사용하여 여러 요인의 중증 패혈증을 치료하기 위한 대규모 제III기 임상 시험에서, 본 발명자는 ala-TFPI 치료로부터 명백히 혜택을 입은 환자의 큰 하위군을 발견하였다. 특히 본 발명자는 CAP에 걸린 환자가 경과가 좋음을 주목하였다. 분석 중에서도, 이 시험에서 본 발명자는 ELISA에 의해 TFPI의 기준선 혈장 농도를 측정하였다. 도 2에서도 보이는 바와 같이, 환자 기준선 TFPI는 사망률과 상응한다. 이것은 전체 또는 CAP 하위군에서도 마찬가지였다. 이러한 결과는 패혈증이 악화됨에 따라 TFPI가 비활성화되어 혈액 세포로부터 방출되었음을 암시한다. 외생성 ala-TFPI는 감염 동안에 손실된 내생성 TFPI를 명백히 대체한다.
실시예 5
전혈 패혈증 모델에서 TFPI 턴오버의 자극 및 TFPI 파괴의 유도
본 발명자는 정상적인 혈액에 혈청을 첨가함으로써 패혈증 혈액 모델을 만들었다. 이렇게 하면 신속한 응고를 유발시키고, 다수 사이토카인의 지질다당체(LPS) 의존성 분비를 유발시켜서, 패혈증 환자의 혈액에서 관찰되는 것과 유사한 조건을 만들게 된다.
ala-TFPI가 전혈에 첨가될 때 C-말단은 온전하게 남아있다. 하지만 본원에서 의 패혈증 모델에서는, 첨가된 ala-TFPI로부터의 C-말단 도메인이 절단되어 있다. 결과는 도 3에 제시하였다. 이러한 데이터는, 응고를 유발시키고 혈액내 염증 사이토카인을 유발시키는 조건은 TFPI의 C-말단 도메인의 제거를 유도한다는 점을 나타낸다. 정상적인 혈장 TFPI 중 95%까지의 C-말단이 결실되었다. C-말단이 절단된 TFPI는 혈액 분석에서 활성이 거의 없었다.
실시예 6
다양한 내생성 TFPI 수준을 사용하는, 환자의 생존에 대한 첨가된 ala - TFPI 의 효과
첨가된 ala-TFPI는 기준선 TFPI가 부재하는 환자에서 효과적인 것으로 보였다(도 4). CAP 환자가 기준선 TFPI 수준에 의해 하위군으로 분리되는 경우, 본 발명자는 ala-TFPI가 낮은 정상적인 기준선 TFPI 수준을 가진 환자 및, 상승된 기준선 TFPI를 가진 환자에서 효과적임을 발견하였다. 첨가된 ala-TFPI가 상승된 기준선 TFPI를 가진 환자를 개선시켰다는 사실은, 혈장 TFPI가 비활성화되었다는 데이터와 ala-TFPI 약물이 완전히 활성형이 되었다는 점과 일치한다.
실시예 7
본 발명자는 건강한 수여자로부터의 희석된 전혈에서 TFPI 활성을 연구하였다. 본 발명자는 TFPI가 염증 사이토카인을 통하여 항박테리아 활성을 조절하는 신호전달 복합체의 일부라는 것과 상응하는 몇가지 활성을 증명하였다. 정상적인 혈액에서 염증 사이토카인 수준은 매우 낮으며 외생성 ala-TFPI가 첨가될 때에도 낮게 유지된다(도 5). 예상한 바와 같이 정상적인 혈액에 LPS를 첨가하면 IL-6, IL- 1β 및 TNF-α를 포함하는 염증 사이토카인을 상승시킨다. 이 반응은 혈장 TFPI 농도에 민감성이며, 기능적 TFPI가 손실되면 반응이 줄어들 것이다.
예상하지 못했지만 LPS는 또한, 첨가된 ala-TFPI가 인터페론-γ (IFN-γ), IL-6, IL-1β, 및 TNF-α를 유발하도록 혈액으로 하여금 TFPI에 감작되도록 하고(도 6, 7A); IL-6, IFN-γ, TNF-α 및 IL1-β 증가는 항-TFPI의 적은 용량에 의해 모두 회귀되었다(도 7B). 이러한 사이토카인의 스펙트럼은 항박테리아 활성을 증가시키기 위한 마크로파지의 활성화와 관련이 있다.
현재의 세포 면역학 수준으로 보아서는 세포성 면역은 TH1 세포에 의해 매개되는 것으로 이해된다. TH1 세포가 활성화되려면 항원 인식과 적절한 T 세포의 클론 증식이 필요한데 이는 1주가 걸리는 과정이다. ala-TFPI가 유발한 유도가 수시간 후에 발생하였다는 것은, 이러한 형태의 활성화가 획득 면역계가 완전히 유발되기 전에 감염의 초기에 중요한 역할을 할 수 있음을 암시하는 것이다.
이러한 결과는 TFPI가 응고 캐스케이드에서 프로테아제 억제제라기 보다는 신호전달 케스케이드에서 리간드로서 작용하는 것으로 추측되는 것임을 나타낸다.
실시예 8
최근의 문헌에서는 Kunitz 도메인 3(K3)은 이의 수용체와 TFPI의 상호작용을 위한 필수적인 도메인이지만, K3은 응집의 억제를 위해서는 중요하지 않은 것으로 보인다고 지적한 바 있다. Piro & Broze, Circulation. 2004 Dec 7;110(23):3567-72 참조. 전혈분석을 사용하여, 본 발명자는 사이토카인을 유도하기 위해 TFPI에게 요구되는 TFPI의 도메인을 매핑하였다. 그 결과는 도 8에 제시하였다. 본 발명자는 C-말단에서 결실된 TFPI는 여전히 활성을 가지지만, C-말단 도메인 및 K3 모두를 결핍한 결실 돌연변이는 비활성인 것을 발견하였다. 이러한 데이터는 K3을 통해 수용체에 고정되는 TFPI의 제안되는 신호전달 활성과 일맥상통한다.
실시예 9
상기 지적한 바와 같이, LPS를 함유하는 혈액에 혈청을 첨가하면 일련의 스펙트럼의 사이토카인을 유발한다: 이러한 사이토카인에는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10이 포함되나 IFN-γ는 없다. 이러한 집단은 활성화된 마크로파지 결과물과도 일치하는 것이다. 외생적으로 첨가된 3 내지 10 nM ala-TFPI는 혈청 유도된 사이토카인을 억제할 수 있다(도 7 및 도 9)
실시예 10
TFPI 는 Xa 인자에 의해 유발되는 IL -6 생산을 억제한다
IL-6 생산에 대한 TFPI의 억제 활성은 Xa 생산을 억제할 수 있는 TFPI의 능력을 통한 것인 것으로 여겨진다. 도 10은 각종 억제제(억제제 DEGR-VIIa, DEGR-IXa, 및 DEGR-Xa는: 각각 VIIai, IXai 및 Xai로 표기)의 존재하에 LPS 및 혈청에 의해 촉발된 IL-6를 측정하는 전혈분석 결과를 제시한다. 본 발명자가 여러가지 억제제를 시험하였을 때, 자리-불활성화된 VIIa는 활성을 가지지 않음을 발견하였는데, 이는 사이토카인이 응괴의 조직인자(TF)-매개성 활성화에 의해 유도되지 않았음을 나타내는 것이다. 본 발명자의 예상과는 반대로 자리 불활성화된 IXa는 대략 TFPI 만큼 효능이 있었는데, 이는 사이토카인 분비가 고유 응괴 캐스케이드를 통해 유도된 Xa 인자의 형성에 관여함을 나타내는 것이다. 문헌에 따르면, Xa는 트롬빈을 만들 수 있는 이의 능력을 통해 사이토카인을 유도한다. 이러한 것에 반대로, 본 발명자는 자리-불활성화된 Xa는 효과가 없음을 발견하였다.
이러한 결과들은 사이토카인은 Xa에 의해 직접적으로 유도될 수 있고, 이러한 유형의 반응에서 TFPI는 Xa 생산을 억제할 수 있는 이의 능력을 통해 효과가 있다는 것을 보여주었다.
실시예 11
TFPI 및 APC(활성형 단백질 C)는 트롬빈의 생산을 각각 제한하기 때문에 응고에 대해 매우 유사한 효과를 가진다(도 11). 하지만 Xa 인자에 의해 사이토카인이 유도되지 않으면 이러한 약물은 IL-6 유도에 대해 상이한 효과를 가질 것이다. APC는 VIIIa 인자의 파괴를 통해 Xa의 생산을 억제하지만, TF 유도성 Xa의 생산에 대해서는 효과를 가지지 않는다. 본 발명의 패혈증 혈액 모델에서, 본 발명자는 소량의 TF를 반응에 첨가한 경우에 정확히 이러한 결과를 관찰할 수 있었다(도 12). IXa가 IL-6를 유도하는 반응에서, 본 발명자는 두 단백질이 IL-6 수준에서 반영되는 바와 같이 혈청 유도성 염증을 억제할 수 있음을 발견하였다. 예상한 바와 같이, APC는 고유 경로를 통해 유도된 IL-6의 생성을 억제하였다. 그러나 TF의 존재하에서는 오로지 TFPI만이 IL-6의 생성을 억제할 수 있었다.
실시예 12
혈구 세포는 이의 표면 위에 TFPI를 가지는 것으로 알려져 있다. 이 TFPI의 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자는 항-TFPI 항체를 사용하여 이의 기능을 억제 시키고 사이토카인을 측정하였다(도 13). 첨가된 ala-TFPI에서 보이는 억제와는 명백히 모순되게, 항-TFPI는 또한 IL-6 분비도 억제하였다. 이러한 데이터는 정상적인 혈액 + LPS에 ala-TFPI를 첨가한 것의 결과와는 비슷한 것이다. 이러한 데이터로부터 본 발명자는 TFPI가 신호전달 복합체의 일부라는 결론을 내렸다.
카베올라에 TF:VIIa:Xa 복합체를 재위치시키고, 여기에서 TFPI와 조합되는 모델이 도 14에 제시된다. 이 복합체는 제제내의 Xa에 따라 달라진다. 본 발명자는 복합체의 기능이 사이토카인 분비를 활성화하는 것이고 박테리아 제거 메카니즘을 향상시키는 것이라고 생각하지만, 이러한 이론으로 국한시키고자 하는 것은 아니다. 복합체의 형성은 Xa에 따라 달라지기 때문에, 과량의 TFPI는 항체를 중화시키면서, 복합체 형성을 예방할 것이다.
이러한 모델과 일관되게, 본 발명자는 프로테아제-활성형 수용체(PAR)-유발성 사이토카인의 조절은, 심지어 PAR-1이 아고니스트 펩티드에 의해 활성화된 경우라 해도 Xa 인자 생성에 의존한다는 것을 발견하였다(도 15). PAR-1은 본 발명의 패혈증 혈액 모델에서 IL-6 분비를 유도하는 신호전달 시스템의 일부인 것으로 보이는데, 이는 PAR-1 활성화를 차단하는 항체가 IL-6 분비를 억제하기 때문이다(도 16). 또한 PAR-1 아고니스트의 첨가는 IL-6 분비를 증가시킨다. 이러한 활성 모두는 염증 사이토카인 생산을 담당한다는 PAR에 대한 문헌의 데이터와도 일치하는 것이다. PAR 활성화가 응고 캐스케이드의 다운스트림이기 때문에, PAR 아고니스트는 이 시스템에서 우성일 것이다. 대신에 본 발명자는, 사이토카인을 조절하는 Xa 의존성 TFPI 복합체의 본 발명의 모델과 일치하게, TFPI는 PAR 아고니스트를 무효로 할 수 있다는 것을 발견하였다.
실시예 13
카베올라내 TFPI의 주요 저장소는 내피 세포 상에서 발견된다. 이러한 세포는 표면 TF의 신속한 유도를 통해 혈액 감염에 대한 감시병으로서 작용하는 것으로 제안된 바 있다. 상기에도 언급한 바와 같이, 본 발명자는 IL-6의 중간정도의 버스트를 방출시킴으로써 LPS에 대해 혈액이 반응하는 것을 발견하였다(도 17). 마찬가지로, 내피 세포는 소량의 사이토카인으로도 LPS에 반응한다. 본 발명자는 혈액과 내피 세포를 조합하면 LPS에 대한 시너지 반응을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자는, 시너지 반응은 IL-6 및 IL-8에 한정되는 것으로 결론내렸고, 이러한 점은 내피 세포가 경고 시스템으로서 작동하고 있음과 일치하는 것이다.
이러한 반응에서 TFPI의 역할을 다시 증명하기 위하여, 본 발명자는 중화 항-TFPI 항체를 첨가하였다(도 18). 본 발명자는 고농도의 항-TFPI는 IL-6의 생산을 억제함을 발견하였다. 이러한 억제가 TFPI에 기한 것이었음을 확인하기 위하여, 본 발명자는 저농도의 ala-TFPI와 항 TFPI를 예비인큐베이팅하였으며, 그 결과 10 nM ala-TFPI는 600 nM 항-TFPI의 효과를 부분적으로 회귀시키는 것을 발견하였다(도 19).
<110> NOVARTIS AG <120> USE OF TFPI TO TREAT SEVERE BACTERIAL INFECTIONS <150> US 60/678,465 <151> 2005-05-06 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 276 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr 35 40 45 Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn 50 55 60 Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe 85 90 95 Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg 100 105 110 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly 115 120 125 Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys 130 135 140 Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys 165 170 175 Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro 180 185 190 Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn 195 200 205 Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly 210 215 220 Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys 225 230 235 240 Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys 245 250 255 Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe 260 265 270 Val Lys Asn Met 275 <210> 2 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu 1 5 10 15 Leu Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp 20 25 30 Asp Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe 35 40 45 Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln 50 55 60 Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 65 70 75 80 Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp 85 90 95 Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr 100 105 110 Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr 115 120 125 Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys 130 135 140 Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr 165 170 175 Lys Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr 180 185 190 Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr 195 200 205 Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly 210 215 220 Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys 225 230 235 240 Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr 245 250 255 Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile 260 265 270 Phe Val Lys Asn Met 275

Claims (39)

  1. 하기의 기준 중 하나 이상을 만족하는, 필요로 하는 환자에게 TFPI 또는 TFPI의 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 중증 박테리아 감염이 발전될 위험에 처해 있거나, 중증 박테리아 감염을 가진 것으로 진단받은 환자의 치료 방법:
    (a) 3,200 pg/ml 미만의 혈액 IL-6 수준;
    (b) 2.5 미만의 국제 표준화 비율(INR);
    (c) 26 미만의 급성 생리학적 지수(APS);
    (d) 38 미만의 급성 생리학적 및 만성 건강 평가(APACHE II) 지수;
    (e) 18보다 큰 MODS 지수.
  2. 하기의 기준 중 하나 이상을 만족하는, 필요로 하는 환자에게 TFPI 또는 TFPI 유사체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 중증 박테리아 감염으로부터의 사망률 위험을 감소시키는 방법:
    (a) 3,200 pg/ml 미만의 혈액 IL-6 수준;
    (b) 2.5 미만의 국제 표준화 비율(INR);
    (c) 26 미만의 급성 생리학적 지수(APS);
    (d) 38 미만의 급성 생리학적 및 만성 건강 평가(APACHE II) 지수;
    (e) 18보다 큰 MODS 지수.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 증증 박테리아 감염은 폐렴, 균혈증, 심조직 감염, 피부 감염, 연조직 감염, 치주 감염, 복막염, 수술 감염, 또는 뇌막염을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 중증 박테리아 감염은 결핵을 유발하고, 결핵은 지역사회획득 결핵이거나 병원획득 결핵인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 결핵은 S. 뉴모니아(S. pneumoniae)에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 비-당화된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 12% 미만은 변형된 종이고, 이때 변형된 종은 하기 i 내지 vi 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    i. 역상 크로마토그래피에 의해 검출되는 바와 같은 산화된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자;
    ii. 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 검출되는 바와 같은 카르바밀화 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자;
    iii. Promega ISOQUANT® 키트에 의해 검출되는 바와 같은 탈아미드화된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자;
    iv. 아미노산 분석에 의해 결정되는 바와 같은 시스테인 부가물을 포함하는 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자;
    v. 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출되는 바와 같은 응집된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자;
    vi. 비변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 검출되는 바와 같은 잘못 폴딩된 TFPI 또는 TFPI 유사체 분자.
  8. 제 7 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 9% 미만이 산화된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 3% 미만이 카르바밀화된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 9% 미만이 탈아미드화된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 2% 미만이 시스테인 부 가물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 3% 미만이 응집된 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 7 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체 분자의 약 3% 미만이 잘못 폴딩된 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 TFPI 또는 TFPI 유사체를 포함하는 동결건조된 조성물로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는아르기닌을 포함하는 제제로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 시트르산염을 포함하는 제제로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 0.01 내지 1.0 mg/ml, 0.01 내지 0.8 mg/ml, 0.01 내지 0.5 mg/ml, 0.01 내지 0.3 mg/ml, 0.01 내지 0.2 mg/ml, 또는 0.01 내지 0.1 mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 150-450 mM, 150-400 mM, 150-350 mM, 또는 150-300 mM L-아르기닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 0.1-50 mM, 0.1-40 mM, 0.1-30 mM, 0.1-25 mM, 0.1-15 mM, 0.1-10 mM, 또는 0.1-5 mL L-메티오닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 5-50 mM, 5-45 mM, 5-40 mM, 5-35 mM, 5-30 mM, 5-25 mM, 또는 5-20 mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 5.0-6, 5.0-5.8, 5.0-5.7, 5.0-5.6, 또는 5.0-5.5의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 0.15 ± 15% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 15% mM L-아르기닌, 5 ± 15% mM L-메티오 닌, 및 pH 5.5 ± 15%에서 20 ± 15% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 0.15 ± 10% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 10% mM L-아르기닌, 5 ± 10% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 10%에서 20 ± 10% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 0.15 ± 5% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 5% mM L-아르기닌, 5 ± 5% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 5%에서 20 ± 5% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 0.45 ± 15% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 15% mM L-아르기닌, 5 ± 15% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 15%에서 20 ± 15% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 0.45 ± 10% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 10% mM L-아르기닌, 5 ± 10% mM L-메티오 닌, 및 pH 5.5 ± 10%에서 20 ± 10% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 것으 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물은 0.45 ± 5% mg/ml TFPI 또는 TFPI 유사체, 300 ± 5% mM L-아르기닌, 5 ± 5% mM L-메티오닌, 및 pH 5.5 ± 5%에서 20 ± 5% mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 약 0.66 mg/kg/hr 미만의 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 용량률로 연속 정맥내 주입함으로써 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 용량률은 약 0.00025 내지 약 0.1 mg/kg/hr의 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등하고, TFPI 또는 TFPI 유사체는 적어도 약 72시간 동안 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 용량률은 약 0.010 내지 약 0.1 mg/kg/hr의 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 용량률은 약 0.02 내지 0.1 mg/kg/hr의 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 적어도 약 96시간 동안 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 약 0.024 내지 약 4.8 mg/kg의 총 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 총 용량을 제공하기 위해, 연속 정맥내 주입함으로써 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 약 0.02 내지 약 1 mg/kg/hr의 용량률에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 용량률로 연속 정맥내 주입함으로써 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 약 0.006 mg/kg 내지 약 1.2 mg/kg의 1일 용량에서 기준 ala-TFPI의 투여와 동등한 1일 용량을 제공하기 위해 연속 정맥내 주입함으로써 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 또는 TFPI 유사체는 10-200 시간, 10-150 시간, 또는 24-96 시간의 기간 동안 주입함으로써 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 TFPI 또는 TFPI 유사체를 투여하기 전 적어도 8시간 동안 헤파린으로 치료받지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성형 단백질 C로 환자를 처리하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, TFPI 유사체는 ala-TFPI인 것을 특징으로 하는 방법.
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